TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung bezieht sich auf ein mikroskopisches Verfahren zum Abbilden einer mit Fluoreszenzmarkern verschiedenen markierten Struktur einer Probe. Solche mikroskopischen Verfahren werden auch als Mehrfarbenmikroskopie bezeichnet. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Abbilden einer mit ersten Fluoreszenzmarkern und schaltbaren zweiten Fluoreszenzmarkern markierten Struktur einer Probe, das die Merkmale des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 aufweist. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf ein Laserscanningmikroskop zur Durchführung eines solchen Verfahrens, insbesondere mit den Merkmalen des Oberbegriffs des Patentanspruchs 6.

STAND DER TECHNIK

In der konventionellen oder der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie können Verteilungen verschiedener Fluoreszenzmarker, die bei unterschiedlichen Wellenlängen angeregt und/oder detektiert werden können, relativ einfach getrennt abgebildet werden. In der Mehrfarben-STED- Mikroskopie, in der eine Lichtverteilung, mit der eine Probe abgetastet wird, neben Anregungslicht zusätzliches Fluoreszenzverhinderungslicht aufweist, ergeben sich jedoch Schwierigkeiten, da für alle Fluoreszenzmarker sowohl ein Anregungslaser passend zum jeweiligen Anregungsspektrum als auch ein STED-Laser für die Abregung durch stimulierte Emission passend zum jeweiligen Fluoreszenzemissionsspektrum benötigt wird. Viele spektral unterschiedliche STED- Laser parallel einzusetzen, ist einerseits sehr teuer und zudem mit dem Nachteil verbunden, dass die für die kurzwelliger emittierenden Fluoreszenzmarker benötigte hohe Leistung des STED- Lasers, die längerwellig emittierenden Fluoreszenzmarker bleicht. ln kommerziell erhältlichen STED-Mikroskopen wird daher für verschiedene Fluoreszenzmarker nur ein STED-Laser verwendet. Dies ist zum Beispiel dann möglich, wenn die Emissionsspektren der verschiedenen Fluoreszenzmarker nur wenig, d. h. typischerweise zwischen 20 nm und 100 nm, zueinander versetzt sind. Die verschiedenen Fluoreszenzmarker werden dann mit Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlängen von verschiedenfarbigen Lasern angeregt, jeweils kombiniert mit dem Fluoreszenzverhinderungslicht von demselben STED-Laser, und das Fluoreszenzlicht von den verschiedenen Fluoreszenzmarkern wird in spektral getrennten Kanälen detektiert. Die kurzwelliger emittierenden Fluoreszenzmarker werden dabei etwas schlechter durch stimulierte Emission abgeregt und entsprechend mit etwas schlechterer Auflösung abgebildet als die langwelliger emittierenden Fluoreszenzmarker. Grundsätzlich bekannt ist überdies die Verwendung zweier unterschiedlicher Fluoreszenzmarker, die sich aufgrund unterschiedlicher Stokes-Verschiebungen im Wesentlichen nur hinsichtlich ihrer Anregungsspektren unterscheiden, so dass sie mit Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlängen selektiv angeregt werden können, während ihre Emissionsspektren im Wesentlichen deckungsgleich sind, so dass sie mit Fluoreszenzverhinderungslicht von demselben STED-Laser in gleichem Maße durch stimulierte Emission abgeregt werden. Neben der spektralen Trennung des Fluoreszenzlichts von verschiedenen Fluoreszenzmarkern ist eine Trennung aufgrund unterschiedlicher Fluoreszenzlebensdauern mit Hilfe spezieller zeitlich hoch auflösender Detektoren bekannt.

Für die STED-Mikroskopie an lebenden Zellen, d. h. in vivo, werden größtenteils fluoreszierende Proteine als Fluoreszenzmarker verwendet, da diese von den Zellen oder dem Organismus nach Transfektion mit einer entsprechenden DNS selbst hergestellt werden können. Darüber hinaus gibt es organische, zellpermeable Fluorophore, die mit Hilfe sogenannter SNAP- oder HALO- Tags an ein Zielprotein gebunden und somit in der in v/Vo-STED-Mikroskopie verwendet werden können. Die Anzahl solcher organischer zellpermeabler Fluoreszenzmarker ist jedoch nur klein. Die überwiegende Verwendung von fluoreszierenden Proteinen als Fluoreszenzmarker schränkt die Mehrfarben-/n v/Vo-STED-Mikroskopie stark ein. Fluoreszierende Proteine mit großer Stokes- Verschiebung existieren kaum bzw. sind für eine Verwendung in der STED-Mikroskopie nicht ausreichend photostabil, so dass sie zu schnalle bleichen. Die Lebensdauern fluoreszierender Proteine unterscheiden sich kaum, was eine Trennung des Fluoreszenzlichts aufgrund ihrer unterschiedlichen Fluoreszenzlebensdauern unmöglich macht. Daher werden in der in vivo- STED-Mikroskopie häufig spektral eng beieinander liegende erste und zweite Fluoreszenzmarker verwendet. Als geeignet hat sich die Kombination von EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) und EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) mit einer Anregungswellenlänge und zwei Detektionskanälen oder mit zwei Anregungswellenlängen und zwei Detektionskanälen erwiesen.

Bei der Verwendung aus Willig, K.I., et al.: Dual-label STED nanoscopy of living cells using photochromism, Nano Lett. 11 (2011) 3970-3973. doi:10.1021/nl202290w, ist ein Verfahren der Mehrfarben-STED-Mikroskopie bekannt, bei dem erste und zweite reversibel schaltbare Fluoreszenzproteine verwendet werden. Diese photochromen Fluoreszenzproteine können mit Schaltlicht zwischen einem fluoreszenten Zustand und einem nicht fluoreszenten Dunkelzustand hin und her geschaltet werden. Konkret werden zwei Proteine, die mit denselben Wellenlängen aber in entgegengesetzten Richtungen zwischen ihren fluoreszenten Zuständen und Dunkelzuständen geschaltet werden können, kombiniert. Konkret beschrieben wird die Verwendung der Fluoreszenzproteine Padron und Dronpa-M159T. Die Emissionsspektren dieser beiden Fluoreszenzproteine ist sehr ähnlich, so dass dieselbe STED-Wellenlänge für die stimulierte Emission verwendet werden kann. Dieses bekannte Verfahren der Mehrfarben-STED- Mikroskopie kann mit einem Einfarben-STED-Mikroskop umgesetzt werden, welches um einen 405 nm Laser für das Schaltlicht ergänzt ist. Daneben ist nur ein 488 nm Laser für das Anregungslicht, ein 595 nm STED-Laser für das Fluoreszenzverhinderungslicht und ein einziger Detektionskanal mit einem einzigen Detektor erforderlich. Nacheinander werden zwei monochromatische Abbildungen der Verteilungen der ersten Fluoreszenzmarker einerseits und der zweiten Fluoreszenzmarker andererseits aufgenommen. Die Detektion des Fluoreszenzlichts in dem einzelnen Kanal kann spektral breiter gewählt werden, weil darin keine spektrale Trennung zwischen den verschiedenen Fluoreszenzmarkern durchgeführt wird. Wenn jedoch nacheinander die ersten Fluoreszenzmarker und dann die zweiten Fluoreszenzmarker in einer lebenden Probe abgebildet werden, können sich die Strukturen in der Probe zwischen den einzelnen Aufnahmen bewegen. Somit ist eine Kolokalisierung der verschiedenen Fluoreszenzmarker nicht eindeutig möglich. Um die verschiedenen Fluoreszenzmarker annähernd gleichzeitig aufzunehmen, müsste zwischen den einzelnen Pixeln zwischen den verschiedenen Fluoreszenzmarkern hin und her geschaltet werden. Da aber der Schaltvorgang pro Pixel deutlich langsamer als die Bildaufnahmezeit pro Pixel ist, würde dieses Schalten die Bildaufnahmezeit um ein Vielfaches verlängern. Das aus Willig, K.I., et al. (2011) bekannte Verfahren ist somit für die in v/Vo-STED- Mikroskopie nicht geeignet. AUFGABE DER ERFINDUNG

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Abbilden einer mit verschiedenen Fluoreszenzmarkern markierten Struktur einer Probe sowie ein entsprechendes Laserscanningmikroskop zur Durchführung des Verfahrens aufzuzeigen, die für Mehrfarben-/n v/ o-STED- Mikroskopie geeignet sind.

LÖSUNG

Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 und durch ein Laserscanningmikroskop mit den Merkmalen des Patentanspruchs 6 gelöst. Die abhängigen Patentansprüche 2 bis 4 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens und die abhängigen Patentansprüche 7 bis 10 bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Laserscanningmikroskops.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Abbilden einer mit ersten und zweiten Fluoreszenzmarkern markierten Struktur einer Probe, von denen zumindest die zweiten Fluoreszenzmarker schaltbar sind. Die Probe wird an verschiedenen ersten Positionen mit einer erstes Anregungslicht umfassenden ersten Lichtintensitätsverteilung beaufschlagt, um die ersten Fluoreszenzmarker jeweils in einem räumlich begrenzten ersten Bereich zur Emission von erstem Fluoreszenzlicht anzuregen. Dabei wird das erste Fluoreszenzlicht registriert und der jeweiligen ersten Position zugeordnet. Dann wird die Probe mit erstem Schaltlicht beaufschlagt, um die zweiten Fluoreszenzmarker aus einem Dunkelzustand in einen zweiten fluoreszenten Zustand zu schalten, und die Probe wird an verschiedenen zweiten Positionen mit einer zweites Anregungslicht umfassenden zweiten Lichtintensitätsverteilung beaufschlagt, um die zweiten Fluoreszenzmarker in dem zweiten fluoreszenten Zustand jeweils in einem räumlich begrenzten zweiten Bereich zur Emission von zweitem Fluoreszenzlicht anzuregen. Das zweite Fluoreszenzlicht wird registriert und der jeweiligen zweiten Position zugeordnet. Dabei wird die Probe an den verschiedenen ersten Positionen, die in einen von mehreren nebeneinander liegenden linienförmigen Abtastbereichen fallen, mit der ersten Lichtintensitätsverteilung beaufschlagt, in diesem gesamten einen linienförmigen Abtastbereich zumindest quasi gleichzeitig mit dem ersten Schaltlicht beaufschlagt und an den verschiedenen zweiten Positionen, die in diesen einen linienförmigen Abtastbereich fallen, mit der zweiten Lichtintensitätsverteilung beaufschlagt, bevor die Probe dann in einem nächsten der nebeneinander liegenden linienförmigen Abtastbereiche mit der ersten Lichtintensitätsverteilung beaufschlagt wird. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Schaltlicht also weder bildweise noch pixelweise, sondern zeilenweise auf die Probe aufgebracht, wobei die Probe in dem jeweiligen gesamten linienförmigen Abtastbereich zumindest quasi gleichzeitig mit dem ersten Schaltlicht beaufschlagt wird. So wird die Dauer des Schaltvorgangs für diesen linienförmigen Abtastbereich oder diese Zeile minimiert und nicht etwa auf die Dauer des Schaltvorgangs pro Pixel multipliziert mit der Anzahl der Pixel der jeweiligen Zeile verlängert. Daher tritt nur eine relativ kurze Verzögerung zwischen der Aufnahme der jeweiligen Zeile des Bilds der ersten Fluoreszenzmarker und der zweiten Fluoreszenzmarker auf, und die Aufnahmezeit für die gesamte interessierende Struktur der Probe wird durch das Schalten zwischen dem Abtasten des jeweiligen linienförmigen Abtastbereichs, d. h. der jeweiligen Zeile, mit der ersten und der zweiten Lichtintensitätsverteilung nicht wesentlich verlängert.

Soweit hier und im Folgenden sowie den Patentansprüchen irgendwelche Merkmale mit den adjektivischen Zahlworten erste/erster/erstes, zweite/zweiter/zweites oder dritte/dritter/drittes versehen sind, so dienen diese Zahlworte nicht dazu, eine Rang- oder Reihenfolge ansonsten gleich bezeichneter Merkmale zum Ausdruck zu bringen. Die adjektivischen Zahlworte dienen nur dazu, die ansonsten gleich bezeichneter Merkmale untereinander zu unterscheiden. Diese Unterscheidung bedeutet aber nicht, dass sich die Merkmale in irgendeiner Art und Weise unterscheiden müssen, soweit dies nicht zusätzlich zu dem Zahlwort angegeben ist. Beispielsweise können die ersten und die zweiten Positionen und die ersten und die zweiten Lichtintensitätsverteilung als solche gleich oder unterschiedlich sein.

Grundsätzlich kann die Probe in dem jeweiligen linienförmigen Abtastbereich durch wiederholtes schnelles Überfahren des jeweiligen linienförmigen Abtastbereichs mit dem punktförmig fokussierten Schaltlicht zumindest quasi gleichzeitig beaufschlagt werden. Vorzugsweise erfolgt die Beaufschlagung des gesamten einen linienförmigen Abtastbereichs mit dem Schaltlicht aber nicht nur quasi sondern tatsächlich gleichzeitig, indem der jeweilige linienförmige Abtastbereich durch eine erste Zylinderlinse hindurch mit dem ersten Schaltlicht beaufschlagt wird.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Abbilden einer Probe, die weiterhin mit dritten Fluoreszenzmarkern markiert ist, wobei sich die ersten Fluoreszenzmarker, die zweiten Fluoreszenzmarker und die dritten Fluoreszenzmarker in ihren Anregungs- und Emissionsspektren unterscheiden, wird die Probe, bevor die Probe in dem gesamten einen linienförmigen Abtastbereich zumindest quasi gleichzeitig mit dem Schaltlicht beaufschlagt wird, an verschiedenen dritten Positionen, die in den einen linienförmigen Abtastbereich fallen, mit einer drittes Anregungslicht umfassenden dritten Lichtintensitätsverteilung beaufschlagt, um die dritten Fluoreszenzmarker jeweils in einem räumlich begrenzten dritten Bereich zur Emission von drittem Fluoreszenzlicht anzuregen, wobei sich eine erste Anregungswellenlänge des ersten Anregungslichts und eine dritte Anregungswellenlänge des dritten Anregungslichts unterscheiden. Das dritte Fluoreszenzlicht wird registriert und der jeweiligen dritten Position zugeordnet. Für diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zwischen den ersten Fluoreszenzmarkern und den dritten Fluoreszenzmarkern spektral unterschieden, und zwar zumindest durch unterschiedliche erste und dritte Anregungswellenlängen. Eine weitere spektrale Unterscheidung kann bei der Detektion des ersten und dritten Fluoreszenzlichts in spektral verschiedenen Detektionskanälen vorgenommen werden.

Eine andere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens geht von einer Probe aus, in der die ersten Fluoreszenzmarker ebenfalls schaltbar sind. In dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Probe mit dem ersten Schaltlicht nicht nur beaufschlagt, um die zweiten Fluoreszenzmarker aus ihrem zweiten Dunkelzustand in ihren zweiten fluoreszenten Zustand zu schalten, sondern auch, um die ersten Fluoreszenzmarker aus einem ersten fluoreszenten Zustand in einen ersten Dunkelzustand zu schalten. Außerdem wird die Probe, bevor die Probe in dem nächsten der nebeneinander liegenden linienförmigen Abtastbereiche mit der ersten Lichtintensitätsverteilung beaufschlagt wird, in dem nächsten linienförmigen Abtastbereich mit zweitem Schaltlicht einer sich von einer ersten Schaltwellenlänge des ersten Schaltlichts unterscheidenden zweiten Schaltwellenlänge beaufschlagt, um die ersten Fluoreszenzmarker in den ersten fluoreszenten Zustand und die zweiten Fluoreszenzmarker in den zweiten Dunkelzustand zu schalten. Auch dieses Beaufschlagen erfolgt zumindest quasi gleichzeitig in dem gesamten nächsten linienförmigen Abtastbereich. Vorzugsweise erfolgt es, indem die Probe in dem jeweiligen nächsten linienförmigen Abtastbereich durch die erste oder eine zweite Zylinderlinse hindurch mit dem zweiten Schaltlicht beaufschlagt wird.

In allen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens können das erste und das zweite Fluoreszenzlicht unter Verwendung eines selben Detektors registriert werden. Wenn insgesamt nur erstes und zweites Fluoreszenzlicht registriert wird, reicht auch insgesamt ein einziger Detektor aus. Dies ist möglich, weil zwischen den ersten und den zweiten Fluoreszenzmarkern mit Hilfe des Schaltlichts unterschieden wird. Wenn auch dritte Fluoreszenzmarker vorhanden sind, kann auch für diese derselbe Detektor verwendet werden, soweit eine ausreichende spektrale Unterscheidung mit Hilfe des Anregungslichts möglich ist. Sonst sind mehrere spektral verschiedene Detektionskanäle vorzusehen. Wenn mit dem ersten Schaltlicht ausschließlich die zweiten Fluoreszenzmarker ein- aber nicht zugleich die ersten oder ersten und zweiten Fluoreszenzmarker ausgeschaltet werden, kann das zweite Fluoreszenzlicht auch dadurch separiert werden, dass von der nach dem ersten Schaltlicht ermittelten Intensitätsverteilung des Fluoreszenzlichts über den jeweiligen linienförmigen Bereich die vor dem ersten Schaltlicht ermittelte Intensitätsverteilung des Fluoreszenzlichts abgezogen wird.

Da zwischen den ersten und den zweiten Fluoreszenzmarkern zumindest durch das erste Schaltlicht unterschieden wird, dass die zweiten Fluoreszenzmarker einschaltet, können weiterhin das erste und das zweite Anregungslicht eine gleiche Anregungswellenlänge aufweisen. Dann ist keine zusätzliche Anregungslichtquelle für das zweite Anregungslicht erforderlich.

Besonders bevorzugt sind Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei denen die Lichtintensitätsverteilungen jeweils eine Teillichtintensitätsverteilung von Fluoreszenzverhinderungslicht aufweisen, so dass es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um ein solches der STED-Mikroskopie handelt. Vorzugsweise weist das Fluoreszenzverhinderungslicht bei allen Lichtintensitätsverteilungen eine gleiche Fluoreszenzverhinderungswellenlänge auf, so dass keine unterschiedlichen Fluoreszenzverhinderungslichtquellen für die verschiedenen Fluoreszenzmarker benötigt werden, sondern ein STED-Laser ausreicht.

Bei den STED-Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens können die erste und die zweite Lichtintensitätsverteilung vollständig übereinstimmen.

Bei allen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die erste Schaltwellenlänge des ersten Schaltlichts gleich der ersten und/oder der zweiten Anregungswellenlänge sein. Auch dann unterscheiden sich das erste Schaltlicht und das erste und/oder das zweite Anregungslicht bzgl. ihrer Lichtintensitätsverteilung in der Probe. Die Lichtintensitätsverteilungen des ersten und des zweiten Anregungslichts sind punktförmig. Die Lichtintensitätsverteilung des ersten Schaltlichts ist zumindest quasi linienförmig. Darüber hinaus werden Unterschiede bei der Intensität gegeben sein. Vorzugsweise stimmen bei allen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens die Positionen aller Lichtintensitätsverteilungen in dem jeweiligen linienförmigen Abtastbereich überein, so dass die entsprechenden Pixel der aufgenommenen Bilder der verschiedenen Fluoreszenzmarker in der Probe deckungsgleich sind.

Ein erfindungsgemäßes Laserscanningmikroskop zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens weist ein Objektiv, einen Scanner, eine erste Lichtquelle, eine erste Schaltlichtquelle, evtl, eine zweite Lichtquelle und eine Detektoranordnung auf. Der Scanner kann die Probe gegenüber dem Objektiv verlagern und/oder das Licht zwischen den Lichtquellen, der Schaltlichtquelle und der Detektionseinrichtung einerseits und dem Objektiv andererseits ablenken. Die erste Lichtquelle ist dazu ausgebildet und angeordnet, die Probe durch das Objektiv und mit Hilfe des Scanners an verschiedenen ersten Positionen mit einer erstes Anregungslicht umfassenden ersten Lichtintensitätsverteilung zu beaufschlagen, um die ersten Fluoreszenzmarker jeweils in einem räumlich begrenzten ersten Bereich zur Emission von erstem Fluoreszenzlicht anzuregen. Die erste Schaltlichtquelle ist dazu ausgebildet und angeordnet, die Probe durch das Objektiv mit erstem Schaltlicht zu beaufschlagen, um die zweiten Fluoreszenzmarker in einen zweiten fluoreszenten Zustand zu schalten. Die erste oder die zweite Lichtquelle ist dazu ausgebildet und angeordnet, die Probe durch das Objektiv mittels des Scanners an verschiedenen zweiten Positionen mit einer zweites Anregungslicht umfassenden zweiten Lichtintensitätsverteilung zu beaufschlagen, um die zweiten Fluoreszenzmarker in dem zweiten fluoreszenten Zustand jeweils in einem räumlich begrenzten zweiten Bereich zur Emission von zweitem Fluoreszenzlicht anzuregen. Die Detektoranordnung ist dazu ausgebildet und angeordnet, das erste und das zweite Fluoreszenzlicht zu registrieren und der jeweiligen ersten oder zweiten Position zuzuordnen. Die Lichtquelle(n) und die erste Schaltlichtquelle sind weiterhin dazu ausgebildet und angeordnet, die Probe an den verschiedenen ersten Positionen, die in einem von mehreren nebeneinander liegenden linienförmigen Abtastbereichen angeordnet sind, mit der ersten Lichtintensitätsverteilung zu beaufschlagen, die Probe durch das Objektiv mittels des Scanners in dem gesamten linienförmigen Abtastbereich zumindest quasi gleichzeitig mit dem zweiten Schaltlicht zu beaufschlagen, und die Probe an den verschiedenen zweiten Positionen in dem jeweiligen linienförmigen Abtastbereich mit der zweiten Lichtintensitätsverteilung zu beaufschlagen, bevor die erste Lichtquelle die Probe durch das Objektiv mittels des Scanners an den verschiedenen ersten Positionen, die in einem nächsten der nebeneinander liegenden linienförmigen Abtastbereiche angeordnet sind, mit der ersten Lichtintensitätsverteilung beaufschlagt. ln einer bevorzugten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Laserscanningmikroskop eine erste Zylinderlinse zum Fokussieren des ersten Schaltlichts von der ersten Schaltlichtquelle in den jeweiligen linienförmigen Abtastbereich auf, die in einer ersten zur Rückapertur des Objektivs konjugierten Ebene angeordnet ist. Mit Hilfe dieser Zylinderlinse kann der jeweilige gesamte linienförmige Abtastbereich nicht nur quasi sondern tatsächlich gleichzeitig mit dem ersten Schaltlicht beaufschlagt werden.

In einer Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Laserscanningmikroskop eine dritte Lichtquelle auf, die dazu ausgebildet und angeordnet ist, die Probe, bevor die Probe in dem einen linienförmigen Abtastbereich mit dem Schaltlicht beaufschlagt wird, an verschiedenen dritten Positionen, die in dem einen linienförmigen Abtastbereich liegen, mit einer drittes Anregungslicht umfassenden dritten Lichtintensitätsverteilung zu beaufschlagen, um die dritten Fluoreszenzmarker jeweils in einem räumlich begrenzten dritten Bereich zur Emission von drittem Fluoreszenzlicht anzuregen. Dabei unterscheiden sich eine erste Anregungswellenlänge des ersten Anregungslichts und eine dritte Anregungswellenlänge des dritten Anregungslichts. Die Detektoranordnung ist dann dazu ausgebildet und angeordnet, das dritte Fluoreszenzlicht zu registrieren und der jeweiligen dritten Position zuzuordnen. Dabei kann die Detektoranordnung verschiedene Detektoren für das erste und das dritte Fluoreszenzlicht aufweisen, um diese spektral zu unterscheiden.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Laserscanningmikroskops ist eine zweite Schaltlichtquelle dazu ausgebildet und angeordnet, die Probe durch das Objektiv mit zweitem Schaltlicht einer sich von einer ersten Schaltwellenlänge des ersten Schaltlichts unterscheidenden zweiten Schaltwellenlänge zu beaufschlagen, um die ersten Fluoreszenzmarker in einen ersten fluoreszenten Zustand und die zweiten Fluoreszenzmarker in einen ersten Dunkelzustand zu schalten. Das zweite Schaltlicht hat damit eine komplementäre Funktion zu dem ersten Schaltlicht.

Die erste Zylinderlinse kann auch zum Fokussieren des zweiten Schaltlichts von der zweiten Schaltlichtquelle in den jeweiligen linienförmigen Abtastbereich dienen, oder eine zweite Zylinderlinse ist zum Fokussieren des zweiten Schaltlichts von der zweiten Schaltlichtquelle in den jeweiligen linienförmigen Abtastbereich in einer zweiten zur Rückapertur des Objektivs konjugierten Ebene angeordnet. Die erste Zylinderlinse oder die zweite Zylinderlinse kann bei dem erfindungsgemäßen Laserscanningmikroskop dazu angeordnet sein, vorübergehend in einen Strahlengang der ersten oder zweiten Lichtquelle eingeführt zu werden, um aus der ersten Lichtquelle vorübergehend die erste oder zweite Schaltlichtquelle auszubilden. Wie bereits im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ausgeführt wurde, kann die erste oder zweite Anregungswellenlänge mit der ersten oder zweiten Schaltwellenlänge übereinstimmen.

Wie ebenfalls bereits im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren angesprochen wurde, kann die Detektoranordnung einen selben Detektor für das erste und das zweite Fluoreszenzlicht aufweisen. Weiterhin können alle Lichtquellen eine selbe Fluoreszenzverhinderungslichtquelle für Fluoreszenzverhinderungslicht aufweisen. D. h. eine STED- Ausführungsform des erfindungsgemäßen Laserscanningmikroskops kann einen einzigen STED- Laser als Fluoreszenzverhinderungslichtquelle für Fluoreszenzverhinderungslicht umfassen.

KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN

Im Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter bevorzugter Ausführungsbeispiele weiter erläutert und beschrieben.

Fig. 1 zeigt schematisch eine erste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Laserscanningmikroskops.

Fig. 2 erläutert eine erste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die mit dem Laserscanningmikroskop gemäß Fig. 1 ausführbar ist.

Fig. 3 erläutert eine zweite Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die ebenfalls mit dem Laserscanningmikroskop gemäß Fig. 1 ausführbar ist.

Fig. 4 zeigt schematisch eine zweite Ausführungsform des erfindungsgemäßen Laserscanningmikroskops und

Fig. 5 erläutert eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die mit dem Laserscanningmikroskop gemäß Fig. 4 ausführbar ist. FIGURENBESCHREIBUNG

Das in Fig. 1 nur schematisch und auch nicht vollständig, sondern mit Augenmerk auf die vorliegende Erfindung dargestellte Laserscanningmikroskop 1 weist ein Objektiv 2 auf, um Anregungslicht 12 von einer Anregungslichtquelle 3 in eine Probe 4 zu fokussieren. Die Probe 4 ist auf einem in allen drei Raumrichtungen positionierbaren Probenhalter 5 angeordnet. Zum Abtasten der Probe 4 mit dem Anregungslicht 12 ist ein zusätzlicher Scanner 6 vorgesehen. Der Scanner 6 entscannt auch aus der Probe 4 kommendes Fluoreszenzlicht 7, so dass dieses zu einem Detektor 8 gelangt, der konfokal zu dem in die Probe 4 fokussierten Anregungslicht 12 angeordnet ist. Neben der Anregungslichtquelle 3 ist als weiterer Teil einer Lichtquelle 26 eine Fluoreszenzverhinderungslichtquelle 9 für Fluoreszenzverhinderungslicht 10 vorgesehen. In dem Strahlengang des Fluoreszenzverhinderungslichts 10 ist ein Strahlformer 11 angeordnet, der dazu führt, dass das von dem Objektiv 2 zusammen mit dem Anregungslicht 12 fokussierte Fluoreszenzverhinderungslicht 10 ein von Intensitätsmaxima umgebendes Intensitätsminimum ausbildet. Die Anregungslichtquelle 3 und die Fluoreszenzverhinderungslichtquelle 9 bilden also zusammen eine Lichtquelle 26 zur Bereitstellung einer Lichtintensitätsverteilung im Fokus des Objektivs 2, die das Anregungslicht 12 mit einem zentralen Intensitätsmaximum und das Fluoreszenzverhinderungslicht 10 mit einem zentralen Intensitätsminimum umfasst. Das Fluoreszenzverhinderungslicht 10 führt dazu, dass das Fluoreszenzlicht 7, das von dem Detektor 8 registriert wird, nur aus einem zentralen Bereich der in die Probe 4 fokussierten Lichtintensitätsverteilung emittiert wird und daher der jeweiligen Position eben dieses räumlich begrenzten Bereichs in der Probe zugeordnet werden kann. Weiterhin ist eine erste Schaltlichtquelle 13 für Schaltlicht 14 vorgesehen. In dem Strahlengang des Schaltlichts 14, in einer ersten zu einer Rückapertur des Objektivs 2 konjugierten Ebene ist eine erste Zylinderlinse 15 angeordnet. Eine zweite Zylinderlinse 16 kann in einer zweiten zu einer Rückapertur des Objektivs 2 konjugierten Ebene in den Strahlengang des Anregungslichts 12 eingeführt werden, um die Anregungslichtquelle 3 als zweite Schaltlichtquelle 17 für zweites Schaltlicht 18 zu nutzen. Um die Strahlengänge in dem Laserscanningmikroskop 1 zusammenzuführen bzw. zu trennen, sind dichroitische Spiegel 19 bis 21 vorgesehen.

Die Funktion des Laserscanningmikroskops 1 wird anhand Fig. 2 und einer darin illustrierten ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erläutert. Fig. 2A zeigt schematisch, wie die Probe 4 längs eines linienförmigen Bereichs 22 oder einer Zeile mit einer Lichtintensitätsverteilung 23 aus dem Anregungslicht 12 und dem Fluoreszenzverhinderungslicht 10 abgetastet wird. Dabei nimmt die Lichtintensitätsverteilung 23 nacheinander verschiedene Positionen 24 in dem Bereich 22 ein. Zu jeder dieser Positionen 24 wird das aus der Probe 4 kommende Fluoreszenzlicht 7 mit dem Detektor 8 gemäß Fig. 1 registriert. Dieses Fluoreszenzlicht stammt von ersten Fluoreszenzmarkern in der Probe 4, die sich während des ersten Abtastens des Bereichs 22 mit der Lichtintensitätsverteilung 23 in einem fluoreszenten Zustand befinden. Fig. 2B zeigt, wie die Probe 4 als nächstes in dem gesamten linienförmigen Bereich 22 gleichzeitig mit dem ersten Schaltlicht 14 beaufschlagt wird. Dies führt dazu, dass die ersten Fluoreszenzmarker aus ihrem fluoreszenten Zustand in einen Dunkelzustand überführt werden, während zweite Fluoreszenzmarker in der Probe aus ihrem Dunkelzustand in einen fluoreszenten Zustand überführt werden.

Gemäß Fig. 2C wird die Probe in dem linienförmigen Bereich 22 erneut an den Positionen 24 mit der Lichtintensitätsverteilung 23 aus dem Anregungslicht 12 und dem Fluoreszenzverhinderungslicht 10 abgetastet. Das dabei von dem Detektor 8 gemäß Fig. 1 registrierte Fluoreszenzlicht 7 stammt jetzt von den zweiten Fluoreszenzmarkern. Fig. 2A' deutet an, dass das in den Fig. 2A bis Fig. 2C illustrierte Vorgehen als nächstes in einem anderen linienförmigen Bereich 25 durchgeführt wird. Dieser andere linienförmige Bereich 25 ist hier weiter von dem einen linienförmigen Bereich 22 entfernt, damit die darin befindlichen ersten Fluoreszenzmarker und zweiten Fluoreszenzmarker von der Beaufschlagung des linienförmigen Bereichs 22 mit dem ersten Schaltlicht 14 gemäß Fig. 2B nicht beeinflusst sind. Ein näher an dem linienförmigen Bereich 22 liegender linienförmiger Bereich 25 wird erst dann abgetastet, wenn die ersten und zweiten Fluoreszenzmarker spontan, d. h. thermisch angeregt, wieder in ihre Ursprungszustände zurückgekehrt sind, d. h. die ersten Fluoreszenzmarker in ihren fluoreszenten Zustand und die zweiten Fluoreszenzmarker in ihren Dunkelzustand.

Fig. 3 illustriert eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem auch unmittelbar benachbarte linienförmige Bereich 22 und 25 direkt nacheinander abgetastet werden können. Bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird gemäß Fig. 3A der linienförmige Bereich 22 zunächst mit dem zweiten Schaltlicht 18 von der Schaltlichtquelle 17 beaufschlagt, wobei die Zylinderlinse 16 den Fokus des Schaltlichts 18 linienförmig über den Bereich 22 hinweg formt. Mit dem zweiten Schaltlicht werden aktiv die ersten Fluoreszenzmarker in ihren fluoreszenten Zustand und die zweiten Fluoreszenzmarker in ihren Dunkelzustand geschaltet. Hieran schließen sich gemäß Fig. 3B bis Fig. 3D die in den Fig. 2A bis Fig. 2C illustrierten Schritte an. Darauf folgt gemäß Fig. 3A' das Beaufschlagen des nächsten, hier direkt daneben liegenden Bereichs 25 mit dem zweiten Schaltlicht 18. Das zeitnahe Abbilden der Intensitätsverteilungen der ersten und zweiten Fluoreszenzmarker in direkt nebeneinander liegenden linienförmigen Bereichen 22 und 25 verhindert, dass sich die mit den Fluoreszenzmarkern markierten Strukturen in der Probe 4 zwischenzeitlich wesentlich verändert haben.

Konkret kann es sich bei den ersten Fluoreszenzmarkern in der Probe 4 um das schaltbare fluoreszente Protein Padron handeln, das mit zweitem Schaltlicht 18 einer zweiten Schaltlichtwellenlänge von 488 nm eingeschaltet und mit dem Anregungslicht 12 derselben Anregungswellenlänge von 488 nm zur Emission von Fluoreszenzlicht 7 einer Fluoreszenzlichtwellenlänge von 515 nm angeregt wird. Dabei wird der räumliche Bereich, aus dem das Fluoreszenzlicht stammen kann mit Fluoreszenzverhinderungslicht der Fluoreszenzverhinderungslichtwellenlänge von 595 nm durch stimulierte Emission eingeengt. Die zweiten Fluoreszenzmarker sind dabei das schaltbare fluoreszente Protein Dronpa-M159T, das von dem zweiten Schaltlicht 18 mit der Schaltlichtwellenlänge 488 nm ausgeschaltet wird. Dronpa-M159T wird mit dem ersten Schaltlicht 14 einer Schaltlichtwellenlänge von 405 nm eingeschaltet. Dieses erste Schaltlicht 14 schaltet zugleich Padron aus. Das eingeschaltete Dronpa-M159T wird mit dem Anregungslicht 12 der Anregungslichtwellenlänge 488 nm zur Emission von Fluoreszenzlicht 7 einer Fluoreszenzlichtwellenlänge von 511 nm angeregt und mit dem zweitem Schaltlicht 18 derselben Schaltlichtwellenlänge von 488 nm ausgeschaltet. Auch beim Anregen des eingeschalteten Dronpa-M159T mit dem Anregungslicht 12 wird der Bereich, aus dem das Fluoreszenzlicht 7 stammen kann, durch das Fluoreszenzverhinderungslicht 10 der Fluoreszenzverhinderungslichtwellenlänge von 595 nm räumlich eingeengt. Für das Fluoreszenzlicht 7 der Fluoreszenzlichtwellenlängen von 511 nm und 515 nm von Dronpa-M159T bzw. Padron wird derselbe Detektor 8 verwendet. Für diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist das erfindungsgemäße Laserscanningmikroskop also nur drei Lichtquellen 3 bzw. 17, 9 und 13 sowie einen einzigen Detektor 8 auf.

Die in Fig. 4 dargestellte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Laserscanningmikroskops 1 unterscheidet sich gegenüber derjenigen gemäß Fig. 1 durch die folgenden zusätzlichen Komponenten. Statt die Anregungslichtquelle 3 auch als zweite Schaltlichtquelle 17 vorzusehen, ist eine separate zweite Schaltlichtquelle 17 mit der Zylinderlinse 16 für das Schaltlicht 18 vorgesehen. Weiterhin ist neben der Anregungslichtquelle 3 für das Anregungslicht 12, die zusammen mit der Fluoreszenzverhinderungslichtquelle 9 die Lichtquelle 26 für die Lichtintensitätsverteilung 23 ausbildet, eine weitere Anregungslichtquelle 27 für weiteres Anregungslicht 28 vorhanden, die zusammen mit der Fluoreszenzverhinderungslichtquelle 9 eine weitere Lichtquelle 29 für eine weitere Lichtintensitätsverteilung ausbildet. Außerdem weist die Detektoranordnung 31 einen weiterer Detektionskanäle mit einem weiteren Detektor 30 für andere Fluoreszenzlichtwellenlängen des Fluoreszenzlichts 7 als der Detektor 8 auf. Zusätzliche dichroitische Spiegel 33 bis 35 und ein Spiegel 36 dienen zur Strahlkombination und -trennung bzw. Strahlführung. Weiterhin ist durch einen Doppelpfeil 32 angedeutet, dass der Abstand des Objektivs 32, beispielsweise mit einem Piezoaktuator schnell in z-Richtung verfahrbar ist, wodurch der als x/y-Scanner ausgebildete Scanner 6 um eine schnelle Abtastbarkeit der Probe 4 in z-Richtung erweitert ist.

Die in Fig. 5 illustrierte, mit dem Laserscanningmikroskop 1 gemäß Fig. 4 ausführbare Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beginnt gemäß Fig. 5A mit dem Beaufschlagen des linienförmigen Bereichs 22 mit dem zweiten Schaltlicht 18 von der zweiten Schaltlichtquelle 17. Dabei ist die Form des linienförmigen, den linienförmigen Bereich 22 abdeckenden Fokusbereichs angedeutet, in den das Schaltlicht 18 mit der Zylinderlinse 16 fokussiert wird. Mit dem Schaltlicht 18 werden bestimmte Fluoreszenzmarker in der Probe in ihren Dunkelzustand ausgeschaltet. Andere Fluoreszenzmarker in der Probe bleiben in ihrem fluoreszenten Zustand oder werden sogar in diesen fluoreszenten Zustand eingeschaltet. Hieran schließt sich gemäß Fig. 5B das Abtasten des linienförmigen Bereichs 22 mit der Lichtintensitätsverteilung 23 aus dem Anregungslicht 12 von der Anregungslichtquelle 3 und dem Fluoreszenzverhinderungslicht 10 von der Fluoreszenzverhinderungslichtquelle 9 an. Anschließend wird gemäß Fig. 5C derselbe linienförmige Bereich 22 erneut, jetzt aber mit der weiteren Lichtintensitätsverteilung 37 aus dem weiteren Anregungslicht 28 von der weiteren Anregungslichtquelle 27 und dem Fluoreszenzverhinderungslicht 10 von der Fluoreszenzverhinderungslichtquelle 9 abgetastet. Da sich die Anregungslichtwellenlängen des Anregungslichts 12 und des weiteren Anregungslichts 28 unterscheiden, werden bei dem Abtasten gemäß Fig. 5B und Fig. 5C unterschiedliche Fluoreszenzmarker mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften in dem linienförmigen Bereich 22 angeregt und damit abgefragt. Die unterschiedlichen spektralen Eigenschaften der Fluoreszenzmarker sind unterschiedliche Anregungsspektren und/oder Fluoreszenzemissionsspektren, so dass die Unterscheidung zwischen den unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern durch das Anregungslicht 12 bzw. 28 unterschiedlicher Anregungslichtwellenlänge und durch die Detektion des Fluoreszenzlichts 7 mit unterschiedlicher von seinem Fluoreszenzlichtspektrum abhängiger Verteilung über die Detektoren 8 und 30 bewirkt wird. In einem folgenden, in Fig. 5D illustrierten Schritt wird der linienförmige Bereich 22 mit dem Schaltlicht 14 von der Schaltlichtquelle 13 beaufschlagt, das die mit dem Schaltlicht 18 von der Schaltlichtquelle 17 ausgeschalteten Fluoreszenzmarker in der Probe 4 wieder in ihren fluoreszenten Zustand einschaltet. Zusätzlich können die in den Schritten gemäß Fig. 5B und Fig. 5C bereits abgefragten Fluoreszenzmarker in dem Bereich 22 mit dem Schaltlicht 14 ausgeschaltet werden. In Fig. 5D ist die Linienform des Fokusbereichs angedeutet, in den das Schaltlicht 14 mit der Zylinderlinse 15 fokussiert wird. Fig. 5E illustriert einen folgenden Schritt, in dem der linienförmige Bereich 22 erneut mit derselben Lichtintensitätsverteilung 23 aus dem Anregungslicht 12 und dem Fluoreszenzverhinderungslicht 10 wie in Fig. 5B abgetastet wird, diesmal aber, um die während des Abtastens gemäß Fig. 5B ausgeschalteten und jetzt wieder mit dem Schaltlicht 14 eingeschalteten Fluoreszenzmarker abzufragen. Wenn dabei die in den Schritten gemäß Fig. 5B eingeschalteten Fluoreszenzmarker weiterhin eingeschaltet sind, sind die zu denselben Positionen mit den Detektoren 8 und 30 registrierten Intensitäten des Fluoreszenzlichts 7 von den in dem Schritt gemäß Fig. 5E registrierten Intensitäten des Fluoreszenzlichts 7 abzuziehen. Die Schritte gemäß den Fig. 5A bis Fig. 5E werden dann für den nächsten linienförmigen Bereich 25 wiederholt, der hier ein dem linienförmigen Bereich 22 direkt benachbarter linienförmiger Bereich 25 ist. Der Beginn dieser Wiederholung ist in Fig. 5A' dargestellt.

Konkret kann eine interessierende Struktur der Probe 4 für das in Fig. 5 illustrierte Verfahren mit EGFP als die in dem Schritt gemäß Fig. 5B abgefragten Fluoreszenzmarker, Citrine als die in dem Schritt gemäß Fig. 5C abgefragten Fluoreszenzmarker und rsEGFP2 als die in dem Schritt gemäß Fig. 5E abgefragten schaltbaren Fluoreszenzmarker markiert sein. Dabei weist das Schaltlicht 18 eine Wellenlänge von 488 nm auf, um das reversibel schaltbare fluoreszente Protein rsEGFP2 in seinen Dunkelzustand auszuschalten. In dem Schritt gemäß Fig. 5B weist das Anregungslicht 12 ebenso wie in dem Schritt gemäß Fig. 5E die Anregungslichtwellenlänge von 483 nm auf. Das weitere Anregungslicht 28 in dem Schritt gemäß Fig. 5C weist eine weitere Anregungslichtwellenlänge von 520 nm auf. Das Fluoreszenzverhinderungslicht 10 hat in allen Schritten die Fluoreszenzverhinderungswellenlänge von 595 nm. In dem Schritt gemäß Fig. 5B detektiert der Detektor 8 das Fluoreszenzlicht 7 von dem EGFP in einem Detektionswellenlängenbereich von 500 bis 515 nm. Diese Detektion ist im Wesentlichen selektiv, da von dem Anregungslicht 12 mit der Wellenlänge von 483 nm das Citrine nur wenig angeregt wird und weil Citrine in dem Detektionswellenlängenbereich zwischen 500 und 515 nm kaum Fluoreszenzlicht 7 emittiert. Auch die Detektion des Fluoreszenzlichts 7 von dem Citrine in dem Schritt gemäß Fig. 5C erfolgt mit dem Detektor 30 selektiv in einem weiteren Detektionswellenlängenbereich von 520 bis 555 nm. In diesem Detektionswellenlängenbereich emittiert das EGFP zwar ein wenig. Mit dem weiteren Anregungslicht 28 der Anregungslichtwellenlänge von 520 nm wird das EGFP aber nicht in relevantem Umfang angeregt. In dem Schritt gemäß Fig. 5E wird mit dem Anregungslicht 12 neben dem jetzt eingeschalteten rsEGFP2 auch das weiterhin fluoreszente EGFP angeregt. Entsprechend ist von dem Fluoreszenzlicht 7, das an jeder Position 24 in dem Schritt gemäß Fig. 5E detektiert wird, das in dem Schritt gemäß Fig. 5B an derselben Position 24 detektierte Fluoreszenzlicht 7 abzuziehen, um den auf das rsEGFP2 zurückgehenden Anteil des Fluoreszenzlichts 7 zu bestimmen. Sowohl in dem Schritt gemäß Fig. 5E als auch in den Schritten gemäß Fig. 5B und Fig. 5C können jeweils beide Detektoren 8 und 30 aktiv sein, um aus den dabei registrierten relativen Intensitäten des Fluoreszenzlichts 7 in den beiden Detektions- Wellenlängenbereichen weitere Rückschlüsse auf die Verteilung der verschiedenen Fluoreszenzmarker in der Probe zu ziehen.

BEZUGSZEICHENLISTE

Laserscanningmikroskop

Objektiv

Anregungslichtquelle

Probe

Probenhalter

Scanner

Fluoreszenzlicht

Detektor

Fluoreszenzverhinderungslichtquelle

Fluoreszenzverhinderungslicht

Strahlformer

Anregungslicht

Schaltlichtquelle

Schaltlicht

Zylinderlinse

(zweite) Zylinderlinse

(zweite) Schaltlichtquelle

(zweites) Schaltlicht dichroitischer Spiegel dichroitischer Spiegel dichroitischer Spiegel linienförmiger Bereich

Lichtintensitätsverteilung

Position nächster linienförmiger Bereich

Lichtquelle

(weitere/dritte) Anregungslichtquelle

(weiteres/drittes) Anregungslicht

(weitere/drittes) Lichtquelle

(weiterer) Detektor

Detektoranordnung

Doppelpfeil dichroitischer Spiegel dichroitischer Spiegel dichroitischer Spiegel Spiegel (weitere) Lichtintensitätsverteilung