Carotinoide werden de novo in Bakterien, Algen, Pilzen und Pflanzen synthetisiert.

Ketocarotinoide, also Carotinoide, die mindestens eine Keto-Gruppe enthalten, wie beispielsweise Astaxanthin, Canthaxanthin, Echinenon, 3-Hydroxyechinenon, 3'- Hydroxyechinenon, Adonirubin und Adonixanthin, sind natürliche Antioxidantien und Pigmente, die von einigen Algen und Mikroorganismen als Sekundärmetabolite produ- ziert werden.

So wird beispielsweise Astaxanthin von Bakterien und Hefe synthetisiert. Diese akku- mulieren freies, nicht verestertes Astaxanthin. Mikroalgen marinen Ursprungs syntheti- sieren Astaxanthin und akkumulieren dieses in der Regel als Astaxanthinester ; geringe Mengen an freiem Astaxanthin sind jedoch auch nachweisbar. Das bekannteste Bei- spiel ist Haematococcus pluvialis, eine Alge, die unter Licht-und Mineralienstress in- nerhalb von wenigen Tagen bis zu 5% des Trockengewichtes als Astaxanthinester (70- 80% als Monoester) akkumuliert. Diese Algenanzucht unter Stressbedingungen wird großtechnisch und wirtschaftlich genutzt.

Astaxanthinester, hauptsächlich Diester, werden im Pflanzenreich natürlicherweise nur von einer Pflanze, dem Adonisröschen, produziert. Die Astaxanthinester werden in den Blütenblättern angereichert ; freies Astaxanthin ist lediglich in äußerst geringen Spuren nachweisbar.

In genetisch verändertem Tabak (Mann, Harker, Pecker und Hirschberg ; Nature Bio- technology 18 (8), 888-892,2000) wurde in den Nektarien der Blüte Astaxanthin syn- thetisiert. Die überwiegende Menge an Astaxanthin wird als Ester gespeichert.

Aufgrund ihrer farbgebenden Eigenschaften werden die Ketocarotinoide und insbeson- dere Astaxanthin als Pigmentierhilfsstoffe in der Tierernährung, vor allem in der Forel- len-, Lachs-und Shrimpszucht verwendet.

Zur Freisetzung der Carotinoide aus ihren Estern werden diese in herkömmlicher Wei- se in ein organisches Lösungsmittel überführt und anschließend alkalisch verseift. Da- bei sind aber insbesondere Ketocarotinoide, wie Astaxanthin, Hydroxyechinenone,

Adonirubin und Adonixanthin, sehr oxidationsempfindlich, wodurch die Ausbeute an Wertprodukt stark vermindert wird.

Aus dem Stand der Technik ist auch die enzymatische Esterspaltung, insbesondere von Carotinoidestern, unter Verwendung von Lipasen oder Esterasen bekannt.

So beschreibt z. B. Liu et al in Nutritional Biochemistry 9,178-183 (1998) die Lipase- katalysierte Hydrolyse von Xanthophyllen in Gegenwart von Gallensäure. Es wurden aber keine Ketocarotinoide analysiert.

Breithaupt beschreibt in Z. Naturforsch., 55c, 971-975 (2000) die enzymatische Hydro- lyse von Carotinoidestern aus Roter Paprika mit Lipase aus Candida rugosa. Experi- mentelle Untersuchungen mit oben beschriebenen Ketocarotinoidestern werden nicht beschrieben. Für die untersuchten Carotinoidester werden Hydroyseraten von 21 bis 59 % beschrieben.

Zorn et al. beschreiben in Enzyme and Microbial Technology, 32,623-628 (2003) die Hydrolyse von Carotinoidestern aus Tagetes erecta und Capsicum annuum. Hydroly- seraten von 18 bis 44 % werden für Tagetes erecta und 30 bis 69% für Capsicum an- nuum beschrieben. Die Hydrolyse von oben beschriebenen Ketocarotinoidestern wur- de nicht untersucht.

Aakermann et al. beschreiben in Biocatalysis and Biotransformation, 13,157-163 (1996) die praktisch gescheiterten Versuche zur Hydrolyse von synthetischem Astha- xanthin-Dipalmitat mit Lipase aus Candida rugosa. Es wurden lediglich 5% freies Asta- xanthin und 6% Monopalmitat nachgewiesen. Auch mit Astaxanthin-Diacetat wurden keine signifikant besseren Ergebnisse erzielt.

Esterase-katalysierte Spaltungen von Carotinoidestern werden von Jacobs et al. in Comp. Biochem. Physio. 72B, 157-162 (1982) beschrieben. Astaxanthin-Diester aus Procambarus acutus (Flußkrebs) werden zu 31% in den Monoester und zu 13% in frei- es Astaxanthin überführt. Eine Hydrolyse von bis zu 85% wird durch Erhöhung der Cholesterin-Esterase Konzentration für möglich gehalten, wobei aber jeglicher experi- mentelle Beleg für diese Behauptung fehlt. Die Autoren führen außerdem aus, dass die Hydrolyse von der Art der Fettsäuren im Ester beeinflusst werden kann, ohne jedoch nähere Angaben zu machen.

Die enzymatischen Methoden zur Carotinoidesterhydrolyse gemäß Stand der Technik führen somit insgesamt zu keinen völlig zufriedenstellenden Ergebnissen, da die tat- sächlich erzielten Hydrolyseraten sehr gering sind. Enzymatische Ketocarotinoidester- M/44120-PCT

Hydrolysen gemäß Stand der Technik verlaufen, soweit untersucht, ebenfalls noch nicht zufriedenstellend. Verlässliche Aussagen über den möglichen Verlauf der Hydro- lyse-Reaktion bei Verwendung anderer Carotinoidester-Quellen, wie insbesondere Algen und Pflanzen, sind daher für den Fachmann nicht möglich.

Kurze Beschreibung der Erfindung Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur enzymatischen Hydrolyse von Carotinoidestern und insbesondere Ke- tocarotinoidestern.

Obige Aufgabe wurde gelöst durch Bereitstellung eines Verfahrens zur enzymatischen Hydrolyse von Carotinoidestern, wobei man einen Carotinoidester-haltigen Reaktan- den, abgeleitet von einem natürlichen oder genetisch verändertem Organismus, mit einem esterspaltenden Enzym, ausgewählt unter Carboxylsäureester-spaltenden Hydrolasen (E. C. 3.1. 1. ), bis zur im wesentlichen quantitativen hydrolytischen Ester- spaltung inkubiert und das (die) gebildete (n) Carotinoid (e) gegebenenfalls aus dem Reaktionsansatz isoliert.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung a) allgemeine Definitionen : In Rahmen der vorliegender Erfindung sind"Carotinoide"ausgewählt unter veresterba- ren Carotinoiden, wie Zeaxanthin, alpha-Cryptoxanthin, beta-Cryptoxanthin, Capsoru- bin, Capsanthin, Violaxanthin, Neoxanthin, Lutein, Astaxanthin, Adonixanthin, Adoniru- bin, 3'-Hydroxyechinenon, 3-Hydroxyechinenon, ohne darauf beschränkt zu sein.

Eine bevorzugte Gruppe von Carotinoiden sind Ketocarotinoide.

In Rahmen der vorliegender Erfindung sind"Ketocarotinoide"ausgewählt unter ve- resterbaren, ketogruppenhaltigen Verbindungen, wie Astaxanthin, 3-Hydroxyechin- enon, 3'-Hydroxyechinenon, Adonirubin und Adonixanthin sowie Gemischen dieser Verbindungen.

Der"Ester"eines Carotinoids/Ketocarotinoids kann sowohl ein Mono-als auch Polyes- ter, insbesondere Diester oder ein Gemisch von verschiedenen Estern sein. Di-oder Polyester können von gleichen oder verschiedenen Carbonsäuren abgeleitet sein.

Ester sind insbesondere Ester von Fettsäuren. Geeignete Fettsäureester sind aufge- baut aus geradkettigen oder verzweigten, ein-oder mehrfach ungesättigten, gegebe- nenfalls substituierten C6-C30-Monocarbonsäuren. Beispiele für gesättigte unverzweigte Fettsäuren sind Capronsäure, Önanthsäure, Caprylsäure, Pelargonsäure, Caprinsäure, Undecansäure, Laurinsäure, Tridecansäure, Myristinsäure, Pentadecansäure, Palmi- tinsäure, Margarinsäure, Stearinsäure, Nonadecansäure, Arachinsäure, Behensäure, Lignocerinsäure, Cerotinsäure und Melissinsäure. Beispiele für einfach ungesättigte Fettsäuren sind Palmitoleinsäure, Ölsäure und Erucasäure. Beispiele für zweifach un- gesättigte Fettsäuren sind Sorbinsäure und Linolsäure. Beispiele für dreifach ungesät- tigte Fettsäure sind Linolensäure und Eiaeostearinsäure. Beispiele für vier-und mehr- fach ungesättigte Fettsäuren sind Arachidonsäure, Clupanodonsäure und Docosahe- xaensäure. Bevorzugt sind unverzweigte, gesättigte Fettsäuren. Weiterhin bevorzugt sind einwertige, gesättigte oder ein-, zwei-oder dreifach ungesättigte Ciao-24-. vorzugs- weise C, 220-oder C, 420-Fettsäuren.

Carotinoide bzw. Ester gemäß obiger Definition umfassen diese Verbindungen sowohl in isomerenreiner Form als auch in Form von Stereisomerengemischen.

"Gesamtcarotinoide"steht für die Summe aller Carotinoide und Carotinoidester gemäß obiger Definition.

Eine"im wesentlichen quantitative hydrolytische Esterspaltung"bedeutet, dass erfin- dungsgemäß durch enzymatische Aktivität wenigstens einer der vorliegenden Caroti- noidester, insbesondere wenigstens einer der vorliegenden Ketocarotinoidester, zu wenigstens etwa 85 %, insbesondere wenigstens etwa 88 % hydrolysiert ist, so dass keine Estergruppen mehr im Molekül enthalten sind. Besonders bevorzugt erhält man erfindungsgemäß Hydrolyseraten von 100% oder weniger, wie z. B. 88 bis 99% oder 95 bis 99%.

Die"Hydrolyserate"ist erfindungsgemäß definiert durch den prozentualen Anteil, um den die Menge an (z. B. extrahierten) Carotinoidestern in einem Reaktanden enzymka- talysiert abnimmt. Insbesondere lässt sich die Hydrolyserate dadurch bestimmen, dass man den Carotinoidester-Gehalt im Reaktanden vor und nach der erfindungsgemäßen enzymatischen Behandlung, z. B. chromatographisch wie in den Beispielen beschrie- ben, bestimmt und daraus den Anteil hydrolysierter Ester bestimmt.

Der im Verfahren eingesetzte esterhaltige"Reaktand"kann von natürlichen oder gene- tisch veränderten, rekombinanten Organismen abgeleitet sein. Der Reaktand kann dabei aus dem gesamten Organismus oder einem Teil (z. B. Blütenblättern) oder einer M/44120-PCT

Fraktion (z. B. erhalten nach Homogenisierung oder Zellaufschluss und anschließende Fraktionierung) davon stammen.

Der"Carotinoidgehalt"eines Reaktanden ist definiert als die Menge an Gesamtcaroti- noiden, bestimmt durch photometrische Messung nach der Methode von Lichtenthaler (Methods Enzymology 148,350-382, 1987).

Der"Carotinoidestergehalt"ist definiert als die Menge an Carotinoiden, die mit einer gesättigten oder ein-, zwei-oder dreifach ungesättigten C1024-, vorzugsweise C12-20- oder C1420-Monocarbonsäure verestert sind. Der Gehalt an Carotinoidestern kann un- ter anderem chromatographisch ermittelt werden, da Carotinoidester bei geeigneten "reverse phase"-Trägermaterialien, wie z. B. langkettigen polymergebundenen C30- Phasen in der Regel längere Retentionszeiten aufweisen als ungebundene Carotinoi- de. Ein geeignetes C30 Trägermaterial und geeignete Trennbedingungen sind bei- spielhaft in Beispiel 3 genannt.

Eine enzymatische Einheit (U) Lipase bedeutet diejenige Menge an Enzym, die 1,0 Microäquivalente Fettsäure aus einen Triglycerid (z. B. Glycerintripalmitat) in einer Stunde bei 37°C und pH 7,7 freisetzt.

Eine enzymatische Einheit (U) Esterase bedeutet diejenige Menge an Enzym, welche innerhalb einer Minute 1,0 Micromol Ester-Substrat bei pH 7,0 und 37°C hydrolytisch vollständig spaltet. 1 U Cholesterol Esterase bedeutet so z. B. diejenige Menge an En- zym, die unter den angegebenen Bedingungen 1 Micromol Cholesteryloleat in Gegen- wart von Taurocholat zu Cholesterin und Oleinsäure innerhalb von einer Minute um- setzt.

"Organismen"umfassen erfindungsgemäß pro-und eukaryotischen Mikroorganismen oder Pflanzen.

"Mikroorganismen"sind dabei ausgewählt unter Bakterien, Hefen, Algen oder Pilzen.

Bevorzugte Mikroorganismen sind ausgewählt unter Escherichia, Erwinia, Agrobacteri- um, Flavobacterium, Alcaligenes, Bacillus, Paracoccus, Nostoc, Cyanobakterien der Gattung Synechocystis, Candida, Saccharomyces, Hansenula, Halobacterium, Phaffia, Pichia, Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Blakeslea, Phycomyces, Fusa- rium, Haematococcus, Phaedactylum tricomatum, Volvox, Chlamydomonas, Ankistro- desmus, Chlorella, Chlorococcum, Coelastrum, Crucigenia, Dictyococcus, Hydrodicty- on, Ermosphera, Coelastrella, Botryococcus, Scenedesmus, Scotiellopsis, Protosi- phon, Euglena, Nannochloropsis, Glenodinium, Aphanocapsa, Parmotrema, Cathare/- M/44120-PCT

lus, Brevibacterium, Eremosphera, Paviova, Gordonia, Isochryis, Brydyrhizobium, Myrmecia, Neochloris, Mycobacterium oder Duna//e//a.

Erfindungsgemäß geeignete Pflanze sind ausgewählt aus den Familien Ranuncula- ceae, Berberidaceae, Begoniaceae, Papaveraceae, Cannabaceae, Chenopodiaceae, Cruciferae, Rosaceae, Fabaceae, Linaceae, Vitaceae, Brassiceae, Cucurbitaceae, Primulaceae, Caryophyllaceae, Amaranthaceae, Apocynaceae, Balsaminaceae, Gen- tianaceae, Geraniaceae, Graminae, Euphorbiaceae, Labiatae, Leguminosae, Caprifoli- aceae, Oleaceae, Tropaeolaceae, Solanaceae, Lobeliaceae, Scrophulariaceae, Com- positae, Asteraceae, Plumbaginaceae, Liliaceae, Amaryllidaceae, Rubiaceae, Poa- ceae, Polemoniaceae, Orchidaceae, Umbelliferae, Verbenaceae, Violaceae, Malva- ceae, llliaceae oder Lamiaceae.

Insbesondere sind Pflanzengattungen wie Marigold, Tagetes erecta, Tagetes patula, Acacia, Aconitum, Adonis, Arnica, Aqulegia, Aster, Astragalus, Bignonia, Calendula, Caltha, Campanula, Canna, Centaurea, Cheiranthus, Chrysanthemum, Citrus, Crepis, Crocus, Curcurbita, Cytisus, Delonia, Delphinium, Dianthus, Dimorphotheca, Doroni- cum, Eschscholtzia, Forsythia, Fremontia, Gazania, Gelsemium, Genista, Gentiana, Geranium, Gerbera, Geum, Grevillea, Helenium, Helianthus, Hepatica, Heracleum, Hisbiscus, Heliopsis, Hypericum, Hypochoeris, Impatiens, Iris, Jacaranda, Kerria, La- burnum, Lathyrus, Leontodon, Lilium, Linum, Lotus, Lycopersicon, Lysimachia, Mara- tia, Medicago, Mimulus, Narcissus, Oenothera, Osmanthus, Petunia, Photinia, Physa- lis, Phyteuma, Potentilla, Pyracantha, Ranunculus, Rhododendron, Rosa, Rudbeckia, Senecio, Silene, Silphium, Sinapsis, Sorbus, Spartium, Tecoma, Torenia, Tragopogon, Trollius, Tropaeolum, Tulipa, Tussilago, Ulex, Viola und Zinnia geeignet. b) Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Hydroly- se von Carotinoidestern, wobei man einen Carotinoidester-haltigen Reaktanden, abge- leitet von einem natürlichen oder genetisch verändertem Organismus mit einem ester- spaltenden Enzym, ausgewählt unter Carboxylsäureester-spaltenden Hydrolasen (E. C.

3.1. 1. ), bis zur im wesentlichen quantitativen hydrolytischen Esterspaltung inkubiert und das (die) gebildete (n) Carotinoid (e) gegebenenfalls aus dem Reaktionsansatz iso- liert.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens liegt die Reaktionszeit im Bereich von mehr als 1 Stunde, wie z. B. 1 bis 48,5 bis 45,10 bis 40,15 bis 35 oder 20 bis 30 Stunden. Die erforderliche Länge der Reaktion bis zur Erzielung der gewünschten im

wesentlichen quantitativen Hydrolyse kann vom Fachmann durch Probenahme und Analyse z. B. der verbrauchten Estermenge, in einfacher Weise bestimmt werden.

Erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Hydrolasen sind ausgewählt unter Lipasen (E. C. 3.1. 1.3) und Esterasen (E. C. 3.1. 1.13), sowie Gemischen davon. Bevorzugte Enzyme sind z. B. Lipasen aus Candida sp., wie z. B. Lipase Typ 7 aus Candida rugosa oder eine Cholesterin Esterase aus Pseudomonas fluorescens und Pseudomonas spec., Rinderpankrea und Schweinepankreas. Weitere bevorzugte Lipasen sind be- kannt aus Candida antarctica, Candida cylindrica, Candida cylindracea, Candida lipoly- tica, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas spec., Pseudomonas fluorescens, Pseu- domonas alcaligenes, Schweinepankreas, Schweineleber, Humicola spec., Rhizomu- cor miehei, Rhizomucor javanicus, Rhizopus arrhizus, Rhizopus japanicus, Rhizopus niveus, Rhizopus delemar, Alcaligenes spec., Penicillium roqueforti, Penicillium cyclo- pium, Carica papaya L., Mucor miehei, Aspergillus niger, Chromobacter viscosum, Thermomyces lanuginosa. Die erfindungsgemäßen Enzyme können dabei in freier (z. B. gelöster) oder immobilisierter, trägergebundener Form vorliegen. Methoden zur Enzym-Immobilisierung sind dem Fachmann geläufig und z. B. in Biotechnology, Rehm et al Hrsg., Vol. 3 VCH Verlagsgesellschaft, 2. Auflage, Kapitel 17 beschrieben.

Insbesondere ist es bevorzugt, dem Reaktionsansatz das Enzym in einer solchen Ge- samtmenge zugesetzt wird, dass die Gesamtaktivität an zugesetztem Enzym, jeweils bezogen auf den Gesamtcarotinoid-Gehalt (in pg bzw. mg) in folgendem Bereich liegt : - Lipase : mehr als 10, insbesondere mehr als 20, oder mehr als 30, wie insbesondere 50 bis 5.000 oder 50 bis 4.000 oder 50 bis 3.000 oder 500 bis 3.000 U/ug Gesamtcaro- tinoide.

- Esterase : mehr als 1, insbesondere mehr als 5, wie z. B. 10 bis 500 oder 50 bis 300 oder 100 bis 200 U/mg Gesamtcarotinoide.

Die angegebenen Gesamtenzymaktivitäten entsprechen der bei Reaktionsbeginn vor- gelegten Enzymaktivität, oder, falls die Zugabe in mehreren Portionen zu verschiede- nen Zeiten der Reaktion erfolgen sollte, der rechnerischen Summe der anfänglichen Enzymaktivitäten der zugesetzten Einzelportionen.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens wird der Carotinoidester-haltige Reak- tand in einem wasserhaltigen Reaktionsmedium mit dem esterspaltenden Enzym inku- biert, wobei die Carotinoidester gegebenenfalls in emulgierter Form im Medium vorlie- gen und wobei dem Reaktionsmedium gegebenenfalls wenigstens ein Emulgator in einer Menge zugesetzt wird, so dass das Mengen-Verhältnis von Emulgator (z. B. in

mg) zu Carotinoid (z. B. in mg) im Bereich von etwa 100 : 1 bis 2000 : 1, wie etwa in Be- reich von 500 : 1 bis 1000 : 1 liegt.

Vorzugsweise umfasst der Emulgator wenigstens eine Verbindung, ausgewählt unter Cholansäure und Derivaten davon sowie Gemischen dieser Verbindungen. Insbeson- dere ist der Emulgator eine (vorzugsweise in etwa äquimolare) Mischung von Cholsäu- re und Desoxycholsäure ist.

Zusätzlich oder anstelle des oben genannten Emulgatorsystems können im erfin- dungsgemäßen wässrigen Reaktanden andere die Löslichkeit hydrophober Carotinoi- dester verbessernder Zusätze enthalten sein. Beispiele hierfür sind Detergentien, wie z. B. Digitonin, Octylglucosid, Brij 35 (Dodecylpoly (oxyethyleneglycolether)), Genapol X- 080 (Isotridecyl (ethyleneglycolether)), Nonidet P-40 (Ethylphenolpoly (ethylen- glycolether)), Synperonic P/F 68 (Polyethyleneglycol-polypropyleneglycol-copolymer), Synperonic P/F 127 (Polyethyleneglycol-polypropyleneglycol-copolymer), Thesit (Do- decylpoly (ethyleneglycoether) n, Triton X-100 und Triton X-114 (Octylphenolpo- ly (ethyleneglycolether) n, Tween 20 und Tween 80 (Poly (oxyetheylene) n-sorbitane- monooleate), Decanoyl-N-methylglucamid (MEGA 10 ; N- (D-Gluco-2, 3,4, 5,6- pentahydroxyhexyl)-N-methyldecanamide), Deoxy-BigCHAP (N, N-bis- (3-D-glucon- amidopropyl)-deoxycholamide), n-Dodecylglucosid (1-O-n-Dodecyl-ß-D-glucopyr- anoside), n-Dodecylmaltosid (1-O-n-Dodecyl-ß-D-glucopyranosyl (1-4) a-D- glucopyranosid), HECAMEG (6-O- (N-heptyl-carbamoyl)-methyl-a-D-glucopyranosid), Octanoyl-N-Methylglucamid (MEGA 8 ; N- (D-Gluco-2, 3,4, 5, 6-pentahydroxyhexyl)-N- methyloctanamid), Sucrosemonolaurate, Taurocholsäure, Taurodeocycholsäure, Li- thiumdodecylsulfat, Natriumdodecylsulfat, CHAPS (3-((3-Cholamidopropyl) dimethyl- ammonio)-1-propan-sulfonat), CHAPSO (3-((3-Cholamidopropyl) dimethylammonio-2- hydroxy-1-propan-sulfonat), N-Dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propan-sulfonat (Sulfobetain SB12), N-Tetradecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propan-sulfonat (Sulfobe- tain SB14) oder Lösungsvermittlern.

Insbesondere kann das Reaktionsmedium ein wässrig-organisches Medium sein, wel- ches ein organisches Lösungsmittel in einem Volumenanteil von etwa 5 bis 95 Vol.-%, wie z. B. 5 bis 50 oder 5 bis 30 oder 5 bis 15 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen des Reaktionsansatzes, enthält. Das organischen Lösungsmittel ist dabei ausgewählt unter niedrig-aliphatischen Ketonen (wie Aceton), C4-C10-Alkanen (wie n-Butan, n- Pentan, n-Hexan, n-Heptan, n-Octan und die ein-oder mehrfach verzweigten Analoga davon), C1-C10-Alkanolen (insbesondere Methanol, Ethanol, n-oder iso-Propanol, n- oder tert.-Butanol), Ethern (wie Di-C2-C6-alkylethern, wie z. B. Isopropylether, oder DMSO und DMF) und aromatischen Lösungsmitteln (wie Benzol, Xylol oder Toluol)

und Gemischen davon. Bei Verwendung von Aceton ist ein Volumenanteil des Acetons im Bereich von etwa 5 bis 15 Vol.-%, insbesondere etwa 10 Vol.-%, bevorzugt.

Insbesondere wird das erfindungsgemäße Verfahren so durchgeführt, dass der Reakti- onsansatz einen pH-Wert im Bereich von etwa 6 bis 8, insbesondere 6,5 bis 7,5, auf- weist. Zur Einstellung des pH-Wertes können übliche Puffer, wie Alkaliphosphat-, Tris-, PIPES-oder HEPES-Puffer, verwendet werden. Andere geeignete Puffer sind dem Fachmann geläufig. Auswahl von Art, Konzentration und Pufferbereich obliegen dem Fachmann und können dem jeweils verwendeten Reaktionsansatz durch wenige Vor- versuche optimal angepasst werden In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Carotinoidester-haltigen Reaktanden in einem im Wesentlichen nichtwässri- gen Reaktionsmedium mit dem esterspaltenden Enzym inkubiert. Das nichtwässrige Reaktionsmedium enthält dabei wenigstens ein organisches Lösungsmittel, ausgewählt unter C4-C10-Alkanen, C1-C10-Alkanolen, Di-C2-C6-alkylethern und aromatischen Lö- sungsmittel, insbesondere solche gemäß obiger Definition.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders zur Hydrolyse eines Reak- tanden, der wenigstens einen Carotinoid-Monoester oder-Diester einer C1024-, vor- zugsweise Ci4-2o-Monocarbonsäure gemäß obiger Definition umfasst.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Reaktand abgeleitet aus natürlichen oder rekombinanten, pro-oder eukaryoti- schen Mikroorganismen oder Pflanzen oder Teilen davon. Der Reaktand wird vor- zugsweise durch Extraktion mit Hilfe eines organischen Lösungsmittels (insbesondere gemäß obiger Definition) oder Gemischen von solchen organischen Lösungsmitteln gewonnen.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Reaktion mehrstufig unter wiederholter Zugabe von Enzym erfolgt. Gewöhn- lich ist es ausreichend für eine im Wesentlichen quantitative Esterspaltung, wenn dem Reaktionsmedium in einer zweiten Stufe eine weitere Enzymportion zugesetzt wird.

Zeitpunkt und Menge kann der Fachmann in einfacher Weise bestimmen. Stellt er z. B. durch Probennahme fest, dass keine weitere Esterhydrolyse erfolgt, obwohl noch nicht umgesetzter Ester im Medium enthalten ist, so kann er eine ausreichende Menge En- zym nachdosieren. Erforderlichenfalls kann diese Nachdosierung wiederholt werden.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Enzym in trägergebundener Form eingesetzt. Beispiele geeigneter Träger sind z. B. beschrieben in Biotechnology, Vol. 3, a. a. O.) Die Reaktionstemperatur liegt erfindungsgemäß vorzugsweise im Bereich von etwa 20 bis 70 °C, je nach Temperaturoptimum des eingesetzten Biokatalysators. Beispielswei- se kann die Reaktionstemperatur im Bereich von 25 bis 45 oder 30 bis 40 °C liegen.

In einer weiteren Variante umfasst der Carotinoidester-haltige Reaktand wenigstens einen von Ketocarotinoidestern verschiedenen Carotinoidester, wenigstens einen Ke- tocarotinoidester oder Gemische von solchen Carotinoidesters und Ketocarotinoi- destern.

Insbesondere ist der Ketocarotinoidester abgeleitet von Astaxanthin.

Vorzugsweise werden die gespaltenen Carotinoide und/oder Ketocarotinoide in an sich bekannter Weise aus dem Reaktionsmedium isoliert.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann batchweise, semi-batchweise oder kontinuier- lich betrieben werden. Die Durchführung des Verfahrens kann vorteilhafterweise auch in Bioreaktoren erfolgen, wie z. B. beschrieben in Biotechnology, Vol. 3, (a. a. O.) Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft schließlich die Verwendung der in obiger Weise hergestellten Carotinoide zur Herstellung von Nahrungs-und Futtermittelzusät- zen. c) Herstellung transgener Ketocarotionidester-produzierender Tagetes-Pflanzen Es wird eine rekombinante, Ketolase-Aktivität exprimierende Tagetes Pflanze herge- stellt. Mit Hilfe dieser Ketolase wird es ermöglicht, in den ß-lononring von Carotinoiden eine Ketogruppe einzuführen. Geeignete Ketolase-kodierende Sequenzen sind aus dem Stand der Technik bekannt, wie z. B. von Haematococcus pluvialis Accession No. : D45881). Andere geeignete Gene und die Herstellung geeigneter Konstrukte sind in der DE 10258971 beschrieben, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.

Die Herstellung transgener Pflanzen kann z. B. in folgender Weise erfolgen : Tagetessamen werden sterilisiert und auf Keimungsmedium (MS-Medium ; Murashige and Skoog, Physio. Plant. 15 (1962), 473-497 ; pH 5,8, 2 % Saccharose) aufgelegt. Die Keimung erfolgt in einem Temperatur/Licht/Zeitintervall von 18 bis 28'C/20-200 gE/3

bis 16 Wochen, bevorzugt jedoch bei 21 °C, 20 bis 70 p. E, für 4 bis 8 Wochen.

Alle Blätter der sich bis dahin entwickelten in vitro Pflanzen werden geerntet und quer zur Mittelrippe geschnitten. Die dadurch entstehenden Blattexplantate mit einer Größe von 10 bis 60 mm2 werden im Verlaufe der Präparation in flüssigem MS-Medium bei Raumtemperatur für maximal 2 h aufbewahrt.

Ein beliebiger Agrobakterium tumefaciens Stamm, bevorzugt aber ein supervirulenter Stamm, wie z. B. EHA105 mit einem entsprechenden Binärplasmid (hergestellt in an sich bekannter Weise), das ein Selektionsmarkergen (bevorzugt bar oder pat) sowie ein Ketolase-Gen trägt, wird über Nacht angezogen und für die Co-Kultivierung mit dem Blattmaterial verwendet. Die Anzucht des Bakterienstammes kann wie folgt erfol- gen : Eine Einzelkolonie des entsprechenden Stammes wird in YEB (0,1 % Hefeextrakt, 0,5 % Rindfleischextrakt, 0,5 % Pepton, 0,5 % Saccharose, 0,5 % Magnesiumsulfat x 7 H20) mit 25 mg/1 Kanamycin angeimpft und bei 28°C für 16 bis 20 Stunden angezogen.

Anschließend wird die Bakteriensuspension durch Zentrifugation bei 6000 g für 10 min geerntet und derart in flüssigem MS Medium resuspendiert, dass sich eine OD600 von ca. 0,1 bis 0,8 einstellt. Diese Suspension wird für die Co-Kultivierung mit dem Blattma- terial verwendet.

Unmittelbar vor der Co-Kultivierung wird das MS-Medium, in dem die Blätter aufbe- wahrt worden sind, durch die Bakteriensuspension ersetzt. Die Inkubation der Blätt- chen in der Agrobakteriensuspension erfolgt für 30 min unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. Anschließend werden die infizierten Explantate auf ein mit Agar (z. B.

0,8 % Plant Agar (Duchefa, NL) verfestigtes MS-Medium mit Wachstumsregulatoren, wie beispielsweise 3 mg/1 Benzylaminopurin (BAP) sowie 1 mg/1 Indolylessigsäure (IAA) aufgelegt. Die Orientierung der Blätter auf dem Medium ist bedeutungslos. Die Kultivierung der Explantate findet für 1 bis 8 Tage, bevorzugt aber für 6 Tage statt, da- bei können folgende Bedingungen angewendet werden : Lichtintensität : 30 bis 80 wMol/m2 x sec, Temperatur : 22 bis 24°C, hell/dunkel Wechsel von 16/8 Stunden. An- schließend werden die co-kultivierten Explantate auf frisches MS-Medium, bevorzugt mit den gleichen Wachstumsregulatoren übertragen, wobei dieses zweite Medium zu- sätzlich ein Antibiotikum zur Unterdrückung des Bakterienwachstums enthält. Timentin in einer Konzentration von 200 bis 500 mg/l ist für diesen Zweck sehr geeignet. Als zweite selektive Komponente wird eine für die Selektion des Transformationserfolges eingesetzt. Phosphinothricin in einer Konzentration von 1 bis 5 mg/1 selektiert sehr effi- zient, aber auch andere selektive Komponenten gemäß des zu verwendenden Verfah- rens sind denkbar.

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Nach jeweils ein bis drei Wochen erfolgt der Transfer der Explantate auf frisches Medi- um bis sich Sprossknospen und kleine Sprosse entwickeln, die dann auf das gleiche Basalmedium einschließlich Timentin und PPT oder alternative Komponenten mit Wachstumsregulatoren, nämlich z. B. 0,5 mg/1 Indolylbuttersäure (IBA) und 0,5 mg/l Gibberillinsäure GA3, zur Bewurzelung übertragen werden. Bewurzelte Sprosse kön- nen ins Gewächshaus überführt werden.

Zusätzlich zu der beschriebenen Methode sind folgende vorteilhafte Modifikationen möglich : - Bevor die Explantate mit den Bakterien infiziert werden, können sie für 1 bis 12 Tage, bevorzugt 3 bis 4, auf das oben beschriebene Medium für die Co-Kultur vorinku- biert werden. Anschließend erfolgt die Infektion, Co-Kultur und selektive Regeneration wie oben beschrieben.

- Der pH Wert für die Regeneration (normalerweise 5, 8) kann auf pH 5,2 gesenkt werden. Dadurch wird die Kontrolle des Agrobakterienwachstums verbessert.

- Die Zugabe von AgNO3 (3-10 mg/l) zum Regenerationsmedium verbessert den Zustand der Kultur einschließlich der Regeneration selbst.

- Komponenten, die die Phenolbildung reduzieren und dem Fachmann bekannt sind, wie z. B. Citronensäure, Ascorbinsäure, PVP, wirken sich positiv auf die Kultur aus.

Für das gesamte Verfahren kann auch flüssiges Kulturmedium Verwendung fin- den. Die Kultur kann auch auf handelsüblichen Trägern, die auf dem flüssigen Medium positioniert werden inkubiert werden.

Aus den auf diese Weise transformierten Pflanzen werden solche mit erhöhter Ketola- se-Aktivität selektiert, vermehrt und als Ausgangsmaterial für die erfindungsgemäße Carotinoidester-Hydrolyse eingesetzt. d) Extraktionsmethoden für Carotinoidester Carotinoide und deren Ester, wie Astaxanthin und dessen Mono-und Diester, können aus den Carotinoid-haltigen Mikroorganismen, Pflanzen oder Pflanzenteilen, die gege- benenfalls vorher getrocknet und/oder zerkleinert wurden, durch organische Lösungs- mittel extrahiert werden, wie beispielsweise durch Aceton, Hexan, Methylenchlorid, M/44120-PCT

tert.-Butylmethylether oder durch Lösungsmittelgemische wie Ethanol/Hexan oder Ace- ton/Hexan. Durch unterschiedliche Mischungsverhältnisse der Lösungsmittel kann auf- grund der verschiedenen Polarität die Extraktionswirkung variiert werden. Durch eine solche Extraktion lassen sich Carotinoide und deren Ester in hoher Konzentration an- reichern.

Anschließend kann durch Ausschütteln der Carotinoide und deren Ester und chroma- tografische Auftrennung des Gemisches deren Reinheit weiter erhöht werden.

Auf diese Weise hergestellte Extrakte eignen sich besonders als Reaktand zur Durch- führung der erfindungsgemäßen Reaktion. e) Allgemeine Durchführung der Lipase-katalysierten Esterhydrolyse Zerkleinertes Ausgangsmaterial, z. B. gemörsertes Petalenmaterial, wird mit einem or- ganischen Lösungsmittel, z. B. 100% Aceton, gegebenenfalls mehrmals über einen ge- eigneten Zeitraum unter Schütteln (z. B. dreimal, jeweils etwa 15 Minuten) extrahiert.

Das Lösungsmittel wird evaporiert. Carotinoide werden anschließend in einem geeig- nete Volumen organischem Lösungsmittels, z. B. Aceton aufgenommen, mit geeigne- tem Puffer, z. B. Kaliumphosphat-Puffer (100 mM, pH7.4), verdünnt, z. B. im Verhältnis 10 : 1 (Puffer zu Lösungsmittel) und gut gemischt. Danach erfolgt gegebenenfalls die Zugabe eines geeigneten Emulgators oder Dispergators, wie z. B. Bile-Salzen, (z. B. in Mengen von 1 mg pro jug Carotinoid). Weiterhin ist die Zugabe von stabilisierenden Salzen, wie z. B. einer NaCI/CaCl2-Lösung, von Vorteil. Die Suspension wird anschlie- ßend ausreichend, z. B. für 30 Minuten bei 37°C, inkubiert. Für die enzymatische Hyd- rolyse der Carotinoidester wird dann eine Lipaselösung (z. B. Lipase Typ7 von Candida rugosa (Sigma)) zugegeben und unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Nach einer ersten Inkubationsphase, wie z. B. etwa 21 Stunden, erfolgt nochmals eine Zugabe von Lipase mit erneuter Inkubation bei 37°C, z. B. über einen Zeitraum von mindestens etwa 5 Stunden, bis zur im Wesentlichen quantitativen Hydrolyse der Ester. Die eingesetzte Gesamtmenge an Lipase beträgt z. B. etwa 500 bis 3000 U/pg Carotinoid. Anschlie- ßend werden die Carotinoide durch kräftiges Mischen (nach Zugabe von Na2S04 (was- serfrei) ) in ein organisches, mit Wasser im Wesentlichen nicht mischbares Lösungs- mittel, wie z. B. Petrolether, extrahiert. Dieses Ausschütteln wird solange wiederholt, bis die organische Phase farblos bleibt. Die organischen Fraktionen werden vereinigt und das Lösungsmittel wird evaporiert. Freie Carotinoide werden anschließend analysiert. f) Allgemeine Durchführung einer Esterase-katalysierten Esterhydrolyse

Zerkleinertes Ausgangsmaterial, z. B. gemörsertes Petalenmaterial, wird mit einem or- ganischen Lösungsmittel, z. B. 100% Aceton, gegebenenfalls mehrmals über einen ge- eigneten Zeitraum unter Schütteln (z. B. dreimal, jeweils etwa 15 Minuten) extrahiert.

Das Lösungsmittel wird evaporiert. Carotinoide werden anschließend in einem geeig- neten Volumen eines organischen Lösungsmittels, wie z. B. Aceton, aufgenommen (Absorption bei 475 nm z. B. zwischen 0,75 und 1,25) und suspendiert, z. B. durch 5- minütige Behandlung im Ultraschall-Bad. Der Carotinoid-Extrakt wird mit in einem ge- eigneten Puffer (z. B. Tris-HCI-Puffer, 50 mM ; pH 7,0) gemischt und inkubiert (z. B. 5-10 Minuten bei 37°C). Danach erfolgt die Zugabe von Esterase (z. B. einer Cholesterol- Esterase von Pseudomonas spec. oder einer Cholesterol-Esterase von Pseudomonas fluoreszens). Nach einer ersten Inkubationsphase (z. B. nach 8-12 Stunden) wird nochmals Enzym zugegeben ; die im Wesentlichen quantitative Hydrolyse der Ester erfolgt innerhalb von etwa 24 Stunden bei Inkubation bei 37°C. Die eingesetzte Ge- samtmenge an Esterase beträgt z. B. etwa 10 bis 500 U/mg Carotinoid. Nach Zugabe von Salz z. B. Na2S04 (wasserfrei) wird mit einem mit Wasser im Wesentlichen nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Petrolether, gut gemischt und zentrifugiert (z. B. 3 Minuten ; 4500g). Diese Vorgang wird gegebenenfalls mehrmals wiederholt. Die organischen Phasen werden vereinigt und evaporiert. Die gebildetenn Carotinoide werden anschließend analysiert. g) Esterhydrolyse in organischen Lösungsmittel anstelle eines wässrigen Milieus Esterhydrolysen in organischem Lössungsmittel können von Vorteil sein, da - organische Lösungsmittel das themodynamische Equilibrium verschieben kön- nen, - einige Lipasen ihr katalytisches Zentrum nur in Gegenwart einer Lipidphase o- der vermutlich in organischem Lösungsmittel exponieren, - die Verwendung von Bile-Salzen im wässrige Milieu kostenintensiv ist, - Lipasen in organischen Lösungsmitteln über lange Zeiträume (Wochen bis Mo- nate) auch bei erhöhten Temperaturen von z. B. 60°C aktiv bleiben.

Es kann die erfindungsgemäße Esterhydrolyse z. B. mit einer immobilisierte Lipase B von Candida antarctica, NOVO 435 von Novo Nordisk, in 100% n-Heptan zur Hydroly- se von Carotinoidester sogar bei erhöhten Temperaturen bis 60°C eingesetzt werden.

Es werden im Wesentlichen quantitative Hydrolyseraten beobachtet.

Als weitere brauchbare organische Reaktionsmedien sind n-Butanol, Hexan, Isooctan, Toluol, Butylether und Isopropylether denkbar.

h) Aufarbeitung der Reaktionsprodukte Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Produkt, wie z. B. Asta- xanthin, lässt sich vorteilhaft aus der wässrigen Reaktionslösung über Extraktion ge- winnen. Die Extraktion kann zur Erhöhung der Ausbeute mehrfach wiederholt werden.

Beispiele für geeignete Extraktionsmittel sind Lösungsmittel, wie Toluol, Methylenchlo- rid, Butylacetyt, Diisopropylether, Benzol, MTBE, Petrolether oder Essigester, ohne darauf beschränkt zu sein.

Wird dir Reaktion im organischen Medium durchgeführt, so ist in einem ersten Schritt die Abtrennung des Enzyms von der organischen Phase ausreichend.

Nach Einengen der so erhaltenen organischen Phase können die Produkte in der Re- gel in guten chemischen Reinheiten gewonnen werden.

Nach der Extraktion kann die organische Phase mit dem Produkt aber auch nur zum Teil eingeengt und das Produkt auskristallisiert werden. Dazu wird die Lösung vorteil- haft auf eine Temperatur von 0 °C bis 10'C abgekühlt. Die Kristallisation kann auch direkt aus der organischen Lösung erfolgen. Das auskristallisierte Produkt kann noch- mals im gleichen oder in einem anderen Lösungsmittel zur erneuten Kristallisation auf- genommen werden und nochmals kristallisiert werden.

Es ist aber auch möglich das erfindungsgemäß hergestellte Produkt weiter aufzureini- gen. Hierzu wird das produkthaltige Medium, gegebenenfalls nach dem Abtrennen des Enzyms, einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das gewünschte Produkt oder die Verunreinigungen ganz oder teilweise auf dem Chroma- tographieharz zurückgehalten werden. Diese Chromatographieschritte können nötigen- falls wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chromatographieharze ver- wendet werden. Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographie- harze und ihrer wirksamsten Anwendung bewandert.

Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindung (en) kann durch bekannte Techni- ken bestimmt werden. Diese umfassen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie, Enzymtest oder mikrobiologische Tests. Diese Analyseverfahren sind zusammenge- fasst in : Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60 : 133-140 ; Malakhova et al.

(1996) Biotekhnologiya 11 27-32 ; und Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer.

19 : 67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH : Wein- heim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547, S. 559-566,575-581 und S. 581-587 ; Michal, M/44120-PCT

G (1999) Biochemical Pathways : An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons ; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in : Labo- ratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17. i) Anwendungen der erfindungsgemäß hergestellten Produkte : Die erfindungsgemäßen Hydrolyseprodukte eignen sich insbesondere als Nahrungs- und Futtermittelzusatz. Sie fördern vor allem die Pigmentierung nach, vorzugsweise oraler, Verabreichung.

Unter"Pigmentierung"wird erfindungsgemäß vorzugsweise die Intensivierung oder Verursachung einer Farbe zumindest eines Teils eines Tieres oder Tierproduktes des pigmentierten Tieres im Vergleich zum nicht pigmentierten Tier verstanden. So bewir- ken insbesondere Astaxanthin-haltige Pigmentierstoffe die Erzeugung oder Intensivie- rung eines rosa bis rosa-roten Farbtons.

Bevorzugte Tiere, die durch die erfindungsgemäße orale Verabreichung pigmentiert werden können, sind Tiere, ausgewählt unter Fischen, Crustaceaen oder Vögeln, ins- besondere Galliformes und Anatridae. Bevorzugte Fische sind Salmoniden, insbeson- dere Lachs oder Forelle. Bevorzugte Crustaceae sind Shrimps oder Krebse. Bevorzug- te Galliformes sind Hühner, Enten oder Gänse. Bevorzugter Anatridae ist Flamingo.

Je nach pigmentiertem Tier werden vorzugsweise unter pigmentierten Tierprodukten insbesondere Fleisch für Lachs oder Forelle, Haut für Hühner, Enten oder Gänse, Fe- der für Hühner, Enten, Gänse oder Flamingo und Ei bzw. Eidotter für Hühner, Enten oder Gänse verstanden.

Die orale Verabreichung der Carotinoide an Tiere kann direkt erfolgen oder, vorzugs- weise, über orale Verabreichung von Tierfutterzubereitungen, denen zuvor das Caroti- noid beigemischt wurden. Die Carotinoide können dabei in fester oder flüssiger Form vorliegen.

Die Carotinoide können, soweit die noch enthaltenen Lösungsmittel für die entspre- chenden Tiere physiologisch unbedenklich sind, direkt der Tierfutterzubereitung oder nach Abdampfen der noch enthaltenen Lösungsmittel in Form Carotinoid-haltiger Pul- ver oder Öle eingesetzt werden. Eine vorherige Aufreinigung des erhaltenen Hydroly- seproduktes ist nicht zwingend erforderlich.

Die erhaltenen Carotinoid-haltigen Pulver oder Öle können beispielsweise in Fischöl eingearbeitet werden, auf pulverige Trägermaterialien, wie beispielsweise Weizenmehl, M/44120-PCT aufgebracht werden, oder in Alginate, Gelatine oder Lipide eingeschlossen werden.

Der Erfindung betrifft daher auch Tierfutterzubereitungen, enthaltend neben üblichen Tierfutterbestandteilen wenigstens ein erfindungsgemäßes Carotinoid-Hydrolysat.

So kann beispielsweise eine Fischfutterzubereitung weitere übliche Fischfutterkompo- nenten enthalten, wie z. B. Fischmehl und/oder andere Proteine, Öle, wie beispielswei- se Fischöle, Getreide, Vitamine, Mineralien, Konservierungsstoffe und gegebenenfalls Medikamente in üblichen Mengen.

Eine typische Fischfutterrezeptur für Forellen setzt sich beispielsweise aus folgenden Komponenten zusammen : Einwaage f. 500 kg Komponenten Geinr.-% kg Fischmehl 30, 00 150, 00 Sojavollfettbohnen 20, 00 100, 00 Weizenquellstärke 18,00 90,00 Vitamin-Prämix 0,80 4,00 Cholinchlorid (50%) 0, 20 1, 00 Weizenkleber 20, 00 100, 00 Sipernat 50S 3, 00 15, 00 Fischöl 8, 00 40, 00 Eine typische Fischfutterrezeptur für Lachse setzt sich beispielsweise aus folgenden Komponenten zusammen : Komponenten Gew.-% Fischmehl 75,00 Pflanzliches Protein 5,00 Getreide 7, 80

Vitamine/Mineralien 1,00 Antioxidantien/Konservierungsstoffe 0,20 Fischöl 11,00

Den Tierfutterzubereitungen können die erfindungsgemäßen Hydrolysate in Pulverform oder flüssig, wie z. B. als Öl beigemischt werden. Die so erhaltenen Tierfutterzuberei- tungen können in an sich bekannter Weise pelletiert oder besonders vorteilhaft extru- diert werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Carotinoid-haltigen Präparate den Tierfutterzubereitungen vorzugsweise in flüssiger Form beigemischt. Dies ist insbeson- dere vorteilhaft bei der Herstellung von extrudierten Futterzubereitungen. Der Extrusi- onsprozess führt zu Extrusionsstress auf die empfindliche Stoffe, wie beispielsweise Astaxanthin, der zu einem Astaxanthinverlust führen kann. Bei Extrusionsstress han- delt es sich primär um die Einwirkung mechanische Kräfte (Kneten, Scherung, Druck, etc. ) jedoch auch um hydrothermischen Stress, verursacht durch Wasser-und Was- serdampfzugaben, auch oxidativer Stress ist zu beobachten.

Um die durch den oben beschriebenen Extrusionsprozess auftretende Stoffverluste zu vermeiden, können flüssige Carotinoid-haltige Extrakte durch die sogenannte PPA- Technik nach dem Extrusions-und Trocknungsprozess unter Vakuum appliziert wer- den (post pelleting application).

Die Carotinoid-haltigen Hydrolysate können, soweit die noch enthaltenen Lösungsmit- tel für die entsprechenden Tiere physiologisch unbedenklich sind, auch direkt oral an Tiere verabreicht werden.

Die Carotinoid-haltigen Hydrolysate können aber auch erst nach Abdampfen der noch enthaltenen Lösungsmittel in Form von Pulver oder Ölen verabreicht werden.

Die erhaltenen Carotinoid-haltigen Pulver oder Öle können beispielsweise in Fischöl eingearbeitet werden, auf pulverige Trägermaterialien, wie beispielsweise Weizenmehl, aufgebracht werden, oder in Alginate, Gelatine oder Lipide eingeschlossen werden.

Der Erfindung betrifft daher auch Pigmentiermittel, enthaltend Carotinoid-haltigen Hydrolysate, wobei diese gegebenenfalls wie vorstehend beschrieben prozessiert sein können.

Experimenteller Teil Beispiel 1 : Enzymatische Cholesterol-Esterase-katalysierte Hydrolyse von Carotinoi- destern aus Pflanzenmaterial und Identifizieruna der Carotinoide Allgemeine Arbeitsvorschrift Gemörsertes Pflanzenmaterial (z. B. Petalenmaterial) (50 bis 100 mg Frischgewicht) wird mit 100 % Aceton (dreimal 500 ul ; jeweils etwa 15 Minuten schütteln) extrahiert.

Das Lösungsmittel wird evaporiert. Carotinoide werden anschließend in 400 NI Aceton aufgenommen (Absorption bei 475 nm zwischen 0.75 und 1,25) und 5 min im Ultra- schall-Bad behandelt. Der Carotinoid-Extrakt wird mit 300 nui 50 mM Tris-HCI-Puffer (pH 7,0) gemischt und 5 bis 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach erfolgt die Zugabe von 100 bis 200 ml Cholesterol-Esterase (Stammlösung : 6,8 U/ml einer Cholesterol- Esterase von Pseudomonas spec. ). Nach 8 bis 12 Stunden wird nochmals 100 bis 200 pl Enzym zugegeben ; Hydrolyse der Ester erfolgt innerhalb von 24 Stunden bei Inku- bation bei 37°C. Nach Zugabe 0.35 g Na2S04x10H20 und 500 pl Petrolether wird gut gemischt und zentrifugiert (3 Minuten ; 4500 g). Petrolether-Phase wird abgezogen und nochmals mit 0,35 g Na2S04 (anhydrous) gemischt. Zentrifugation für 1 Minute bei 10000 g. Petrolether wird evaporiert und freie Carotinoide werden in 100 bis 120 ml Aceton aufgenommen. Mittels HPLC und C30-reverse phase-Säule können freie Caro- tinoide aufgrund von Retentionszeit und UV-VIS-Spektren identifiziert werden.

Beispiel 2 : Enzymatische Lipase-katalysierte Hydrolyse von Carotinoidestern aus Pflanzenmaterial und Identifizierung der Carotinoide Allgemeine Arbeitsvorschrift a) Gemörsertes Pflanzenmaterial (z. B. Petalenmaterial) (30-100 mg Frischgewicht) wird mit 100% Aceton (dreimal 500pal ; jeweils etwa 15 Minuten schütteln) extrahiert.

Das Lösungsmittel wird evaporiert. Carotinoide werden anschließend in 495 pl Aceton aufgenommen, 4,95 ml Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH7.4) zugegeben und gut gemischt. Danach erfolgt die Zugabe von ca. 17 mg Bile-Salze (Sigma) und 149 NI ei- ner NaCI/CaCl2-Lösung (3M NaCI und 75 mM CaCiz). Die Suspension wird für 30 Mi- nuten bei 37°C inkubiert. Für die enzymatische Hydrolyse der Carotinoidester wird 595 NI einer Lipaselösung (50 mg/ml Lipase Typ7 von Candida rugosa (Sigma)) zugegeben und unter Schütteln bei 37C inkubiert. Nach etwa 21 Stunden erfolgte nochmals eine Zugabe von 595 Ll Lipase mit erneuter Inkubation von mindestens 5 Stunden bei 37°C.

Anschließend werden etwa ca. 700 mg Na2S04 in der Lösung gelöst. Nach Zugabe M/44120-PCT

von 1800 ul Petrolether werden die Carotinoide durch kräftig Mischen in die organische Phase extrahiert. Dieses Ausschütteln wird solange wiederholt, bis die organische Phase farblos bleibt. Die Petroletherfraktionen werden vereinigt und der Petrolether evaporiert. Freie Carotinoide werden in 100-120 NI Aceton aufgenommen. Mittels HPLC und C30-reverse phase-Säule können freie Carotinoide aufgrund von Retenti- onszeit und UV-VIS-Spektren identifiziert werden.

Die verwendeten Bile-Salze oder Gallensäuresalze sind 1 : 1 Mischungen von Cholat und Desoxycholat. b) Arbeitsvorschrift für Aufarbeitung, wenn nur geringe Mengen an Carotinoidestern im Pflanzenmaterial vorhanden sind Alternativ kann die Hydrolyse der Carotinoidester durch Lipase aus Candida rugosa nach Trennung mittels Dünnschichtchromatographie erreicht werden. Dazu werden 50- 100mg Pflanzenmaterial dreimal mit etwa 750, ul Aceton extrahiert. Der Lösungsmit- telextrakt wird im Vakuum einrotiert (erhöhte Temperaturen von 40-50°C sind tolera- bel). Danach erfolgt Zugabe von 300111 Petrolether : Aceton (Verhältnis 5 : 1) und gute Durchmischung. Schwebstoffe werden durch Zentrifugation (1-2 Minuten) sedimentiert.

Die obere Phase wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Das verbleibende Rest wird erneut mit 200u1 Petrolether : Aceton (Verhältnis 5 : 1) extrahiert und Schwebstoffe werden durch Zentrifugation entfernt. Die beiden Extrakte werden zusammengeführt (Volumen 500p1) und die Lösungsmittel evaporiert. Der Rückstand wird in 30, u1 Petrol- ether : Aceton (Verhältnis 5 : 1) resuspendiert und auf eine Dünnschichtplatte (Silica-Gel 60, Merck) aufgetragen. Falls mehr als eine Auftragung für präparativ-analytische Zwe- cke erforderlich ist, sollten mehrere Aliquots mit jeweils 50-100 mg Frischgewicht in der beschriebenen Weise für die dünnschichtchromatographische Trennung aufbereitet werden.

Die Dünnschichtplatte wird in Petrolether : Aceton (Verhältnis 5 : 1) entwickelt. Caroti- noidbanden können visuell aufgrund ihrer Farbe identifiziert werden. Einzelne Caroti- noidbanden werden ausgekratzt und können für präparativ-analytische Zwecke gepoolt werden. Mit Aceton werden die Carotinoide vom Silica-Material eluiert ; das Lösungs- mittel wird im Vakuum evaporiert. Zur Hydrolyse der Carotinoidester wird der Rück- stand in 495NI Aceton gelöst, 17mg Bile-Salze (Sigma), 4, 95m10. 1 M Kaliumphosphat- puffer (pH 7,4) und 149p. 1 (3M NaCI, 75mM Cal2) zugegeben. Nach guter Durchmi- schung wird 30min bei 37°C äquilibriert. Danach erfolgt die Zugabe von 595, 1 Lipase von Candida rugosa (Sigma, Stammlösung von 50mg/ml in 5mM Cal2). Über Nacht erfolgt die Inkubation mit Lipase unter Schütteln bei 37°C. Nach etwa 21 Stunden wird nochmals die gleiche Menge an Lipase zugegeben ; für mindestens 5 Stunden wird M/44120-PCT

nochmals bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Dann erfolgt die Zugabe von 700mg Na2S04 (wasserfrei) ; mit 1800111 Petrolether wird für ca. 1 Minute ausgeschüttelt und die Mischung bei 3500 Umdrehungen/Minute für 5 Minuten zentrifugiert. Die obere Phase wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt und das Ausschütteln so lange wie- derholt, bis die obere Phase farblos ist. Die vereinigte Petrolether-Phase wird im Vaku- um eingeengt (Temperaturen von 40-50°C sind möglich). Der Rückstand wird in 120p1 Aceton, eventuell mittels Ultraschall, gelöst. Die gelösten Carotinoide können mittels HPLC unter Verwendung einer C30-Säule getrennt und anhand von Referenzsubstan- zen quantifiziert werden.

Obige Angaben in den Beispielen 1 und 2 sind entsprechend auf Algenmaterial über- tragbar.

Beispiel 3 : HPLC-Analyse freier Carotinoide Die Analyse der nach der Arbeitsvorschrift von Beispiel 1 und 2 erhaltenen Proben erfolgt unter folgenden Bedingungen : Folgende HPLC-Bedingungen wurden eingestellt.

Trennsäule : Prontosil C30-Säule, 250 x 4,6 mm, (Bischoff, Leonberg, Germany) Flussrate : 1.0 ml/min Eluente : Laufmittel A-100% Methanol Laufmittel B-80% Methanol, 0.2% Ammoniumacetat Laufmittel C-100% t-Butyl-methylether Detektion : 300-530 nm Gradientenprofil : Zeit Flussrate % Laufmittel A % Laufmittel B % Laufmittel C 1.00 1.0 95.0 5.0 0 12. 00 1.0 95.0 5.0 0 12. 10 1. 0 80. 0 5. 0 15. 0 22. 00 1. 0 76. 0 5. 0 19. 0 22. 10 1. 0 66. 5 5. 0 28. 5 38. 00 1. 0 15. 0 5. 0 80. 0 45. 00 1. 0 95. 0 5. 0 0 46. 0 1. 0 95. 0 5. 0 0 Einige typische Retentionszeiten für erfindungsgemäß gebildete Carotinoide sind z. B. :

Violaxanthin 11,7 min, Astaxanthin 17,7 min, Adonixanthin 19 min, Adonirubin 19,9 min, Zeaxanthin 21 min.

Einige typische Retentionszeiten-Bereiche für erfindungsgemäß gebildete Carotinoi- deester sind : Bei Haematococcus sind die Carotinoide am häufigsten mit Palmitat, Oleat, Linolat und Linolenat verestert. Typische Retentionszeiten liegen bei 28 bis 40 Minuten.

Bei Tagetes sind die häufigsten Carotinoidester Dipalmitate, Myristat-Palmitate, Palmi- tat-Stearate und Dimyristate vertreten ; die Monoester sind deutlich seltener. Typische Retenstionszeiten liegen bei 28 bis 38 Minuten.

Die Carotinoidester in Paprika tragen Fettsäuren der Längen C,2 bis C16 wie z. B. Lau- rinsäure, Myristinsäure und Palmitinsäure. Am häufigsten kommen in rotem Paprika Carotiniode verestert mit Linolsäure, Palmitinsäure und Linolensäure vor. Typische Retenstionszeiten liegen bei 28 bis 40 Minuten.

Bei Adonis sind die Carotinoide am häufigsten mit Oleat, Palmitat, Myristat, Linoleat und Laureat verestert. Typischen Retentionszeiten liegen bei 28 bis 38 Minuten.

Beispiel 4 : Lipase-katalysierte Esterhydrolyse mit verschiedenen Carotinoidester- Quellen Unter Befolgung der allgemeinen Lehre von Beispiel 2a werden Carotinoidester- Extrakte aus folgenden pflanzlichen Quellen bzw. Algen hergestellt und hydrolysiert : Paprika (Capsicum annuum 1.) Adonis (Adonis aestivalis) Tagetes (Tagetes erecta) BioAstin (Haematococcus pluvialis) Außerdem wurde der Emulgatorgehalt (Gehalt an Bile Salzen) bei verschiedenen Ex- perimenten variiert.

Die ermittelten Hydrolyseraten sind in folgender Tabelle zusammengefasst : Hydrolyseraten für verschiedene Esterquellen

Quelle Lipase Emulgator Hydrolyserate Abnahme der [U/pg [mg/mg Caroti- [%] Hydrolyserate Carotinoid] noid] um [%] Paprika 2400 900 89 450 = [50%] 5 Tagetes 2700 800 95 560 = [70%] 7,4 400 =[50%] 15 200 =[25%] 10 ohne 11,5 Adonis 700 ohne 96 bis 99 BioAstin 2200 800 95 Spezifische Aktivität der eingesetzten Lipase aus Candida rugosa : 819 U/mg Protein.

Die Hydrolyseraten sind bezogen auf die Gesamtmenge an Ester. Dies sind bei Adonis und Haematococcus fast ausschließlich Ketocarotinoidester, bei Tagetes und Paprika ausschließlich Carotinoidester.