本发明涉及多肽合成领域， 特别涉及一种艾塞那肽的制备方法。 背景技术

糖尿病， （diabetes )是由遗传因素、 免疫功能紊乱、 微生物感染 及其毒素、 自由基毒素、 精神因素等等各种致病因子作用于机体导致 胰岛功能减退、 胰岛素抵抗等而引发的糖、 蛋白质、 脂肪、 水和电解 质等一系列代谢紊乱综合征， 临床上以高血糖为主要特点， 典型病例 可出现多尿、 多饮、 多食、 消瘦等表现， 即"三多一少"症状， 糖尿病 (血糖）一旦控制不好会引发并发症， 导致肾、 目艮、 足等部位的衰竭 病变， 且无法治愈。

糖尿病分 1 型糖尿病、 2型糖尿病、 妊娠糖尿病及其他特殊类型 的糖尿病 , 在糖尿病患者中 , 2型糖尿病所占的比例约为 95%。 1型糖 尿病 (Type I diabetes)是一种自体免疫疾病 (Autoimmune Disease),由身 体的免疫系统对自身作出攻击而成。 糖尿病患者的免疫系统对自身分 泌胰岛素的胰脏贝它细胞 （pancreatic beta cells)作出攻击并杀死他们， 结果胰脏并不能分泌足够的胰岛素。 1 型糖尿病多发生于青少年， 因 胰岛素分泌缺乏， 依赖外源性胰岛素补充以维持生命。 2 型糖尿病有 更强的遗传性和环境因素， 并呈显著的异质性。 目前认为发病原因是 胰岛素抵抗（主要表现为高胰岛素血症， 葡萄糖利用率降低）和胰岛 素分泌不足的合并存在， 其表现是不均一的， 有的以胰岛素抵抗为主 伴有胰岛素分泌不足， 有的则是以胰岛素分泌不足伴有或不伴有胰岛 素抵抗。

艾塞那肽（Exenatide ), 结构如式 I所示， 氨基酸序列如 SEQ ID No.2所示， 是由美国礼来公司与 Amylin公司共同研发的第一个肠降 血糖素类似物， 是人工合成的由 39个氨基酸组成的多肽， 与内源性肠 降血糖素如胰高血糖素样肽 -1 ( GLP-1 )作用相似， 具有促进葡萄糖依 赖的胰岛素分泌， 恢复第一时相胰岛素分泌， 抑制胰高血糖素的分泌， 减慢胃内容物的排空， 改善胰腺 β细胞的功能等作用。 2004年 FDA 批准其上市， 该药为皮下注射制剂， 商品名为百泌达， 每天给药两次。

2012年 1月 27 日， 美国食品药品监督管理局 （FDA )批准了艾 塞那肽注射液每周一次的緩释剂型的上市申请 ， 2 型糖尿病成人在饮 食和锻炼基础上， 可使用此制剂改善血糖控制。 这是 2型糖尿病中首 个每周一次治疗药物。

专利 US6924264、 US7157555, US6902744, CN101357938A中均 采用了纯固相顺序偶联的方法进行肽的合成。 以氨基树脂为载体， 顺 序偶联， 最终切割得到艾塞那肽。 但是由于 N末端的氨基酸为 His, 采用 Fmoc固相常规的偶联原料 Fmoc-His ( Trt ) -OH及偶联方法会造 成 His的消旋杂质， 并且杂质通过纯化方法难以去除。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种艾塞那肽的制备 方法。该方法通过选用 含有保护基团的组氨酸或其盐及片段合成法， 在抑制 D-His-艾塞那肽形 成的基 上， 提高艾塞那肽的产率和纯度。

为了实现上述发明目的， 本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种艾塞那肽的制备方法， 包括如下步骤：

步骤 1 : 取丝氨酸与树脂经第一偶联获得丝氨酸-树脂� �

步骤 2: 取所述丝氨酸-树脂依次与氨基酸经第二偶联� �得序列如

SEQ ID No.1所示的肽树脂；

步骤 3: 取含有保护基团的组氨酸或其盐与所述序列如 SEQ ID No.l 所示的肽树脂经第三偶联， 获得艾塞那肽树脂， 裂解、 纯化后即得。

作为优选， 步骤 3 中含有保护基团的组氨酸或其盐的结构如式 II所

X-His(Y)-OH

式 II

其中， X选自 Fmoc、 Boc或 Trt;

Y选自 Trt、 Bum, Boc、 mtt或 mmt。

作为优选， 步骤 3中含有保护基团的组氨酸或其盐的结构如式 III所

X-His(Boc)-OH

式 III

其中， X选自 Fmoc、 Boc或 Trt。

作为优选， 步骤 3中含有保护基团的组氨酸或其盐的结构如式 IV所

Boc-His(Boc)-OH.DCHA

式 IV。

作为优选， 第三偶联为预活化偶联或原位偶联。

作为优选，步骤 3具体为在溶剂中，含有保护基团的组氨酸或� �盐与 序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂在偶联剂、 有机碱的存在下经第三偶 联， 获得艾塞那肽树脂， 经裂解剂裂解、 纯化后即得。

作为优选 , 偶联剂为 HATU和 HOAt。

作为优选， 有机碱为 DIPEA或 TMP。

作为优选， 溶剂为 NMP、 DMF、 DCM 中的一种或两者以上的混合 物。

作为优选， 裂解剂为 TFA、 PhSMe、 EDT、 TIS、 水、 Phenol的混合 物。

作为优选， 裂解剂中 TFA、 PhSMe、 EDT、 TIS、 水、 Phenol的体积 比为 80 ~ 85:2 ~ 5: 2 ~ 5: 2 ~ 5: 0 ~ 3: 0 ~ 2。

作为优选， 第三偶联的反应温度为 0〜30 °C。

作为优选， 步骤 2中具体为在溶剂中， 丝氨酸-树脂与氨基酸在偶联 剂、有机碱的存在下， 依次经第二偶联， 获得序列如 SEQ ID No.l所示的 肽树脂。

作为优选， 偶联剂为 HATU或 HOAt。

作为优选， 有机碱为 DIPEA或 TMP。

作为优选， 溶剂为 NMP、 DMF、 DCM 中的一种或两者以上的混合 物。

作为优选， 步骤 2 具体为取丝氨酸 -树脂依次与 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Ser(tBu) -OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH , Fmoc-Lys(Boc)-OH、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Trp(Boc) -OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Arg(pBf)-OH、 Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Met-OH、 Fmoc-Gln(Trt) -OH 、 Fmoc-Lys(Boc)-OH 、 Fmoc-Ser(tBu)-OH 、 Fmoc-Leu-OH 、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH 、 Fmoc-Ser(tBu)-OH 、 Fmoc-Thr(tBu)-OH 、 Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc- Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Gly-OH经第二偶联获得序列如 SEQ ID No.1所示的肽树脂。 作为优选， 第二偶联的反应温度为 0〜30 °C。

作为优选， 第一偶联的偶联剂为 HOBt。

作为优选， 第一偶联的反应温度为 0〜30 °C。

作为优选， 步骤 1中树脂为 Rink Amide-MBHA Resin。

本发明提供了一种艾塞那肽的制备方法。该方 法通过选用含有保护基 团的组氨酸或其盐，结合原位合成法或预活化 法合成艾塞那肽。具体为取 丝氨酸与树脂经第一偶联获得丝氨酸 -树脂； 依次与氨基酸经第二偶联获 得序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂；取含有保护基团的组氨酸� �其盐与 序列如 SEQ ID No.1所示的肽树脂经第三偶联，获得艾塞那肽� �脂，裂解、 纯化后即得艾塞那肽精肽。 本发明提供的艾塞那肽的制备方法， 在抑制 D-His-艾塞那肽形成的基 上， 提高艾塞那肽的产率和纯度。 附图说明

图 1示实施例 34中对照组制得的精肽 HPLC谱图;

图 2示实施例 34中试验组制得的精肽 HPLC谱图。 具体实施方式

本发明公开了一种艾塞那肽的制备方法，本领 域技术人员可以借鉴本 文内容， 适当改进工艺参数实现。 特别需要指出的是， 所有类似的替换和 改动对本领域技术人员来说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明。 本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行 了描述,相关人员明显能在 不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述 的方法和应用进行改动或适 当变更与组合， 来实现和应用本发明技术。

缩写及英文 含义

DCHA 二环己胺

CHA 环己胺

Bum 叔丁氧曱基

mmt 4-曱氧基三苯曱基

mtt 曱基三苯曱基 Trt 三苯曱基

HOAt 1 -羟基 -7-偶氮苯并三氮唑

Fmoc 9-芴曱氧羰基

DIPCDI 二异丙基碳二亚胺

HOBt 1-羟基苯并三唑

2-(7-偶氮苯并三氮唑) -Ν,Ν,Ν',Ν'-四曱基

HATU

脲六氟磚酸酯

苯并三氮唑 -Ν,Ν,Ν',Ν'-四曱基脲六氟磷

HBTU

酸盐

DIPEA Ν,Ν-二异丙基乙胺

DMF Ν,Ν-二曱基曱酰胺

DCM 二氯曱烷

NMP Ν-曱基吡咯烷酮

TMP 2,4,6-三曱基吡啶

TFA 三氟乙酸

PhSMe 苯曱硫醚

TIS 三异丙基硅烷

EDT 乙二疏醇

Phenol 苯酚

SCX-HPLC 强阳离子交换色谱法 实施例 1: 替^ ^为 0.1mmol/g的 Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide-MBHA树 脂的合成

称取 Rink Amide-MBHA树脂 100 g,加入到固相反应柱中，用 DMF 洗涤 2次， 用 DMF溶月长树脂 30分钟后， 用 DBLK脱除 Fmoc保护， 然后用 DMF洗涤 6次。 用茚三酮法检测树脂颜色， 树脂有颜色， 表 示 Fmoc已脱除。称取 4.60g Fmoc-Ser(tBu)-OH( 12mmol )、 1.95g HOBt ( 14.4mmol )溶于体积比为 1:1的 DCM和 DMF混合溶液， 冰水浴下 加入 2.25 ml DIC ( 14.4 mmol ) 活化 3min后加入固相反应柱中， 室温 反应 2小时。 用 DMF洗涤 3次， 加入封闭液（吡啶 /乙酸酐 =1 : 1 )封 闭 2小时。 用 DMF洗涤 4次， DCM洗 4次， 曱醇收缩抽干， 得到 Fmoc-Ser(tBu)-RinkAmide-MBHA树脂。 检测替代度为 0.098mmol/g。 实施例 2: 替^ ^为 0.2mmol/g的 Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide-MBHA 树脂的合成

称取 Rink Amide-MBHA树脂 100 g,加入到固相反应柱中，用 DMF 洗涤 2次， 用 DMF溶月长树脂 30分钟后， 用 DBLK脱除 Fmoc保护， 然后用 DMF洗涤 6次。 用茚三酮法检测树脂颜色， 树脂有颜色， 表 示 Fmoc已脱除。称取 9.20g Fmoc-Ser(tBu)-OH ( 24mmol )、 3.89g HOBt ( 28.8mmol )溶于体积比为 1 : 1的 DCM和 DMF混合溶液， 冰水浴下 加入 4.50 ml DIC ( 28.8 mmol ) 活化 3min后加入固相反应柱中， 室温 反应 2小时。 用 DMF洗涤 3次， 加入封闭液 (吡啶 /乙酸酐 =1 : 1 )封 闭 2小时。 用 DMF洗涤 4次， DCM洗 4次， 曱醇收缩抽干， 得到 Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide-MBHA树脂。 检测替代度为 0.192mmol/g。 实施例 3: 替^ ^为 0.3mmol/g的 Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide-MBHA 树脂的合成

称取 Rink Amide-MBHA树脂 100 g,加入到固相反应柱中，用 DMF 洗涤 2次， 用 DMF溶胀树脂 30分钟后 , 用 DBLK脱除 Fmoc保护 , 然后用 DMF洗涤 6次。 用茚三酮法检测树脂颜色， 树脂有颜色， 表 示 Fmoc已脱除。称取 13.8g Fmoc-Ser(tBu)-OH ( 36mmol )、 5.84g HOBt ( 43.2mmol )溶于体积比为 1 : 1的 DCM和 DMF混合溶液， 冰水浴下 加入 6.75 ml DIC ( 43.2 mmol ) 活化 3min后加入固相反应柱中， 室温 反应 2小时。 用 DMF洗涤 3次， 加入封闭液 (吡啶 /乙酸酐 =1 : 1 )封 闭 2小时。 用 DMF洗涤 4次， DCM洗 4次， 曱醇收缩抽干， 得到 Fmoc- Ser(tBu)-Rink Amide-MBHA树脂。 检测替代度为 0.302mmol/g。 实施例 4: 序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂的合成

称取替代度为 0.192mmol/g的 Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide-MBHA树脂 78. lg, 加入到固相反应柱中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF溶月长树脂 30 分钟后 , 用 DBLK脱除 Fmoc保护 , 然后用 DMF洗涤 6次， 用茚三酮法 检测树脂颜色 ,树脂有颜色 ,表示 Fmoc已脱除。取 20.24 g Fmoc-Pro-OH ( 60 mmol ), 9.73 g HOBt ( 72 mmol ),溶于体积比为 1: 1的 DCM和 DMF 混合溶液， 冰水浴下加入 11.26 ml DIC ( 72 mmol )活化 3min后加入固相 反应柱中， 室温反应 2小时。 以茚三酮法检测判断反应终点， 如果树脂无 色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应不完全， 需再偶联反应 1小时， 此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测 判断反应终点。 重 复上述脱除 Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照� �塞那肽主链 肽序，从 C端到 N端依次完成 2-39片段的偶联，反应结束后用曱醇收缩， 树脂真空干燥过夜， 称重得到艾塞那肽（2-39 ) -Rink Amide-MBHA树脂 160.3g。 实施例 5: 序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂的合成

称取替代度为 0.098mmol/g的 Fmoc- Ser(tBu)-Rink Amide-MBHA树脂 153.1 g, 加入到固相反应柱中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF溶胀树脂 30 分钟后 , 用 DBLK脱除 Fmoc保护 , 然后用 DMF洗涤 6次， 用茚三酮法 检测树脂颜色 ,树脂有颜色 ,表示 Fmoc已脱除。取 20.24 g Fmoc-Pro-OH ( 60 mmol ), 9.73 g HOBt ( 72 mmol ),溶于体积比为 1: 1的 DCM和 DMF 混合溶液， 冰水浴下加入 11.26 ml DIC ( 72 mmol )活化 3min后加入固相 反应柱中， 室温反应 2小时。 以茚三酮法检测判断反应终点， 如果树脂无 色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应不完全， 需再偶联反应 1小时， 此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测 判断反应终点。 重 复上述脱除 Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照� �塞那肽主链 肽序，从 C端到 N端依次完成 2-39片段的偶联，反应结束后用曱醇收缩， 树脂真空干燥过夜， 称重得到艾塞那肽（2-39 ) -Rink Amide-MBHA树脂 233.9。 实施例 6: 序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂的合成

称取替代度为 0.302mmol/g的 Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide-MBHA树脂 49.7g, 加入到固相反应柱中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF溶月长树脂 30 分钟后 , 用 DBLK脱除 Fmoc保护 , 然后用 DMF洗涤 6次， 用茚三酮法 检测树脂颜色 ,树脂有颜色 ,表示 Fmoc已脱除。取 20.24 g Fmoc-Pro-OH ( 60 mmol ), 9.73 g HOBt ( 72 mmol ),溶于体积比为 1 : 1的 DCM和 DMF 混合溶液， 冰水浴下加入 11.26 ml DIC ( 72 mmol )活化 3min后加入固相 反应柱中， 室温反应 2小时。 以茚三酮法检测判断反应终点， 如果树脂无 色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应不完全， 需再偶联反应 1小时， 此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测 判断反应终点。 重 复上述脱除 Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照� �塞那肽主链 肽序，从 C端到 N端依次完成 2-39片段的偶联，反应结束后用曱醇收缩， 树脂真空干燥过夜， 称重得到艾塞那肽（2-39 ) -Rink Amide-MBHA树脂 131.3g。 实施例 7: Boc-His(Boc)-OH.DCHA与序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 原位法合成序列如 SEQ ID No.2所示的肽树脂

称取实施例 4制备的序列如 SEQ ID No. l所示的肽树脂 15mmol加入 到固相反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟。取 32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA ( 60mmol )、 22.81 g HATU ( 60mmol )、 9.80g HOAt ( 72mmol )加入树脂中， 加 500ml NMP溶液， 搅拌反应 5min后， 滴加 15.86ml TMP ( 120mmol ), 在 0°C环境下反应 3h。 以茚三酮法检测判断反 应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应不 完全， 需再偶联反应 1小时。 实施例 8: Boc-His(Boc)-OH.DCHA与序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 原位法合成序列如 SEQ ID No.2所示的肽树脂

称取实施例 5制备的序列如 SEQ ID No. l所示的肽树脂 15mmol加入 到固相反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟。取 32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA ( 60mmol )、 22.81g HATU( 60mmol )、 9.80g HOAt ( 72mmol )加入树脂中， 加 500ml NMP溶液， 搅拌反应 5min后， 滴加 20.86ml DIPEA ( 120mmol ), 在 0°C环境下反应 3h。 以茚三酮法检测判断 反应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应 不完全， 需再偶联反应 1小时。 实施例 9: Boc-His(Boc)-OH.DCHA与序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 原位法合成序列如 SEQ ID No.2所示的肽树脂

称取实施例 6制备的序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 15mmol加入 到固相反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟。取 32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA ( 60mmol )、 22.81g HATU( 60mmol )、 9.80g HOAt ( 72mmol )加入树脂中， 加 500ml DCM溶液， 搅拌反应 5min后， 滴加 15.86ml TMP ( 120mmol ), 在 0°C环境下反应 3h。 以茚三酮法检测判断反 应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应不 完全， 需再偶联反应 1小时。 实施例 10: Boc-His(Boc)-OH.DCHA与序列如 SEQ ID No.l所示的肽树 脂原位法合成序列如 SEQ ID No.2所示的肽树脂

称取实施例 4制备的序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 15mmol加入 到固相反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟。取 32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA ( 60mmol )、 22.81g HATU( 60mmol )、 9.80g HOAt ( 72mmol )加入树脂中，加 500ml DMF/DCM ( 1: 1 )溶液，搅拌反应 5min 后， 滴加 15.86ml TMP ( 120mmol ), 在 0°C环境下反应 3h。 以茚三酮法 检测判断反应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则 表示反应不完全， 需再偶联反应 1小时。 实施例 11: Boc-His(Boc)-OH.DCHA与序列如 SEQ ID No.l所示的肽树 脂原位法合成序列如 SEQ ID No.2所示的肽树脂

称取实施例 6制备的序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 15mmol加入 到固相反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟。取 32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA ( 60mmol )、 22.81g HATU( 60mmol )、 9.80g HOAt ( 72mmol )加入树脂中， 加 500ml NMP溶液， 搅拌反应 5min后， 滴加 15.86ml TMP ( 120mmol ), 在 25°C环境下反应 2h。 以茚三酮法检测判断 反应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应 不完全， 需再偶联反应 1小时。 实施例 12: Boc-His(Boc)-OH.DCHA与序列如 SEQ ID No.l所示的肽树 脂原位法合成序列如 SEQ ID No.2所示的肽树脂

称取实施例 5制备的序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 15mmol加入 到固相反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟。取 32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA ( 60mmol )、 22.81g HATU( 60mmol )、 9.80g HOAt ( 72mmol )加入树脂中， 加 500ml DCM溶液， 搅拌反应 5min后， 滴加 15.86ml TMP ( 120mmol ), 在 25°C环境下反应 2h。 以茚三酮法检测判断 反应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应 不完全， 需再偶联反应 1小时。 实施例 13: Boc-His(Boc)-OH.DCHA与序列如 SEQ ID No.l所示的肽树 脂原位法合成序列如 SEQ ID No.2所示的肽树脂

称取实施例 6制备的序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 15mmol加入 到固相反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟。取 32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA ( 60mmol )、 22.81g HATU( 60mmol )、 9.80g HOAt ( 72mmol )加入树脂中，加 500ml DMF/DCM ( 1: 1 )溶液，搅拌反应 5min 后， 滴加 15.86ml TMP ( 120mmol ), 在 25°C环境下反应 2h。 以茚三酮法 检测判断反应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则 表示反应不完全， 需再偶联反应 1小时。 实施例 14: Boc-His(Boc)-OH.DCHA与序列如 SEQ ID No.l所示的肽树 脂原位法合成序列如 SEQ ID No.2所示的肽树脂

称取实施例 5制备的序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 15mmol加入 到固相反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟。取 32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA ( 60mmol )、 22.81 g HATU ( 60mmol )、 9.80g HOAt ( 72mmol )加入树脂中，加 500ml NMP/DCM ( 1: 1 )溶液，搅拌反应 5min 后， 滴加 15.86ml TMP ( 120mmol ), 在 25°C环境下反应 2h。 以茚三酮法 检测判断反应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则 表示反应不完全， 需再偶联反应 1小时。 实施例 15: Boc-His(Boc)-OH.DCHA与序列如 SEQ ID No.l所示的肽树 脂原位法合成序列如 SEQ ID No.2所示的肽树脂

称取实施例 4制备的序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 15mmol加入 到固相反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟。取 32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA ( 60mmol )、 22.81 g HATU ( 60mmol )、 9.80g HOAt ( 72mmol )加入树脂中， 加 500ml NMP溶液， 搅拌反应 5min后， 滴加 15.86ml TMP ( 120mmol ), 在 30°C环境下反应 2h。 以茚三酮法检测判断 反应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应 不完全，需再偶联反应 1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三� �法 检测判断反应终点。 实施例 16: Boc-His(Boc)-OH.DCHA与序列如 SEQ ID No.l所示的肽树 脂原位法合成序列如 SEQ ID No.2所示的肽树脂

称取实施例 5制备的序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 15mmol加入 到固相反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟。取 32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA ( 60mmol )、 22.81g HATU( 60mmol )、 9.80g HOAt ( 72mmol )加入树脂中， 加 500ml DCM溶液， 搅拌反应 5min后， 滴加 15.86ml TMP ( 120mmol ), 在 30°C环境下反应 2h。 以茚三酮法检测判断 反应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应 不完全， 需再偶联反应 1小时。 实施例 17: Boc-His(Boc)-OH.DCHA与序列如 SEQ ID No.l所示的肽树 脂原位法合成序列如 SEQ ID No.2所示的肽树脂

称取实施例 4制备的序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 15mmol加入 到固相反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟。取 32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA ( 60mmol )、 22.81g HATU( 60mmol )、 9.80g HOAt ( 72mmol )加入树脂中， 力口 500ml DMF溶液， 搅拌反应 5min后， 滴加 15.86ml TMP ( 120mmol ), 在 30°C环境下反应 2h。 以茚三酮法检测判断 反应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应 不完全， 需再偶联反应 1小时。 实施例 18: Boc-His(Boc)-OH.DCHA与序列如 SEQ ID No.l所示的肽树 脂原位法合成序列如 SEQ ID No.2所示的肽树脂

称取实施例 6制备的序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 15mmol加入 到固相反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟。取 32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA ( 60mmol )、 22.81g HATU( 60mmol )、 9.80g HOAt ( 72mmol )加入树脂中， 加 500ml DMF/DMF(1:1)溶液， 搅拌反应 5min 后， 滴加 15.86ml TMP ( 120mmol ), 在 30°C环境下反应 2h。 以茚三酮法 检测判断反应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则 表示反应不完全， 需再偶联反应 1小时。 实施例 19: Boc-His(Boc)-OH.DCHA与序列如 SEQ ID No.l所示的肽树 脂预活化法合成序列如 SEQ ID No.2所示的肽树脂

称取实施例 6制备的序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 15mmol加入 到固相反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟。取 32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA ( 60mmol )、 22.81g HATU( 60mmol )、 9.80g HOAt ( 72mmol )加入树脂中，用 500ml DMF溶解，冰水浴下加入 15.86 ml TMP ( 120mmol ) 活化 5分钟， 将混合液加入到反应柱中， 室温反应 2小时， 以茚三酮检测反应终点.如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应不完全， 需再偶联反应 1小时。 实施例 20: Fmoc-His(Boc)-OH. DCHA与序列如 SEQ ID No.l所示的肽 树脂原位法合成序列如 SEQ ID No.2所示的肽树脂

称取实施例 4制备的序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 15mmol加入 到固相反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟。取 34.56g Fmoc-His(Boc)-OH. CHA( 60mmol )、 22.81g HATU( 60mmol )、 9.80g HOAt ( 72mmol )加入树脂中， 加 500ml NMP溶液， 搅拌反应 5min后， 滴加 15.86ml TMP ( 120mmol ), 在 0°C环境下反应 3h。 以茚三酮法检测判断反 应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应不 完全， 需再偶联反应 1小时。 用 DBLK脱除 Fmoc保护， 然后用 DMF洗 涤 6次。 用茚三酮法检测树脂颜色， 树脂有颜色， 表示 Fmoc已脱除。 实施例 21: Fmoc-His(Bum)-OH与序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂原 位法合成序列如 SEQ ID No.2所示的肽树脂

称取实施例 5制备的序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 15mmol加入 到固相反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟。取 27.81g Fmoc-His(Bum)-OH ( 60mmol )、 22.81g HATU ( 60mmol )、 9.80g HOAt ( 72mmol )加入树脂中， 力口 500ml NMP溶液， 搅拌反应 5min后， 滴加 15.86ml TMP ( 120mmol ), 在 0°C环境下反应 3h。 以茚三酮法检测判断反 应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应不 完全， 需再偶联反应 1小时。 用 DBLK脱除 Fmoc保护， 然后用 DMF洗 涤 6次。 用茚三酮法检测树脂颜色， 树脂有颜色， 表示 Fmoc已脱除。 实施例 22: Fmoc-His(mmt)-OH与序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂原 位法合成序列如 SEQ ID No.2所示的肽树脂

称取实施例 5制备的序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 15mmol加入 到固相反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟。取 38.98g Fmoc-His(mmt)-OH ( 60mmol )、 22.81g HATU ( 60mmol )、 9.80g HOAt ( 72mmol )加入树脂中， 加 500ml NMP溶液， 搅拌反应 5min后， 滴加 15.86ml TMP ( 120mmol ), 在 0°C环境下反应 3h。 以茚三酮法检测判断反 应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应不 完全， 需再偶联反应 1小时。 用 DBLK脱除 Fmoc保护， 然后用 DMF洗 涤 6次。 用茚三酮法检测树脂颜色， 树脂有颜色， 表示 Fmoc已脱除。 实施例 23: Fmoc-His(mtt)-OH与序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂原位 法合成序列如 SEQ ID No.2所示的肽树脂

称取实施例 4制备的序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 15mmol加入 到固相反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟。取 38.02g Fmoc-His(mtt)-OH ( 60mmol )、 22.81g HATU ( 60mmol )、 9.80g HOAt ( 72mmol )加入树脂中， 加 500ml NMP溶液， 搅拌反应 5min后， 滴加 15.86ml TMP ( 120mmol ), 在 0°C环境下反应 3h。 以茚三酮法检测判断反 应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应不 完全， 需再偶联反应 1小时。 用 DBLK脱除 Fmoc保护， 然后用 DMF洗 涤 6次。 用茚三酮法检测树脂颜色， 树脂有颜色， 表示 Fmoc已脱除。 实施例 24: Boc-His(Trt)-OH与序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂原位法 合成序列如 SEQ ID No.2所示的肽树脂

称取实施例 6制备的序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 15mmol加入 到固相反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟。取 29.86g Boc-His(Trt)-OH ( 60mmol )、 22.8 lg HATU ( 60mmol )、 9.80g HOAt ( 72mmol )加入树脂中， 加 500ml NMP溶液， 搅拌反应 5min后， 滴加 15.86ml TMP ( 120mmol ), 在 0°C环境下反应 3h。 以茚三酮法检测判断反 应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应不 完全， 需再偶联反应 1小时。 实施例 25: Boc-His(Bum)-OH与序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂原位 法合成序列如 SEQ ID No.2所示的肽树脂

称取实施例 4制备的序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 15mmol加入 到固相反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟。取 20.49g Boc-His(Bum)-OH ( 60mmol )、 22.8 lg HATU ( 60mmol )、 9.80g HOAt ( 72mmol )加入树脂中， 加 500ml NMP溶液， 搅拌反应 5min后， 滴加 15.86ml TMP ( 120mmol ), 在 0°C环境下反应 3h。 以茚三酮法检测判断反 应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应不 完全， 需再偶联反应 1小时。 实施例 26: Boc-His(mmt)-OH与序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂原位 法合成序列如 SEQ ID No.2所示的肽树脂

称取实施例 5制备的序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 15mmol加入 到固相反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶月长树脂 30分钟。取 31.66g Boc-His(mmt)-OH ( 60mmol )、 22.81g HATU ( 60mmol )、 9.80g HOAt ( 72mmol )加入树脂中， 加 500ml NMP溶液， 搅拌反应 5min后， 滴加 15.86ml TMP ( 120mmol ), 在 0°C环境下反应 3h。 以茚三酮法检测判断反 应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应不 完全， 需再偶联反应 1小时。 实施例 27: Boc-His(mtt)-OH与序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂原位 法合成序列如 SEQ ID No.2所示的肽树脂

称取实施例 6制备的序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 15mmol加入 到固相反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟。取 30.70g Boc-His(mtt)-OH ( 60mmol )、 22.8 lg HATU ( 60mmol )、 9.80g HOAt ( 72mmol )加入树脂中， 加 500ml NMP溶液， 搅拌反应 5min后， 滴加 15.86ml TMP ( 120mmol ), 在 0°C环境下反应 3h。 以茚三酮法检测判断反 应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应不 完全， 需再偶联反应 1小时。 实施例 28: Trt-His(Trt)-OH与序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂原位法 合成序列如 SEQ ID No.2所示的肽树脂

称取实施例 5制备的序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 15mmol加入 到固相反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟。取 38.39g Trt-His(Trt)-OH( 60mmol )、 22.81g HATU( 60mmol )、 9.80g HOAt( 72mmol ) 加入树脂中， 加 500ml NMP溶液， 搅拌反应 5min后， 滴加 15.86ml TMP ( 120mmol ), 在 0°C环境下反应 3h。 以茚三酮法检测判断反应终点， 如 果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应不完全， 需再 偶联反应 1小时。 实施例 29: 艾塞那肽肽树脂的裂解

取实施例 7〜28中的任意一项实施例制备获得的肽树脂 100g置于裂 解反应器中， 以 10ml/g树脂的比例加入裂解试剂 TFA: PhSMe: EDT: TIS: H ₂ 0: Phenol=80:5:5:5:3:2 ( V:V ), 室温搅拌 2h。 反应物用砂芯漏斗 过滤， 收集滤液， 树脂再用少量 TFA洗涤 3次， 合并滤液。 加入冰冻的 无水乙醚沉淀（无水乙醚用量为 100ml/g树脂）， 将沉淀离心， 用无水乙 醚洗涤 3次， 真空干燥得到白色粉末固体， 即艾塞那肽粗肽。 实施例 30: 艾塞那肽肽树脂的裂解

取实施例 7〜28中的任意一项实施例制备获得的肽树脂 100g置于裂 解反应器中， 以 10ml/g树脂的比例加入裂解试剂 TFA: PhSMe: EDT: TIS: H ₂ 0: Phenol=85:4:4:4:2: l ( V:V ), 室温搅拌 2h。 反应物用砂芯漏斗 过滤， 收集滤液， 树脂再用少量 TFA洗涤 3次， 合并滤液。 加入冰冻的 无水乙醚沉淀（无水乙醚用量为 100ml/g树脂）， 将沉淀离心， 用无水乙 醚洗涤 3次， 真空干燥得到白色粉末固体， 即艾塞那肽粗肽。 实施例 31: 艾塞那肽肽树脂的裂解

取实施例 7〜28中的任意一项实施例制备获得的肽树脂 100g置于裂 解反应器中， 以 10ml/g树脂的比例加入裂解试剂 TFA: PhSMe: EDT: TIS: H ₂ 0: Phenol=81.5:5:5:5:2.5:1 ( V:V ), 室温搅拌 2h。 反应物用砂芯 漏斗过滤， 收集滤液， 树脂再用少量 TFA洗涤 3次， 合并滤液。 加入冰 冻的无水乙醚沉淀（无水乙醚用量为 100ml/g树脂）， 将沉淀离心， 用无 水乙醚洗涤 3次， 真空干燥得到白色粉末固体， 即艾塞那肽粗肽。

称取实施例 29〜31中任意一项实施例制备获得的艾塞那肽� �肽 20.0 g 用 2000 ml水溶解后， 采用 Waters 2545 RP-HPLC系统， 波长 230nm, 色 语柱为 50x250 mm反相 C18柱， 常规 0.2%TFA/乙腈流动相纯化， 收集 目的峰馏分， 得到纯度大于 98.5%精肽。 将精肽溶液采用 Waters 2545 RP-HPLC系统， 色谱柱为 50x250 mm反相 C18柱， 0.2%醋酸溶 乙腈 流动相转盐， 收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩， 冻干得到艾塞那肽醋酸盐 精肽 4.2g, HPLC纯度 98.5%。 采用 SCX-HPLC方法检测其中 D-His-艾 塞那肽小于 0.5%。

实施例 33: 艾塞那肽精肽醋酸盐的 化制备

称取 RinkAmide-MBHA树脂 lOOO g, 加入到固相反应柱中， 用 DMF 洗涤 2次， 用 DMF溶月长树脂 30分钟后， 用 DBLK脱除 Fmoc保护， 然 后用 DMF洗涤 6次。用茚三酮法检测树脂颜色，树脂有颜色� �表示 Fmoc 已脱除。称取 92.0g Fmoc-Ser(tBu)-OH( 240mmol )、 38.9g HOBt( 288mmol ) 溶于体积比为 l:l的 DCM和 DMF混合溶液，冰水浴下加入 45 ml DIC( 288 mmol )活化 3min后加入固相反应柱中， 室温反应 2小时。 用 DMF洗涤 3次， 加入封闭液 (吡啶 /乙酸酐 =1:1 )封闭 2小时。 用 DMF洗涤 4次， DCM洗 4次， 曱醇收缩抽干 , 得到 Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide-MBHA树 脂。 检测替代度为 0.189mmol/g。

称取替代度为 0.189mmol/g的 Fmoc- Ser(tBu)-Rink Amide-MBHA树脂 1005.3 g ( 190mmol ), 加入到固相反应柱中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF 溶月长树脂 30分钟后， 用 DBLK脱除 Fmoc保护， 然后用 DMF洗涤 6次， 用茚三酮法检测树脂颜色， 树脂有颜色， 表示 Fmoc已脱除。 取 256.42 g Fmoc-Pro-OH ( 760 mmol ), 123.21 g HOBt ( 912 mmol ), 溶于体积比为 1 :1的 DCM和 DMF混合溶液， 冰水浴下加入 142.57 ml DIC ( 912 mmol ) 活化 3min后加入固相反应柱中， 室温反应 2小时。 以茚三酮法检测判断 反应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应 不完全，需再偶联反应 1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三� �法 检测判断反应终点。重复上述脱除 Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步 骤， 按照艾塞那肽主链肽序， 从 C端到 N端依次完成 2-39片段的偶联， 取 408.12g Boc-His(Boc)-OH.DCHA ( 760mmol ) 、 288.95g HATU ( 760mmol )、 124.12g HOAt( 912mmol )加入树脂中，加 5000ml NMP/DCM ( 1:1 )溶液， 搅拌反应 5min后， 滴加 200.9ml TMP ( 1520mmol ) , 在 0°C 环境下反应 3h。 以茚三酮法检测判断反应终点， 如果树脂无色透明， 则 表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应不完全， 需再偶联反应 1小时。 反 应结束后用曱醇收缩， 树脂真空干燥过夜， 称重得到序列如 SEQ ID No.l 所示的肽树脂 2029.6g。

将序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 2029.6g置于裂解反应器中， 以

10ml/g 树脂的比例加入裂解试剂 TFA: PhSMe: EDT : TIS : H ₂ 0 : Phenol=81.5:5:5:5:2.5:l ( V:V ), 室温搅拌 2h。 反应物用砂芯漏斗过滤， 收集滤液， 树脂再用少量 TFA洗涤 3次， 合并滤液。 加入冰冻的无水乙 醚沉淀（无水乙醚用量为 100ml/g树脂）， 将沉淀离心， 用无水乙醚洗涤 3次， 真空干燥得到白色粉末固体， 即艾塞那肽粗肽 836.97g, 重量收率 为 105.2%, 粗肽纯度为 55.9%。

将艾塞那肽粗肽经过纯化转盐， 最终得到艾塞那肽精肽 173.68g, HPLC纯度为 98.9%, 采用 SCX-HPLC检测 D-His-艾塞那肽为 0.19%。 实施例 34

对照组：

称取替代度为 0.15mmol/g的 Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide-MBHA树脂 10g, 加入到固相反应柱中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF溶胀树脂 30分 钟后， 用 DBLK脱除 Fmoc保护， 然后用 DMF洗涤 6次， 用茚三酮法检 测树脂颜色， 树脂有颜色， 表示 Fmoc已脱除。 取 2.02 g Fmoc-Pro-OH ( 6 mmol ), 0.97 g HOBt ( 7.2 mmol ), 溶于体积比为 1 :1的 DCM和 DMF混 合溶液， 冰水浴下加入 1.13 ml DIC ( 7.2 mmol )活化 3min后加入固相反 应柱中， 室温反应 2小时。 以茚三酮法检测判断反应终点， 如果树脂无色 透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应不完全， 需再偶联反应 1 小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮 法检测判断反应终点。重复 上述脱除 Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照� �塞那肽主链肽 序， 从 C端到 N端依次完成剩余氨基酸的偶联， 其中 N端第 1位氨基酸 采用 Fmoc-His(Trt)-OH, 反应结束后用曱醇收缩， 树脂真空干燥过夜， 称 重得到艾塞那肽树脂 19.3g。

将得到的肽树脂加入裂解试剂 TFA: PhSMe: EDT: TIS: H20: Phenol=85:4:4:4:2: l ( V:V ) 193ml, 室温搅拌 2h。反应物用砂芯漏斗过滤， 收集滤液， 树脂再用少量 TFA洗涤 3次， 合并滤液。 加入冰冻的无水乙 醚沉淀（无水乙醚用量为 100ml/g树脂）， 将沉淀离心， 用无水乙醚洗涤 3次， 真空干燥得到白色粉末固体， 即艾塞那肽粗肽。

得到的艾塞那肽粗肽采用 RP-HPLC方法纯化， 转盐， 得到醋酸艾塞 那肽 1.75克， HPLC纯度 94.3%。

SCX-HPLC方法检测，液相色谱谱图如图 1所示， RT21.523为 D-His- 艾塞那肽 2.73%。 试验组：

称取 RinkAmide-MBHA树脂 1000 g, 加入到固相反应柱中， 用 DMF 洗涤 2次， 用 DMF溶月长树脂 30分钟后， 用 DBLK脱除 Fmoc保护， 然 后用 DMF洗涤 6次。用茚三酮法检测树脂颜色，树脂有颜色� �表示 Fmoc 已脱除。称取 92.0g Fmoc-Ser(tBu)-OH( 240mmol )、 38.9g HOBt( 288mmol ) 溶于体积比为 l:l的 DCM和 DMF混合溶液，冰水浴下加入 45 ml DIC( 288 mmol )活化 3min后加入固相反应柱中， 室温反应 2小时。 用 DMF洗涤 3次， 加入封闭液 (吡啶 /乙酸酐 =1:1 )封闭 2小时。 用 DMF洗涤 4次， DCM洗 4次， 曱醇收缩抽干， 得到 Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide-MBHA树 月旨。 检测替代度为 0.193mmol/g。

称取替代度为 0.193mmol/g的 Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide-MBHA树脂 984.5g ( 190mmol ), 加入到固相反应柱中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF 溶月长树脂 30分钟后， 用 DBLK脱除 Fmoc保护， 然后用 DMF洗涤 6次， 用茚三酮法检测树脂颜色， 树脂有颜色， 表示 Fmoc已脱除。 取 256.42 g Fmoc-Pro-OH ( 760 mmol ), 123.21 g HOBt ( 912 mmol ), 溶于体积比为 1:1的 DCM和 DMF混合溶液， 冰水浴下加入 142.57 ml DIC ( 912 mmol ) 活化 3min后加入固相反应柱中， 室温反应 2小时。 以茚三酮法检测判断 反应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应 不完全，需再偶联反应 1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三� �法 检测判断反应终点。重复上述脱除 Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步 骤， 按照艾塞那肽主链肽序， 从 C端到 N端依次完成 2-39片段的偶联， 取 408.12g Boc-His(Boc)-OH.DCHA ( 760mmol ) 、 288.95g HATU ( 760mmol )、 124.12g HOAt( 912mmol )加入树脂中，加 5000ml NMP/DCM ( 1:1 )溶液， 搅拌反应 5min后， 滴加 200.9ml TMP ( 1520mmol ) , 在 0°C 环境下反应 3h。 以茚三酮法检测判断反应终点， 如果树脂无色透明， 则 表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应不完全， 需再偶联反应 1小时。 反 应结束后用曱醇收缩， 树脂真空干燥过夜， 称重得到序列如 SEQ ID No.l 所示的肽树脂 1998.7g。

将序列如 SEQ ID No.l所示的肽树脂 1998.7g置于裂解反应器中， 以

10ml/g 树脂的比例加入裂解试剂 TFA: PhSMe: EDT : TIS : H ₂ 0 : Phenol=81.5:5:5:5:2.5:l ( V:V ), 室温搅拌 2h。 反应物用砂芯漏斗过滤， 收集滤液， 树脂再用少量 TFA洗涤 3次， 合并滤液。 加入冰冻的无水乙 醚沉淀（无水乙醚用量为 100ml/g树脂）， 将沉淀离心， 用无水乙醚洗涤 3次， 真空干燥得到白色粉末固体， 即艾塞那肽粗肽 846.9g, 重量收率为 106.5%, 粗肽纯度为 56.7%。

得到的艾塞那肽粗肽采用 RP-HPLC方法纯化， 转盐， 得到醋酸艾塞 那肽 176.84克， HPLC纯度 99.01%。 SCX-HPLC方检测， 采用本发明提 供的方法合成的典型图谱如图 2所示。 RT21.547为 D-His-艾塞那肽 0.20%。 以上对本发明所提供的一种艾塞那肽的制备方 法进行了详细介绍。本 说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心 思想。应当指出，对于本技 术领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的 前提下，还可以对本发明进 行若干改进和修饰， 这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护 范围 内。