<一の実施形態の活性計測方法の説明>
 図1は、一の実施形態に係る培養細胞の活性 計測方法の概要を示す図である。一の実施形 態では、液体培地11とともに培養細胞12を収� �したディッシュなどの培養容器13に対して、 計測対象の細胞12を取り囲むマイクロチャン� ��14を配置し、マイクロチャンバ14内の空間に 含まれる環境因子を測定する。

 ここで、本明細書の環境因子とは、細胞� ��代謝で産生または消費される物質を意味す� ��。一例として、環境因子には、グルコース� ��カルシウムイオン、カリウムイオン、ナト� ��ウムイオン、水素イオン、酸素、活性酸素� ��、過酸化水素、二酸化炭素、細胞が産出す� ��タンパクやヘプタイドなど(例えばサイトカ イン、ホルモンなど)が含まれる。

 図2は、一の実施形態に係るマイクロチャ ンバ14の構成例を模式的に示す断面図である� ��一の実施形態のマイクロチャンバ14の全体� �状は、培養容器13の培養面と接触する底面側 が開放されるとともに、上面側が閉塞された 有底円筒形のカップ状に構成されている。そ のため、マイクロチャンバ14の内側には計測� ��象の細胞12を収容可能となっている。そし� �、一の実施形態では、培養容器13の培養面上 にマイクロチャンバ14を配置することで、培� ��容器13の容積に対して十分に微小な被計測� �間がマイクロチャンバ14の内側に構築される 。なお、マイクロチャンバ14の大きさは、計� ��対象の細胞12の種類や数、計測する環境因� �の種類、計測の所要時間などに応じて適宜� �択されるが、一例として、その直径が50μmか ら100μm程度に設定される。

 また、一の実施形態のマイクロチャンバ1 4の内側には、環境因子センサ15および生体分 子検出プローブ16がそれぞれ固定されている� ��環境因子センサ15は、培養液に含まれる環� �因子の量を電気化学的手段によって電気信� �に変換するセンサである。一例として、環� �因子センサ15は、酸素センサや各種のバイオ センサ(グルコースセンサなど)で構成される� ��

 生体分子検出プローブ16は、環境因子の� �ちから選択された標的分子を特異的に補足� �る分子で構成され、例えば、抗体、酵素等� �タンパク質、ペプチド、糖類等を用いるこ� �ができる。一の実施形態では、異なる種類� �生体分子検出プローブ16をパターニング等で マイクロチャンバ14の特定の位置(マイクロチ ャンバ14内の上面など)にアレイ化して固定し てもよい。この場合には、同時に多項目の網 羅的な解析が可能になる。また、標的分子を 蛍光標識等しておけば、生体分子検出プロー ブ16と標的分子との結合を容易に判断するこ� ��ができる。なお、上記の場合には蛍光強度� ��よって標的分子の量を測ることもできる。

 ここで、一の実施形態でのマイクロチャ� ��バ14は、以下の(1)から(5)の構成(あるいはこ� ��らの組み合わせ)を有していてもよい。

 (1)光学的計測(蛍光測定、色変化の測定、 吸光度測定)によって環境因子を計測する場� �には、マイクロチャンバ14内で生じる光学的 な変化に対応した波長の光を透過する透光性 材料でマイクロチャンバ14を形成することが� ��ましい。このとき、光学的計測を容易に行� ��観点から、マイクロチャンバ14の屈折率は� �体培地11の屈折率と同じ値に設定することが 好ましい。一例として、可視光に対する透光 性を有するとともに屈折率が液体培地11とほ� ��同等な材質として、非晶質フッ素樹脂(例え ば、サイトップ(登録商標))などが挙げられる 。

 また、光学的計測を行う場合には、計測� ��の光学像のひずみを避けるために、マイク� ��チャンバ14の上面を平坦にしてもよい。あ� �いは、光学的計測でのNAを向上させるために 、マイクロチャンバ14の上面にマイクロレン� ��を形成してもよい(この場合の図示は省略す る)。

 (2)マイクロチャンバ14は、柔軟性の高い� �性材料で形成してもよい。かかる構成によ� �ば、例えば、外部の細胞と接合した軸索な� �にダメージを与えずに計測対象の細胞12にマ イクロチャンバ14を被せることができる。ま� ��、培養容器13の培養面に対してマイクロチ� �ンバ14に傾きが生じている場合にも、マイク ロチャンバ14の変形によってアライメントの� ��差を吸収することが可能となる。なお、マ� ��クロチャンバ14に用いられる弾性材料とし� �は、例えば、シリコンゴム(ポリジメチルシ� ��キサン)が挙げられる。

 (3)マイクロチャンバ14は、酸素透過性を� �する材質で形成してもよい。かかる構成に� �れば、比較的長時間の計測を行う場合にも� �マイクロチャンバ14内に細胞の培養環境を維 持できる。勿論、この場合には酸素濃度が計 測項目に含まれないことが前提となる。なお 、マイクロチャンバ14に用いられる酸素透過� ��材料としては、例えば、シリコンゴム(ポリ ジメチルシロキサン)が挙げられる。

 (4)被計測空間内を液体培地11で満たすこ� �を容易とするために、マイクロチャンバ14の 内面には、親水性被膜の形成などによって親 水性を付与してもよい。この場合には、マイ クロチャンバ14を上下に反転させて空気が入� ��ないように予め液体培地11を容器内に充填� �、その後にマイクロチャンバ14を本来の状態 (底面側に開口がある状態)に戻しても表面張� ��によって容器内の液体は保持される。した� ��って、この場合には、予め液体培地11で満� �されている状態のマイクロチャンバ14を、細 胞12の上に被せることが可能となる。

 (5)マイクロチャンバ14の表面には、蛋白� �の吸着を阻害する物質(ポリエチレングリコ� ��ル(PEG)、2-メタクリロイオキシエチルホスホ リルコリン(MPC)など)で被膜を形成してもよい 。この場合には、計測が培養環境に及ぼす影 響をより低減させることができる。

 次に、一の実施形態における培養細胞の� ��性計測方法の各手順を具体的に説明する。

 第1の手順では、培養容器13内の上側から� ��計測対象の細胞12を取り囲むようにマイク� �チャンバ14を配置する。これにより、計測対 象の細胞12が収容されるとともに培養容器13� �容積に対して微少な被計測空間がマイクロ� �ャンバ14の内側に形成される。

 また、熱の移動による培養環境への悪影� ��を抑制するために、マイクロチャンバ14は� �め培地11と同じ温度に保温しておくことが好 ましい。なお、被計測空間に収容する細胞12� ��数は複数であってもよいが、一の実施形態� ��はマイクロチャンバ14内に1つの細胞を収容� ��るものとする。

 第2の手順では、被計測空間に含まれる環 境因子を計測する。これにより、計測された 環境因子の量に基づいて、計測対象の細胞の 活性、細胞のアポトーシスや分化の度合い、 細胞の性質などを評価することができる。

 培養容器13の環境因子を測定する場合に� �、培地全体に代謝物などが拡散されるため� �個々の細胞に着目して環境因子を測定する� �とは不可能である。一方、一の実施形態で� �、培養容器13内にマイクロチャンバ14を配置� ��て、計測対象の細胞12を含む微小な被計測� �間を構成して環境因子を計測している。こ� �被計測空間に含まれる環境因子は計測対象� �細胞12と密接に関連するので、培養環境下に おいて計測対象の細胞12に注目した局所的な� ��境因子の計測が可能となる。

 また、マイクロチャンバ14内の被計測空� �は培養容器13の容積に対して微小であるので 、マイクロチャンバ14の外側の環境と比べて� ��計測空間内では代謝物などの濃度変化がよ� ��大きくなる。そのため、非常に高い感度で� ��境因子を検出できる。また、被計測空間内� ��は環境因子の濃度変化が高くなるため、比� ��的短時間で計測を行うことが可能となる。

 さらに、一の実施形態では、細胞12の周� �の空間に含まれる環境因子を計測対象とし� �細胞の活性を評価する。そのため、細胞自� �を計測対象とする場合と比べて計測による� �胞への影響を少なくできる。また、一の実� �形態では計測対象の細胞12を培養容器13内で� ��のまま計測できるので、計測によって細胞1 2や周囲の培養環境に与える影響を極めて少� �くできる。

 ここで、第2の手順での計測方法をより詳 細に説明する。具体的には、第2の手順では� �マイクロチャンバ14内に配置された環境因子 センサ15で被計測空間の環境因子を計測する� ��あるいは、第2の手順では、マイクロチャン バ14内に配置した生体分子検出プローブ16や� �試薬(pH指示薬など)による被計測空間の光学� ��な変化を顕微鏡で観察し、環境因子の光学� ��計測(蛍光測定、色変化の測定、吸光度測定 など)を行ってもよい。なお、上記の光学的� �測で用いる生体分子検出プローブは、マイ� �ロチャンバ14の内面に固定するものでもよく 、マイクロチャンバ14に固定せずに培養容器1 3内の培地11に直接投入するものであってもよ い。

 また、第2の手順では、マイクロチャンバ 14内の被計測空間で代謝物を十分蓄積させる� ��めに、被計測空間を形成した後に所定の待� ��時間をあけて環境因子を計測してもよい。� ��らに、第2の手順では、各々の計測時期を変 化させて環境因子を複数回計測してもよい。 この場合には、環境因子の量の変化と計測の インターバルとに基づいて、環境因子の量が 変化する速度を求めることが可能となる。

 第3の手順では、上記の環境因子の計測が 終了した後に、培養容器13からマイクロチャ� ��バ14を除去する。これにより、細胞の培養� �境を計測前とほぼ同様の状態に復元できる� �したがって、一の実施形態では、上記の第1� ��手順から第3の手順を繰り返すことで、培養 環境下で培養される細胞12の活性をほぼ非侵� ��で周期的に判断することが可能となる。

 なお、一の実施形態において、1つの培養 容器13内に複数のマイクロチャンバ14を配置� �て、異なる細胞12の活性測定を並行して行う ようにしてもよい。

 <一の実施形態の変形例>
  図3、図4は、一の実施形態のマイクロチャ ンバ14の他の構成例をそれぞれ模式的に示す� ��面図である。これらの構成によっても、計� ��対象の細胞12の周囲に微小な被計測空間を� �築することができ、図2に示すマイクロチャ� ��バ14の場合とほぼ同様の効果を得ることが� �きる。なお、図3、図4において図2と共通す� �構成については、同一符号を付して重複説� �は省略する。

 図3に示すマイクロチャンバ14は、培養容� ��13と接触する底面と、上面とがそれぞれ開� �した筒状の部材で構成されている。図3の構� ��によれば、マイクロチャンバ14を細胞12に被 せるときに上面側の開口から空気を逃がすこ とができる。なお、図3の構成では、マイク� �チャンバ14の上面側から培地11が流入するこ� ��を防ぐように、マイクロチャンバ14の高さ� �設定する必要がある。

 図4に示すマイクロチャンバ14は、培養容� ��13と接触する底面と、上面とがそれぞれ開� �した筒状の部材で構成されている。そして� �図4のマイクロチャンバ14では、培地11の流出 入を阻害するとともに空気の流出入を許容す る疎水性の半透過膜17で上面側の開口部が覆� ��れている。図4の構成によれば、マイクロチ ャンバ14を細胞12に被せるときに上面側の開� �から空気を一方的に逃がすことができ、か� �、被計測空間内を形成したときにマイクロ� �ャンバ14の内外で培地11が混ざることを防止� ��きる。

 <他の実施形態の活性計測方法の説明>
 図5は、他の実施形態に係る培養細胞の活性 計測方法の概要を示す図である。他の実施形 態は、図1に示す一の実施形態の変形例であ� �て、マイクロチャンバ14を配列したマイクロ チャンバシート21を用いて各々の被計測空間� ��に環境因子の計測を行う。なお、他の実施� ��態では培養容器13側の培養面を修飾するこ� �で、培養細胞12の付着位置がマイクロチャン バシート21に合わせて制御されている。

 図6は、他の実施形態に係るマイクロチャ ンバシート21を模式的に示す部分断面図であ� ��。また、図7は、他の実施形態で用いる培養 容器13の培養面と、マイクロチャンバシート2 1との対応関係を示す図である。他の実施形� �に係るマイクロチャンバシート21の全体形状 は、培養容器13の内径よりも外径が小さい円� ��状の部材であって、一方の面(底面側)には� �数のマイクロチャンバ14が形成されている。 マイクロチャンバ14は有底円筒形の凹部で構� ��されており、例えばリソグラフィなどの公� ��の微細加工手段で形成される。

 そして、マイクロチャンバシート21の各� �のマイクロチャンバ14は一定間隔をおいて2� �元的に配列されている。なお、図5、図7では 、一例として、マイクロチャンバ14が4×4の配 列をなすマイクロチャンバシート21を図示す� ��。

 一方、培養容器13の培養面上には、各々� �細胞の付着性が異なる第1領域22と第2領域23� �が形成されている。上記の第1領域22は、培� �面上で相対的に細胞の付着性が高い領域で� �る。この第1領域22は培養面上に複数形成さ� �ており、その数はマイクロチャンバシート21 のマイクロチャンバ14の数と対応する。培養� ��上の第1領域22は、マイクロチャンバ14の間� �に合わせて4×4の配列をなしている。なお、� ��々の第1領域22のサイズは、マイクロチャン� ��14のサイズよりも若干小さくなるように設� �されている。

 また、第2領域23は、培養面上で相対的に� ��胞の付着性が低い領域であって、第1領域22� ��取り囲むように形成されている。そのため� ��培養容器13内では、マイクロチャンバ14の位 置に対応する第1領域22に細胞が付着しやすく なっている。

 ここで、第1領域22および第2領域23の形成手� ��としては、以下の(1)から(4)の例が考えられ� ��。なお、これらの構成は適宜組み合わせて� ��かまわない。
(1)第1領域22に対して親水性を付与することで 蛋白質の吸着を高め、第1領域22での細胞の付 着性を相対的に高くする。一例として、培養 容器13の培養面にプラズマや紫外線を照射し� ��パターニングを行うことで、親水性が付与� ��れた第1領域22を形成することができる。
(2)電荷を持った高分子被膜(例えばポリリジ� �のコーティングなど)を第1領域22に形成する� ��とで蛋白質の吸着を高め、第1領域22での細� ��の付着性を相対的に高くする。
(3)第2領域23に対して蛋白質の吸着を阻害する 皮膜を形成することで、第2領域23での細胞の 付着性を相対的に低くする。上記の被膜の材 料としては、例えば、ポリエチレングリコー ル(PEG)や、2-メタクリロイオキシエチルホス� �リルコリン(MPC)などが挙げられる。
(4)第2領域23に表面加工で微小な突起を形成し 、細胞の接着面積を低くすることで第2領域23 での細胞の付着性を相対的に低くしてもよい 。

 なお、他の実施形態における活性計測方� ��の手順は、マイクロチャンバシート21を培� �容器13に配置する点と、個々のマイクロチャ ンバ14ごとに環境因子を計測する点を除いて� ��一の実施形態とほぼ共通するので説明を省� ��する。なお、マイクロチャンバシート21や� �養容器13にアライメントマークを予め設けて おけば、マイクロチャンバシート21を培養容� ��13に配置するときの位置決めが容易となる� �

 他の実施形態の構成によれば、上記の一� ��実施形態の効果に加えて、細胞の活性の計� ��をアレイ化して一度に行うことができるの� ��、複数の細胞の活性を評価するときのスル� ��プットを大幅に向上させることができる。� ��た、他の実施形態では、アレイ化により個� ��のマイクロチャンバ14をそれぞれ独立して� �ライメントする必要がないので、計測作業� �煩雑さが低減して作業効率が一層向上する� �

 <活性計測装置の構成例>
 図8は、上述の一の実施形態または他の実施 形態の活性計測方法を実行するための活性計 測装置の構成例を示すブロック図である。

 活性計測装置は、恒温室31と、ロボット� �ーム32と、光学観察ユニット33と、モニタ34� �、記憶部35と、制御部36と、ユーザーから各� ��の操作を受け付ける操作部37とを有してい� �。ここで、ロボットアーム32、光学観察ユニ ット33、モニタ34、記憶部35および操作部37は� ��それぞれ制御部36に接続されている。

 恒温室31には、計測対象の細胞12を培養す る培養容器13が収納される。この恒温室31の� �部は、細胞の培養に適した環境(例えば温度3 7℃、湿度90%の雰囲気)に維持されるとともに� ��コンタミネーションを防止するために高い� ��浄度に保たれている。

 ロボットアーム32は、マイクロチャンバ14 (またはマイクロチャンバシート21)が先端に� �持されており、マイクロチャンバ14を三次元 的に移動させる。そして、ロボットアーム32� ��、制御部36の指示に応じて、培養容器13の所 定位置の細胞12にマイクロチャンバ14を被せ� �とともに、計測終了後にマイクロチャンバ14 を除去する動作を行う。

 光学観察ユニット33は、培養細胞を照明� �る照明装置と、培養細胞を観察するための� �微光学系と、顕微光学系を介した培養容器13 内の像を撮像する撮像装置とを有している。 この光学観察ユニット33は、ロボットアーム3 2が培養容器13内にマイクロチャンバ14を位置� ��めするときの位置情報の取得や、マイクロ� ��ャンバ14内の被計測空間で生じる光学的な� �化を示す画像情報の取得に用いられる。な� �、光学観察ユニット33で撮像された画像は、 制御部36の制御によってモニタ34に表示する� �とができる。

 記憶部35は、ハードディスクやフラッシ� �メモリ等の不揮発性の記憶媒体で構成され� �。この記憶部35には、環境因子の計測情報や 、環境因子の計測時に光学観察ユニット33が� ��成した画像情報がそれぞれ記憶される。上� ��の画像情報や環境因子の計測情報は、計測� ��象の細胞の識別情報および計測日時の情報� ��それぞれ対応付けされた状態で記憶部35に� �憶される。なお、記憶部35には、制御部36に� ��って実行されるプログラムも記憶される。

 制御部36は、活性計測装置の各部の動作� �統括的に制御するプロセッサである。例え� �、制御部36は、ロボットアーム32を制御して� ��イクロチャンバ14を移動させる。また、制� �部36は、光学観察ユニット33の撮像装置やマ� ��クロチャンバ14内の環境因子センサ15によっ て、マイクロチャンバ14内の環境因子の計測� ��行う。

 以下、図9の流れ図を参照しつつ、活性計 測装置の動作例を説明する。

 ステップS101:制御部36は、光学観察ユニッ ト33を駆動させて培養容器13内の状態を撮像� �た観察画像を取得する。これにより、制御� �36は、マイクロチャンバ14を位置決めすると� ��の位置情報を取得する。一例として、制御� ��36は、画像の基準点(例えば画面の中心)と培 養容器13での位置とを予め対応付けておく。� ��して、制御部36は、光学観察ユニット33での 撮影倍率やレンズ位置などを考慮して、画像 内における細胞と基準点との位置関係から、 培養容器13での実際の細胞の座標を幾何学的� ��求めることができる。

 その後、制御部36は、上記の観察画像を� �ニタ34に表示する。これにより、ユーザーは 観察画像に基づいて、計測対象となる細胞12� ��操作部37から指定することができる。

 ステップS102:ユーザーから計測対象とな� �細胞12の指定を受け付けると、制御部36は、� ��記の位置情報(S101)に基づいてロボットアー� ��32を駆動させて計測対象の細胞12の上からマ イクロチャンバ14を配置する。これにより、� ��測対象の細胞12の周囲にマイクロチャンバ14 で被計測空間が形成される。

 ステップS103:制御部36は、光学観察ユニッ ト33による画像の撮像や、環境因子センサ15� �出力によって、被計測空間内の環境因子の� �測を実行する。そして、制御部36は、必要に 応じて環境因子の計測結果を統計解析した後 に、記憶部35への計測結果の記録や、モニタ3 4での計測結果の表示を行う。

 ステップS104:制御部36は、計測終了後に、 ロボットアーム32を駆動させて培養容器13か� �マイクロチャンバ14を除去し、培養容器13内� ��培養環境を復元する。

 以上で、図9の流れ図の説明を終了する。 上記の活性計測装置によれば、上述の実施形 態の活性計測方法を効率的に実行することが 可能となる。

 <実施例>
 本発明の実施例として、マイクロチャンバ( リアクター)内の溶残酸素濃度の測定が可能� �あることを示すために、酸素センサの検量� �を作成した。

 図10は、実施例での測定系の構成を示す� �略図である。実施例では、ルテニウム(Ru)錯� ��を含むポリジメチルシロキサン(PDMS)シート� ��ガラス基板上に配置し、上記のシートを配� ��したガラス基板と、直径500μm-800μmの穴を開 口したシリコン(Si)ウエハとを接着してリア� �ターを構成した。また、Siウエハの上面側も ガラス基板で封止した。なお、リアクター全 体の厚さは500μmとした。

 そして、上記のリアクター内に溶存酸素� ��度の異なる溶液を封入して、それぞれ顕微� ��で蛍光強度を測定した。

 図11は、実施例での蛍光強度と溶存酸素� �度との関係を示すグラフである。図11からは 、リアクター内の溶存酸素濃度が上昇するに 従って、蛍光強度が低下することが確認でき た。

 次に、実施例での実験データをもとに酸素� ��ンサの検量線を作成した。検量線のパラメ� ��タは、下記の式(1)で示される。
I ₀ /I=1+K _SV [O ₂ ]  …(1)
 ここで、「I ₀ 」は、溶存酸素濃度が0mg/Lであるときの蛍光� ��度を示す。「I」は、各溶存酸素濃度での蛍 光強度を示す。「K _SV 」は、検量線の傾きを示す値である。「O ₂ 」は溶存酸素濃度を示す。

 実施例では、溶存酸素濃度が0mg/Lであると� �の蛍光強度を実験から得ることができない� �め、蛍光強度の逆数を直線で近似し(図12参� �)、近似曲線のy切片から求まるI”をI ₀ とした。
I”=1/(2.159×10 ^-5 )=46317.74  …(2)
 そして、上記のI”を用いて、縦軸をI”/Iと し、横軸を溶存酸素濃度として検量線を作成 した(図13参照)。このとき、K _SV =0.19976となった。

 <実施形態の補足事項>
 (1)上記の実施形態において、マイクロチャ� ��バ14に光硬化性樹脂を用いた場合には、マ� �クロチャンバ14にレーザーを照射することで 任意の細胞をマイクロチャンバ14内に封止す� ��ことができる。上記の構成によれば、被計� ��空間における環境因子の計測結果に基づい� ��、所望の細胞を選択的に分離抽出すること� ��可能となる。

 (2)上記の図4の例において、マイクロチャ ンバ14の側面に疎水性の半透過膜17で覆われ� �開口部を形成してもよい。

 (3)上記の実施形態において、マイクロチ� ��ンバ14内の蛍光を観察する場合には、マイ� �ロチャンバ14の側壁の内面側に、蛍光の波長 を反射する反射膜を形成してもよい。この場 合には、マイクロチャンバ14内の蛍光シグナ� ��をより高感度に検出できるようになる。

 (4)なお、上記実施形態のマイクロチャン� ��14、マイクロチャンバシート21、培養容器13� ��どの器具は、使い捨て物品として設計する� ��とが好ましい。

 以上の詳細な説明により、実施形態の特� ��点および利点は明らかになるであろう。こ� ��は、特許請求の範囲が、その精神および権� ��範囲を逸脱しない範囲で前述のような実施� ��態の特徴点および利点にまで及ぶことを意� ��する。また、当該技術分野において通常の� ��識を有する者であれば、あらゆる改良およ� ��変更に容易に想到できるはずであり、発明� ��を有する実施形態の範囲を前述したものに� ��定する意図はなく、実施形態に開示された� ��囲に含まれる適当な改良物および均等物に� ��ることも可能である。