Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Modifizierung eines Substrats .

Die nanoskalige Oberflächen-Modifizierung von Substratmaterialien mit multifunktionalen und/oder biofunktionalen Eigenschaften ist ein wichtiger Zweig der Nanotechnologie, der nahezu alle Zukunftstechnologien, von der Nanoelektronik mit bioelektronischen Funktionsbausteinen über Biosensoren bis hin zu biokompatiblen Materialien, wie Implantaten oder Wirkstoff-Carriern, berührt.

Aus Berlin et al . (Berlin P., Klemm D., Jung A., Liebegott H., Riesler R., Tiller J., Film-forming aminocellulose derivatives as enzyme-compatible Support matrices for biosen- sor developments . Cellulose 2003, Vol. 10, pp . 343-367) ist bekannt, ein Aminocellulosederivat (ACD) auf einem Glas- Substrat aufzubringen. Die auf diese Weise hergestellten relativ dicken ACD-Filme von etwa 100 bis 200 Nanometer werden regelmäßig zur Bildung von Biochip-Oberflächen mit kovalent immobilisierten Biomolekülen versehen und zum Nachweis komplementärer Strukturen verwendet .

Aus Jung et al . (Jung A., Berlin P., Wolters B., Biomolecule- compatible Support structures for biomolecule coupling to physical measuring principle surfaces . IEE Proceedings Nano- biotechnol. 2004, VoI 151, No .3 , pp . 87-94) ist eine andere Variante der Filmbildung bekannt. Ausgehend von einem Aminocellulosederivat und von einem durch 3-Merkaptopropionsäure mit Carboxylgruppen funktionalisierten Gold-Substrat ist die

Bereitung von Biochip-Oberflächen mit kovalent immobilisiertem Enzymprotein bekannt .

Nachteilig werden Filmpartikel mit kovalent immobilisiertem Enzymprotein bei Kontakt der Biochip-Oberflächen mit wässri- gen Lösungen von der Substratoberfläche wieder abgelöst.

Aufgabe der Erfindung ist es, fest fixierte multifunktionale bzw. biofunktionale Oberflächenstrukturen bereit zu stellen.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Hauptanspruch und durch ein Material gemäß Nebenanspruch gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den darauf rückbezogenen Patentansprüchen .

Das Verfahren weist die erfindungsgemäßen Schritte auf:

Ein Substrat wird mit mindestens einem Aminocellulosederivat und/oder mindestens einem NH ₂ - (Organo)polysiloxanderivat in Kontakt gebracht.

Es ist dadurch gekennzeichnet, dass sich ein Substratverbundmaterial aus Substrat und Aminocellulosederivat und/oder Substrat und NH ₂ - (Organo) polysiloxan ausbildet.

Der Begriff Substratverbundmaterial ist hier synonym zu Ver- bundwerkstoff . Das hergestellte Substratverbundmaterial weist fest verbundene Materialien auf, deren Oberflächeneigenschaften die der Einzelkomponenten übertreffen.

Mit fest verbunden ist gemeint, dass die Oberflächenstrukturen in Lösungsmitteln unterschiedlichster Elektrolytzusammen- setzung beispielsweise auch unter Ultraschallbehandlung nicht gelöst werden können. Auch kovalent immobilisierte Biofunkti-

onsmoleküle werden nicht vom Substratverbundmaterial abgelöst.

Vorteilhaft werden durch das erfindungsgemäße Verfahren eine Vielzahl neuer erfindungsgemäßer Substratverbundmaterialien je nach Bedarf für unterschiedlichste Anwendung bereitgestellt .

Das Substratverbundmaterial wird bei Kontakt des Substrats mit einer Modifizierungslösung durch spontane, adhäsive Selbstorganisation eines darin enthaltenen Aminocellulosede- rivats bzw. NH ₂ - (Organo) polysiloxanderivats gebildet. Dabei werden Monolagen aus Aminocellulosen-Polymerketten und/oder NH ₂ - (Organo) polysiloxanen auf dem Substrat unter Beeinflussung der Substratoberflächenstruktur gebildet .

Das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Sub- stratverbundmaterial weist mindestens zwei unterschiedliche

Materialien, das heißt ein Substrat mit Aminocellulosederivat bzw. ein Substrat mit NH ₂ - (Organo) polysiloxanderivat auf. Es weist abhängig von den beteiligten Komponenten die neuen und vorteilhaften Eigenschaften auf, die die Einzelkomponenten nicht aufweisen.

Es ist denkbar, dass das Substratverbundmaterial drei oder mehr Materialien umfasst, z. B. ein Substrat mit einem Aminocellulosederivat und einem NH ₂ - (Organo) polysiloxan.

Bei Kontakt des Substrats mit der Modifizierungslösung bildet sich durch die komplementär adhäsiven Elektronenstrukturen der Komponenten und durch die daraus folgende Selbstorganisation eine polymere Monolagen-Interfacestruktur aus. Die Korn-

ponenten gehen durch eine gemeinsame Elektronenbandstruktur miteinander einen engen Verbund ein.

Sehr vorteilhaft ist es in der Regel ausreichend, das Substrat mit der Modifizierungslösung durch einfachste Mittel miteinander in Kontakt zu bringen. Hierunter fallen einfaches Schwenken, Tauchen, kurzzeitiges Aufbewahren und so weiter. Anspruchsvollere Verfahren, wie z. B. spin-coating, dip- coating, air-brushing, Mikrokontakt-Drucken können, müssen aber nicht, eingesetzt werden. Spin coating wird z. B. bei 1 bis 20 Tausend Umdrehungen pro Minute, insbesondere 15 Tausend Umdrehungen pro Minute und einer Rotationsdauer von 3 bis 10 Minuten angewendet. Beim dip-coating kann das Substrat beispielsweise für 5 bis 60 Sekunden, insbesondere für 30 Sekunden in die Modifizie- rungslösung getaucht werden.

Die Modifizierungslösung kann in einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung mittels eines mikro- oder nanostrukturierten Stempels aus einem Polymer, insbesondere aus PoIy (dimethyl- siloxan) (PDMS) , durch Mikro- oder Nanokontakt-Drucken (μCP) auf das Substrat aufgebracht werden.

Dabei werden vorteilhaft die Oberflächenstrukturen beispielsweise in Form eines nanoskaligen Linienmusters mit anwendungsspezifischen Linienabständen und Linienbreiten auf das Substratmaterial gestempelt. Der Stempel kann hierzu mit der Modifizierungslösung benetzt und danach für 2 bis 15 Minuten mit der Substratoberfläche in Kontakt gebracht werden. Der Stempel kann vorab durch Schütteln in der Modifizierungslösung für eine Zeitdauer von 1 bis 3 Stunden getränkt worden sein und nach dem Tränken 1 bis 2 Minuten im Argon-Strom belassen werden.

Die Substratverbundmaterial-Oberfläche kann durch NH ₂ - reaktive Funktionalisierung zur Änderung des Wasser- Kontaktwinkels, das heißt zur Änderung der Hydropho- bie/Hydrophilie-Balance und/oder zur kovalenten Kopplung mit (Bio-) Funktionsmolekülen oder Nanopartikeln mittels einer NH ₂ -reaktiven bifunktionellen Reagenz funktionalisiert bzw. chemisch aktiviert worden sein.

Die NH ₂ -reaktive Funktionalisierung kann vorteilhaft anwendungsspezifisch ausgewählt werden. Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, dass positive oder negative Ladungsverteilungen, pH-, Chelat-, Redox- oder Chromogen-Eigenschaften ganzflächig oder in Form von Strukturmustern auf der Substratverbundmaterial-Oberfläche hergestellt werden.

Es sind für diese Verfahren vorteilhaft auch nicht notwendi- gerweise hohe Temperaturen oder andere Katalysatoren nδtig, sondern die spontane Adhäsion tritt auch bei Raumtemperatur auf .

Im Rahmen der Erfindung wurde überraschend gefunden, dass die spontane Adhäsion auf dem Substrat in der Regel schon nach wenigen Minuten (< 5 Minuten) erfolgt. Das Verfahren sieht daher in der Regel ein kurzes in Kontaktbringen des Substrats mit der Modifizierungs-Lösung vor.

Das Verfahren kann zur ganzflächigen Modifizierung beliebig kleiner Substrat-Abmessungen oder zur Oberflächen-Modifi- zierung in mikrofluidischen (Sensor-) Systemen oder zur Herstellung mikro- und nanoskaliger Oberflächenstruktur-Muster nach dem Prinzip des Mikrokontakt-Drückens eingesetzt werden.

Die Konzentration der eingesetzten Aminocellulosederivate und NH ₂ - (Organo)polysiloxane darf nicht zu hoch gewählt werden. Ansonsten werden Aggregate der eingesetzten polymeren Derivate auf der Substratoberfläche abgelagert, die nicht als Sub- stratverbundmaterial im Sinne der Erfindung gelten.

Besonders vorteilhaft wird als Modifizierungslösung eine 0,05 bis 0,5%ige Aminocellulosederivatlösung der Formel I verwendet (s. u.) . Es ist denkbar, höhere Konzentrationen bis 5% zu verwenden, allerdings muss dann der Waschvorgang intensiviert werden.

In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung wird als Modifizierungslösung eine 0,03 bis l%igen NH ₂ - (Organo) polysiloxan- lösung der allgemeinen Formeln Pl bis P5 (s.u.) verwendet. Besonders vorteilhaft ist eine Konzentration von etwa 0,03 bis 0,1%.

Das Substrat wird nach Kontakt mit der Modifizierungslösung mit dem jeweiligen Lösemittel gewaschen, z. B. durch Schütteln bei mehrfacher Lösemittelanwendung oder im Ultraschall- bad. Bei einer auf diese Weise durchgeführten Substratbehandlung liegen die auf dem Substrat angeordneten Polymerketten in einer Dickenabmessung < 1 bis 3 Nanometer vor. Dies entspricht im Falle eines Aminocellulosederivats etwa nur einer Monolage der entsprechend auf dem Substrat aufge- brachten Polymerketten.

Die Polymerketten sind auf dem Substrat über genannte gemeinsame Elektronenbandstrukturen fest fixiert und verleihen dem gebildeten Substratverbundmaterial eine neue Qualität in Bezug auf eine spätere Anwendung.

Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass je nach Art der verwendeten Aminocellulosederivate und/oder NH ₂ - (Organo) poly- siloxane erstmalig ein Strukturdesign auf dem Substrat für die weitere vorzugsweise biophysikalische oder biomedizini- sehe Anwendung möglich ist.

Ein grundlegender Vorteil bei der Verwendung der Polysaccharidstrukturen in Form von Cellulosestrukturen ist, dass Polysaccharide natürlicherseits in Gesellschaft mit Proteinen bzw. Zellen vorkommen und an diese binden.

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung werden die Substratverbundmaterialien mit Funktionsmolekülen versehen, die je nach Art der Verwendung ausgewählt werden können. Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, dass auf die Monolagen aus Aminocellulosederivat und/oder NH ₂ - (Organo) polysiloxanen wei- tere Moleküle, z. B. Bio-Funktionsmoleküle durch elektrostatische oder kovalente Kopplung aufgebracht werden. Diese dienen dann z. B. zum Nachweis eines Analyten mit Komplementärstruktur. Es ist denkbar, durch ein derartiges Strukturdesign eine Pro- tein- oder Zelladhäsion oder eine Körperabwehrreaktion zu fördern bzw. zu vermeiden.

Die erfindungsgemäßen Substratverbundmaterialien finden beispielsweise Anwendung bei der Herstellung von Biochips und Implantaten mit verbesserten biokompatiblen Oberflächeneigen- Schäften im Sinne einer verbesserten Körperverträglichkeit. Es können besonders vorteilhaft auch geeignete textile Substrate, z. B. Baumwolle mit gewünschten Modifizierungslösungen strukturiert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die Substratverbundmaterialien werden insbesondere zur Entwicklung nanostrukturierter biofunktionaler Implantatoberflächen angewendet. Dabei kann das erfindungsgemäße Oberflächenstrukturdesign auf alle biomedizinisch relevanten Substratmaterialien bzw.

Implantate zur Herstellung der als biokompatibel erkannten Oberflächenstrukturen, wie hydrophobe, hydrophile, elektrostatisch negative, biofunktionalisierte, nanoskalig Strukturgemusterte und Zelladhäsive und/oder topografisch definierte Oberflächen, angewendet werden.

Derartige Eigenschaften und Anwendungsmδglichkeiten bieten nur die erfindungsgemäßen Substratverbundmaterialien, nicht jedoch die Einzelkomponenten und keinesfalls unmodifizierte Substrate bzw. Implantate.

Den Substraten, die mit den Aminocellulosederivaten oder NH ₂ - (Organo) polysiloxanderivaten Substratverbundmaterialien bilden, ist gemeinsam, dass sie in Bezug auf die Derivate komplementär adhäsive Elektronenstrukturen vorzugsweise durch Sauerstoff- bzw. Hydroxy-Funktionen auf den Substratoberflä- chen besitzen, die die adhäsive Selbstorganisation der Amino- cellulosederivate und/oder NH ₂ - (Organo) polysiloxane insbesondere über deren NH ₂ -Gruppen bewirken und somit für den festen Verbund sorgen.

Besonders vorteilhaft ist man bei der Wahl des Substrats nicht eingeschränkt .

Es können biophysikalisch und medizinisch relevante oder auch textile Substrate gewählt werden, sofern diese geeignet sind, mit den Aminocellulosederivaten und/oder NH ₂ - (Organo) polysi- loxanen über spontane Adhäsion ein Substratverbundmaterial mit den oben genannten Eigenschaften auszubilden.

Substrate, die nur geringe bis keine adhäsiven Eigenschaften bei Kontakt mit einer Modifizierungslösung entfalten, werden vorab in einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung mit Sau- erstoffplasma oder durch ein anderes Sauerstoff- oder OH- Funktionen erzeugendes Verfahren behandelt .

Besonders vorteilhaft werden sie zu diesem Zweck vorab mit einem ultradünnen SiO _x -Polymerfilm mit einer Dicke < 1 bis 2 Nanometer beschichtet .

Es ist im Rahmen des Verfahrens ohne weiteres denkbar, ver- schiedenartige Substrate, z. B. zur Bildung eines Array, nebeneinander in einer Ebene anzuordnen.

Als Substrate können eingesetzt werden: Glastyp-Substrate (hydrophilisiert oder pyrolytisch SiO _x -Polymer-beschichtet) , Si- oder SiO ₂ -Substrate mit nativer oder thermisch erzeugter Si0 ₂ -Polymerschicht oder pyrolytisch mit SiO _x -Polymer beschichtet und Metall- und Metall/Metalloxid-Substrate. Hierunter fallen z. B. Gold, Silber, Platin, Titan, Tantal, Aluminium, Zirkon, Vanadium, Niob, Chrom, Molybdän, Wolfram, Mangan, Technetium, Rhenium, Ruthenium, Osmium, Kobalt, Rho- dium, Iridium, Nickel, Palladium, Kupfer und deren Oxide.

Makromolekulare Substrate, wie Keramik aus z. B. Zirkonoxid oder Nanopartikel , wie Gold-, SiO ₂ - oder Metalloxid-Nano- partikel sind ebenfalls umfasst. Weiterhin kommen in Betracht : Polymere mit Hydroxygruppen bzw. Sauerstoff-Funktionen, z. B. Polysaccharide (Cellulosen in Faser- oder Hohlfaser-Form und Bakteriencellulosen in Flächen- oder Röhrenform) . Polysiloxane bzw. (Orga- no)polysiloxane, wie Polydimethylsiloxan (PDMS), NH ₂ - (Organo) polysiloxane, Polymethylmethacrylat, PoIy-N- isopropylacrylamid (PNiPAM) , Poly-Glykolid-co-Lactid (PGL) .

Polymere mit Carboxyl- oder Sulfogruppen (Polyhydroxiethyl- methacrylat (PHEMA) , Kationen-bindende Polystyrole) , Proteine (Kollagene, Glykoproteine) und textile Substrate, wie Baumwolle, Wolle.

Die multifunktionalen Oberflächenstrukturen der Substratverbundmaterialien sind charakterisiert durch ihre Dickenabmessungen kleiner 1-3 Nanometer.

Sie weisen eine hohe Variabilität in der Hydrophilie- bzw. Hydrophobiebalance auf, gekennzeichnet durch einen Wasser- Kontaktwinkel kleiner 40 bis größer 90 Grad.

Sie weisen weiterhin eine große strukturelle Variabilität der kovalenten Funktionalisierungsmöglichkeiten, ausgehend von NH ₂ -Ankergruppen-Dichten von 0,2 bis 5 nMol pro cm ² der Substratoberfläche, auf.

Eine definierte Oberflächentopografie bei RMS-Rauhigkeiten von 0,5 bis 2 Nanometer durch AFM vermessen ist die Regel. Sofern das Substrat vor der Modifizierung mit einem Plasma, insbesondere mit einem Argon- oder Sauerstoff-Plasma behandelt wird, werden vorteilhaft besonders geringe RMS-Rauhig- keiten kleiner 0,5 Nanometer der Substratverbundmaterialoberfläche gebildet.

Zur Bereitung der Modifizierungslösung werden die Aminocellu- losederivate vorzugsweise in bidestilliertem Wasser oder Di- methylacetamid (DMA) gelöst . NH ₂ - (Organo)polysiloxane werden vorzugsweise in Methanol, Ethanol oder 2-Propanol gelöst.

Sie werden vorzugsweise mittels Zentrifugalfilterröhrchen mit einer Porenweite von 0,2 bis 0,45 μm filtriert.

1. Aminocellulose- und NH ₂ - (Organo) polysiloxanderivate

Als Aminocellulosederivate kommen z. B. alle im nachfolgend genannten FormelSchema 1 Verbindungen in Betracht.

Formelschema 1

NH,

Allgemeine Formel I : Anhydro-Glucoseeinheit (AGU)

Mögliche Substituenten an der AGU sind :

S = Acetat-, Benzoat-, Carbanilat-, Propionat-, Tosylat- oder Methoxy-Gruppen, gemäß dem Substitutionsgrad von S (DS ₃ : 0 < DS ₃ < 2 an C2/C3 der AGU) .

(X) = Spacergruppen, gemäß dem Substitutionsgrad von -NH(X)NH ₂ (DS _NH (X)NH2 0 < DS _NH (X)NH2 < D an C6 der AGU) : Siehe Typ a bis d in Formelschema 1.

n = 100 bis 1500, vorzugsweise 200.

Derivate der Aminocellulose-Leitstruktur gemäß Allgemeiner Formel I können sein:

Typ a: (X)= Alkylen-Rest (CH ₂ ) ι; i= 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12;

Typ b: (X)= Oligoamin-Rest , z. B.

-CH ₂ -CH ₂ -NH-CH ₂ -CH ₂ -, („DETA-Cellulose") oder

-CH ₂ -CH ₂ -CH ₂ -NH-CH ₂ -CH ₂ -CH ₂ -, („DPTA-CeIlulose") oder

-CH ₂ -CH ₂ -NH-CH ₂ -CH ₂ -NH-CH ₂ -CH ₂ -, („TETA-Cellulose") oder

-CH ₂ -CH ₂ -NH-CH ₂ -CH ₂ -NH-CH ₂ -CH ₂ -NH-CH ₂ -CH ₂ -, („TEPA-Cellulose") als Isomere oder

-CH ₂ -CH ₂ -NC _CH ² ] _CH ² ] _NH („TETAT-Cellulose")

Diese Derivate des Typ b weisen vorzugsweise als Substituent S ein Tosylat auf, wobei das Derivat in Wasser löslich ist, oder aber ein Carbanilat auf, wobei das Derivat in DMA lös- lieh ist.

Typ c: (X)= Aryl oder Aryl-Alkylen-Rest , z. B.:

( 1 ) = PDA- Cellulosetosylat oder

(4a) = XDA _O -Cellulosecarbanilat

(4b) = XDA _m -Cellulosecarbanilat

(4c ) = XDAp-Cellulosecarbanilat

Typ d: N,N-disubstituierte PDA-Cellulosen, mit redox- chromogenen Eigenschaften, z. B.:

Die oben genannten Derivate gemäß FormelSchema 1 können durch weitere Derivatisierungen von Tosylcellulose bzw. Tosylcellu- losederivaten mit Diaminen, Oligoaminen bzw. Polyaminen erweitert werden.

Als NH ₂ - (Organo) polysiloxanderivate kommen z. B. die nachfolgend in FormelSchema 2 genannten Verbindungen in Betracht.

Formel Schema 2 :

Allgemeine Formel II

Die NH ₂ - (Organo) polysiloxanderivate Pl bis P3 werden durch ein Gemisch aus NH ₂ - (Organo) silan/Wasser, vorzugsweise in den Mol-Verhältnissen 1:3 (Pl), 1:2 (P2) und 1:1 (P3), hergestellt.

Für die Reste gelten nachfolgende Vorgaben:

Entweder ist

Ri und R ₂ = H oder Methyl bzw. Ethyl und

R, R ₃ und R ₄ = NH ₂ - (Organo) polysiloxan-Strukturen,

oder es ist

R ₁ und R ₃ = H oder Methyl bzw. Ethyl und

R, R ₂ und R ₄ = NH ₂ - (Organo) polysiloxan-Strukturen,

oder es ist

Ri und R ₄ = H oder Methyl bzw. Ethyl und

R, R ₂ und R ₃ = NH ₂ - (Organo) polysiloxan-Strukturen,

oder es ist

R ₂ und R ₄ = H oder Methyl bzw. Ethyl und

R, Ri und R ₃ = NH ₂ - (Organo) polysiloxan-Strukturen,

oder es ist

R ₂ und R ₃ = H oder Methyl bzw. Ethyl und R, Ri und R ₄ = NH ₂ - (Organo) polysiloxan-Strukturen.

Für die Substituenten (X) in P _x bis P ₃ gilt:

NH

(CH ₂ J ₂ (CH ₂ J ₂ NH NH

(X) = (CH ₂ ) ₃ (CH ₂ ) ₃ (CH ₂ J ₃ a b c

Es können als NH ₂ - (Organo) polysiloxanderivate aber auch die nachfolgenden Verbindungen P4 bis P5 eingesetzt werden.

Allgemeine Formel II (Fortsetzung)

Die NH ₂ - (Organo) polysiloxanderivate P4 und P5 werden durch ein Gemisch aus NH ₂ - (Organo) silan/Wasser, vorzugsweise in den Mol-Verhältnissen 1:2 (P4) bzw. 1:1 (P5) , hergestellt.

Für die Reste gelten nachfolgende Vorgaben: Entweder ist

R ₁ und R ₂ = H oder Methyl bzw. Ethyl und

R ₃ und R ₄ = NH ₂ - (Organo) polysiloxan-Strukturen,

oder es ist,

R ₁ und R ₃ = H oder Methyl bzw. Ethyl und R ₂ und R ₄ = NH ₂ - (Organo) polysiloxan-Strukturen,

oder es ist

R ₁ und R ₄ = H oder Methyl bzw. Ethyl und

R ₂ und R ₃ = NH ₂ - (Organo) polysiloxan-Strukturen,

oder es ist

R ₂ und R ₄ = H oder Methyl bzw. Ethyl und

R ₁ und R ₃ = NH ₂ - (Organo) polysiloxan-Strukturen.

Für die Substituenten (X) in P4 bis P5 gilt:

a b c

Die oben genannten NH ₂ - (Organo) polysiloxanderivate gemäß Formelschema 2 können besonders vorteilhaft auch in Kombination mit den Aminocellulosederivaten beim erfindungsgemäßen Strukturdesign der Substratverbundmaterialien eingesetzt werden.

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung kann das Substrat im Falle des erfindungsgemäßen Strukturdesigns durch ein NH ₂ - (Organo) polysiloxanderivat vorab mittels des

hydrophilen SiO _x -Polymers in Dickenabmessungen kleiner als 1 bis 2 Nanometer pyrolytisch modifiziert werden. Dies gelingt vorteilhaft durch eine einfache und kurzzeitige, das heißt in einer weniger als 1 Sekunde andauernden, Behand- lung des Substrats mittels Verfahren gemäß 2.3.

Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich dann auch bei solchen Substratmaterialien anwenden, die nicht von vornherein mit den Derivaten gemäß Formelschema 1 und 2 spontan adhäsiv getriebene Oberflächenstrukturen ausbilden.

2.1 Oberflächenstrukturdesign von Substraten mit Aminocellu- losederivaten

Grundlage der Derivatisierung der Aminocellulosen-Leit- struktur ist die unterschiedliche S _N2 -Reaktivität der OH- Funktionen an C6 bzw. C2/C3 der AGU, s. Allgemeine Formel I.

Der allgemeine Derivatisierungs-Ansatz geht z. B. von einem 6 (2) -O-Tosylcellulosederivat , vorzugsweise von kommerziell erhältlichen 6 (2) -O-Tosylcellulosen oder 6 (2) -O-Tosylcel- lulose-carbanilaten aus, die an C6 der AGU einen reaktiven Tosylat-Rest und an C2/C3 der AGU löslichkeitsvermittelnde Substituentengruppen, wie Tosylat oder Carbanilat mit unterschiedlichem Substitutionsgrad DS (0< DS _S <2) besitzen (s. „S" in der allgemeinen Formel I) .

Der Tosylat-Rest an C6 wird in einem Modifizierungsansatz durch Diamin- oder Oligoamin-Verbindungen H ₂ N- (X) -NH ₂ " sub- stituiert (s. (X) in Formel I) . Dazu wird die Tosylcellulose bzw. das Tosylcellulosecarbanilat in Dimethylsulfoxid (DMSO) mit einem Modifizierungs-Reagenz H ₂ N-(X)-NH ₂ (s. (X), Typ a bis d in Formelschema 1) gemischt und für 3 bis 6 h auf 70

bis 100 ⁰ C erhitzt. Nach Abkühlung wird das Reaktionsgemisch in ein Gefäß mit Tetrahydrofuran gegossen. Dabei fällt das gewünschte Aminocellulosen-Derivat als Feststoff aus. Das Derivat wird isoliert, mit Tetrahydrofuran und Ethanol gewa- sehen und danach getrocknet . Das Aminocellulosen-Derivat ist je nach Struktur des Substituenten S (s. allgemeine Formel I) und Substitutionsgrad DS ₃ an C2/C3 in Wasser oder Dimethyl- acetamid (DMA) löslich.

Auf diese Weise werden alle Derivate der Aminocellulose gemäß Formelschema 1 hergestellt.

Das erfindungsgemäße Verfahren stützt sich daher besonders vorteilhaft auf die vielfältigen strukturellen Modifizierungsmöglichkeiten der Aminocellulosen nach dem allgemeinen Derivatisierungs-Ansatz .

Die Derivatvielfalt lässt sich vorteilhaft komplettieren, wenn der allgemeine Derivatisierungsansatz von Tosylcellulo- sederivaten mit Substituenten-Gruppen S, wie z. B. Acetat, Propionat, Benzoat, Methoxy an C2/C3 der AGU ausgeht und weitere Diamine, Oligoamine oder Polyamine in die Substitutions- reaktion an C6 einbezogen werden.

2.1.1 Spacereffekt und strukturelle Eigenschaftsmuster durch (X) an AGU-Position C6

Abgestufte Abstände (Spacereffekt) der NH ₂ -Endgruppen zur Cellulosekette werden an AGU-Position C6 dadurch bereit ge- stellt, dass (X) in der allgemeinen Formel I eine Alkylen-, Aryl-, Aralkylen- oder Oligoamin-Struktur ist (s. (X) -Typ a bis d in Formelschema 1) . Beispielsweise variieren die Matrixabstände zwischen etwa 0,4 und 2 nm, wenn Derivate mit

Strukturen (X) der Typ-Reihe a bzw. b aus FormelSchema 1 eingesetzt werden.

Durch Strukturen (X) der Typ-Reihen a bis c werden insbesondere die Reaktivitäts- bzw. spontanen Adhäsions-Eigenschaften entlang der Aminocellulosen-Polymerketten modifiziert, wie auch die pH-Eigenschaften sowie die Hydrophilie- bzw. Hydrophobie-Balance .

Vorteilhaft kann beispielsweise mit zunehmender Alkylen- Kettenlänge (X) gemäß Typ a aus FormelSchema 1 das hydrophobe Eigenschaftsmuster der entsprechenden Derivate dominanter und der Spacereffekt größer eingestellt werden.

Sofern besondere Elektronentransfereigenschaften des Substratverbundmaterials erwünscht sind, können Aminocellulose- derivate mit EDA- (Typs a, i=2) oder mit Oligoamin-Resten (Typ b) an C6 verwendet werden, da diese Derivate Chelate mit Schwermetall -Ionen, z. B. blaugefärbte Cu ²⁺ -Chelate (λ _Max -Werte = 560 bis 630 nm) , ausbilden, die im Falle ihrer Anwendung den entsprechenden Substratoberflächen besondere Elektronentransfereigenschaften verleihen. Deshalb sind sie für die Kopplung mit biologischen Redoxsystemen insbesondere mit Cu- Proteinen von besonderer Bedeutung.

Derivate mit Spacerstrukturen (X) des Typs c und d sind vorteilhaft redoxaktiv bzw. -chromogen. Diese Eigenschaften weisen bei adhäsiver Fixierung auf Substratoberflächen je nach Struktur (X) und redoxchromogener Folgereaktion spezielle Elektronentransfer-Eigenschaften auf .

Der Grad der strukturellen Modifizierung mittels (X) entlang der Aminocellulosenpolymerketten ist durch den Substitutions-

grad DS _NH (X)NH2 veränderbar.

Dies determiniert bei lateraler Übertragung auf die Substrat- Oberfläche die Dichte der funktionellen Gruppen und in Relation zur Substitution S bzw. DS ₃ die funktionelle Eigenschaft auf der Substratoberfläche.

2.1.2 Löslichkeit und Hydrophilie- bzw. Hydrophobie-Balance mittels S an AGU-Position C2/C3

Vorteilhafte Eigenschaften erhalten die Aminocellulosederiva- te auch mittels Substitution der OH-Gruppen an C2/C3 durch unterschiedliche Estergruppen. Dies hat auf die Löslichkeit der Aminocellulosederivate einen determinierenden Einfluss . Der Substitutionsgrad DS ₃ , das heißt das Verhältnis von OH- /Ester-Gruppen an den (Aminocellulosen-) Polymerketten entscheidet darüber, ob das Derivat in Wasser oder in einem or- ganischen Lösungsmittel, z. B. DMA löslich ist: Darüber hinaus beeinflusst der DS ₃ die Hydrophilie- bzw. Hydrophobie- Balance. Darüber hinaus geht auch von den Strukturen an den AGU-Positionen C2/C3 (OH- bzw. Ester-Gruppen) ein Einfluss auf die adhäsiven Elektronenstruktur-Eigenschaften der Amino- cellulosenpolymerketten aus.

Beispielsweise sind EDA-Cellulosetosylate (Typ a, i=2) bzw. Aminocellulosentosylate der (X) -Typ-Reihe b aus Formelschema 1 bei DS _Tθs yiat-Werten von 0,1 bis 0,2 in Wasser löslich. In wässrigem Milieu stellen sich bei diesen Derivaten pH-Werte zwischen 10 und 11 ein.

Für das Strukturdesign lassen sich vorteilhaft durch Titration z. B. mit 5n HCl Biomolekül -relevante pH-Optima, z. B. pH 5,5 bis 8, einstellen.

2.2 Oberflächenstrukturdesign von Substraten mittels NH ₂ - (Organo) polysiloxanderivate

Die NH ₂ - (Organo) polysiloxane der allgemeinen Formeln Pl bis P5 aus Formelschema 2 werden aus NH ₂ - (Organo) alkoxysilan/Was- sergemischen oder NH ₂ - (Organo) alkoxysilan/Wasser/Ethanol- gemischen oder NH ₂ - (Organo) alkoxysilan/Wasser/Methanolge- mischen oder vorzugsweise NH ₂ - (Organo) alkoxysilan/Wasser/2- Propanol-Gemischen gebildet. Die Zusammensetzung kann variieren, z.B. zwischen Molverhältnissen (Organo) alko- xysilan/Wasser wie 1:3, 1:2 oder 1:1, und Zusatz einer kata- lytisehen Menge In HCl durch 3 bis 4 -stündiges Rühren.

Die erhaltenen NH ₂ - (Organo) polysiloxane lösen sich vorteilhaft zwischen 0,03 und 1%-ig z. B. in Methanol, Ethanol oder 2 -Propanol und stehen sodann für die erfindungsgemäße Ober- flächen-Modifizierung bereit.

Als (Organo) alkoxysilane werden für die Herstellung der NH ₂ - (Organo) polysiloxane beispielsweise 3-Aminopropyl-trimetho- xysilan, 3-Aminopropyl-triethoxysilan, 3- [2- (2-Amino- ethylamino) ethylamino] propyl-trimethoxysilan, 3- (2- Aminoethylamino) propylmethyl-dimethoxysilan oder vorzugsweise 3- (2 -Aminoethylamino) propyl-trimethoxysilan bzw. Silan- Gemische aus NH ₂ - (Organo) alkoxysilanen oder aus NH ₂ - (Organo) alkoxysilan und (Organo) alkoxysilan (ohne NH ₂ - Gruppen) oder aus NH ₂ - (Organo) alkoxysilan und Tetraalkoxysi- lan eingesetzt.

Die NH ₂ - (Organo) polysiloxan-Derivate werden vorzugsweise in Ethanol- oder 2 -Propanol- Lösungen angewendet und vor ihrem Einsatz z. B. mittels Zentrifugal-Filter-Röhrchen (Porenweite z. B. 0,2 bis 0,45 μm) filtriert.

Besonders vorteilhaft ist die Anwendung der relativ hydrophoben NH ₂ - (Organo)polysiloxanderivate in Kombination mit Amino- cellulosederivaten .

Vorteilhaft werden beispielsweise Substratverbundmaterialien mit mikro- und nanoskaligen Mustern alternierender hydrophober und NH ₂ -Gruppenhaitiger Oberflächenstrukturen oder alternierender NH ₂ -Gruppenhaitiger Oberflächenstrukturen mit unterschiedlichen NH ₂ -Spacerlängen (X) ausgehend von NH ₂ - (Organo) polysiloxan-modifizierten Substratoberflächen und μCP mittels entsprechender Aminocellulosederivate hergestellt.

Vorteilhaft ist auch die Anwendung von NH ₂ - (Organo) poly- siloxanderivaten zur Hydrophobisierung von geeigneten texti- len Substraten oder beim Oberflächenstrukturdesign von Aluminiumoxid- bzw. Zirkonoxid-Keramiken oder von Biochips, vor- zugsweise ausgehend von Glastyp-, Si/SiO ₂ -, Gold-, PDMS-

Substraten, und anschließender Bio-Funktionalisierung, z. B. in mikrofluidischen Sensorsystemen.

Bei anderen kombinierten Anwendungen von NH ₂ - (Organo) poly- siloxanen und Derivaten der Amino-cellulosen-Leitstruktur zur Herstellung von Substratverbundmaterialien wird z. B. folgendermaßen verfahren: Ausgehend von SiO _x -Polymer-modifizierten Glastyp-Substraten oder von Si/SiO ₂ -Substraten, wird die Substratoberfläche mittels NH ₂ - (Organo) polysiloxanderivat Pia gemäß Formelschema 2 modifiziert. Anschließend wird z. B. mittels 0,1 n HCl protoniert und danach beispielsweise mit einer Modifizierungslösung von EDA-Cellulosecarbanilat (Typ a, i=2) gemäß (X) -Typ b aus Formelschema 1 behandelt. Ganz besonders vorteilhaft bewirkt dies die Ausrichtung der Aminocellulosen-Polymerketten in mehr oder weniger vertikal angeordneten Polymerkettenbündeln.

Auch diese Ausrichtung ist selbstjustierend, so dass sich die

Aminocellulosen-Polymerketten einerseits auf der Substratoberfläche repulsiv ausrichten und andererseits kettenadhäsiv aggregieren. Bei der AFM-Vermessung stellt sich dies auf der Substratoberfläche als typische Polymerkettenbündel bzw. bürstenförmige Topografie dar.

Bei der AFM-Vermessung der modifizierten Substratoberflächen werden zwischen den Polymerketten-Bündeln Mulden- oder Gra- bentopografien sichtbar.

Besonders vorteilhaft sind diese speziellen topografischen Oberflächenstrukturen für die Biochip-Entwicklung, wenn Substratoberflächen mit einem hohen Grad der Bio-Funktionali- sierung benötigt werden.

Denn bei dieser Topografie der Aminocellulosen-Strukturen stehen entlang der Polymerketten mittels NH- (X) -NH ₂ an C6 der AGU bei idealisierter Kettenlänge von ca. 100 nm zahlreiche NH ₂ -Ankergruppen für die Bio-Funktionalisierung zur Verfügung.

Des Weiteren ist vorteilhaft, dass sich Derivat-typische Milieu-Bedingungen zwischen den Polymerketten auf der Substrat- Oberfläche einstellen. Das eröffnet die Möglichkeit, bei der Modifizierung von Substratoberflächen solche Aminocellulosen- derivate einzusetzen, die anhand ihrer Strukturen (X) und S sowie der Substitutionsgrade DS _NH ( _X ) _NH2 und DS _S jeweils biospezifische Milieubedingungen erwarten lassen.

Eine Beeinflussung der Milieubedingungen auf der Substratverbundmaterialoberfläche geht im Falle der kovalenten Bio- Funktionalisierung auch von den NH ₂ -reaktiven Kopplungsreagenzien aus, wie entsprechende Untersuchungen unter Einsatz von Enzymproteinen als Bio-Funktionsmoleküle zeigten.

2.3 Oberflächen-Modifizierung von Substraten mittels hydrophiles SiO _x -Polymer

Ein Silicoatingverfahren ist überraschenderweise hervorragend geeignet, um Substratmaterialien, die kurzzeitig hitzestabil sind, durch Bildung einer ultradünnen SiO _x -Polymerstruktur zu hydrophilisieren. Das Kernstück des Verfahrens ist ein Brenner, der mit einem Pyrosilgasgemisch gefüllt ist. Das Gasgemisch enthält eine Silizium-organische Verbindung, die sich bei dem Verfahren unter Bildung eines SiO ₂ /Silikat-Gemisches flammenpyrolytisch zersetzt.

Beispielsweise wird auf Glastyp-, Silizium- oder Metall- Substratoberflächen durch kurzzeitiges (< 1 sec) Befächeln mit der Flamme des oben genannten Brenners ein SiO ₂ /Silikat- Gemisch gebildet, woraus nach kurzer Zeit ein glasartiges SiO _x -Polymer als ultradünne und transparente Oberflächenstruktur mit einer Dickenabmessung kleiner 1 - 2 Nanometer entsteht. Die SiO _x -Polymer-modifizierten Substratoberflächen haben ähnlich geringe RMS-Rauhigkeiten wie die thermisch bei 600°C erzeugten Si0 ₂ -Polymerschichten auf Si-Substratproben.

Das stark hydrophile SiO _x -Polymer (Wasser-Kontaktwinkel kleiner 10 bis 15 Grad) wird wie erwähnt vorab verwendet, wenn die erfindungsgemäße Bildung des Substratverbundmaterials durch Oberflächen-Modifizierung via Aminocellulosederivaten und/oder NH ₂ - (Organo)polysiloxanen nicht von vornherein zum Ziel führt.

Die offensichtlich hohe OH-Gruppendichte bzw. Hydrophilie des SiO _x -Polymers ist aber auch direkt, das heißt ohne weitere Funktionalisierung, für adhäsive Bio-Funktionalisierungen z. B. durch funktionelle Proteine, Zellen oder andere Bio-

funktionsmoleküle oder für kovalente Bio-Funktionalisierungen mittels üblicher OH-reaktiver Reagenzien anwendbar.

2.4 Variationsmöglichkeiten des Verfahrens

Die Oberflächen-Modifizierung geschieht auf einfache Weise in einem Gemisch der Substratprobe und einer Modifizierungslösung, bestehend aus einem Derivat der Aminocellulosen gemäß Formelschema 1 in bidestilliertem Wasser bzw. Dimethylaceta- mid (DMA) und/oder aus einem NH ₂ - (Organo) polysiloxanderivat gemäß FormelSchema 2 z. B. in 2-Propanol.

Beispielsweise werden 0,03 bis 0,l%ige filtrierte Derivatlösungen mit den Substratproben in Kontakt gebracht .

Welches Verfahren angewendet wird, richtet sich im Wesentlichen nach dem Substratmaterial und nach der erforderlichen Qualität und dem Anwendungszweck der modifizierten Substrate. Aber auch die Art der Vorbehandlung der Substratoberfläche, z. B. die Reinigung oder eine vorangehende Plasmabehandlung oder eine Modifizierung mittels SiO _x -Polymer des Substrats spielen hierfür eine Rolle.

Es hat sich bewährt : - Schütteln des Ansatzes, z.B. 1 Min. bis 6 h,

- Schütteln des Ansatzes im Ultraschallbad, z. B. 5 bis 30 Min. ,

- Stehen lassen des Ansatzes, vorzugsweise bei Raumtemperatur, - Aufschleudern (spin-coating) der Derivat-Lösung,

- Auftropfen der Derivat-Lösung,

- kurzes Eintauchen (dip-coating) in die Derivat-Lösung, oder

- Versprühen (air-brush-Verfahren) der Derivat-Lösung.

Anschließend wird gegebenenfalls mehrmalig mit bidestillier- tem Wasser oder DMA oder mit Methanol, Ethanol oder 2- Propanol gewaschen, z.B. unter Schütteln oder im Ultraschall- bad. Abschließend wird das Substratverbundmaterial im Argon- Strom getrocknet . Das Substratverbundmaterial bleibt dabei miteinander fixiert. Die Modifizierung der Substratoberflächen ist je nach Substratmaterial und seiner Vorbehandlung in der Regel nach 1 bis 5 Minuten Schütteln, anschließendem intensiven Waschen mit bidestilliertem Wasser bzw. DMA und nachfolgendem Trocknen im Argon-Strom beendet.

Von besonderer Bedeutung für die Nanotechnologie ist die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens

- in Kombination mit μCP, zur Herstellung von Substratverbundmaterialien mit nanoskaligen Mustern von Oberflächenstrukturen oder

- bei der Herstellung analytsensitiver Biochips im mikroflui- dischen Sensorsystem.

Aus ellipsometrisch ermittelten und mittels AFM verifizierten Dickenabmessungen D« 0 , 5 bis 1 Nanometer von PDA-Cellulose- tosylatpolymerketten (s. Formelschema 1) auf Au (111) -Substratoberflächen ist beim Vergleich mit einem kalkulierten Wert D=O, 8 Nanometer für die Dickenabmessung von PDA-Cellulo- seketten nach Computer-Molekülmodellverfahren zu schließen, dass quasi Monolagen der Aminocellulosenpolymerketten auf die Substratoberfläche übertragen werden.

Mittels computergestützter Kalkulationen des Molekülmodells von Polymerketten-Monolagen für EDA-Cellulose (s. Typ a, i=2, Formelschema 1) ergibt sich D= 1 Nanometer und für TEPA- Cellulose (vgl. Typ b, Formelschema 1) D«3 Nanometer.

Vorteilhaft weisen die modifizierten Substratverbundmaterialien bzw. ihre Oberflächen eine definierte Topografie mit geringer RMS-Rauhigkeit von meist 0,1 bis 1,5 Nanometer auf.

Auch nach kurzzeitiger Behandlung von Substrat mit Modifizierungslösung sind die Oberflächenstrukturen via Derivate gemäß Formelschema 1 und 2 auf der Substratoberfläche fest fixiert, wie Folgereaktionen mit NH ₂ -reaktiven Kopplungs-Reagenzien, Behandlungen der modifizierten Substratproben mit Lösemitteln bzw. wässrigen Lösungen wechselnder Elektrolyt-Zusammensetzung im Ultraschallbad sowie unter kinetischen Messbedin- gungen bei massesensitiver Vermessung der modifizierten Substratproben im mikrofluidischen Sensorsystem zeigen.

In einigen Fällen werden die Substratverbundmaterialien z. B. mit einer l%igen wässrigen Glutaraldehyd (GDA) -Lösung kurzzeitig bei einer Zeitdauer von etwa 10 bis 30 Sekunden behan- delt und anschließend mit bidestilliertem Wasser mehrfach gewaschen, frei von überschüssigem GDA.

Der Effekt der partiellen Vernetzung der Oberflächenstruktur bzw. der Aminocellulosenpolymerketten wird auch mittels NH ₂ - reaktiver Reagenzien anders als GDA erreicht. Die partielle Vernetzung wird beispielsweise im speziellen Falle angewendet, wenn Oberflächenstrukturen mit einer Dickenabmessung größer als 3 Nanometer, das heißt molekulare Multischichten auf der Substratoberfläche erforderlich sind.

Als wesentliche Parameter zur Charakterisierung der Substrat- Verbundmaterialien werden die Dickenabmessungen der Oberflächenstrukturen, die NH ₂ -Gruppendichte bzw. Konzentration je Substratprobenfläche, der Wasser-Kontaktwinkel und der Wert der RMS-Rauhigkeit herangezogen.

Die NH ₂ -Gruppen der Oberflächenstrukturen, die mittels Amino- cellulosepolymerketten (s. (X), Typ a bis d, Formelschema 1) und/oder NH ₂ - (Organo) polysiloxan-Polymerketten (s. (X)= a bis c, Formelschema 2) auf die Substratoberflächen lateral über- tragen werden, dienen unter anderem als (NH ₂ -) Ankergruppen für die kovalente Bio-Funktionalisierung. Die Dichte bzw. Konzentration der NH ₂ -Ankergruppen je Substratprobenfläche ist eine wichtige Maßzahl für die Einsatzmöglichkeit der erfindungsgemäßen Substratverbundmaterialien. Der Wasser- Kontaktwinkel KW dient als Maß für die Hydrophobie- bzw. Hyd- rophilie-Balance der Oberflächenstrukturen.

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung werden die Substratoberflächen mit Sauerstoff- bzw. Argon-Plasma für etwa 30 Sekunden bis 2 Minuten vorbehandelt. Bei nachfolgender erfindungsgemäßer Behandlung mit Modifizierungslösung weisen die erhaltenen Substratverbundmaterialien häufig die jeweils geringsten Dickenabmessungen und RMS- Rauhigkeiten auf.

Vorteilhaft können die modifizierten Substratoberflächen nach ihrer Herstellung zeitlich unbegrenzt aufbewahrt werden

- zur komplettierenden Oberflächenmodifizierung z. B. durch μCP oder durch NH ₂ -reaktive Reagenzien bzw. Funktionalisierungen zum Zwecke der Einstellung anwendungsspezifischer Oberflächeneigenschaften, wie z.B. pH-Wert, Ladungs-

Verteilung, Hydrophilie- bzw. Hydrophobiebalance, redoxak- tiver oder Iicht-absorbierender Eigenschaften und/oder

- zur elektrostatischen oder kovalenten Kopplung mit Funktionsmolekülen, z. B. von funktionellen Biomolekülen bzw. Proteinen oder Zellen bzw. Zeil-Bestandteilen.

Zusammenfassend wird mit der Erfindung erstmals ein einfaches Verfahren für ein umfassendes Strukturdesign von zukunftstechnologisch relevanten Substratmaterialien zur Verfügung gestellt. Dabei stützt sich das Strukturdesign auf die Anwen- düng

- und Modifizierung der Aminocellulosen-Leitstruktur P-CH2- NH- (X) -NH2 (P-CH2-=Cellulose-C6, s. Formelschema 1) mit den strukturbildenden und biokompatiblen Eigenschaften der CeI- lulosestruktur, die durch Spacerstrukturen (X) an den AGU- Positionen C6 und Ester-Gruppen S an C2/C3 sowie durch Variation der Substitutionsgrade DSNH (X) NH2 und DSS entlang der Cellulose-Polymerketten leicht und vielfältig modifizierbar sind;

- von speziellen NH2- (Organo) polysiloxanen (vgl. Formelsche- ma 2) , insbesondere in Kombination mit μCP;

- vielfältiger NH2 -reaktiver bifunktioneller Reagenzien zur weiteren Funktionalisierung, insbesondere Biofunktionali- sierung von Substratoberflächen für die biophysikalische und biomedizinische Anwendung.

Durch die Einbeziehung weiterer geeigneter NH ₂ -Polymere, z. B. Aminopolysaccharide anders als Aminocellulosen nach

Formel I, ist das erfindungsgemäße Verfahren noch zu komplettieren.

Im Folgenden werden nur beispielhaft, ohne eine Einschränkung vorzunehmen, Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der auf diese Weise hergestellten Substratverbundmaterialien beschrieben.

3. Anwendungsgebiete

3.1 Biophysikalisches Anwendungsgebiet

3.1.1 Oberflächen-Modifizierung von Si-Spitzen für Rasterson- den-Methoden

Modifizierte Si-Spitzen werden beispielsweise bei der AFM (atomic force microscopy) für die Kraftabstands- bzw. Kraft- modulations-Vermessung von funktionalisierten Substratoberflächen, z. B. Biochipoberflächen, oder bei Rastersondenli- thografietechniken zur lateralen Nanostrukturierung von Substratoberflächen, z. B. Biochips, benötigt.

Zur Modifizierung von Si-Spitzen wird folgendermaßen verfahren: Die Si-Spitze, die an einem so genannten Federbalken (canti- lever) befestigt ist, wird anhand dieses cantilevers auf einem Gel-Pack adhäsiv fixiert, so dass die Si-Spitze in den Raum zeigt. Die Si-Spitze wird dann auf eine geeignete Weise vorsichtig gereinigt bzw. vorbehandelt und anschließend mit einer Modifizierungslösung eines geeigneten Derivates gemäß Formelschema 1 oder 2 benetzt. Dabei werden die verfahrensgemäß üblichen Lösungen und Konzentrationen angewendet. Nach einer Benetzungs-Zeitdauer von ca. 30 Min. bis 3 h wird die Modifizierungslösung abgezogen und die modifizierte Si-Spitze

mit 30 bis 50 μl Lösungsmittel (z. B. bidestilliertes Wasser, DMA oder 2-Propanol) 3 bis 5 mal gewaschen. Danach wird der am Gel-Pack fixierte cantilever im Argon-Strom getrocknet und anschließend bei AFM-Vermessungen eingesetzt, um den Modifi- zierungs-Effekt anhand einer geeigneten Probenoberflächen zu charakterisieren .

Der Modifizierungs-Effekt wird besonders deutlich sichtbar, wenn beispielsweise im rasterkraftmikroskopischen NichtKontakt-Modus die modifizierte Si-Spitze mit einer nicht- modifizierten Si-Spitze durch AFM-Vermessung einer Kalibrierprobe, auf deren Oberfläche sich Kegelformen auf Si-Basis mit Abmessungen von wenigen Nanometern befinden, hinsichtlich der abgebildeten topografischen Charakteristika verglichen werden.

Der besondere Effekt bei der Vermessung der Kalibrierprobe ist, dass die jeweils im AFM-Gerät mittels cantilever befindliche Si-Spitze topografisch abgebildet wird. Demnach wird die nicht-modifizierte Si-Spitze in einer typischen kegelförmigen Topografie abgebildet. Das ist bei der beschriebenen modifizierten Si-Spitze nicht der Fall. Hier zeigt die topografische (3D-) Abbildung eine Aufspaltung der Kegelspitze, das heißt eine quasi-Doppelspitze.

Diese Topografie spiegelt die auf der Si-Spitze befindlichen Aminocellulosen-Polymerketten wider. Denn die Vorstellung auf der mikroskopischen Betrachtungsebene ist, dass die adhäsiv fixierten Polymerketten mit einer idealisierten Kettenlänge von ca. 100 Nanometer die Si-Spitze gewissermaßen rundherum fransenförmig überragen, was beim Abrastern der Kalibrierprobe als verlängerte artifizielle bzw. gespaltene Spitze topo- grafisch abgebildet wird.

Besonders vorteilhaft ist die weitere Funktionalisierung der erfindungsgemäß modifizierten Si-Spitzen mittels der genannten NH ₂ -reaktiven Kopplung mit Funktionsmolekülen, die für den jeweiligen Anwendungsfall der Rastersondentechnik rele- vant sind. Rastersondenrelevant sind beispielsweise solche

Funktionsmoleküle, die Kraft-Abstands- bzw. Kraftmodulations- Effekte bei der AFM-Vermessung von modifizierten Substratoberflächen induzieren oder die bei Rastersondenlithografie- Techniken eine laterale Strukturübertragung via Funktionsmo- leküle auf Substratoberflächen ermöglichen.

3.1.2 Oberflächenmodifizierung von PDMS-Substraten

Polydimethysiloxane (PDMS) spielen als weiches und leicht verformbares Polymer und aufgrund vorteilhafter physikalischer, chemischer und biokompatibler Eigenschaften in der Mikro- und Nanotechnik, z. B. als Stempel für das μCP, als

Biochip-Material speziell in mikrofluidischen Sensorsystemen oder als Implantatmaterial eine besondere Rolle, insbesondere auch wegen der Silan-chemischen Modifizierbarkeit des Sauer- stoffplasma-behandelten PDMS. Dabei kommt es darauf an, die PDMS-Oberfläche möglichst anwendungsspezifisch, z. B. analyt- sensitiv oder biofunktional, zu modifizieren. Durch Behandlung der PDMS-Oberflächen mit Sauerstoff-Plasma entstehen OH- Gruppen (Wasser-Kontaktwinkel kleiner 20 Grad) . Die OH- Gruppen werden bekanntermaßen mittels Silan-Verbindungen mo- difiziert.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden beispielsweise PDMS-Stempel für das molekulare Bedrucken auf die genannte einfache Weise mit Wechselwirkungs-spezifischen Strukturarealen, wie hydrophobe, elektrostatisch-orientierte oder komple- mentäre bzw. bioaktive Strukturareale modifiziert. Für alle

genannten Anwendungen steht die Derivate-Vielfalt gemäß Formelschema 1 und 2 zur Verfügung. Beispielsweise werden die mit Sauerstoff-Plasma behandelten PDMS-Oberflächen auf die erfindungsgemäß einfache Weise durch kurzen Kontakt mit der jeweiligen Modifizierungslösung modifiziert. Dabei entsteht ein PDMS-Verbundmaterial mit Oberflächenstrukturen kleiner 1- 2 Nanometer, RMS-Rauhigkeiten kleiner 0,2-0,5 Nanometer, Wasser-Kontaktwinkeln kleiner 50 bis größer 90 Grad und NH ₂ - Gruppendichten von 0,5-1,5 nMol je cm ² der Substratoberflä- che.

3.1.3 Erfindungsgemäßes Verfahren mittels μCP

Anhand regelmäßig mikro- oder nanostrukturierter Stempel aus polymeren Materialien werden Oberflächenstrukturen mittels der Derivate gemäß Formelschema 1 und 2 in entsprechenden mikro- bzw. nanoskaligen Mustern auf die Substratoberflächen gestempelt. Geeignete Mikro- und Nanostempel werden vorzugsweise aus PoIy (dimethylsiloxan) (PDMS) auf bekannte Weise hergestellt, beispielsweise aus Sylgard 184-Kit, bestehend aus Sylgard-184 A und Sylgard-184 B. Als Stempelmuster dienen beispielsweise parallel angeordnete Linien mit Linienbreiten von 200 nm bis 4 μm und Linienabständen von 200 nm bis 200 μm. Es können auch solche Mikro- bzw. Nanokontaktstempel aus Materialien anders als PDMS angewendet werden.

Im Falle von beispielhaft eingesetzten Si/SiO ₂ -Substrat- Oberflächen wird beim μCP ausgehend von Aminocellulosederiva- ten und von NH ₂ - (Organo) polysiloxanderivaten gemäß Formelschema 1 bzw. 2 folgendermaßen verfahren: Das Linienmuster eines PDMS-Stempels (z. B. Linienabstände: 200 nm bis 50 μm) wird mit 5 bis 10 μl einer 0,05 bis 0,5%igen Lösung eines Derivates der Aminocellulosen-Leitstruktur, z. B. einer PDA-

Cellulosetosylat-Lösung in DMA, betropft. Anschließend wird der Stempel 1 bis 5 sec mit der benetzten Seite vorsichtig auf ein Filterpapier gedrückt und danach sofort, vorzugsweise für 2 bis 15 Min. , mit einer Si/Si0 ₂ -Substratoberflache durch leichtes Aufdrücken in Kontakt gebracht . Danach wird der

Stempel von der Substratoberfläche entfernt und diese 5 bis 30 Minuten in DMA unter mehrfachem Wechsel der DMA-Phase geschüttelt . Danach wird die gestempelte Substratoberfläche im Argon-Strom getrocknet und das Linienmuster beispielsweise durch (Auflicht-) Mikroskopie (mit Polarisationsfilter) , abbildende Ellipsometrie und AFM charakterisiert. Bei der mikroskopischen Betrachtung der gestempelten Substratoberflächen wird das mikroskalige Linienmuster der Oberflächenstrukturen sichtbar und durch abbildende Ellipsometrie werden Linien- förmige Oberflächenstrukturen veranschaulicht und vermessen. Es werden Substratverbundmaterialien mit Oberflächenstrukturen < 1 - 3 nm (je nach eingesetztem Derivat) gefunden. Diese ellipsometrisch bestimmten Dickenabmessungen der Oberflächenstrukturen werden durch AFM betätigt. Mittels AFM werden Li- nienbreiten gefunden, die mit den Sollwerten von 200 nm bis 4 μm der eingesetzten Mikro- bzw. Nanostempel in Einklang stehen.

Das μCP-Verfahren wird bei den oben definierten Substratoberflächen auch mit Modifizierungslösungen von NH ₂ (Organo) poly- siloxanderivaten Pl bis P5 gemäß Formelschema 2 angewendet.

Beispielsweise wird auf Si/Si0 ₂ -Substratoberflachen durch μCP ein Linien-Strukturmuster in Abständen von 2 bis 200 μm gestempelt. Dazu wird der PDMS-Stempel beispielsweise mit 5 bis 10 μl einer 0,03 bis 0,l%igen Lösung eines NH ₂ - (Organo) poly- siloxanes (z.B. Typ P2b) in 2-Propanol betropft und danach wie beim μCP mit Aminocellulosederivat verfahren. Nach Ent-

fernen des Stempels von der Substratoberfläche wird diese 5 bis 15 Minuten in 2-Propanol unter mehrfachem Wechsel der 2- Propanol-Phase geschüttelt. Danach wird die gestempelte Substratprobe im Argon-Strom getrocknet und das Linienmuster auf die gleiche Weise wie beim μCP mittels Aminocellulosederivat charakterisiert. Mittels AFM werden linienförmige Oberflächenstrukturen mit Dickenabmessungen < 1 - 2 nm und Linienbreiten gefunden, die den Sollwerten des Stempels entsprechen.

Beide Verfahren, also das erfindungsgemäße Verfahren und Varianten des μCP, ermöglichen auf synergetische Weise Substratoberflächen mit Eigenschafts- bzw. Wechselwirkungs- Mustern beispielsweise für Bio-Funktionalisierungen bzw. biophysikalische Anwendungen oder für Protein- und Zell-Adhäsion und so weiter nach den Kriterien eines einzelnen Anwendungs- falles zu optimieren.

Dabei werden die Derivate gemäß FormelSchema 1 und 2 eingesetzt. Mittels entsprechender Mikro- oder Nano-Stempel lassen sich auch Strukturmuster anders als Linienmuster auf den Sub- stratoberflachen herstellen. Die Varianten-Vielfalt, die das erfindungsgemäße Verfahren und das μCP eröffnen, wird im Folgenden anhand von Beispielen dargelegt:

Beispiel 1: Eine Substratoberfläche wird je nach Anwendung mittels eines Aminocellulosederivates der Cu-Chelat-bildenden Typ-Reihe b (z.B. TETAT-Cellulosederivat) erfindungsgemäß modifiziert und anschließend durch μCP ein Muster aus PDA- Cellulosetosylat (mit redoxchromogenen Eigenschaften) gestempelt. An die NH ₂ -Ankergruppen des PDA-Restes an C6 (der AGU) wird beispielsweise ein redoxaktives Protein, wie ein sog. Cu-Protein, immobilisiert.

Beispiel 2: Eine Substratoberfläche wird je nach Anwendungserfordernis entweder durch ein Aminocellulosederivat aus der Typ-Reihe b, z. B. ein DPTA-Cellulosederivat zwecks Bildung von Cu-Chelaten oder Einstellung eines Protein relevanten pH- Wertes oder mittels eines redoxaktiven Aminocellulosederiva- tes der Typ-Reihe c oder d erfindungsgemäß modifiziert und anschließend mittels μCP ein Muster aus einem Aminocellulosederivat des Typs a mit Spacereffekt oder aus einem NH ₂ (Organo) -polysiloxanderivat Pl bis P5 gestempelt. Die freien NH ₂ -Ankergruppen werden durch ein NH ₂ -reaktives Kopplungsreagenz, das auf die Bio-Funktion abgestimmt ist, bio- funktionalisiert .

Beispiel 3: Eine Substratoberfläche wird je nach Anwendungserfordernis mittels SiO _x -Polymer hydrophilisiert und an- schließend mittels μCP ein Muster aus einem Aminocellulosederivat der Typ-Reihen a oder b bzw. einem NH ₂ - (Organo) polysiloxanderivat Pl bis P5 gestempelt, um an die freien NH ₂ - Ankergruppen eine strukturell abgestimmte Biomolekülspezies via üblicher NH ₂ -reaktiver Kopplungsreagenzien zu immobili- sieren.

Beispiel 4: Eine Substratoberfläche wird je nach Anwendungserfordernis mittels eines NH ₂ - (Organo) polysiloxanderivates Pl bis P5 erfindungsgemäß modifiziert und anschließend mittels μCP ein Muster aus einem Aminocellulosederivat oder einem Derivat-Gemisch der Typ-Reihen a bis c gestempelt, um durch NH ₂ -reaktiver Folgereaktion biorelevante Eigenschaften (z. B. pH-Wert, Ladungsverteilung, Wasser-Kontaktwinkel) einzustellen und/oder (Bio-) Funktionsmoleküle zu immobilisieren.

Bei einer anderen μCP-Ausführungsvariante wird die Stempel - Oberfläche mit der Derivat-Lösung (als „Stempel-Tinte") mit-

tels Stempelkissen benetzt. Beispielsweise wird ein PDMS- Stempelkissen (Abmessung ca. 10x10 mm, Dicke ca. 1 bis 3 mm) aus dem „PDMS Sylgard 184 "-Material gegossen, danach mit der Modifizierungslösung ca. 3 h unter Rühren getränkt und an- schließend 1 bis 2 Min. im Argon-Strom getrocknet. Der PDMS- Stempel wird auf das vorbehandelte Stempelkissen gedrückt, und anschließend mit der Substratoberfläche ca. 2 Minuten in Kontakt gebracht. Die gestempelte Substratprobe wird dann, wie oben beschrieben, behandelt und charakterisiert.

3.1.4 Oberflächenstrukturmuster mit Gold-Nanopartikeln

An Strukturmuster, die mittels μCP aus Derivaten gemäß Formelschema 1 oder 2 auf einer Substratoberfläche gestempelt wurden, lassen sich Gold-Nanopartikel bei Kontakt mit kommerziell erhältlichen Gold-Kolloid-Lösungen adhäsiv fixieren. Auf einer Substratoberfläche werden beispielsweise alternierende Strukturmuster einerseits zur Adhäsion von Gold- Nanopartikeln und andererseits für die Bio-Funktionalisierung hergestellt. Hierbei werden solche Derivate gemäß Formelschema 1 und 2 angewendet, die den strukturellen bzw. funktionel- len Erfordernissen der eingesetzten Bio-Funktion entsprechen. Gold-Nanopartikel spielen, z. B. auf Substratoberflächen, in Verbindung mit funktionellen Biomolekülen bzw. Proteinen bei der Biochip-Entwicklung bzw. bei bioelektronischen Funktionsbausteinen eine wichtige Rolle.

Bei der erfindungsgemäßen Herstellung einer Substratoberfläche, die ein Strukturmuster aus adhäsiv fixierten Gold- Nanopartikeln und eine Bio-Funktion enthält wird beispielsweise folgendermaßen verfahren: Eine Substratoberfläche wird mit einem Derivat gemäß Formelschema 1 oder 2 bestempelt. Danach wird die gestempelte Substratoberfläche mit einer kom-

merziell erhältlichen Gold-Kolloid-Lösung (Gold-Nanopartikel : 3 bis 30 nm) behandelt und anschließend mit einer Biomolekül- spezifischen Oberflächenstruktur aus einem Derivat gemäß Formelschema 1 oder 2 erfindungsgemäß modifiziert. Danach werden an die NH ₂ -Ankergruppen der modifizierten Substratoberfläche via NH ₂ -reaktiver bifunktioneller Reagenzien Bio-Funktions- moleküle kovalent gekoppelt.

Alternativ wird eine Substratoberfläche je nach biospezifischem Erfordernis z. B. mittels SiO _x -Polymer hydrophi- lisiert und anschließend mittels eines Kupfer (Cu) -Chelat- bildenden Aminocellulosederivates des Typs b gemäß Formel- Schema 1 modifiziert und anschließend mit einer Cu-Ionen- Lösung behandelt. Danach wird die Cu-Ionen-modifizierte Substratoberfläche beispielsweise durch μCP mit einer Oberflä- chenstruktur aus einem Derivat gemäß Formelschema 1 oder 2, z. B. in Linienform, gestempelt und anschließend mit einer kommerziell erhältlichen Gold-Kolloid-Lösung (Gold- Nanopartikel : 3 bis 30 nm) behandelt. Die so modifizierte Substratoberfläche wird entweder via eines bio-spezifischen NH ₂ - reaktiven Kopplungsreagenz bio-funktionalisiert oder die Substratprobe wird nochmals mit einer Modifizierungslösung eines Derivats gemäß Formelschema 1 oder 2 zwecks adhäsiver Kopplung an die Gold-Nanopartikel behandelt und danach auf die übliche Weise ein Bio-Funktionsmolekül, z. B. DNA-Sequenzen, kovalent immobilisiert.

3.1.5 Biochips

SAW-Chips bestehen aus Quarzscheiben, die aus einem (Quarz-) Einkristall geschnitten werden. Auf der Quarzoberfläche befindet sich eine Si0 ₂ -Polymerschicht mit einer Dickenabmes- sung von ca. 5 /im als Signal-führende Schicht. Mittels Silan-

chemischer Verfahren gemäß Stand der Technik, ist es nicht möglich, eine reproduzierbare Kopplung von Bio-Funktions- molekülen, z. B. DNA- oder RNA-Aptameren, auf der SiO ₂ - Polymeroberflache der SAW-Chips herzustellen.

Besonders vorteilhaft ermöglicht nun das erfindungsgemäße

Verfahren die Oberflächen-Modifizierung des SAW-Chips bis hin zu einem funktionsfähigen Biochip direkt auf der Signal- führenden Si0 ₂ -Polymerschicht oder auf auch einer darauf befindlichen Gold (Au) -Schicht auch dann, wenn sich der SAW- Chip im mikrofluidischen Sensorsystem befindet. Im Falle eines Au-beschichteten SAW-Chips wird die Au-Oberflache vor Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die übliche Weise gereinigt bzw. vorbehandelt, z. B. mittels Argon- Plasma.

Analyt-sensitive SAW-Chips werden beispielsweise auf der Signal-führenden SiO ₂ -Polymerschicht in folgenden Schritten im mikrofluidischen Sensorsystem hergestellt:

Schritt 1 : Beispielweise wird eine 0,5%ige wässrige TETAT- Cellulosetosylat-Lösung über den SAW-Chip geleitet (Fließge- schwindigkeit ca. 25 μl/Min. , Fließdauer von ca. 9 Min.) . Die als übliche Meßgröße beobachtete Phasenänderung, das heißt die Masse-Zunahme, des SAW-Chips ist nach ca. 3 Min. beendet. Danach wird bidest . Wasser durch das mikrofluidische Sensorsystem geleitet (Fließgeschwindigkeit ca. 25 μl/Min., Fließ- dauer ca. 9 Min.) - zwecks Ablösung von ggf. nicht-adhäsiv auf der Chipoberfläche befindlichem TETAT-Cellulose-tosylat . Dabei wird kaum eine Signaländerung, d. h. kaum Masse- Ablösung, beobachtet. Der Schritt 1 wird mit gleicher TETAT- Cellulosetosylat-Lösung bei gleichen Fließbedingungen wieder- holt. Es wird keine Masse- bzw. Signaländerung des SAW-Chips

beobachtet - auch nicht beim anschließenden Durchleiten von bidest. Wasser (Fließbedingungen wie oben) . D. h. die Modifizierung der SAW-Chipoberfläche ist mittels TETAT-Cellulose- tosylat-Lösung innerhalb einer Fließdauer von 3 Min. beendet.

Schritt 2 : Die Aminocellulosen-modifizierte SAW-Chipoberfläche wird mittels einer üblichen NH ₂ -reaktiven bifunktionellen Reagenz, z. B. Glutaraldehyd (GDA), funktionalisiert . Dazu wird eine 25%ige wässrige GDA-Lδsung über die modifizierte SAW-Chipoberfläche geleitet (Fließgeschwindigkeit ca. 50 μl/min. , Fließdauer ca. 5 Min.) . Anschließend wird die nicht an der SAW-Chipoberfläche umgesetzte bifunktionelle Reagenz mittels bidest. Wasser bei gleicher Fließgeschwindigkeit und Dauer entfernt. Die vermessene Phasenänderung bzw. Masse-Zunahme signalisiert, dass die SAW-Chipoberfläche via GDA funktionalisiert wurde.

Schritt 3 : Ausgehend von der GDA-funktionalisierten SAW- Chipoberfläche wird mittels eines Anti-Thrombin-RNA-Aptamers ein Analyt (Thrombin) -sensitiver SAW-Chip (SAW-Sensorchip) hergestellt. Dazu wird eine Anti-Thrombin-RNA-Aptamer-Lösung in bidest. Wasser (1 μmolar) über die SAW-Chipoberfläche geleitet (Fließgeschwindigkeit ca. 25 μl/Min. , Fließdauer ca. 9 Min.). Die resultierende Phasenänderung signalisiert, dass das Aptamer auf der SAW-Chipoberfläche fixiert vorliegt . Bei anschließendem Durchleiten von bidest. Wasser (Fließgeschwin- digkeit ca. 25 μl/Min., Fließdauer ca. 9 Min.) zeigt sich, dass das Aptamer nicht abgelöst wird. Der SAW-Sensorchip ist einsatzbereit, um Thrombin als Analyt zu messen.

Sensor-Test- bzw. Messschritt: Der Test- bzw. Messstatus des mikrofluidischen Sensorsystems wird durch einen SELEX-Puffer (1 mmolar, pH 8) mit einer Fließgeschwindigkeit von ca. 25

μl/Min. eingestellt. Der SAW-Sensorchip ist Thrombin- spezifisch und frei von unspezifischer Protein-Bindung, wie sich anhand von Testläufen mittels Thrombin- bzw. Elastase- und Rinderserumalbumin-Lösungen in SELEX-Puffer erweist. Das Thrombin, welches sich nach dem Messschritt auf der Sensoroberfläche befindet, wird mittels 0,1 molarer NaOH-Lösung abgelöst. Die anschließende erneute Vermessung der Thrombin- Lösung in SELEX-Puffer bestätigt, dass der SAW-Sensorchip regenerierbar ist und reproduzierbare Messwerte liefert.

Auf die beschriebene Weise lassen sich auch Sensor-Chipoberflächen für Messprinzipien anders als das SAW-Prinzip unter Bedingungen eines mikrofluidischen Sensorsystems durch das erfindungsgemäße Verfahren modifizieren. Dabei können die Sensorchips aus unterschiedlichen Substratmaterialien beste- hen, wie unter 2. definiert. Bezüglich der Oberflächenstrukturen steht mindestens die gesamte Derivatevielfalt gemäß Formelschema 1 und 2 zur Verfügung. Darüber hinaus lässt sich die strukturelle Varianz durch zusätzliche Einbeziehung weiterer Diamine, Oligoamine oder Polyamine in die allgemeine Derivatisierungs-Prozedur in einem erheblichen Umfang noch komplettieren, wie bereits an anderer Stelle erwähnt.

3.2 Biomedizinisches Anwendungsgebiet

3.2.1 Strukturdesign von Substratoberflächen für in vitro Zell-Kulturen bzw. Zell -Adhäsionen

Die Adhäsion oder Abstoßung von Proteinen bzw. von lebenden

Zellen auf Grenzflächen bzw. Substratoberflächen sind äußerst komplexe Prozesse. Zwecks Untersuchung von Zusammenhängen über Zell-Adhäsion, Zell-Wachstum, Zeil-Differenzierung, programmierter Zelltod anhand von in vitro Zellkulturen auf

Oberflächen mit dem Ziel der medizinischen Implantat- Entwicklungen nach dem Prinzip des Tissue Engineering oder der biophysikalischen Anwendung von Zellen (z. B. von Neuronen u.a.), wird nach Einflussfaktoren anhand von modifizier- ten Substratoberflächen gesucht .

Die strukturelle Heterogenität der bisher bekannten modifizierten Substratoberflächen für in vitro Zellkulturen bzw. Zeil-Adhäsionen ist für das Erkennen diesbezüglicher Zusammenhänge wenig geeignet. So werden zur Herstellung von late- ralen Kontrasten, z. B. von alternierenden Strukturarealen mit hydrophoben bzw. hydrophilen Eigenschaften auf Substrat- Oberflächen häufig PoIy- und Oligo (ethylenglykole) , Dextranen und so weiter als Protein- und Zell-resistente Matrixstrukturen eingesetzt.

Um Zell-Adhäsionen zu untersuchen, werden auch häufig Substratoberflächen mit definierten Mustern adhäsionsfordernder Proteine, wie extrazelluläre Proteine, Proteoglykane, Kolla- gene mit sich wiederholenden Sequenzen Gly-Pro-Pro oder Fibronektin, Fibrinogen, Laminin und so weiter, eingesetzt, welche mit methylterminierten Oberflächenarealen in Wechselwirkung treten. Alternativ kann die Kopplung aber auch über Oligopeptide mit Zell-Adhäsionsarealen oder kovalent sowie unspezifisch gebundenen Antikörpern erfolgen.

Die Ausbildung von kovalenten Bindungen sowie Wechselwirkun- gen über Dehydratisierung hydrophober Oberflächenareale zwischen Substratoberfläche und Proteinen bzw. Zellen sind wichtige Aspekte für die Funktion von Proteinen und Zellen gegenüber Inaktivität, Verdrängung oder Reorganisation unter lateraler Verschiebung von Oberflächenstrukturen. Die Komplexität wird bei Zell-Kontakten dadurch noch erhöht, weil Proteine und Stoffe der Zelle und des Kulturmediums mit der Substrat- Oberfläche in Wechselwirkung treten. Die Wechselwirkungen

sind Wasserstoff-Brücken-getrieben oder von elektrostatischer, van der Waals' scher (dispersiver) sowie kovalenter Natur .

Im Licht einer völlig neuen Entwicklung in der Implantat- Technik, die seit einigen Jahren auf die Nutzung von Zellkulturtechniken abzielt, gewinnen Verfahren für ein Strukturdesign von Zeil-spezifischen Substratoberflächen für die Biomaterial-Entwicklung eine enorme Bedeutung. Beim Tissue Engineering werden neue Organe ausgehend von funktionalen Zellen auf Zeil-spezifischen Trägerstrukturen außerhalb des Körpers gebildet, um sie einem Patienten einzupflanzen. An das Tissue Engineering sind hohe Erwartungen für die Zukunft der Implantat-Entwicklung geknüpft. Ziel ist die Herstellung von Oberflächen, die die Funktion der extrazellulären Matrix simulie- ren und mit dem Empfängergewebe auf Rezeptorbasis spezifische Reaktionen eingehen.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es in Kombination mit dem μCP erstmals möglich, Substratmaterial-Oberflächen, insbesondere auch solche für Implantationszwecke, auf der Grundlage der Derivatisierung einer natürlichen polymeren

Leitstruktur des Aminocellulosen-Typs der allgemeinen Formel I im Sinne von Fragestellungen zur Wechselwirkung zwischen Zellen und Substratoberfläche strukturell zu modellieren.

3.2.2 Oberflächenstrukturdesign von Implantatmaterialien

Auch die herkömmliche Implantat-Entwicklung auf der Grundlage von geeigneten Metallen/Metalloxiden und Legierungen, Keramiken oder Polymeren bzw. textilen Materialien erfordert Verfahren der Oberflächen-Modifizierung, um die Biofunktionalität der Implantatoberfläche zu erhöhen und die Vorgänge an den Grenzflächen Implantat/Gewebe oder Implantat/Blut so weit

wie möglich zu kontrollieren bzw. das Einwachsverhalten der Implantate zu optimieren. Dabei geht es vor allem darum, zwei wesentliche Gefahren Immunreaktionen und die Blut-Gerinnungs- kaskade bei Implantaten, z. B. Stents (künstliche Gefäßstüt- zen) , artifizielle Gefäße, Stütz-Implantate und so weiter weitgehend zu vermeiden.

Zwei wesentliche Wege werden beschritten:

1. die Entwicklung von nanostrukturierten biofunktionalen

Oberflächen mit verbessertem Blut- bzw. Einwachsverhalten und 2. die Einkopplung von biologischen Signalen auf die Implantatoberfläche zur aktiven Steuerung des Zellwachstums. Das heißt, es werden Oberflächenstrukturen benötigt, die nano- technologisch so gestaltet sind, dass auf ihnen Zellen besonders gut wachsen oder je nach Anwendungszweck sich gerade nicht ansiedeln können, wie z. B. bei Stents, bei denen häufig die Gefahr von RestStenosen besteht. Zur Frage, welche Oberflächenstrukturen optimale biofunktionale bzw. biokompatible Eigenschaften haben, gibt es nach dem Stand der Technik verschiedene Vorstellungen, die auch von den Anwendungsbedin- gungen und der Verweildauer des Implantates abhängen. Eine Rolle spielen beispielsweise hydrophobe Oberflächen mit Lotus-Effekt oder irreversible Passivierung durch Protein, z. B. Albumin, hydrophile oder negativ geladene Oberflächen (Minimierung der Protein-Adhäsion) oder Oberflächen mit Funk- tionsmolekülen, z. B. Antithrombotika, wie Heparin, Fondapa- rinux, Induronsäure und so weiter. Aber auch die Topografie (Rauhigkeit) der Implantatoberfläche hat einen Einfluss auf die Biokompatibilität.

Das erfindungsgemäße Verfahren des Oberflächenstrukturdesigns bietet alle Voraussetzungen, um den genannten Herausforderungen der Implantatoberflächen-Modifizierung zu genügen. Das

trifft sowohl auf die Einbeziehung der verschiedenen Implantatmaterialien, als auch auf die Herstellung der strukturellen Vielfalt der biofunktionalen Oberflächen-Eigenschaften zu. Auf folgende Implantatmaterialien ist das erfindungsgemäße

Verfahren prinzipiell anwendbar: Edelstahl, Chrom-, Kobalt-, Nickel-Legierungen, Gold, Platin, Titan/Titanoxid, Tantal/Tantaloxid, Keramiken, Keramik-Zirkonoxid, Cellulosen bzw. Bakteriencellulosen in Flächen- oder Röhren-Form, Po- Iy (dimethylsiloxane) (PDIVIS), Polymethylmethacrylat (PMMA,

Plexiglas) ,PoIy-N-isopropylacrylamid (PNiPAM), Poly-Glykolid- co-Lactid (PGL) , Polymere mit Carboxyl- oder SuIfo-Gruppen, wie Polyhydroxiethylmethacrylat (PHEMA) .

Vorteilhaft ist das erfindungsgemäße Verfahren geeignet, um auf unterschiedlichen Substratmaterialien, insbesondere auf den genannten Implantatmaterialien, Strukturmuster bzw. Strukturareale herzustellen, denen z. B. hydrophobe bzw. dispersive, hydrophile, elektrostatische bzw. reaktive Eigenschaften sowie Spacereffekte oder geringe Rauhigkeiten, inhä- rent sind. Darüber hinaus können an die Oberflächen der Implantat-Verbundmaterialien via genannte NH ₂ -reaktive bifunktionelle Reagenzien Funktionsmoleküle zur Verbesserung der Biokompatibilität gekoppelt werden. Beispielsweise sind die Oberflächenstrukturen aus den Derivaten gemäß Formelschema 1 und 2 von vornherein geeignet um die Carboxyl- bzw. SuIfo- funktionalisierten Antithrombotika, wie Heparin, Fondapari- nux, Induronsäure, elektrostatisch fest zu fixieren.

Hervorzuheben an dieser Stelle ist das wesentliche Neue, dass die strukturelle Oberflächen-Modellierung von unterschiedli- chen Substratmaterialien insbesondere anhand von Derivaten

(gemäß Formelschema 1) ein und derselben Polymerstruktur, nämlich z. B. der Cellulosestruktur geschieht.

Vorteilhaft werden bei der Derivatisierung der Leitstruktur gemäß Formel I die funktionellen Eigenschaften an AGU- Positionen C6 - entlang der Polymerketten - modifiziert, aber die gemeinsamen Grundeigenschaften, wie die biokompatiblen, strukturbildenden, konformationellen, adhäsiven Eigenschaften, bleiben erhalten.

Darüber hinaus werden alle Derivate der allgemeinen Formel I als konformationeil uniforme Polymerketten unter Erhalt der oben genannten Grundeigenschaften auf die gleiche Weise durch spontane Adhäsion und Selbstorganisation mit der genannten Monolagen-ähnlichen Dickenabmessung auf unterschiedliche Substratmaterial-Oberflächen lateral übertragen. Schließlich werden die vielfältig modifizierbaren Strukturmerkmale bzw. Wechselwirkungsareale der (Aminocellulosen-) Polymerketten durch μCP in mikro- bzw. nanoskaligen Mustern auf die Substratmaterial-Oberflächen lateral übertragen. Die Möglichkeiten der Oberflächen-Modifizierung von Substratmaterialien werden durch die Kombination der Leitstruktur-Derivate mit NH ₂ -Oligo) polysiloxanen und/oder mit der SiO _x -Polymer- Modifizierung erheblich erweitert.

Des weiteren ist die Vielfalt der Leitstruktur-Derivate durch die Beispiele gemäß Formelschema 1 bei weitem nicht er- schöpft, sondern durch Einbeziehung weiterer Diamine, Oligoa- mine oder Polyamine in die allgemeine Derivatisierungs- Prozedur lassen sich letztlich die Möglichkeiten der strukturellen Modellierung von Substratmaterial- bzw. Implantatmaterial-Oberflächen noch in einem erheblichen Maße komplettie- ren .

Aus genannten Ergebnissen sind Aminocellulosen-modifizierte Substratverbundmaterialien bekannt, die frei von unspezifischen Protein-Adhäsionen bleiben. Andererseits ist auch bekannt, dass die erfindungsgemäßen Substratverbundmaterialien für die Bio-Funktionalisierung, z. B. für die Kopplung mit empfindlichen Enzymproteinen, DNA- oder RNA-Apatameren unter Erhalt ihrer biologischen Funktion, hervorragend geeignet sind. Die Ergebnisse und die weiterhin genannten vorteilhaften Oberflächen-Eigenschaften der Substratverbundmaterialien bilden die Grundlage für ein biokompatibles Oberflächenstrukturdesign von verschieden Implantatmaterialien bzw. Biomaterialien.

3.2.3 Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens für Wirkstoff-Carrier In der Diagnostik bzw. Therapie verbindet man große Hoffnungen mit Drug-Delivery-Systemen. Das sind z. B. Oberflächenmodifizierte Nanopartikel aus SiO ₂ - oder Metalloxid- Nanopartikeln, die als Vehikel für den Wirkstofftransport an den Wirkort im Körper des Menschen dienen. Vorteilhaft kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die erforderliche Wirkstoff-Trägereigenschaft durch Oberflächen- Modifizierung der Nanopartikel bereit gestellt werden.

Im Weiteren wird die Erfindung an Hand spezifischer Ausführungsbeispiele näher beschrieben.

Substratproben auf Silizium (Si) -Basis

Als Substrate des Si-Typs wurden rechteckige oder runde Si- Substratproben der Abmessung 6yi6 mm bzw. D= 10 mm eingesetzt. Es wurden Si-Substratproben mit nativer Siliziumoxid- bzw. SiO ₂ -Polymer-Schicht und solche mit thermisch oder pyroly-

tisch erzeugter SiO ₂ - bzw. SiO _x - Polymerschicht bei variierender Dicken-Abmessung < 1 - 2 nm oder 6 nm (thermisch) bis 6 μm (im Falle von SAW-Chips) eingesetzt.

Als Glastyp-Substrate wurden rechteckige und runde Mikrosko- pie-Deckgläschen (MD) mit einer Abmessung von 10x10 mm bzw. D= 10 mm eingesetzt. Die MD können vor dem Einsatz mit einem Reinigungsmittel wie Extran-Lδsung, und/oder Aceton im Ultraschallbad bei 10 Minuten vorbehandelt. Auch eine Vorbehandlung mit Piranha-Lösung oder mit konzentrierter Schwefelsäure oder Salpetersäure bei 10 bis 30 Minuten und anschließender Spülung mit bidest . Wasser ist möglich. Die Proben wurden sodann mit Sauerstoff- oder Argon-Plasma für ca. 1 bis 2 Minuten behandelt .

Metalloxid-Substratproben (Al-Oxid) Si-Chips (10x10 mm) wurden mittels Pulsed Laser Deposition (PLD) mit Aluminiumoxid (Al- Oxid) beschichtet (Dickenabmessung= 5 bis 6 nm; KW: 70 bis 80°; RMS-Rauhigkeit : 0, 1 bis 0,15 nm) und ohne Vorbehandlung eingesetzt .

Au-Substratproben

Ein Si-Wafer wurde im Schritt 1 mit Chrom, (Dickenabmessung ca. 2-3 nm) und im Schritt 2 auf bekannte Weise mit einer Goldschicht besputtert bzw. bedampft (Dickenabmessung ca. 100 nm) . Anschließend wurde der Gold-beschichtete Si-Wafer in rechteckige oder runde Au-Substratproben der Abmessung 6x6 mm bzw. D= 10 mm geschnitten. Die Au-Substratproben wurden vor dem Einsatz auf unterschiedliche Weise vorbehandelt, z. B. mit einer 5%-igen wässrigen Lösung von Extran-Reinigungs- mittel bei 1 bis 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Danach wurde mit bidest. Wasser und abs . Ethanol gewaschen und

anschließend im Argon-Strom getrocknet oder mit Piranha- Lösung behandelt und anschließend, wie oben genannt, gewaschen und getrocknet oder mit Sauerstoff- bzw. Argon-Plasma behandelt, um bei der erfindungsgemäßen Oberflächen- Modifizierung eine besonders geringe RMS-Rauhigkeit bzw. hohe Qualität zu erzielen.

Au(IIl) -Substratproben

Au(IIl) -Probenflächen (D= ca.5 mm) wurden poliert. Vor jedem Einsatz wurden die Au (111) -Probenflächen ca. 12 bis 24 h mit konz . Schwefelsäure behandelt, anschließend mit bidest . Wasser und abs . Ethanol gewaschen und nach dem Trocknen im Argon-Strom mittels eines Butangas-Brenners vorsichtig bis zur Gelbglut für eine Dauer von 5 bis 10 Minuten geglüht. Die Au (111) -Probenflächen wurden nach Abkühlung auf Raumtempera- tur sofort eingesetzt oder vor dem Einsatz noch mit Piranha- Lösung behandelt.

PDMS-Substratproben

PDMS-Substratproben wurden mittels des Sylgard 184 -Kits (Firma „Dow Corning") , bestehend aus Sylgard-184 A und Sylgard- 184 B auf Si-Chips hergestellt. Dazu wurden „A" und „B" im

Verhältnis 10:1 gemischt und mit Hexan (1:1000) verdünnt. Aus je 5 μl dieses Gemisches wurden die PDMS-Substratproben mittels spin-coating (20 Tausend U/Min.) auf runden Si-Chips (D= 10 mm, PDMS-Dickenabmessung: 2 bis 4 nm, ellipsometrisch) bereitet. Für den weiteren Einsatz wurden die PDMS-Substrat- proben mit Sauerstoff-Plasma vorsichtig behandelt (Dauer ca. 30 sec und Abdeckung der Probe mit einem Metallsieb) . Nach Behandlung mit Sauerstoff-Plasma betrugen die PDMS-Schicht-

dicken 1 bis 2 nm. Die PDMS-Substratproben wurden sofort bei der erfindungsgemäßen Oberflächen-Modifizierung eingesetzt.

Behandlung mit hydrophilem SiO _x -Polymer

Es wurde ein kommerzielles Silicoating-Verfahren der Klebe- und Zahntechnik angewendet, um kurzzeitig hitzestabile Substratmaterialien durch Bildung eines ultradünnen SiO _x - Polymer-Filmes zu hydrophilisieren. Dazu wurde die Substratmaterial-Oberfläche mit der Flamme eines feuerzeugähnlichen Gerätes, das ein brennbares „Pyrosil"-Gasgemisch mit einer Silizium-organischen Verbindung enthielt, extrem kurzzeitig

(< 1 sec) befächelt. Das dabei gebildete SiO ₂ /Silikat-Gemisch wurde nach kurzer Zeit ein glasartiges „SiO _x -Polymer" als ultradünner und transparenter Film (Dickenabmessung < 1 bis 2 nm) . Das Verfahren war bei allen kurzzeitig (< 1 sec) stabi- len Substratmaterialien anwendbar.

Oberflächenmodifizierte Substrate (Substratverbundmateria- lien)

Allgemeine Verfahrens-Vorschrift: Für Substratverbundmaterialien mit besonders geringer RMS-Rauhigkeit bzw. höchster Oberflächenqualität wurden die Substratoberflächen mittels Sauerstoff-Plasma vorbehandelt.

Die Oberflächen-Modifizierung bzw. das Substratverbundmaterial wurde mittels einer sog Modifizierungslösung hergestellt, mit der die Substratproben auf unterschiedliche Weise und Zeitdauer in Kontakt gebracht werden. Die Modifizierungslösung bestand entweder aus einer 0,05 bis 0,5%igen Lösung eines Aminocellulosederivates gemäß allgemeiner Formel I bzw. Formelschema 1 in bidestilliertem Wasser oder Dimethylaceta-

mid (DMA) oder aus einer 0,03 bis 0,l%igen Lösung eines NH ₂ - (Organo) polysiloxanderivat Pl bis P5 gemäß FormelSchema 2 in Methanol, Ethanol oder 2-Propanol. Die Modifizierungslösungen wurden vor ihrem Einsatz vorzugsweise mittels Zentrifugal- Filter-Röhrchen (Porenweite ca. 0,2 bis 0,45 μm) filtriert. Für Oberflächen-Modifizierungen wurden je nach Anwendungszweck, Substratmaterial und Vorbehandlung unterschiedliche Prozedur-Varianten angewendet, z. B.

- Schütteln (1 Min. bis 6 h) - Schütteln im Ultraschallbad ( 5 bis 30 Min.)

- Stehen (1 bis 12 h)

- spin-coating (1 bis 20 Tausend Umdrehungen pro Min.)

- -Auftropfen und 5 bis 10 Min. Verweildauer

- dip-coating (5 bis 60 sec) - air-brush und 5 bis 10 Min. Verweildauer

- Mikro- und Nanokontakt-Drucken (μCP) .

Im Falle des μCP wurde die Modifizierungslösung mittels eines mikro- oder nanostrukturierten Stempels aus einem Polymer, vorzugsweise aus PDMS, mit der Substratoberfläche in Kontakt gebracht. Die PDMS-Stempel wurden auf übliche Weise aus dem kommerziellen „PDMS-Sylgard 184", z.B. je nach Anwendungszweck mit mikro- oder nanostrukturierten Linienmustern bzw. Linienabständen angefertigt. Die Modifizierungslösung wurde als Stempeltinte auf unterschiedliche Weise auf die Stempel- Oberfläche aufgebracht.

Die ganzflächig oder in Mustern Oberflächen-modifizierten Substratproben bzw. Substratverbundmaterialien wurden mit dem jeweiligen Lösungsmittel mehrfach und intensiv unter Schüt-

teln, z.B. im Ultraschallbad, frei von nicht adhäsiv auf der Substratoberfläche fixiertem Derivat gewaschen und nachfolgend im Argon-Strom getrocknet.

Die Modifizierungs-Prozedur war je nach Typ und Vorbehandlung der Substratproben und nach Maßgabe der erforderlichen Modi- fizierungs-Charakteristika, z. B. Dickenabmessung der Oberflächenstruktur, NH ₂ -Gruppen-Konzentration/Fläche, RMS- Rauhigkeit u.a., meist nach 1 bis 5 Min. Schütteln, anschließendem Waschen mit Lösungsmittel und nachfolgendem Trocknen im Argon-Strom beendet.

Die modifizierten Substratproben wurden unmittelbar nach ihrer Bereitung oder nach einer Standzeit, z. B. nach zeitlich unbegrenzter Lagerung, eingesetzt, z. B.

- für weitere (z.B. NH ₂ -reaktive) Funktionalisierungen mit hydrophoben, hydrophilen, geladenen, redoxaktiven Strukturen bzw. pH- oder Licht-Absorptions-Eigenschaften und/oder

- für die adhäsive oder kovalente Fixierung von Funktionsmolekülen, z. B. Bio-Funktionsmolekülen, wie Proteinen, DNA-, RNA- oder Protein-Aptameren, Zellen bzw. Zellbestandteilen oder Wirkstoffen.

Beispiel 1: Si-Verbundmaterial mittels Aminocellulosetosylate

Si-Substratproben wurden in einer 0,05%igen wässrigen Lösung eines Aminocellulosetosylates (Typ b, Formelschema 1), z. B. bei Raumtemperatur - 5 Min. geschüttelt oder

- 5 Min. im Utraschallbad behandelt oder - 3 h stehengelassen.

Danach wurden die modifizierten Si-Substratproben 3 bis 4 mal mit jeweils 0,5 bis 1 cm ³ bidest . Wasser unter Schütteln, z. B. 3 mal 1 Min. im Ultraschallbad, gewaschen und anschließend im Argon-Strom getrocknet.

Oberflächenstruktur-Charakteristika, z. B. Dickenabmessung (ellipsometrisch) <1 - 3 nun; KW: 60 - 80°; RMS-Rauhigkeit : 0,8 - 2 nm; NH ₂ -Gruppen-Konzentration: 0,2 - 1,3 nMol/cm ² .

Beispiel 2: Si-Verbundmaterial mittels Aminocellulosecarbani- lat

Si-Substratproben wurden in einer 0,l%igen Lösung eines Ami- nocellulosecarbanilates (Typ a, Formelschema 1) in DMA bei Raumtemperatur

- 1 Min. geschüttelt oder

- 5 Min. im Utraschallbad behandelt oder - I h stehengelassen.

Danach wurden die modifizierten Si-Substratproben 3 bis 4 mal mit jeweils 0,5 bis 1 cm ³ DMA ca. 5 Min. geschüttelt oder 2 mal im Ultraschallbad gewaschen und anschließend im Argon- Strom getrocknet .

Oberflächenstruktur-Charakteristika, z.B. Dickenabmessung (ellipsometrisch) < 1 - 2 nm; KW: 55 - 70°; RMS-Rauhigkeit : 0,2 - 0,5nm; NH ₂ -Gruppen-Konzentration: 0,2 - 1,3 nMol/cm ² .

Beispiel 3: Si-Verbundmaterial mittels EDA-Cellulose durch spin-coating

Si-Substratproben (D= 10 mm) wurden mittels spin-coating (bei 20 Tausend U/Min.) mit 1 oder 2 μl einer 0,5%igen EDA- Cellulosecarbanilat-Lösung (Typ a, i=2) in DMA bei Raumtemperatur betropft (Rotationsdauer 3 - 5 Min.) . Danach wurden die modifizierten Si-Substratproben 2 mal im Ultraschallbad (Zeitdauer ca. 10 Min.) mit jeweils ca. 1 cm ³ DMA gewaschen und anschließend im Argon-Strom getrocknet.

Oberflächenstruktur-Charakteristika, z.B. Dickenabmessung (ellipsometrisch) <1 bis 2 nm; Wasser-Kontaktwinkel KW: 60 bis 75°; RMS-Rauhigkeit : < 1 bis 2 nm; NH ₂ -Gruppen- Konzentration: 0,2 bis 1 nMol/cm ² .

Beispiel 4: Si -Verbundmaterial mittels NHg- (Organo) poly- si1oxanderivat

Si-Substratproben wurden vorzugsweise in einer 0,05 bis 0,09 %igen Lösung eines NH ₂ - (Organo) polysiloxanderivates (Pl bis P5, Formelschema 2), z. B. in Ethanol oder 2-Propanol, bei Raumtemperatur - 1 - 5 Min. geschüttelt oder

- 15 Min. im Utraschallbad behandelt oder

- 6 h stehengelassen.

Danach wurden die modifizierten Si-Substratproben 3 bis 4 mal mit jeweils 300 bis 500 μl Ethanol oder 2-Propanol geschüt- telt oder 2 mal im Ultraschallbad (Zeitdauer ca. 5 bis 15

Min.) gewaschen und anschließend im Argon-Strom getrocknet. Es wurden insbesondere auch Gemische der NH ₂ -Organo) poly-

siloxane gemäß Formelschema 2, z. B. P3a und P5, P3a und P3c, P2a und P5 , in Ethanol oder 2-Propanol eingesetzt.

Bei Anwendung von spin-coating wurden die Si-Substratproben (D= 10 mm) bei ca. 20 Tausend U/Min, mit 1 bis 2 μl der je- weiligen NH ₂ - (Organo) polysiloxan-Lösung betropft (Rotationsdauer ca. 3 bis 5 Min.) und anschließend wie oben angegeben weiterbehandelt .

Die Oberflächenstruktur-Charakteristika waren in Abhängigkeit vom NH ₂ - (Organo) polysiloxanderivat von der Konzentration der Derivat-Lösung und von den Bedingungen der unterschiedlichen Prozeduren variierbar.

Oberflächenstruktur-Charakteristika : Dickenabmessungen (el- lipsometrisch) < 1 bis 3,5 nm; Wasser-Kontaktwinkel KW: 45 bis 70°; RMS-Rauhigkeiten: 0,5 bis 1,7 nm (maximierbar) und NH ₂ -Gruppen-Konzentrationen 0,1 bis 2 nMol/cm ² .

Beispiel 5: Redoxaktives Si-Verbundmaterial mittels PDA- Cellulosetosylat

Si-Substratproben wurden mit SiO _x -Polymer behandelt und danach in einer 0,l%igen Lösung eines PDA-Cellulosetosylates (Typ c, 1, Formelschema 1) in DMA, z. B. bei Raumtemperatur

- 30 Minuten geschüttelt oder

15 Minuten im Utraschallbad behandelt oder - 3 h stehengelassen.

Danach wurden die modifizierten Si-Substratproben 3 bis 4 mal mit jeweils 0,5 bis 1 cm ³ DMA durch Schütteln gewaschen und anschließend im Argon-Strom getrocknet.

Oberflächenstruktur-Charakteristika : Dickenabmessung (el- lipsometrisch) < 1 bis 1,5 nm; Wasser-Kontaktwinkel KW: 70 bis 80°; RMS-Rauhigkeit : < 1 bis 1,5 nm; NH ₂ -Gruppen- Konzentration: 0,4 bis 1 nMol/cm ² .

Beispiel 6: Glas-Verbundmaterial mittels TETAT- Cellulosetosylat

(a) MD-Substratproben, wie genannt vorbehandelt, wurden in einer 0,5%igen wässrigen Lösung eines TETAT-Cellulose- tosylates bei Raumtemperatur 30 Min. geschüttelt, danach 3 bis 4 Mal mit jeweils 0,5 bis 1 cm ³ bidest . Wasser durch Schütteln oder 2 Mal im Ultraschallbad gewaschen und anschließend im Argon-Strom getrocknet.

Oberflächenstruktur-Charakteristika : Dickenabmessung < 3 nm; Wasser-Kontaktwinkel KW: 60 bis 75°; RMS-Rauhigheit : < lnm NH ₂ -Gruppen-Konzentration: 2 bis 4 nMol/cm ² .

(b) MD-Substratproben wurden mit SiO _x -Polymer behandelt und danach in einer 0,05%igen wässrigen Lösung eines TETAT- Cellulosetosylates bei Raumtemperatur 1 Min. geschüttelt, danach 3 bis 4 Mal mit jeweils 0,5 bis 1 cm ³ bidest. Wasser durch Schütteln gewaschen und anschließend im Argon-Strom getrocknet .

Oberflächenstruktur-Charakteristika : Dickenabmessung < 3 nm; Wasser-Kontaktwinkel KW: 60 bis 75°; RMS-Rauhigheit: < 1,5 bis 2,5 nm NH ₂ -Gruppen-Konzentration: 4,8 bis 5,5 nMol/cm ² .

Beispiel 7: Al-Oxid-Verbundmaterial mittels Aminocellulosede- rivat

Al-Oxid-Substratproben wurden in einer 0,05 bis 5%igen Lösung eines Aminocellulosenderivates (z. B. Typ b, Formelschema 1) z. B. bei Raumtemperatur

5 Minuten geschüttelt oder 1 bis 2 h stehengelassen.

Danach wurden die modifizierten Al-Oxid-Substratproben 3 bis 4 mal mit jeweils 0,5 bis 1 cm ³ des eingesetzten Lösungsmit- tels (DMA oder bidest . Wasser) durch Schütteln gewaschen und anschließend im Argon-Strom getrocknet.

Oberflächenstruktur-Charakteristika : Dickenabmessung (el- lipsometrisch) < 1,5 bis 3 nm; Wasser-Kontaktwinkel KW: 65 bis 80°; RMS-Rauhigkeit : 0,5 bis lnm; NH ₂ -Gruppen- Konzentration: 0,5 bis 1 nMol/cm ² (z. B. mittels EDA-

Cellulosetosylat modifiziert) . Oder aber Dickenabmessung (el- lipsometrisch) < 1 bis 2 nm; Wasser-Kontaktwinkel KW: 60 bis 75°; RMS-Rauhigkeit : 0,4 bis 1 nm; NH ₂ -Gruppen-Konzentration: 0,3 bis 0,5 nMol/cm ² (mittels EDA-Cellulosecarbanilat modifi- ziert) .

Beispiel 8: Al-Oxid-Verbundmaterial mittels NH ₂ - (Organo) poly- siloxanderivat

Al -Oxid-Substratproben wurden in einer 0,04 bis 0,l%igen Lösung eines NH ₂ - (Organo) polysiloxanderivates (z.B. P4b bzw. P5b, Formelschema 2), z. B. in Ethanol oder 2-Propanol, bei Raumtemperatur

- 5 Minuten geschüttelt oder - 3 h stehengelassen oder

- 30 Minuten im Ultraschallbad behandelt.

Danach wurden die modifizierten Al-Oxid-Substratproben 3 bis 4 mal mit jeweils 0,5 bis 1 cm ³ 2-Propanol durch Schütteln gewaschen und anschließend im Argon-Strom getrocknet.

Oberflächenstruktur-Charakteristika : Dickenabmessung (el- lipsometrisch) < 1 bis 3 nm; KW: 65 bis 80°; RMS-Rauhigkeit : 0,24 bis 0,5 nm; NH ₂ -Gruppen-Konzentration: 0,5 bis 1,2 nMol/cm ² .

Beispiel 9: Au-Verbundmaterial via Aminocellulosecarbanilat

Au-Substratproben wurden in einer 0,05 bis 0,l%igen Losung eines Aminocellulosecarbanilates (Typ a bzw. b, Formelschema l)in DMA bei Raumtemperatur - 15 Minuten geschüttelt oder

- 15 Minuten im Utraschallbad behandelt oder

- 3 h stehengelassen.

Danach wurden die modifizierten Au-Substratproben 3 bis 4 mal mit jeweils 0,5 bis 1 cm ³ DMA unter Schütteln gewaschen und anschließend im Argon-Strom getrocknet.

Oberflächenstruktur-Charakteristika: Dickenabmessung (el- lipsometrisch) : 0,5 bis 1 nm; Wasser-Kontaktwinkel KW: 65 bis 70°; RMS-Rauhigkeit : 0,3 bis 0,5 nm; NH ₂ -Gruppen- Konzentration: 0,2 bis 1,3 nMol/cm ² .

Beispiel 10: PDMS-Verbundmaterial via Aminocellulosederivat

PDMS-Substratproben wurden mit Sauerstoff-Plasma behandelt und anschließend in einer 0,05 bis 0,l%iger Lösung eines Ami- nocellulosederivates (Typ a bzw. b, Formelschema 1) bei Raum- temperatur

10 Minuten geschüttelt oder - 3 h stehengelassen.

Danach wurden die modifizierten PDMS-Substratproben 3 bis 4 mal mit jeweils 0,5 bis 1 cm ³ des jeweils eingesetzten Lö- sungsmittels (DMA oder bidest . Wasser) durch Schütteln gewaschen und anschließend im Argon-Strom getrocknet.

Oberflächenstruktur-Charakteristika : Dickenabmessung (el- lipsometrisch) < 2 bis 3 nm; KW: 65 bis 80°; RMS-Rauhigkeit : < 0,7 nm; NH ₂ -Gruppen-Konzentration: 0,8 bis l,2nMol/cm ² (z.B. via EDA-Cellulosetosylat , Typ a, i=2, modifiziert) oder z.B. Dickenabmessung (ellipsometrisch) < 1 bis 2 nm; RMS- Rauhigkeit: 0,3 bis 0,6 nm; NH ₂ -Gruppen-Konzentration: 0,5 bis 1 nMol/cm ² (z.B. EDA-Cellulosecarbanilat-modifiziert) .

Beispiel 11: Si-Verbundmaterial durch μCP

(a) Si-Substratproben wurden anhand eines PDMS-Stempels mit TETAT-Cellulosetosylat-Strukturmustern in periodisch unterschiedlichen Linienabständen: 2 μm, Iμm, 500 nm und 200 nm und unterschiedlichen Linienbreiten: 2 μm, lμm, 500 nm und 200 nm gestempelt. Dazu wurde der PDMS-Stempel mit 5 bis 10 μl einer 0,05 bis 0,5%igen wässrigen Lösung eines TETAT-

Cellulosetosylates betropft. Anschließend wurde der Stempel mit der benetzten Seite 1 bis 5 sec vorsichtig auf ein FiI-

terpapier gedrückt und danach sofort für 2 bis 15 Minuten mit der Si-Substratproben-Oberfläche durch leichtes Aufdrücken in Kontakt gebracht .

Danach wurde der Stempel von der Si-Oberflache entfernt, die gestempelte Si-Substratprobe 15 bis 30 Minuten in bidest . Wasser unter Wechseln der wässrigen Phase geschüttelt und anschließend im Argon-Strom getrocknet.

Oberflächenstruktur-Charakteristika : (Linien-) Dickenabmessung (ellipsometrisch) < 1 - 2 nm. Bei der AFM-Vermessung wurde das periodische Linienmuster mit den unterschiedlichen Abständen und Linienbreiten verifiziert. Für die Linienbreiten wurden ca. Sollwerte vermessen und (Linien-) Dickenabmessungen < 1 bis 3 nm gefunden.

(b) Bei einer anderen Ausführungsvariante wurde ausgehend vom gleichen PDMS-Stempel, der Si-Substratprobe und einer 0,05 bis 0,5%igen wässrigen Lösung eines TETAT-Cellulosetosylates eine Stempel-Prozedurvariante angewendet. Hierfür wurde ein PDMS-Stempelkissen (Abmessung ca. 1x1 cm, Dicke ca. 3 mm) aus dem „PDMS-Sylgard 184 "-Material gegossen und mit der TETAT- Cellulosetosylat-Lösung ca . 3 h unter Rühren getränkt. Der PDMS-Stempel wurde auf das vorbehandelte Stempelkissen gedrückt und anschließend mit der Si-Substratproben-Oberfläche ca. 5 Minuten in Kontakt gebracht. Die gestempelte Substratprobe wurde dann, wie unter (a) beschrieben, behandelt und charakterisiert. Dabei wurden die Ergebnisse der Stempel- Prozedur, wie unter (a) beschrieben, bestätigt.

Beispiel 12: Oberflächen-Modifizierung von SAW- (Sensor) chips im mikrofluidischen Sensorsystem

Bei der Modifizierung der SAW-Chips wurde von unterschiedlichen SAW-Chipoberflächen ausgegangen, z. B. (a) SiO ₂ -Polymeroberfläche als Signal-führende Schicht oder (b) Au-Oberflache auf Si0 ₂ -Polymer als Signal -führende Schicht.

Vor Einsetzen des SAW-Chips (b) in das mikrofluidische Sensorsystem wurde die Au-Oberflache auf die genannten Weisen vorbehandelt.

Schritt 1: Eine 0,5%ige, Lösung eines TETAT-Cellulose- tosylates in bidest . Wasser wurde über den SAW-Chip geleitet (Fließgeschwindigkeit ca. 25 μl/Min. , Dauer ca. 9 Min.). Das Signal der Phasenänderung, d. h. die Masse-Zunahme, des SAW- Chips war nach ca. 3 Minuten konstant. Danach wurde bidest. Wasser durch das mikrofluidische Sensorsystem geleitet (Fließgeschwindigkeit ca. 25 μl/Min., Dauer ca. 9 Min.), zwecks Ablösung von gegebenenfalls nicht-adhäsiv auf der Chipoberfläche befindlichem TETAT-Cellulosetosylat . Dabei wurde kaum eine Signaländerung, das heißt kaum eine Masse- Ablösung, beobachtet. Der Schritt 1 wurde mit der 0,5%igen TETAT-Cellulosetosylat-Lösung bei gleichen Fließbedingungen wiederholt. Es wurde keine Masse- bzw. Signaländerung des SAW-Chips beobachtet, auch nicht beim anschließenden Durch- leiten von bidest. Wasser (Fließbedingungen wie oben) . Die Modifizierung der Au-Oberflache bzw. SiO ₂ -Polymeroberfläche des SAW-Chips mittels TETAT-Cellulosetosylat war somit innerhalb einer Fließdauer von 3 Minuten beendet.

Schritt 2 : Die modifizierte SAW-Chipoberflache wurde mittels eines NH ₂ -reaktiven bifunktionellen Reagenz,

z. B. Glutaraldehyd (GDA), funktionalisiert . Dazu wurde eine 25%ige wässrige Glutaraldehyd-Lösung über die modifizierte SAW-Chipoberflache geleitet (Fließgeschwindigkeit ca. 50 μl/Min. , Dauer ca. 5 Min.) . Anschließend wurde das nicht an der SAW-Chipoberflache umgesetzte bifunktionelle Reagenz mittels bidest. Wasser bei gleicher Fließgeschwindigkeit und Dauer entfernt. Die vermessene Phasenänderung bzw. Masse- Zunahme signalisiert, dass die SAW-Chipoberflache via GDA funktionalisiert wurde.

Schritt 3 : Ausgehend von der modifizierten SAW-Chipoberflache wurde z. B. mittels eines Anti-Thrombin-RNA-Aptamers ein Ana- lyt (Thrombin) -sensitiver SAW-Sensorchip hergestellt. Dazu wurde eine Anti-Thrombin-RNA-Aptamer-Lösung in bidest. Wasser (1 μmolar) über die SAW-Chipoberflache geleitet (Fließge- schwindigkeit ca. 25 μl/Min., Dauer ca. 9 Min.). Die resultierende Phasenänderung signalisiert, dass das Aptamer auf der SAW-Chipoberflache fixiert vorliegt. Bei anschließendem Durchleiten von bidest. Wasser (Fließgeschwindigkeit ca. 25 μl/Min., Dauer ca. 9 Min.) zeigte sich, dass das Aptamer nicht abgelöst wird. Das heißt, der SAW-Sensorchip war geeignet, um Thrombin als Analyt zu vermessen.

Sensor-Test- bzw. Messschritt: Der Test- bzw. Messstatus des mikrofluidischen Sensorsystems wurde durch einen SELEX-Puffer (1 mmolar, pH 8) mit einer Fließgeschwindigkeit von ca. 25 μl/Min. eingestellt. Der SAW-Sensorchip war Thrombin- spezifisch und frei von unspezifischer Protein-Bindung, wie sich anhand von Testläufen mittels Thrombin- bzw. Elastase- und Rinderserumalbumin-Lösungen in SELEX-Puffer erwies. Das Thrombin, welches sich nach dem Messschritt auf der Sensor- Oberfläche befand, wurde mittels 0,1 molarer NaOH-Lösung abgelöst. Die anschließende erneute Vermessung der Thrombin-

Lösung in SELEX-Puffer bestätigte, dass der SAW-Sensorchip regenerierbar ist und reproduzierbare Messwerte liefert.

Die Modifizierung von SAW- (Sensor) chips war auch via NH ₂ - (Organo) polysiloxanderivaten und bei Variation des NH ₂ - reaktiven Reagenz bzw. des Bio-Funktionsmolekül-Typs erfolgreich.

Beispiel 13 : Funktionalisierung mittels NH ₂ -reaktiver bifunktioneller Reagenzien

Die Funktionalisierung dient der Modifizierung der genannten Oberflächen-Eigenschaften, insbesondere der Bio- Funktiona1isierung .

Allgemeines Verfahren: Zwecks Funktionalisierung wurde das Substratverbundmaterial in einer meist gesättigten Lösung eines NH ₂ -reaktiven bifunktionellen Reagenz 5 bis 60 Min. geschüttelt oder stehengelassen. Danach wurde die funktiona- lisierte Substratprobe mehrfach unter Schütteln gewaschen, im Argonstrom getrocknet und für den Anwendungszweck, insbesondere bei der Bio-Funktionalisierung, eingesetzt.

Zur Variation des Wasser-Kontaktwinkels, der pH- oder La- dungsverteilungs-Eigenschaften und/oder zur Bio-

Funktionalisierung wurden als bifunktionelle Reagenzien vorzugsweise eingesetzt:

L-Ascorbinsäure, 1, 3-Benzol-disulfonylchlorid, 1,4-Benzol- disulfonylchlorid, Phthaldialdehyd, Isophthaldialdehyd, 1,4- Diacetylbenzol, 1, 3-Diacetylbenzol , Glutaraldehyd, Benzochi- non, 1, 3 -Benzol-dicarbonsäure dichlorid, 1, 4-Benzoldicarbon- säuredichlorid, Cyanurchlorid.