本发明涉及医疗器械领域。 更具体而言， 本发明涉及一种边缘刚 性化人工生物瓣 （膜） 的制备方法。 背景技术

人工生物（心脏）瓣的研制一直是心脏外科领 域攻关的主题之一。 理想的人工生物瓣的标准是耐久性和生物相容 性良好、 接近生理瓣膜 的血流动力学性能、 对血细胞破坏小、 易植入、 抗感染和无免疫原性 等。 微创介入人工生物瓣 （膜） 包括球囊扩张型生物瓣膜和自扩张型 生物瓣膜。 球囊扩张型生物瓣膜是可塑性变形的支架上固 定人工生物瓣膜。 通过径向压缩支架， 使其固定在球囊上， 微创介入输送到主动脉瓣后 通过给球囊加压的方式使支架扩张固定。 这种球囊扩张型生物瓣膜存 在的缺点和问题是： 在支架压缩和球囊扩张过程中， 生物瓣膜的瓣叶 组织结构将受到极大地破坏， 严重影响了心脏瓣膜植入后的使用寿命。 另外心脏瓣膜的支架由球囊直径决定， 如果尺寸选择过小， 瓣膜有松 动或移位的风险， 只能进行二次球囊扩张， 尺寸选择过大， 就会有撕 裂主动脉瓣口的风险， 导致其他的并发症的发生。 这种心脏瓣膜， 球 囊一旦扩张后就不可重置， 在位置放置不当的情况下， 会当场危及患 者的生命； 心脏瓣膜一旦植入， 如出现问题， 无法回收， 只能通过外 科手术置换。 自扩张型人工心脏瓣膜是在镍钛自扩张的支架 上固定生物瓣膜。 将支架放入输送器的导管中， 微创介入到达主动脉瓣后将支架释放， 通过支架自身的结构使之与主动脉瓣口固定。 这种自扩张型生物瓣膜 存在的缺点和问题是： 支架长度过长， 开口设计不理想， 容易影响左、 右冠脉口的血流动力学， 导致心功能失常； 心脏瓣膜释放不当， 无法 重置， 会危及患者生命； 心脏瓣膜一旦植入， 如出现问题， 无法回收， 只能通过外科手术置换。 目前的人工生物瓣膜还不能够完全达到释放十 分自如的目的。 人 工生物瓣膜在释放过程中， 中心血流很容易冲击人工生物瓣膜的边缘 使得阻碍下一步的释放过程。 并且， 从心包材料的钙化现象和老化过 程中的损害现象观察到人工生物瓣膜的边缘往 往是最容易发生钙化和 老化的部位， 这也严重影响到了人工生物瓣的使用。 如何确保生物瓣 膜在使用过程中释放自如， 且不容易发生边缘钙化和损坏现象， 并使 生物瓣膜在结构上更接近正常体内的瓣膜， 是研究人工生物瓣过程中 所要解决的主要问题。 文献 1 【Hsing-Wen Sung, Yen Chang, Chi- Tung Chiu, Chiun-Nan Chen, Huang-Chien Liang. Mechanical properties of a porcine aortic valve fixed with a naturally occurring crosslinking agent. Biomaterials, 1999， 20: 1759-1772】 采用京尼平来处理人工生物瓣中的胶原纤维， 并和传统的 戊二醛方法进行了比较， 发现京尼平的防钙化处理的效果优于传统的 戊二醛处理法， 但是没有对人工生物瓣膜的边缘破损现象进行 分析。 文献 2 【 Peter Angele, Jochen Abke， Richard Kujat, Hubert

Faltermeier, Detlef Schumann, Michael Nerlich, Bernd Kinner, Carsten Englert, Zbigniew Ruszczak, Robert Mehrl, Rainer Mueller. Influence of different collagen species on physico-chemical properties of crosslinked collagen matrices. Biomaterials, 2004, 25 : 2831-2841】采用碳化亚胺来处 理人工生物瓣中的胶原纤维， 并对其力学性能和溶胀性能进行了研究， 但是没有对人工生物瓣膜的整体耐久性进行处 理和研究。 中国专利申请 No. 200680018417.4 (美国爱德华兹生命科学公司） 公开了对生物假体组织进行处理以缓解植入后 钙化。 该申请采用热处 理过的或者 pH调节过的戊二醛溶液预先处理生物假体组织� ��然后采用 封闭剂和还原剂相结合的方法来构建防钙型人 工生物瓣。 中国专利申请 No. 92100096.0 (北京阜外医院）公开了异种生物瓣 化学改性的方法， 其采用羟基铬和戊二醛相结合的方法来构建防 钙型 人工生物瓣。 发明内容

本发明的目的在于提供一种边缘刚性化人工生 物瓣膜的制备方 法， 以克服现有技术存在的上述缺陷。 本发明方法先将人工生物瓣膜浸没在预处理的 戊二醛溶液中， 所 述人工生物瓣膜在与所述预处理的戊二醛溶液 接触之前、 之后或者同 时可用戊二醛部分固定； 然后通过还原剂、 栲胶将戊二醛预处理过的 人工生物瓣膜所形成的游离醛基、 羧基、 氨基、 羟基、 羰基基团封闭。 不受任何现有理论所束缚， 本发明人工生物瓣膜边缘刚性化增强 的机制推测是： 戊二醛使人工生物瓣膜中的胶原蛋白产生化学 反应， 主要与胶原蛋白中的赖氨酸的 ε-氨基产生缩合反应， 生成牢固的交联 键， 同时也可能与羟脯氨酸中的羟基作用形成缩醛 ， 产生牢固的交联 键。 在上述反应的同时， 还能产生烷醇化合。 通过以上三种反应， 戊 二醛使胶原分子的分子内交联和分子间交联， 加强结构强度。 还原剂， 例如， 硼氢化钠， 可使人工生物瓣在戊二醛溶液处理改性过程中 所产 生的游离醛基得以还原， 减少人工生物瓣表面的醛基数目， 提高人工 生物瓣的防钙化性能。 而栲胶作为一种天然化合物改性剂， 主要由单 宁、 非单宁、 简单酚、 有机酸等组成。 在 PBS， Hank's或 D-Hank's缓 冲溶液 （组成成分参见下文的表 3-5 ) 中， 水解单宁中的多元酚羧酸和 多元醇将与人工生物瓣膜表面的醛基、 羧基、 氨基、 羟基、 羰基等基 团以酯键或苷键结合形成复杂化合物。 同时， 缩合单宁中的黄烷醇聚 缩物与酸共热会聚缩成聚合物填鞣在人工生物 瓣膜的表面。 通过加入 亚硫酸盐， 可使栲胶的 PBS， Hank's或 D-Hank's缓冲溶液中不溶物含 量减少， 冷溶性增强， 渗透速度和浅化颜色提高， 从而得到具有良好 界面性能的人工生物瓣。 亚硫酸盐包括亚硫酸钾， 亚硫酸氢钾， 亚硫 酸钠， 亚硫酸氢钠， 亚硫酸锌， 亚硫酸铵中的一种或几种， 浓度范围 0.1〜30%。 具体而言， 本发明提供一种边缘刚性化人工生物瓣的制备 方法， 包括下列步骤：

将新鲜人工生物瓣膜材料， 经过 PBS， Hank's或 D-Hank's缓冲溶 液 （pH 7.0〜7.8 ) 充分漂洗干净后， 选择厚薄均匀和纤维取向一致的 人工生物瓣膜切割成 l〜60cm ² 大小的膜片放入预处理的戊二醛复方缓 冲溶液中固定 1〜25 天， 然后用双蒸馏水洗脱人工生物瓣膜， 将戊二 醛洗脱干净；

将上述戊二醛预处理过的人工生物瓣膜放入含 有还原剂的 PBS， Hank's或 D-Hank's缓冲溶液中修饰 1〜20小时；

将上述还原剂溶液处理过的人工生物瓣膜放入 栲胶的 PBS， Hank's或 D-Hank's缓冲溶液中 30〜60天， 取出后经过 PBS缓冲溶液 充分漂洗和双蒸蒸馏水洗脱干净后放入双蒸蒸 馏水中保存。 本发明中， 所用的还原剂选自硼氢化钠， 氢化铝锂， 硼氢化钾， 硫代硼氢化钠， 三仲丁基硼氢化锂， 异丙醇铝， 锌粉和镁粉中的一种 或几种。 本发明中， 所用的戊二醛复方缓冲溶液选自戊二醛 /羟乙基哌嗪乙 磺酸复方缓冲溶液、戊二醛 /无水吗啉乙磺酸复方缓冲溶液、戊二醛 /Tris 乙磺酸复方缓冲溶液和戊二醛 /三羟甲基氨基甲烷复方缓冲溶液中的一 种或几种， 其中戊二醛浓度为 0.1〜10%， 羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为 0.1 - 10%, 无水吗啉乙磺酸浓度为 0.1〜10%， Tris乙磺酸浓度为 0.1〜 10%， 三羟甲基氨基甲烷浓度为 0.1〜10%， 戊二醛复方缓冲溶液 pH范 围为 5.0〜7.8。 本发明中， 所用的栲胶选自杨梅栲胶、 荆树栲胶、 五倍子栲胶、 橡树栲胶、 落叶松栲胶、 柚柑栲胶、 红根栲胶、 坚木栲胶、 栲树皮栲 胶、 柯子栲胶、 栗木栲胶、 椿木栲胶、 橡梳栲胶、 槟榔浸膏、 余柑栲 胶、 黑荆树栲胶、 橡椀栲胶和马占相思栲胶等中的一种或几种。 本发明方法可使人工生物瓣膜的边缘刚性增强 ， 从而提高了人工 生物瓣的长期稳定性和耐久性。 附图说明

为了更清楚地描述本发明的技术方案， 下面将结合附图作简要介 绍。 显而易见， 这些附图仅是本申请记载的一些具体实施方式 。 本发 明的技术方案包括但不限于这些附图。 图 1示出人工生物瓣膜经过实施例 1、 实施例 2和实施例 3处理 后的醛基、 羧基含量。 具体实施方式

为了进一步理解本发明， 下面将结合实施例对本发明的优选方案 进行描述。 这些描述只是举例说明本发明方法的特征和优 点， 而非限 制本发明的保护范围。

实施例 1

将人工生物瓣膜在 0.625%戊二醛 /0.5%羟乙基哌嗪乙磺酸复方缓 冲溶液 （pH 7.4 ) 中固定 3天。 将戊二醛预处理过的人工生物瓣膜放入含有 0.5%硼氢化钠的 PBS 缓冲溶液 （pH 6.8 ) 中修饰 5小时。 将所述戊二醛预处理过、 硼氢化钠的溶液处理过的人工生物瓣膜 放入 0.5%杨梅栲胶的 PBS溶液 （pH6.8) 中处理 2天。 实施例 2

将人工生物瓣膜在 0.625%戊二醛 /0.5%无水吗啉乙磺酸复方缓冲 溶液 （pH7.4) 中固定 15天。 将戊二醛预处理过的人工生物瓣膜放入含有 0.5%硼氢化钠的 PBS 缓冲溶液 （pH6.8) 中修饰 10小时。 将所述戊二醛预处理过、 硼氢化钠的溶液处理过的人工生物瓣膜 放入 0.5%荆树栲胶的 PBS缓冲溶液 （pH6.8) 中处理 3天。 实施例 3

将人工生物瓣膜在 0.625%戊二醛 /0.5%三羟甲基氨基甲烷复方缓 冲溶液 （pH7.4) 中固定 20天。 将戊二醛预处理过的人工生物瓣膜放入含有 1%硼氢化钠的 Hank's缓冲溶液 （pH6.8) 中修饰 20小时。 将所述戊二醛预处理过、 硼氢化钠的溶液处理过的人工生物瓣膜 放入 1%坚木栲胶的 Hank's缓冲溶液 （pH 6.8) 中处理 7天。 实施例 4

拉伸强度、 弯曲强度、 残余干重和撕裂点占比的测定方法如下所 示：

拉伸测试

测试仪器： Instron 5543型拉伸试验机

测试条件： 常温， PBS水浴槽中 测试方法： 将人工生物瓣膜裁成 5mm X 50mm的试条， 将试条两 端固定在夹具上， 设置上下夹具间距离为 25mm， 固定好后对其进行预 加载， 预加载条件为： 速率为 60mN/min， 最大数值为 lmN， 循环 3次； 预调后按 25 mm/min的加载速度沿纤维排列方向对样品进行应 力加载， 进行相应指标的测定， 并计算材料的拉伸强度。 弯曲测试

测试仪器： 脉冲流体冲击试验机

测试条件： 常温， PBS水浴槽中

测试方法： 将人工生物瓣膜裁成 15mm X 60mm的试条， 将试条一 端固定在夹具上， 设置试条的中心距离脉冲流体发射口为 50mm， 脉冲 流体压力为 20 mmHg， 循环 3次， 进行相应指标的测定， 并计算材料 的弯曲强度。 残余干重测试

仪器准备： -80°C冰箱， 真空冻干机

步骤： 将样品置于 -80°C冰箱预冻 lh后用真空冻干机冻干 24h， 取 出后天平称量， 测得干重。 撕裂点测试

测试仪器： 大压力流体试验机

测试条件： 常温， PBS水浴槽中

测试方法： 将人工生物瓣膜缝合在镍钛支架上， 将组件固定在夹 具上， 设置流体压力为 300 mmHg， 循环次数为 75次 /分钟， 总次数为 2亿次， 结束后进行相应指标的测定， 并计算组件中人工生物瓣膜的撕 裂点。 测定结果参见表 1-2和图 1。 表 1 : 人工生物瓣膜经过实施例 1、 实施例 2和实施例 3处理后的 力学性能比较

实施方法 拉伸强度 （MPa) 弯曲强度 （mN/ mm ² ) 实施例 1 10.07 75

实施例 2 11.45 108

实施例 3 14.69 146 表 2: 实施例 1、 实施例 2和实施例 3处理后人工生物瓣膜在 300 mmHg大压力流体测试 35天后的残余干重和撕裂点占比

实施方法 初始干重 (mg) 残余干重 （mg) 撕裂点占比 （％) 实施例 1 830.02 787.56 14.50 实施例 2 832.97 805.89 5.78 实施例 3 831.45 827.23 1.24 从图 1， 表 1和表 2中可以清楚地看到， 采用根据本发明方法制 备的人工生物瓣表面的基团分布合理， 力学性能优异和大压力流体测 试结果良好。 表 3 : PBS缓冲溶液 （g/L) 的成分

成分 PBS

NaCl 8

KC1 0.2

Na ₂ HPO ₄ 1.42

KH ₂ PO ₄ 0.27 表 4: Hank's缓冲溶液 （g/L) 的成分

成分 Hank's

CaCl ₂ (无水） 0.14

KC1 0.4

KH ₂ PO ₄ 0.06

MgCl ₂ -6H ₂ O 0.10

MgSO ₄ -7H ₂ O 0.10

NaCl 8.0

NaHCO ₃ 0.35

Na ₂ HPO ₄ -7H ₂ O 0.09

D-葡萄糖 1.0

酚红 （0.1%) 1 mL 表 5 : D-Hank's缓冲溶液 （g/L) 的成分

成分 Hank's

KC1 0.4

KH ₂ PO ₄ 0.06

NaCl 8.0

NaHCO ₃ 0.35

Na ₂ HPO ₄ 12H ₂ O 0.132

D-葡萄糖 1.0

酚红 （0.1%) 1 mL 本发明方法能够在化学改性过程中较好地提高 人工生物瓣的力学 性能和防钙化性能的同时， 提高了人工生物瓣的整体耐久性。 本领域技术人员可以理解， 以上描述只是示例性的。 在不背离发 明思想的情况下， 本领域技术人员可对本发明作出多种修改和变 化， 但这些修改和变化将落入本发明的保护范围。