Titre de l’invention : Procédé de pronostic de la virulence et de la pathogénicité de souches de bactéries gram négatif L’invention concerne le domaine des infections par des bactéries Gram négatif de la famille des entérobactéries, en particulier par Enterobacter cloacae, et les moyens de prédire leur virulence et/ou leur caractère pathogène. L'invention se rapporte notamment à de nouveaux biomarqueurs et à leur utilisation ainsi qu'aux dispositifs permettant leur utilisation dans des méthodes de pronostic, en particulier de pronostic clinique.

Les infections par la bactérie Enterobacter cloacae sont responsables d'infection sévère chez l'homme pouvant évoluer vers un choc septique et le décès du patient. Certaines populations tels que les patients âgés, les patients immunodéprimés et les nourrissons nés prématurément présentent un risque important de contracter cette infection. Chez les prématurés, l'infection à Enterobacter cloacae est mortelle dans 80% des cas et survient de manière épidémique.

Les espèces du complexe Enterobacter cloacae, des bactéries à Gram négatif de la famille des Enterobacteriaceae, sont généralement isolées du sol, des plantes et des intestins de mammifères et d'insectes. En tant qu'anaérobie facultatif, elles ont la capacité de survivre dans divers environnements, notamment un sol sec, des conduites d'eau et des équipements médicaux en métal ou en plastique. Le complexe E. cloacae est un contaminant commun de cathéter intravasculaire centraux, de matériel biomédical et peut être un agent pathogène opportuniste chez les humains immunodéprimés et les nouveau-nés responsable d’infections nosocomiales. Le complexe E. cloacae comprend six espèces différentes : Enterobacter asburiae, Enterobacter cloacae, Enterobacter hormaechei, Enterobacter kobei, Enterobacter ludwigii et Enterobacter nimipressuralis.

Chez l'homme, le complexe £. cloacae (£. cloacae) fait partie du microbiote intestinal normal et n'est généralement pas un agent pathogène primaire. Cependant, certaines souches deviennent virulentes, en particulier en milieu hospitalier : le complexe £. cloacae est devenu l'un des agents pathogènes nosocomiaux les plus couramment rencontrés dans les unités de réanimation néonatales, pédiatriques et adultes. Les facteurs associés à la virulence d’Enterobacter cloacae sont pour l’heure mal connus.

Les souches sauvages d Enterobacter cloacae sont sensibles aux céphalosporines de troisième génération, céphalosporines de quatrième génération, aux aminosides, quinolones, sulfamides, tétracyclines et chloramphénicol. Toutefois, l'émergence et la dissémination de souches multi-résistantes aux antibiotiques en milieu hospitalier nécessite l’utilisation d’antibiotiques de dernier recours. Dans le cas spécifique des infections néonatales, on emploie classiquement en première intention une association d'une pénicilline ou une céphalosporine de 3 ^eme génération avec une autre classe d'antibiotique, notamment aminosides (gentamycine). Si le traitement est inefficace, une antibiothérapie de seconde intention est mise en place avec d'autres associations à base de pénicillines et inhibiteurs des betalactamases, carbapénèmes, de polymixines et/ou de tigécycline. Dans le cas de souches résistantes, des traitements antibiotiques de troisième ou quatrième ligne seront nécessaires pour aboutir à l’éradication de l’infection.

La pression thérapeutique induite par le traitement d Enterobacter cloacae participe à l’émergence de souches multirésistantes. Dans le cas de souches virulentes, les infections sont susceptibles d’entrainer le décès du patient dans un délai très court, parfois de l’ordre de 48 heures. Il n’est donc pas possible, dans ces cas, d’attendre la réaction du patient à un traitement de première intention pour l’adapter en cas d’absence d’efficacité. L’extrême sévérité de ces infections dans des populations fragiles conduit à un schéma thérapeutique ayant recours d’emblée à des traitements par des antibiotiques de troisième ou quatrième ligne, dès que la présence de souches dEnterobacter est détectée. Ce n’est qu’a posteriori que la sensibilité à différents antibiotiques des souches identifiées lors du prélèvement pourra être ou non confirmée par des techniques classiques. Or un nombre significatif de patients peuvent présenter un portage asymptomatique qui lui ne nécessite pas de traitement.

En outre, bien que non spécifique à E. cloacae, l'utilisation extensive d'antibiotiques à large spectre est responsable du développement de résistance et de la sélection des souches pathogènes. Elle résulte en une modification de l'épidémiologie des infections néonatales avec émergence des infections graves aux entérobactéries, dont Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae et Enterobacter cloacae. Il est donc souhaitable de réserver l'utilisation des antibiothérapies de seconde intention aux souches virulentes et/ou résistantes aux antibiotiques de première intention responsables d’infections invasives.

Outre le portage propre du patient de souches d ’Enterobacter cloacae, la contamination de matériel (par exemple des incubateurs pour nourrissons nés prématurément) est une source potentielle d’infection du patient. Il est donc également important de déterminer si celui-ci peut être traité par des méthodes courantes ou si la destruction et le remplacement du matériel sont nécessaires au vu de la pathogénicité des souches.

Il est essentiel de pouvoir différencier les souches possédant un risque de pathogénicité humaine élevé de celles responsables de portage asymptomatique de manière à 1) Initier le plus rapidement les traitements adéquats pour les souches pathogènes avant l’infection invasive, le choc septique et le décès du patient, et 2) de ne pas traiter inutilement des souches non pathogènes et donc générer une pression de sélection antibiotique inutile.

Il existe donc un besoin pour détecter et identifier rapidement les souches pathogènes nécessitant la mise en place d'un traitement adapté avant que le patient ne décède.

Il existe également un besoin pour identifier les souches non pathogènes et éviter de traiter inutilement.

Dans le cadre de la présente invention, une corrélation entre une structure spécifique du lipopolysaccharide (LPS) et la pathogénicité des souches nosocomiales d'entérobactéries, en particulier d'E. cloacae résistantes aux antibiotiques a été mise en évidence.

L'invention permet donc la mise en place d'une technique rapide et fiable de détection de la pathogénicité et/ou du caractère virulent de souches cliniques d'entérobactéries telles que Enterobacter cloacae. Ceci est rendu possible par la caractérisation d’un marqueur spécifique, présent dans le LPS, et plus particulièrement dans le lipide A des bactéries.

Le lipopolysaccharide (LPS) est un composant majeur de la surface externe des bactéries à Gram négatif. Le LPS est composé de trois entités : (i) le lipide A, possède un caractère hydrophobe, (ii) l’antigène O (pour « Ohne Kapsel »), situé à la partie distale du LPS, de nature polysaccharidique, possède un caractère hydrophile et (iii) le noyau (ou « core ») de nature polysaccharidique représente le pont entre les deux autres parties. Le lipide A, enchâssé dans la membrane externe, représente la partie proximale du LPS, le noyau, sa partie médiane, et l’antigène O, sa partie distale « libre » dans le milieu extérieur. Chez les entérobactéries, le lipide A est fortement conservé et le noyau est très peu variable tandis que l’antigène O est la région hypervariable. Plusieurs activités et rôles biologiques ont été associées au LPS, parmi lesquelles l’activité endotoxinique portée par le lipide A et la spécificité antigénique de la souche bactérienne portée par l’antigène O.

La structure du lipide A est assez conservée parmi l’ensemble des bactéries Gram négatif. Parmi les bactéries d’une même famille, comme la famille Enterobacteriaceae, la structure du lipide A est même quasi identique. Chez E.coli, le lipide A est composé d’un disaccharide de D-glucosamine liés par liaison b-1.6 et phosphorylés en position 1 et 4’. Ce disaccharide est acylé en position 2,3, 2’ et 3’ avec quatre groupements b- hydroxymyristoyl. Deux autres chaînes d’acides gras : un résidu laurate (12c) et un résidu myristate (14) estérifié à leur extrémité non réductrice peuvent se lier sur deux premiers résidus hydroxymyristoyls (raetz, 1990) Le rôle du LPS dans la résistance des bactéries à Gram négatif aux antibiotiques et aux agents antimicrobiens est directement lié à la barrière que le LPS forme sur la surface externe de la membrane bactérienne. Les antibiotiques hydrophiles, tels que les b-lactames, utilisent les porines pour pénétrer à l’intérieur de la cellule bactérienne, alors que d’autres médicaments doivent déstabiliser cette barrière rendue rigide en raison des fortes interactions entre les molécules de LPS. Par conséquent, les modifications de la région lipide A des LPS peuvent modifier la capacité de pénétration de certains agents antimicrobiens. Par exemple, l'ajout de résidus de 4- aminoarabinose ou de phosphoéthanolamine sur les groupes phosphate du lipide A, réduit la charge négative des LPS, diminuant ainsi la répulsion entre molécules de LPS adjacentes. Par ailleurs, l’ajout d’un palmitate sur le lipide A, augmente les interactions hydrophobes entre les molécules de LPS voisines.

Chez les bactéries à Gram négatif, une virulence accrue peut être due à une résistance accrue à différents peptides antimicrobiens cationiques (CAMP) produits par l’hôte, tels que les défensines, le peptide neutrophile humain (HNP-1), la protéine cationique humaine 18 (hCAP18 ou LL-37), et la kinocidinl 4. Les principaux mécanismes de résistance aux CAMP consistent en des modifications des LPS par addition de 4-amino-4-désoxy-L-arabinose ou de phosphoéthanolamine, ce qui diminue la charge négative du lipide A. Les opérons codant pour les enzymes impliquées dans ces modifications sont arnBCADTEF et pmrCAB. L'activation des gènes modifiant les LPS est souvent médiée par PmrA/ PmrB et PhoP / PhoQ, des systèmes de régulation à deux composants (TCS) interconnectés selon les espèces. Par exemple, chez Escherichia coli, Salmonella enterica ou Klebsiella pneumoniae, la forme phosphorylée de PhoP peut stimuler l'expression de PmrD qui active à son tour PmrA en favorisant la transcription des opérons arnBCADTEF et pmrCAB. En ce qui concerne E. cloacae et sa résistance aux CAMP, il a été récemment démontré qu’un opéron artificiel est impliqué, mais, contrairement à E. coli, Salmonella ou Klebsiella, seul PhoP / PhoQ (et non PmrA / PmrB) semble jouer un rôle.

L'augmentation du nombre d'infections contractées en milieu hospitalier dans les unités de soins intensifs due à E. cloacae et leur mortalité importante montre qu'il est urgent d’identifier des marqueurs de pathogénicité.

En raison de l'évolution fulminante des infections à Enterobacter cloacae et des chocs septiques qu’elles entraînent, les travaux réalisés dans le cadre de l’invention ont eu comme objectif d'étudier les structures des lipopolysaccharidiques de souches cliniques responsables de décès ou de portage asymptomatique ; ils ont pu établir une corrélation entre certaines de ces structures et le tableau clinique, en particulier avec la survie des patients infectés.

L'invention a notamment pour but de proposer un test de détection in-vitro permettant d’identifier les souches pathogènesd'entérobactéries, telles que celles d 'Enterobacter cloacae responsables d’infection invasive et de choc septique et d’une surmortalité associée.

La présente invention a pour objet un procédé de pronostic de la pathogénicité d'une souche de bactéries à Gram négatif de la famille des Enterobacteriaceae, dans lequel on mesure la quantité d’acide 2-hydroxy-myristique ou de l’un de ses esters présent dans le lipo-polysaccharide des bactéries, on compare ladite quantité d’acide 2-hydroxy-myristique ou d’esters d’acide 2-hydroxy-myristique à une valeur de référence, et dans lequel on conclut que la souche est pathogène si la quantité d’acide 2-hydroxy-myristique ou d’esters d’acide 2-hydroxy-myristique est supérieure à la valeur de référence. La présente invention a en particulier pour objet un procédé de pronostic de la pathogénicité d'une souche de bactéries à Gram négatif appartenant au genre Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Salmonella, Serratia ou Yersinia, et notamment au genre Enterobacter, Escherichia, Pseudomonas, Serratia ou Yersinia dans lequel on mesure la quantité d’acide 2-hydroxy-myristique ou de l’un de ses esters présent dans le lipo-polysaccharide des bactéries, on compare ladite quantité d’acide 2-hydroxy-myristique ou d’esters d’acide 2-hydroxy-myristique à une valeur de référence, et dans lequel on conclut que la souche est pathogène si la quantité de d’acide 2-hydroxy-myristique ou d’esters d’acide 2-hydroxy-myristique est supérieure à la valeur de référence.

Selon un autre aspect, l’invention a pour objet un procédé de pronostic de la virulence d'une souche de bactéries à gram négatif de la famille des Enterobacteriaceae et notamment du genre Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Salmonella, Serratia ou Yersinia, notamment au genre Enterobacter, Escherichia, Pseudomonas, Serratia ou Yersinia dans lequel on mesure la quantité d’acide 2-hydroxy-myristique ou de l’un de ses esters présent dans le lipo polysaccharide des bactéries, on compare ladite quantité d’acide 2-hydroxy-myristique ou d’esters d’acide 2-hydroxy-myristique à une valeur de référence, et dans lequel on conclut que la souche est pathogène si la quantité de d’acide 2-hydroxy-myristique ou d’esters d’acide 2-hydroxy-myristique est supérieure à la valeur de référence

Le procédé de pronostic de la pathogénicité et/ou de la virulence d'une souche de bactéries à Gram négatif de la famille des Enterobacteriaceae et en particulier de bactéries du genre Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Salmonella, Serratia ou Yersinia, et notamment du genre Enterobacter, Escherichia,

Pseudomonas, Serratia ou Yersinia repose sur la mesure qualitative et quantitative d'acide 2 hydroxymyristique ou de l'un de ses esters tel que le 2-hydroxymyristate présent dans les lipopolysaccharides des bactéries. La comparaison de la quantité de 2-hydroxymyristate et/ou d'acide 2-hydroxymyristique à une valeur de référence permet de déterminer le caractère virulent et/ou pathogène de la souche étudiée.

Ainsi, dans le procédé de pronostic selon l'invention peut comprendre l'identification de l'acide 2 hydroxymyristique ou de l'un de ses esters, présent dans les lipopolysaccharides des bactéries. La valeur de référence peut être égale à 0, ou être celle d'un témoin négatif soumis à la même détermination. Elle sera ainsi adaptée par l’homme du métier en fonction de la sensibilité de la méthode et du seuil de détection des composés d’intérêt mesurés.

La valeur de référence sera ainsi dans certains modes de réalisation de l’invention être fixée à 0,001 , ou à 0,01.

Avantageusement, la bactérie est une souche du genre Enterobacter, en particulier une bactérie appartenant à Enterobacter cloacae complex, et choisie parmi Enterobacter asburiae, Enterobacter cloacae, Enterobacter hormaechei, Enterobacter kobei, Enterobacter bugandensis, Enterobacter roggenkampii, Enterobacter ludwigii et Enterobacter nimipressuralis.

Dans la description, à moins qu'il n'en soit précisé différemment, les termes Enterobacter cloacae (ou E. cloacae) désignent par défaut une souche appartenant à Enterobacter cloacae complex et choisie parmi l'une de ces sous-espèces : Enterobacter asburiae, Enterobacter cloacae, Enterobacter hormaechei, Enterobacter kobei, Enterobacter bugandensis, Enterobacter roggenkampii, Enterobacter ludwigii et Enterobacter nimipressuralis.

Selon un autre aspect de l'invention, la bactérie est une souche d'entérobactérie pathogène pour l'homme, appartenant à l'une des espèces suivantes : Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa et Yersinia pestis.

Par souche pathogène, on entend une souche susceptible d'entrainer une infection invasive, un choc septique voire le décès du patient en lien avec cette infection, dans un délai court, de quelques heures à quelques jours, notamment dans un délai inférieur à 5 jours ; en particulier pouvant entraîner un choc septique et/ou le décès du patient dans un délai inférieur ou égal à 48h.

A la connaissance des inventeurs, il n'avait jamais été montré que la présence de 2- OH myristate est un marqueur de pronostic de la capacité d'une souche de bactérie gram négatif, en particulier d 'Enterobacter cloacae complex, à entraîner le décès du patient porteur de ladite souche.

Par souche virulente, on entend une souche présentant des caractéristiques lui permettant d’échapper aux mécanismes de défenses de l’hôte, notamment les peptides antimicrobiens cationiques, la phagocytose et la réponse cytokinique. On entend en particulier une souche bactérienne présentant une résistance à un ou plusieurs agents antimicrobiens tels que les antibiotiques choisis parmi les céphalosporines de troisième génération, les pénicillines, les carbapénèmes, les aminosides, les quinolones, les sulfamides, les tétracyclines et le chloramphénicol. De telles souches peuvent notamment être porteuses de beta-lactamases à spectre étendu (BLSE). La souche virulente peut aussi être une souche résistant aux agents antimicrobiens qui sont les peptides antimicrobiens cationiques produits par l'organisme pour se défendre contre les infections, tels que les défensines, le peptide neutrophile humain (HNP-1), la protéine cationique humaine 18 (hCAP18 ou LL-37), et la kinocidin 14 dérivée de plaquettes humaines

Selon l'un de ses aspects, le procédé de pronostic est un procédé de diagnostic in vitro de pathogénicité des souches cliniques de la famille des Enterobacteriaceae, notamment de souches de bactéries du genre Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Salmonella, Serratia ou Yersinia, et notamment au genre Enterobacter, Escherichia, Pseudomonas, Serratia ou Yersinia, en particulier d 'Enterobacter cloacae telles que définies dans la présente description.

Selon un autre de ses aspects, le procédé de pronostic de l'invention est un procédé de pronostic de résistance de souches d 'Enterobacter cloacae aux antibiotiques et/ou aux peptides anti-microbiens

Selon l'un des modes de réalisation du procédé de pronostic selon l'invention, on compare la quantité de 2-hydroxymyristate à la quantité de 3-hydroxymyristate présent dans le lipopolysaccharide des bactéries, et si le ratio 2-hydroxymyristate / 3- hydroxymyristate est supérieur ou égal à 0.01, on conclut que la souche est pathogène.

L'invention sera notamment mise en œuvre pour caractériser des bactéries présentes dans un échantillon, en particulier un échantillon biologique, cutané et/ou prélèvements d’hygiène, c’est à dire tout prélèvement microbiologique de matériel médical et issus de l’environnement.

L'échantillon biologique pourra être obtenu à partir d'un mammifère, de préférence d'un être humain. Un échantillon biologique pourra être issu de tout prélèvement à partir d'un sujet suspecté d'être porteur de souches d' Enterobacteries en particulier d' Enterobacter cloacae. On peut citer, de manière non limitative, les échantillons biologiques choisis parmi le sang, le sérum, le plasma, le liquide céphalo-rachidien (LCR), l’ascite et le liquide pleural, le mucus, les selles et les urines ou tout autre sécrétion ou excrétion. L'échantillon peut notamment être obtenu à partir d'un prélèvement des voies respiratoires et/ou d'une partie au moins du pharynx telle que du nasopharynx (ou cavum), d’un prélèvement à partir de la peau obtenu par exemple par frottis cutané ou d'un prélèvement vaginal.

Le procédé de pronostic selon l'invention est particulièrement adapté à la détection et la caractérisation de souches d' Enterobacter cloacae présentes chez le patient fragile tels que nouveau-né, en particulier chez les nourrissons nés prématurément, patients immunosupprimés ou immunodéprimés, patients poly-morbides. Dans l’ensemble de ces patients, il est particulièrement utile de connaître précocement le caractère de pathogénicité et/ou virulence de la souche. Cela permet de décider plus rapidement du type d'antibiotiques devant être administré, sans attendre les premiers symptômes d’infection. Le caractère fulminant et dévastateur de ce type d’infection nécessite une anticipation des traitements à appliquer.

Dans le cadre des infections néonatales, le procédé peut aussi être mis en œuvre sur des prélèvements biologiques maternels, notamment des prélèvements de dépistage microbiologique, provenant notamment de la filière vaginale par exemple frotti vaginal, du placenta, ou du liquide amniotique. En effet, la contamination du nouveau-né peut être d'origine maternelle (per partum, infection foeto-maternelle).

Si une souche pathogène d' Enterobacter cloacae est identifiée chez la mère en fin de gestation ou au moment de l'accouchement, notamment dans la filière vaginale, sur frottis de placenta ou sur une culture de liquide amniotique, une mise en route préemptive du traitement antibiotique adapté peut être envisagé et justifier une surveillance accrue du nouveau-né.

Le procédé de pronostic pourra être appliqué à des bactéries du genre Enterobacter cloacae, et en particulier d 'Enterobacter cloacae présentes chez des sujets présentant divers types d'infections, notamment chez des patients âgés et/ou immunodéprimés, et patients de soins intensifs. On sait que Enterobacter cloacae peut être impliqué dans des infections du sang, des voies respiratoires, des pathologies ostéo-articulaires, des infections urinaires ou des infections cutanées par exemple : le procédé de pronostic pourra être mis en œuvre pour des souches provenant d'un sujet présentant l'une de ces pathologies. Selon un autre aspect de l'invention, le procédé de pronostic pourra être mis en œuvre pour des bactéries provenant d'un échantillon d’hygiène ou environnemental, notamment un échantillon prélevé sur des équipements ou appareillage, tel que du matériel hospitalier et/ou biomédical. Enterobacter cloacae peut en effet contaminer le matériel utilisé qui devient alors une source de contamination pour les patients qui seront en contact avec celui-ci. C'est le cas par exemple pour des cathéters, des sondes, ou des couveuses dans lesquels les nouveau-nés sont placés. Dans le cas de détection de souche d' Enterobacter cloacae sur du matériel, il importe de déterminer s'il s'agit d'une souche pathogène devant faire l'objet d'un traitement particulier (voire de la destruction du matériel contaminé).

Selon l'un de ses modes de réalisation, le procédé de pronostic comprend une étape préalable d'isolement des bactéries à partir d'un échantillon, en particulier d'un échantillon biologique, ou d’un échantillon d’hygiène ou environnemental.

Par exemple, on recueille un échantillon susceptible de contenir Enterobacter cloacae, et on effectue une première étape d'identification de l'espèce selon des techniques connues de l'homme du métier.

La souche est ensuite isolée et mise en culture sur un milieu adapté.

Avantageusement, le procédé comprend ensuite une étape de lavage afin de séparer les bactéries du milieu de culture et des contaminants éventuels. Le procédé comprend alors les étapes suivantes a) Isolement de bactéries Gram négatif du genre Enterobacter à partir d’un échantillon b) culture des bactéries isolées à l’étape a) in vitro sur un milieu adapté, c) récupération des bactéries à partir du milieu de culture, d) lavage des cellules bactériennes et séparation de la partie solide contenant les cellules bactériennes de la partie liquide, e) mesure la quantité d'acide 2-hydroxymyristique présent dans le lipopolysaccharide des bactéries obtenues à l’étape d, f) comparaison de ladite quantité d'acide 2-hydroxymyristique à une valeur de référence, g) pronostic sur la pathogénicité des bactéries présentes dans l’échantillon si la quantité d'acide 2-hydroxymyristique déterminée à l’étape e) est supérieure à la valeur de référence. Selon une variante de l’invention, avant l’étape e) on effectue une hydrolyse des cellules bactériennes.

Selon une autre variante de l’invention, on réalise avant l’étape d) une étape de lyophilisation des bactéries. Selon un autre mode de réalisation de l’invention, le procédé comprend les étapes suivantes a) Isolement de bactéries Gram négatif de la famille des entérobactéries, notamment du genre Enterobacter, à partir d’un échantillon b) culture des bactéries isolées à l’étape a) in vitro sur un milieu adapté, c) récupération des bactéries à partir du milieu de culture, d) extraction des lipopolysaccharides présents dans les bactéries récupérées à l’étape c), e) mesure la quantité d'acide 2-hydroxymyristique présent dans le lipopolysaccharide obtenu à l’étape d, f) comparaison de ladite quantité d'acide 2-hydroxymyristique à une valeur de référence, g) pronostic sur la pathogénicité des bactéries présentes dans l’échantillon si la quantité d'acide 2-hydroxymyristique déterminée à l’étape e) est supérieure à la valeur de référence.

Avantageusement, les bactéries Gram négatif sont des bactéries de l’espèce Enterobacter cloacae

La présence et la quantité d’acide hydroxymyristique, en particulier d’acide 2- hydroxymyristique dans les bactéries peut être mesurée par des méthodes connues de l’homme du métier, telles que la chromatographie gazeuse, la chromatographie gaz liquide ou HPLC. Selon certains modes de réalisation, l’échantillon bactérien sera traité avant son analyse par chromatographie, par exemple par extraction en phase solide. La détermination de la présence d’acide 2-hydroxymyristique (ou de ses esters), et la mesure de la quantité présente peut être effectuée directement sur les souches cultivées, après séparation du milieu de culture. Cette détermination peut selon une variante de l’invention, être effectuée sur les lipopolysaccharides, qui ont été préalablement extraits à partir de la culture bactérienne.

Selon un mode de réalisation avantageux, la détermination de la quantité d’acide 2- hydroxymyristique et/ou de ses esters comme le 2-hydroxymyristate est effectuée en utilisant la spectrométrie de masse.

Un spectromètre de masse comporte 3 parties : (i) une source d’ion, où les ions sont produits en phase gazeuse à partir des états solides, liquides ou gazeux, (ii) un ou plusieurs analyseurs dans lequel les ions sont manipulés (transportés, tournés, triés, sélectionnés, fragmentés...) et (iii) un détecteur qui compte des ions et amplifie leurs signaux ou enregistre l’image d’un courant induit par le mouvement des ions.

Enfin un système informatique qui collecte toutes les données à partir de ces trois éléments pour générer un spectre de masse. Le spectromètre de masse peut inclure d’autres éléments, notamment des systèmes de séparation tels que des interfaces avec des systèmes de chromatographie.

Selon la nature de la source d’ions et de l’analyseur, différents types de spectrométrie sont définis. On peut citer, de manière non limitative les analyseurs de type FT-ICR (Fourier transform ion cyclotron), Orbitrap, piège ionique, triple quadripôle et TOF ( time offlight). De même, on peut citer les sources d’ions telles que Electrospray, MALDI ( matrix assisted desorption ionization), Impact électronique, APPI, FAB-MS, Ionisation chimique et secteur magnétique.

La résolution, c’est-à-dire la capacité à séparer deux pics, variera en fonction de ces sources et analyseurs et sera adaptée par l’homme du métier.

Les systèmes de chromatographie interfacés peuvent comprendre tout système de chromatographie, tels que la chromatographie gazeuse (GC), la chromatographie lliquide (LC), ou par mobilité d’ion (éventuellement combinée avec les procédés GC et/ou LC). Selon certains modes de réalisation de l’invention, le système de spectrométrie de masse est un système GC-MS ou LC-MS.

L’identification de l’acide a-hydroxymyristique peut en particulier être effectuée de deux manières différentes :

Selon un mode de réalisation les lipopolysaccharides (LPS) sont extraits des souches cultivées. Les structures du lipide A sont analysées, par exemple par la technique MALDI-TOF ou toute autre technique connue de l’homme du métier, afin de déterminer la présence d’acide 2-hydroxymyristqiue ou de 2-hydroxymyristate. Comme technique utilisable, on peut citer de manière non limitative TLC ("thin layer chromatography" ou chromatographie en couche mince), Maldi TOF (MS), Maldi TOF/TOF (MS/MS), ESI (electrospray), GC (chromatographie gazeuse), GC/MS (chromatographie gazeuse/ spectrométrie de masse), LC/MS (chromatographie liquide / spectrométrie de masse ) et RMN (résonance magnétique nucléaire).

Selon un autre mode de réalisation, les bactéries entières sont traitées puis analysées directement sans étape d’extraction par chromatographie de type GC-MS ou toute autre technique connue de l’homme du métier, afin de déterminer la présence d’acide 2-hydroxymyristique ou de 2-hydroxymyristate. Le traitement des bactéries peut notamment comprendre une étape d'élimination des phospholipides, par exemple lors d'une étape de lavage par un ou plusieurs solvants et une étape d’hydrolyse de la cellule bactérienne. De manière optionnelle, les bactéries pourront être lyophilisées après lavage.

La spectrométrie de masse est une technique d’analyse permettant d’identifier différents types de molécules ionisées par mesure de leur rapport masse/charge (m/z). La technologie de type MALDI-TOF (ou Matrix-Assisted Laser Desorption lonisation- Time Of Flight) requiert au préalable une étape de cristallisation, sur support inerte, de l’échantillon dans une matrice. Le complexe ainsi formé est bombardé par un faisceau laser émettant dans la zone d’absorption de la matrice. L’irradiation du mélange cristallin conduit à la désorption d’ions caractéristiques de l’échantillon (MALDI). Les molécules ionisées sont alors accélérées dans un champ électrique et dirigées vers un analyseur séparant les ions selon leur temps de vol (TOF), qui est proportionnel à la masse et à la charge. Ainsi, en fonction de leur rapport m/z, les ions atteignent plus ou moins rapidement le détecteur où ils sont alors transformés en un signal électrique qui sera amplifié puis analysé. La technique de type MALDI-TOF MS est classiquement utilisée pour identifier rapidement des microorganismes au niveau de l'espèce par analyse de leurs protéines totales, en comparant les spectres obtenus à des spectres de référence. L’identification peut être réalisée à partir de microorganismes entiers.

Dans le lipide A des souches ou pathogènes de E. cloacae, de petites quantités d'acide a-hydroxymyristique (20H-C14) remplacent la chaîne secondaire C14: 0 en position 2 ou en position 3 '. La formation du 2-hydroxymyristate nécessite l’action d’enzymes codées, entre autres par le gène IpxO. Il convient toutefois de noter que 20H-C14 peut être absent, même en présence de LpxO, si une enzyme homologue à LpxL2 est absente. En effet, LpxO ne modifie qu'un groupe de myristate secondaire précédemment transféré par LpxL2. En conséquence le gène IpxO seul ne peut pas expliquer en totalité la présence ou absence du a-hydroxymyristate dans le LPS. Des variants de IpxO codant pour des enzymes différentes en termes de spécificités peuvent éventuellement intervenir. Les résultats montrent que 20H-C14 est un substituant secondaire en position 2 chez certaines espèces moléculaires (Fig. 3A) et 3' dans d'autres (Fig. 3B)

Les inventeurs ont montré que chez les souches du complexe Enterobacter cloacae, l'ADN codant pour LpxO est présent, soit dans le génome de la bactérie soit porté par un plasmide.

Les analyses des structures de lipide A par MALDI-TOF, suivies d'analyses par GC- MS de leur teneur en acides gras, ont montré une corrélation statistique indiscutable entre la présence d'acide 2-hydroxymyristique dans le LPS des souches d 'Enterobacter cloacae et la pathogénicité des souches, entraînant une mortalité des patients.

En revanche, la mortalité des patients n’est corrélée ni à d’autres caractéristiques structurelles des endotoxines, ni à des marqueurs phénotypiques tels que les profils ERIC-PCR ou l’expression AmpC.

Ainsi, dans une étude réalisée sur un panel de 36 nourrissons dans le cadre de l’invention, il convient de noter que les six bébés décédés en l'absence d’acide 2- hydroxymyristique (ou de 20H-C14) dans leurs isolats sont décédés de pathologies indépendantes de l'infection à E. cloacae : hémorragie pulmonaire, méningite à autre germe, perforation digestive et entérocolite, hémorragie intra-cérébrale.

L'invention fournit donc un biomarqueur de la pathogénicité et/ou de la virulence de souches d'Enterobacter.

Un objet de l'invention est encore l'utilisation de l'acide 2-hydroxymyristique ou de ses esters comme marqueur de virulence et/ ou de pathogénicité de souche bactérienne à Gram négatif de la famille des entérobactéries, notamment du genre Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Salmonella, Serratia ou Yersinia et notamment du genre Enterobacter, Escherichia, Pseudomonas, Serratia ou Yersinia et en particulier d 'Enterobacter cloacae complex.

Ce marqueur pourra être utilisé dans des méthodes de diagnostic in vitro.

C'est pourquoi un autre objet de l'invention est un kit de diagnostic de pathogénicité et/ou de virulence de souches d'entérobactéries (en particulier d’Enterobacter cloacae complex) le kit comprenant des moyens de mesure de la concentration de 2- hydroxymyristate (ou d'acide 2-hydroxymyristique) dans le LPS d'un isolat bactérien. Le kit pourra contenir par exemple des solvants organiques utiles pour la préparation des échantillons avant analyse de leur contenu en acide gras. Ces solvants pour notamment être choisis parmi l’hexane, le chloroforme, le méthanol et leurs mélanges ensemble et/ou avec de l’eau en toutes proportions.

A titre indicatif, un protocole pour le Diagnostic GC/MS est décrit ci-après 1) A partir des bactéries directement

Pour le traitement et la préparation préalable des échantillons avant dérivation. Un lavage peut être effectué en utilisant de l’hexane ou un mélange de chloroforme/méthanol/eau etc..

1 a) Kit proposé Lavage des bactéries :

1 tube en verre contenant 2ml d’Hexane 1 tube en verre vide avec bouchon 1 tube à vis pyrex en verre Protocole proposé pour Lavage des bactéries

Ajouter les bactéries (lyophilisées ou non) au tube pyrex en verre et 500mI d’hexane

Agiter 2min

Centrifuger 10min à 2000g

Eliminer la phase organique dans le tube en verre vide faisant office de poubelle. Reextraire de la même manière 2 autres fois le culot

Sécher le culot bactérien

1 b) Kit Hydrolyse et dérivation :

1 tube contenant 700mI de Méthanol anhydre 1 tube contenant 100mI de chlorure d’acétyle

1 ampoule contenant 10pg de standard AG C20 ( eicosanoic acid) méthylé 1 tube contenant 1.5ml d’acétate éthyle 1 tube contenant 200mI H20 stérile et endotoxines free

Ampoule vide avec insert et septum pour GC/MS (adapté au type d’appareil)

Protocole proposé pour hydrolyse et dérivation (Méthylation). Au tube pyrex sec contenant le culot après lavage

Ajouter 520mI de méthanol anhydre

Ajouter 5mI de standard C20 à 1 pg/mI après avoir reconstituer l’ampoule de standard avec 10mI d’acétate éthyle

Ajouter très lentement en agitant le tube pyrex 70mI de chlorure acétyle petit volume par petit volume.

Chauffer le tube à 85°C (Temps à définir pour le Kit)

Après le temps du traitement refroidir le tube

Ajouter 500mI d’acétate d’éthyle

Evaporer l’ensemble Ajouter 10OmI H20 et 600mI acétate éthyle

Centrifuger 10min à 2000g

Récupérer la phase organique supérieure et la sécher

Reprendre le matériel avec 50mI d’acétate éthyle et le transférer dans l’ampoule avec insert pour injecter 5mI en GC/MS.

2) A partir des LPS préalablement extraits

On adapte le même protocole et kits précédents sans l’étape lavage Pour la dérivation, il est possible d’utiliser un mélange de méthanol anhydre et de chlorure acétyle (10/1.5). Le rapport peut toutefois être ajusté il permet à la fois en une étape l’hydrolyse des acides gras du LPS et leur dérivation. On peut également dériver par d’autres méthodes.

Pour l’injection en GC/MS : Le solvant utilisé doit permettre la reprise de l’échantillon et être très volatil. Il est possible d’utiliser de l’acétate éthyle, chloroforme, hexane ou autre.

Comme mentionné plus haut, l'enzyme LpxO ou l'ADN codant pour LpxO peut également constituer un marqueur de la pathogénicité d'une souche d'E. cloacae. Selon un autre aspect l'invention concerne une méthode de diagnostic in vitro de la pathogénicité d'une souche de bactéries du genre Enterobacter, en particulier de souches d'E. cloacae complex, dans lequel on détermine la présence dans le matériel génétique des bactéries la présence d'acide nucléique codant pour l'enzyme LpxO.

Ledit acide nucléique peut être présent dans le génome de la bactérie (ADN génomique ou ARN), ou dans un plasmide. L'invention concerne ainsi un procédé de pronostic de la pathogénicité et/ou de la virulence d'une souche de bactéries du genre Enterobacter en particulier de souches d'E. cloacae complex dans lequel on détecte la présence dans l'ADN génomique ou plasmidique des bactéries, la présence d'ADN codant pour l'enzyme LpxO.

Lorsque l'acide nucléique codant pour LpxO est présent dans le matériel génétique, en particulier dans l'ADN génomique ou plasmidique de la bactérie, on conclut que la souche est pathogène.

Les procédés et méthodes seront mis en œuvre par des techniques connues de l'homme du métier, après extraction de l'acide nucléique génomique et plasmidique, amplification par PCR des séquences définies par des amorces spécifiques du gène codant pour LpxO . Cette technique de diagnostic moléculaire pourra être adaptée aux différents systèmes, par exemple, puce, cartridge/pocheou PCR/Q-PCR.

L'invention concerne également des kits de diagnostic permettant la détection et l'identification d'ADN codant pour LpxO.

Brève description des figures

L'invention sera mieux comprise à la lecture des exemples qui suivent. Dans ces exemples on se référera aux figures suivantes : [Fig. 1] Spectrométrie de masse MALDI / TOF à ions négatifs du lipide A de la souche E. cloacae de type E avec surproduction de céphalosporinase. P, L-Ara4N et C16 représentent des déplacements m / z correspondant aux substituants phosphate, 4-amino-4-désoxy-L-arabinose et palmitate, respectivement. Les pics marqués représentent les espèces où C14: 0 est remplacé par C12: 0 (¨) ou 2- hydroxymyristate (·)

[Fig. 2] Spectrométrie de masse MALDI / TOF à ions négatifs du lipide A de la souche E. cloacae, non traitée ou hydrolysée par HCl

[Fig. 3] Structure des principales espèces moléculaires du lipide A de type E de E. cloacae. Les structures A et B sont présentes en quantités presque égales [x] substituants mineurs: L-Ara4N / P03H2; [y] variants mineurs: C12: 0 / C13: 0 / 20H- C14; [z] substituant mineur: C16: 0. [Fig. 4] chromatogramme gazeux des esters méthylique d'acide gras du LPS de la souche de E. cloacae H7i

[Fig 5] Analyse de survie selon Kaplan-Meyer en fonction de la présence de LPS portant du 20H-C14. La ligne en trait plein correspond aux souches pour lesquelles l'acide 2-hydroxymyristique est présent dans le LPS. La ligne en pointillé correspond aux souches pour lesquelles l'acide 2-hydroxymyristique est absent dans le LPS.

[Fig 6] Epreuve de survie de souches d'Enterobacter cloacae complex exprimant le 2-hydroxymyristate et n'exprimant pas le 2-hydroxymyristate, après 4 heures d'exposition à différentes concentrations de polymyxine B

Exemple 1

18 patients du service de réanimation néonatale de l'hôpital Antoine Béclère, Assistance-Publique Hôpitaux de Paris (Clamart, France), tous grand prématurés (<28 semaine d’âge gestationnel) , ont été infectés par E. cloacae. Les souches ont été isolées et douze d'entre elles, qui présentaient plusieurs caractéristiques différentes, notamment les profils ERIC-PCR ont été sélectionnées comme indiqué sur le Tableau 1.

[Tableau 1] Pour cela, les isolats de bactéries ont été inoculées sur une gélose Columbia contenant 5% de sang de mouton ((bioMérieux, Marcy l'Étoile, France) et ont été incubées toute la nuit à 37 ° C. L'identification bactérienne a été confirmée par spectrométrie de masse (MALDI-TOF) (Brucker, Leipzig, Allemagne). Des tests de sensibilité aux antimicrobiens ont été effectués à l'aide de la méthode de diffusion sur disque d'agar sur Mueller-Hinton (MH, Bio-Rad, Hercules, CA) conformément à la norme CLSI38.

La PCR par consensus intergénique répétitif entérobactérienne (ERIC-PCR) a été réalisée conformément à Duan et al. (Environ. Res. 109, 511-517 ; 2009). Les profils de bandes ERIC obtenus à partir de l'électrophorèse sur gel d'agarose ont été utilisés pour définir différents profils. Composition des espèces moléculaires présentes dans les régions lipides A.

Les lipopolysaccharides ont été extraits des souches cultivées et les structures de leurs régions lipides A ont été analysées par MALDI-TOF. Les bactéries ont été cultivées pendant une nuit à 37 ° C dans du bouillon LB

(Sigma) et les LPS ont été isolés par la méthode phénol / eau de Westphal et Jann40. En bref, le culot humide de bactéries a été agité dans une solution aqueuse à 45% de phénol à 65 ° C pendant 30 min, la matière insoluble a été éliminée de la phase aqueuse refroidie par centrifugation et l'extrait limpide a été dialysé dans de l'eau du robinet jusqu'à élimination du phénol, puis dialysé contre l'eau distillée. Les extraits ont été soumis à des traitements enzymatiques (ADNase, ARNase et protéinase K) pour éliminer l'ADN, l'ARN et les protéines, puis purifiés avec du chloroforme acidifié- méthanol-eau pour éliminer les phospholipides et les lipoprotéines contaminants. Les LPS ont ensuite été lavés en suspension dans du méthanol froid, centrifugés (7000 x g) et séchés sous un courant d'air. Le lipide A a été préparé par le procédé à la triéthylamine-citrate. En bref, l'échantillon de LPS a été mis en suspension à une concentration de 10 pg / pi dans une solution de triéthylamine-citrate 0,01 M (rapport molaire 1: 1, pH 3,6) et chauffé pendant 1 h à 100 ° C. L'échantillon a ensuite été lyophilisé et mis en suspension dans du méthanol. Après centrifugation (7000 x g pendant 10 min à 4 ° C), le lipide A a été extrait avec un mélange de chloroforme: méthanol: eau (3: 1 ,5: 0,25; en volume) à une concentration de 10 pg / pi. Les espèces moléculaires présentes dans cette préparation ont été analysées à l'aide d'un spectromètre de masse MALDI-TOF (assistée par matrice) à désorption laser assistée par matrice AXIMA performance (Shimadzu Biotech) (I2BC, Université Paris Saclay, Gif sur Yvette, France). Une suspension de lipide A (1 pg / pi) dans du chloroforme: méthanol: eau (3: 1 ,5: 0,25, v: v: v) a été dessalée avec quelques grains de Dowex 50W-X8 (H +), 1 pi a été déposé sur la cible et mélangée avec 1 mI d'une matrice d'acide gentisique (acide 2,5-dihydroxybenzoïque) (DHB de Fluka) en suspension à 10 pg / mI dans le même solvant ou dans de l'acide citrique aqueux 0,1 M, et séchée. Les ions d'analyte ont été désorbés de la matrice avec des impulsions d'un laser à l'azote à 337 nm. Les spectres ont été obtenus en mode ion négatif à 20 kV, avec le détecteur linéaire. L'étalonnage en masse a été réalisé avec le kit d'étalons de masse peptidiques de AB SCIEX ou avec un échantillon de LPS purifié et caractérisé par la structure de Bordetella pertussis et de E. coli J5. Comme le lipide A d'autres bactéries à Gram négatif, les fragments lipides A isolés des douze souches sélectionnées d'E. cloacae contenaient de multiples variants moléculaires représentés par de multiples pics dans leurs spectres de masse. Parmi les douze lipides A, l'un des plus hétérogènes était celui isolé de la souche H7i (profil E avec céphalosporinase inductible), avec plus de 13 pics significatifs (13 espèces moléculaires) dans son spectre lipidique A (Fig. 1 ). Le spectre contient une série de pics (1360-1388, 1570-1598, 1797-1825, 1928-1956, 2035-2063) avec une distance entre pics de 28 mu, suggérant la présence d'acides gras de longueur différente de deux atomes de carbone dans les variantes moléculaires de ce lipide A. La composition des espèces moléculaires correspondant aux différents pics est indiquée dans le tableau 2.

[Tableau 2]

Le pic de base à m / z = 1825 est dû à un squelette bisphosphorylé de glucosamine disaccharide substitué par deux acides gras myristiques et quatre acides gras hydroxymyristiques (identifiés comme 30H-C14 par GC-MS). Cela signifie que dans le pic homologue du doublet correspondant, à m / z = 1797, un des deux acides myristiques (C14: 0) est remplacé par de l’acide laurique (C12: 0). Les doublets suivants (1928-1956 et 2035-2063) s’expliquent par l’addition de palmitate (C16: 0) et de 4-amino-4-désoxy-L-arabinose (L-Ara4N), respectivement, à m / z 1797 et 1825.

En plus des deux pics dominants du spectre (à m / z 1797,4 et 1825,4), de petits pics adjacents à +16 Da (m / z 1813,4 et 1841,4, marqués · sur la Fig. 1) indiquent la présence d'un autre résidu d'hydroxymyristate moins abondant. L'analyse par GC / MS (Fig. 4) a indiqué la présence dans ce LPS de traces d'acide a-hydroxymyristique (20H-C14), suggérant ainsi qu'une espèce de lipide A contient cet acide gras et explique le faible encombrement des pics observés. Ceci peut être produit par un orthologue de la dioxygénase LpxO identifiée dans S. enterica sérovar Typhimurium. Cette enzyme génère du 2-hydroxymyristate par hydroxylation du myristate transféré au lipide A par l'acyltransférase MsB / LpxM17. Un autre petit pic (m / z 1769.3) dans ce spectre (indiqué par ¨ sur la figure 1) peut être expliqué par la présence d'une espèce mineure contenant deux C12: 0 secondaires au lieu de C12 + C14 (m / z 1797.4) ou C14. + C14 (m / z 1825.4) présent dans les principales espèces. Position des résidus d'aminoarabinose et de phosphate des lipides A.

Des espèces monophosphorylées de lipide A peuvent être produites par hydrolyse acide (HCl 0,1 M pendant 10 min à 100 ° C. Des liaisons labiles telles que les pyrophosphates et la liaison acétal de la glucosamine proximale (phosphate lié à C1) sont hydrolysées dans ces conditions. Après un tel traitement du lipide A de E. cloacae, les pics correspondant aux espèces bisphosphorylées et hexa-acylées contenant de l'aminoarabinose (m I z 1928.5 et 1956.5) étaient complètement absents du spectre MALTI-TOF (Fig. 2), de sorte que le groupe L-Ara4N n'était pas situé sur P4 'chez les espèces bisphosphorylées non traitées, car les liaisons L-Ara4N phosphate et phosphate 4'-GlcN sont toutes deux résistantes. La perte de phosphoryl- aminoarabinose par une hydrolyse modérée en acide prouve que le substituant L- Ara4N est sur le phosphate P1 de l’espèce bisphosphorylée.

En ce qui concerne les groupes phosphate, la présence de molécules triphosphorylées dans le lipide A non traité (m / z 1877.4 et 1905.4) indique qu'un pyrophosphate doit être présent dans ces deux espèces moléculaires. Cependant, nous pouvons noter que les molécules contenant du pyroposphate (m / z 1877.4 et 1905.4) ne contiennent pas de L-Ara4N et que les molécules contenant L-Ara4N (m / z 1928.5 et 1956.5) ne contiennent pas de pyrophosphate. Ceci suggère que lors de la biosynthèse du lipide A de E. cloacae, un troisième groupe phosphate ou un groupe L- Ara4N est ajouté sur le phosphate P1. Il est à noter que la procédure d'hydrolyse modérée utilisée ici n'a pas induit de clivage important des acides gras car les espèces hepta-acylées et monophosphorylées (m / z 1955.8 et 1983.9) étaient toujours présentes après cette hydrolyse.

Analyse des profils d'acylation des lipides A.

La libération séquentielle d'acides gras liés à des esters par traitement alcalin doux, utilisée dans des études antérieures (Silipo, A., et al. J. Lipid Res. 43, 2188-2195, 2002) fournit généralement des informations précieuses sur les positions des différents acides gras sur le squelette du lipide A.

Selon ces études, les acides gras secondaires des groupes C2 'et C2 (en particulier C2') sont les plus résistants, ceux du groupe C3 (primaire ou secondaire) les plus labiles, les substitutions du groupe C3' présentant des comportements intermédiaires. De plus, les acides secondaires sont plus résistants que les acides gras primaires aux traitements alcalins. Afin d'analyser les profils d'acylation des acides gras dans le LPS de E. cloacae, le lipide A H7i a été traité avec du NH40H à 28% à 50 ° C pendant 30 min, 1h ou 3 h. Après cette étape, les structures complètes des principales espèces moléculaires présentes dans le lipide A complexe d'E. cloacae peuvent maintenant être proposées (Fig.3). Quatre espèces moléculaires majeures et structurellement différentes sont présentes. Dans deux d’entre elles (structure générale A), un C14: 0 secondaire est en position 2, tandis que dans les deux autres (structure générale B), il est en position 3 '. De plus, lorsqu'il est présent en tant que substituant mineur, un groupe palmitique (C16:0) est en position 3 'dans la structure A et en position 2 dans la structure B.

Similarités et différences entre les spectres lipidiques A des souches de E. cloacae sélectionnées. Comparaison des lipides

Les spectres des douze souches de E. cloacae sélectionnées au cours de cette première étape indiquent que certains pics ne sont pas toujours présents et que de petits pics supplémentaires sont parfois détectables (tableau 3).

[Tableau 3]

Source d'isolement m/z (calculé) Pics présents dans le spectre

1388.7 + + + + +

1599.1 +

1717.4 + + + +

1745.5 + + + + + + + + +

1769.3 + + + + + +

1783.4 +

1797.4 + + + + + + + + + + + +

1811.4 + + +

1813.4 + + +

1825.4 + + + + + + + + + + + +

1841.4 + + + +

1877.4 + + + + + + +

1905.4 + + + + + + + + + +

1928.5 + + + + + + + + +

1956.6 + + + + + + + +

2035.8 + + + + + + + + +

2063.9 + + + + + + + + + + + +

2143.8 + + +

Un disaccharide de glucosamine tétraacylé (trois acides hydroxymyristiques et un acide myristique) et bisphosphorylé (pic à m / z = 1388,7) est présent dans cinq souches (C17, C12, H8, H7o et H10), mais il est absent des sept autres.

L'espèce moléculaire tétraacylée observée dans ces cinq souches de E. cloacae contient trois 30H-C14 et un C14: 0. La formation de cette espèce tétra-acylée est très probablement due à la perte, par clivage enzymatique, d'un résidu myristoxy-myristoyle de la forme hexa-acylée du lipide A à m / z 1825,4. Un tel clivage nécessite la structure générale B affichée à la Fig.3, qui porte un C14: 0 secondaire sur 3 '. Aucune corrélation n'a été trouvée entre ce clivage enzymatique détecté dans seulement cinq souches (C17, C12, H8, H7o et H10) et les profils ERIC-PCR de ces souches (profils E, H, C, E et F, respectivement).

La présence d'autres petits pics représente un deuxième type de variation structurelle entre les douze souches. Les petits pics à m / z 1813,4 et 1841 ,4 mentionnés ci-dessus dans le spectre de la souche H7i (présence d'un acide a- hydroxymyristique) étaient en réalité présents dans quatre souches: H1, H7o, H7i et H10 (tableau 3). Ils sont dus à un acide 2-hydroxymyristique (20H-C14) qui remplace le C14: 0 secondaire en positions 2 (Fig.3A) ou 3 '(Fig.3B). Le même C14: 0 peut également être remplacé par C13: 0 (pic à 1811 ,4 dans les souches C12, H2 et H8) ou par C12: 0 (pic à m / z 1769,3 dans les souches C17, C18, C12, H8, H7o et H7i ) (Tableau 3 et Fig.3).

Composition en acides gras des LPS analysée par chromatographie en phase gazeuse / spectrométrie de masse.

Les échantillons de LPS (200 pg) ont été incubés à 85 ° C pendant 15 à 18 h (mais ce temps peut être considérablement réduit) dans 600 pl d'un mélange méthanol anhydre / chlorure d'acétyle (10 / 1 ,5 en volumes) contenant 4 pg d'acide arachidique (eicosanoïque) (C20) utilisé comme standard interne. Après cette réaction de transméthylation, le méthanol a été évaporé sous vide à la température ambiante, les esters méthyliques d'acides gras résultants ont été extraits dans de l'acétate d'éthyle (600 pl) et le solvant a été évaporé à la température ambiante sous un courant d'azote. Le matériau a été dissous dans 50 pl d'acétate d'éthyle et la solution (1 à 5 pl) a été analysée par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) dans un appareil Shimadzu (GCMS-QP2010SE). Une colonne capillaire de Phenomenex (Zebron ZB-5MS, 30 m <0,25 mm <0,25 pm) a été utilisée avec un gradient de température de 50 ° C à 120 ° C (20 ° C / min) suivi d'un gradient de 120 ° C à 250 ° C (3 ° C / min) et enfin une température constante (250 ° C pendant 2 min). Les acides gras ont été identifiés par leurs spectres de masse (base NIST) et leurs temps de rétention comparés aux standards des acides gras (Sigma-Aldrich).

L'analyse de la composition en acides gras des LPS par chromatographie en phase gazeuse / spectrométrie de masse (GC / MS) a confirmé les résultats obtenus par MALDI, notamment la présence de faibles quantités de groupes tridécanoïques et 2- hydroxymyristiques dans certains LPS (Figure 4).

Des traces d'un groupe 2-hydroxylaurique (20H-C12), indétectable par MALDI, ont également été détectées par GC / MS dans les LPS des souches C12, H1, H9, H7o, H7i et H10.

D'autres variations parmi les douze isolats sont produites par l'absence de pics MALDI significatifs caractéristiques des espèces moléculaires les plus complètes. C'est le cas de l'absence de pyrophosphate (espèces trisphosphorylées à m / z 1877.4 et 1905.4) dans les souches C17 et H11 , ainsi que de l'absence de L-Ara4N (pics à m / z 1928.5 et 1956.6) dans les souches C17, C16 et C12 (tableau 2).

Aucune corrélation n'a été observée entre les structures lipide A des différentes souches, caractérisées par leur spectre de masse, et leurs autres caractéristiques disponibles, telles que leur profil ERIC-PCR (A à H), la source à partir de laquelle elles ont été isolées (cavum, rectum ou sang), ou l'expression de la céphalosporinase (inductible ou surproduite). Par exemple, les souches H7o et H7i (isolées du même nourrisson) ont le même profil ERIC-PCR et des spectres de masse du lipide A très similaires, mais diffèrent quant à l'expression de la céphalosporinase. Inversement, les souches H11 et H7o ont toutes deux une surproduction de céphalosporinase, mais présentent des spectres de lipides A différents et des profils ERIC-PCR (profils A et E respectivement.

Exemple 2 : Corrélation entre la présence de 2-hydroxymyristate et la pathogénicité des souches du complexe E. cloacae.

Bien que toutes les souches sélectionnées portent les mêmes espèces moléculaires majeures du lipide A, elles diffèrent par des variations mineures, telles que la présence d'un L-Ara4N ou d'un pyrophosphate en position 1 et la présence d'un 2- hydroxymyristate (20H-C14) ou un C13: 0 remplaçant un myristate (Fig. 3). Il est donc possible de classer les souches en fonction de la présence dans leur lipide A d'espèces moléculaires portant ou non certains de ces quatre constituants. Par cette méthode, les douze souches peuvent être regroupées en six groupes comme indiqué dans le tableau 4. [Tableau 4]

L-Ara4N+ / PP+ L-Ara4N+ / P- L-Ara4N- / PP+

20H-C14+ /

C13-

20H-C14- /

C13+

20H-C14- /

C13-

† : nourrisson décédé ; L-Ara4N : 4-amino-4-deoxy-L-arabinose ; PP : pyrophosphate ; 20H-C14 : acide 2-hydroxymyristique ; C13 : acide tridecanoique. "+" indique la presence et l'absence du substituant correspondant.

Remarquablement, les souches mortelles ne sont pas distribuées aléatoirement dans les 6 groupes identifiés mais appartiennent à deux groupes seulement. Ce résultat peut suggérer que la présence de 2-hydroxy myristate (20H-C14) (100% (3/3) de décès) et, dans une moindre mesure, de tridécanoate (C13) (1/3 de décès; 33%) améliorent nettement le pouvoir pathologique de la souche par rapport aux souches sans ces acides gras (0% de décès).

Un plus grand nombre de bébés bactériémiques et non bactériémiques a ensuite été étudié pour vérifier la corrélation entre la létalité induite par ces souches dans ces deux populations et un élément structurel de leur système LPS. Ces deux populations de nourrissons ont été choisies homogènes pour leurs autres caractéristiques et, en particulier, ne différent pas par d'autres facteurs de risque qui contribuent à la mortalité néonatale mais ne sont pas liés à leur portage bactérien. À cette fin, l’indice CRIB II (pour "clinical risk index for babies" : indice de risque clinique pour les bébés) a été utilisé. Le CRIB II est un système de notation hospitalier largement utilisé en soins intensifs néonatals, qui reflète la gravité de l’état des bébés hospitalisés. Le score prend en compte plusieurs caractéristiques des nouveau-nés, notamment le poids à la naissance, le sexe, l'âge gestationnel, la température, le score d'Apgar à 5 min, l'excès de base, l'âge et la parité maternels.

Pour obtenir une population homogène de nourrissons, 18 nourrissons prématurés infectés par le complexe E. cloacae ont d'abord été sélectionnés. Ensuite, pour chacun de ces bébés, un nourrisson colonisé ayant un score CRIB II similaire a été sélectionné. Les souches de 18 nourrissons infectés ont été isolées de l'hémoculture, tandis que chez 18 nourrissons colonisés, 9 souches ont été isolées du cavum et 9 du rectum (tableau 5). Sur les 36 nourrissons, 13 sont décédés dans le mois qui a suivi la naissance, dont 12/18 dans le groupe des nourrissons infectés et 1/18 dans le groupe des nourrissons colonisés. Le décès est survenu en moyenne à 10 ± 8 jours après la naissance.

La présence de 2-hydroxymyristate (20H-C14) dans le LPS, telle que déterminée par GC-MS, était associée à la détection du gène IpxO dans 8 souches (tableau 5). Dans le LPS H9, le 2-hydroxymyristate (20H-C14) était indétectable dans le spectre MALDI (absence de pics à m / z 1813,4 et 1841 ,4 ;) et presque absent par analyse GC-MS (0,5%) par rapport à la moyenne quantité de ce constituant dans d’autres souches (4,3 ± 1 ,4%). Il a donc été considéré que le LPS H9 est dépourvu de 20H- C14. Des données sur le nombre de décès en fonction de la présence ou non de 20H-

C14 dans les LPS correspondants ont été extraites du tableau 5.

[Tableau 5]

^* céphalosporinase inductible (i) ou surproduite (o).

^** exprimé par le rapport: 20H-C14 x 100 / 30H-C14.

^*** + détecté; - non-détecté * ^*** + bébé décédé dans le premier mois après la naissance; - bébé a survécu

Les patients atteints de septicémie à E. cloacae portant ce marqueur 20H-C14 dans le LPS ont été comparés à ceux ne présentant pas le marqueur. Les patients atteints de LPS portant 20H-C14 ont un score VIS plus élevé (drogues vasoactives et inotrope nécessaires pour maintenir une pression artérielle systémique normale) (p = 0,03) et sont plus susceptibles de développer une oligurie (p = 0,02) que ceux sans ce marqueur LPS. Un test exact de Fisher effectué sur les données montre une dépendance significative (p = 0,0178) entre la présence de 20H-C14 dans les LPS du complexe E. cloacae et la mortalité induite par ces souches.

Le décès de 9 nouveau-nés était directement imputable à un choc septique à E. cloacae. Les autres causes de décès étaient la perforation intestinale spontanée (n =

2) et la pneumonie à Haemophilus influenzae (n = 1), une infection à Bacteroides fragilis (n = 1), une entérocolite nécrosante (n = 1) et une dysplasie bronchopulmonaire sévère (n = 1). Par conséquent, les données correspondant aux décès non imputables à un choc septique à E. cloacae doivent être supprimées de l'analyse statistique. Une analyse de survie selon Kaplan-Meier montre une imputabilité fortement significative sur la mortalité de la présence de LPS portant 20H-C14 (p = 0,007 par test de logrank).

Les résultats sont représentés sur la Figure 5. Sur le diagramme, la courbe en trait plein correspond aux souches pour lesquelles l'acide 2-hydroxymyristique est présent dans le LPS. La courbe en pointillé correspond aux souches pour lesquelles l'acide 2- hydroxymyristique est absent dans le LPS.

Le risk ratio de décès chez les patients infectés par une Enterobacter cloacae dont le LPS présente un 20H-C14 est de 5,55.

Exemple 3 : épreuve de survie à la polymyxine B d' E. cloacae complex Des souches du complexe Enterobacter ont été sélectionnées.

Les souches d'Enterobacter conservées dans un tube congelé avec 30% de glycérol sont repiquées en culture planctonique dans 20 ml de milieu de culture LB. Après incubation à 37°C une nuit, 1ml de culture diluée à 10 ⁷ est mis en contact avec des concentrations croissantes de polymyxine B (1 pg/ml, 3 pg/ml et 10 pg/ml). Un tube sans antibiotique est ajouté comme contrôle.

Tous les tubes sont incubés à 37°C avec agitation pendant 4 heures supplémentaires. Les cultures sont ensuite diluées et étalées sur des boîtes de Pétri LB agar. Les boîtes sont incubées à 37°C une nuit et les colonies sont dénombrées.

Le pourcentage de survie est calculé comme suit :

(UFC polymyxine B /UFC contrôle) x 100 5 souches d'E. cloacae complex exprimant le 2-hydroxymyristate (2HM) et 5 souches d'E. cloacae complex n'exprimant pas le 2-hydroxymyristate (2HM) ont été exposées pendant 4 heures à différentes concentrations de polymyxine B. Les résultats présentés sur la figure 6 montrent que la présence de 2-OH myristate sur le Lipide A génère une résistance au traitement par la polymixine B. Exemple 4 : étude de la présence de IpxO

L’insertion de 2-hydroxymyristate (2HM) dans la structure du Lipid A est sous la dépendance d'une hydroxylase LpxO décrite chez Salmonella. Le gène IpxO existe au sein des séquences du chromosome bactérien de plusieurs ECC sur GenBank. Le séquençage du génome entier des 20 souches d ’Enterobacter cloacae complex (ECC) a été réalisé par la technologie Illumina. Un alignement de séquences via Clustal Oméga entre les séquences de IpxO de nos souches (n=5) et des séquences disponibles sur GenBank parmi des génomes d’ECC et d’autres bactéries gram négatif a été réalisé. La recherche dans les séquences NGS d’un homologue de IpxO a retrouvé sa présence chez 5 des 7 souches avec 2HM. A l’intérieur du genre Enterobacter , les séquences IpxO des différentes espèces sont identiques à plus de 80% hormis pour toutes les séquences disponibles chez E. hormaechei qui n’avaient que 60% d’identité avec les autres Enterobacter . Alors que les séquences IpxO d’une même espèce d ’Enterobacter varient très peu (par exemple, de 96% à 100% chez £. bugandensis et de 99 à 100% chez £. cloacae ), toutes les séquences IpxO d’E. hormaechei sont 100% identiques et semblent provenir d’un plasmide.