Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung zumindest einer Fibroinlösung, insbesondere aus Seide und insbesondere in medizinischer Qualität.

Seide ist ein Naturprodukt, das aufgrund seines einzigartigen Eigenschaftsprofils nicht nur in der Textilindustrie verarbeitet wird, sondern auch für die Lebenswissenschaften, insbesondere für die Medizintechnik, großes Anwendungspotential hat. Insbesondere Fibroin, das als Protein ein Baustein natürlicher Seide ist, weist Eigenschaften auf, die es für eine Verwendung als Medizinprodukt prädestinieren. Hierbei stellt sich jedoch die Problematik, Fibroin in einer verwendbaren Form und für eine Verwendung als Medizinprodukt in medizinischer Qualität bereitzustellen.

Eine solche Bereitstellung von Fibroin ist die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, mittels dessen zumindest auch eine Fibroinlösung erzeugt wird, wobei das Verfahren zumindest die folgenden, in der angegebenen Reihenfolge ablaufenden Verfahrensschritten umfasst:

• Bereitstellen von Fibroin; Fibroin wird im Kontext der Erfindung als Strukturprotein verstanden, welches aus Aminosäuren besteht (vorzugsweise Glycin und/oder Serin und/oder Alanin) und weiterhin natürlichen und/oder synthetischen Ursprungs ist; das Bereitstellen kann beispielsweise in Form von Kokons oder Wolle oder Fasern oder Pulver (natürlichen Ursprungs oder rekombinant hergestellt) erfolgen;

• Lösen des Fibroins in einem ersten Lösesystem zur Erzeugung einer Fibroinrohlösung; Lösen bedeutet im Kontext der vorliegenden Erfindung, eine bestimmte Substanz, wie beispielsweise Fibroin, in eine fließfähige, vorzugsweise homogene, zumindest augenscheinlich homogene Form zu überführen. Ein Lösesystem bezeichnet im Kontext der vorliegenden Erfindung eine Kombination von Chemikalien, welche zum Lösen einer bestimmten Substanz verwendet werden kann.

• Reinigen der Fibroinrohlösung durch Absenken des pH-Werts der Fibroinrohlösung, vorzugsweise auf einen Wert < 2, bevorzugt < 1,5, besonders bevorzugt < 1 , durch das Einbringen mindestens einer sauren Substanz; was hier einer Substanz mit einem pH Wert von < 4, bevorzugt < 2, besonders bevorzugt < 1 entspricht, in die Fibroinrohlösung; die saure Substanz kann vorzugsweise eine Säure, beispielweise Ameisensäure und/oder Essigsäure und/oder Zitronensäure und/oder Salzsäure sein; die saure Verbindung kann in Lösung mit einem Lösemittel, vorzugsweise Wasser, besonders bevorzugt destilliertes Wasser mit einer Leitfähigkeit geringer als 30 pS/cm, eingebracht werden; bei Verwendung einer solchen Lösung kann die Konzentration dieser Lösung beispielsweise zwischen 0,1 M und 6 M, vorzugsweise ungefähr (d.h. ± 0,1 M) oder genau 1 M oder 0,5 M betragen; das Reinigen führt zur Inaktivierung und/oder Zerstörung ungewollter Verunreinigungen und zur Reduzierung von Kontaminationen, wie beispielsweise Pilzsporen, Endotoxinen oder Bakterien; dies hat den Vorteil, dass die Fibroinrohlösung auch ohne Reinigungsschritte, wie beispielsweise einer Sterilisation, die einem erfindungsgemäßen Verfahren nachgeschaltet sind, zu beispielsweise Medizinprodukten und insbesondere medizinischen Implantaten verarbeitet werden kann;

• Anheben des pH-Werts der Fibroinrohlösung, insbesondere auf einen Wert zwischen 6 und 9, vorzugsweise zwischen 7 und 8 und besonders bevorzugt auf einen Wert von ungefähr (d.h. ± 0,1) oder genau 7,5, durch ein Einbringen einer basischen Substanz (d.h. einer Substanz mit einem pH Wert von > 10, bevorzugt > 11, besonders bevorzugt > 12), vorzugsweise Natriumcarbonat (Na2COs) oder Natriumhydroxid (NaOH) oder Kaliumhydroxid (KOH) oder Magnesiumhydroxid (MgOH) oder Calciumhydroxid (CaOH), in die Fibroinrohlösung; die basische Verbindung kann in Lösung mit einem Lösemittel, vorzugsweise Wasser, vorzugsweise destilliertes Wasser mit einer Leitfähigkeit geringer als 30 pS/cm, eingebracht werden; bei Verwendung einer solchen Lösung kann die Konzentration dieser Lösung vorzugsweise zwischen 0,1 M und 6 M, vorzugsweise ungefähr (d.h. ± 0,1 M) oder möglichst genau 1 M oder 0,5 M, betragen;

• Entsalzen (d.h. ein Reduzieren des Salzgehalts) der Fibroinrohlösung zur Erzeugung der Fibroinlösung.

Als „Fibroin“ wird auch eine (reines) Fibroin umfassende Substanz verstanden.

Das Verfahren kann dabei weitere vorausgehende und/oder nachfolgende Verfahrensschritte und/oder Zwischenschritte umfassen.

Das Bereitstellen des Fibroins in Form einer Fibroinlösung ermöglicht eine einfache und vorteilhafte Verwendung, beispielsweise zur Herstellung von Medizinprodukten, wie beispielsweise Scaffolds, Membranen, Wundauflagen, Verbände, Hydrogele, Kleber, Pulver und Filler oder zur Beschichtung von Medizinprodukten. Durch eine gezielte Variation der Prozessparameter innerhalb bestimmter Grenzen können dabei auch die Lösungseigenschaften wie beispielsweise die Viskosität oder das Molekulargewicht der Proteinlösung genau an eine nachgeschaltete Weiterverarbeitung angepasst werden. Insbesondere kann konzentrationsabhängig auch eine hochviskose Fibroinlösung erzeugt werden, vorzugsweise mit einer Viskosität zwischen 300 mPa*s und 1500 mPa*s, vorzugsweise zwischen 300 mPa*s und 600 mPa*s oder zwischen 1200 mPa*s und 1500 mPa*s, die vorteilhaft im Rahmen einer Weiterverwendung der Fibroinlösung zur Herstellung von hochstabilen Strukturen verwendet werden kann. Eine Bestimmung der Viskosität kann dabei gemäß DIN 53019-1 erfolgen.

Das Reinigen und auch das Entsalzen der Fibroinlösung sorgt im Rahmen eines erfindungsgemäßen Verfahrens für eine ausreichende Reinheit der Fibroinlösung, wobei insbesondere auch eine medizinische Qualität („medical grade“) erreicht werden kann. Als medizinische Qualität wird dabei verstanden, dass die Fibroinlösung zumindest bei einer Konzentration von bis zu 5 Gew.-% einen Bioburden < 1 CFU/ml und Endotoxine mit einem Gehalt < 0,5 EU/rnl aufweist. Bei einer Konzentration von größer als 5 Gew.-% kann der Bioburden entsprechend verhältnismäßig ansteigen (Verhältnisse gemäß einer Konzentration von 5 Gew.-% einerseits und andererseits dem Bioburden < 1 CFU/ml sowie dem Endotoxingehalt < 0,5 EU/ml). Bioburden bezeichnet in diesem Zusammenhang die Anzahl an koloniebildenden Keimen bzw. Bakterien in einer Volumeneinheit der Lösung. Hierzu kann es erforderlich sein, dass zumindest das Reinigen der Fibroinlösung und die sich anschließenden Prozessschritte unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Als sterile Bedingungen gelten dabei Arbeitsbedingungen, wie sie bei Verwendung von sterilisierten Werkzeugen und Hilfsmitteln in einer Umgebung, die Kontaminationen der Fibroinlösung verhindert (z.B. Sterilwerkbank), erzielt werden können. Die Fibroinlösung soll dabei nach dem Reinigungsschritt nicht durch Kontaminationen, d.h. durch einen Eintrag von anorganischen und/oder organischen und/oder biologischen Verunreinigungen in Form von beispielsweise Pilzsporen, Endotoxinen oder Bakterien, verunreinigt sein. Eine Bestimmung des Endotoxingehalts kann dabei gemäß DIN EN ISO 29701 erfolgen. Eine Bestimmung des Bioburden kann dabei gemäß DIN EN ISO 11737-1 erfolgen.

Das Lösen des Fibroins kann vorzugsweise durch ein Einbringen von thermischer Energie, beispielsweise durch ein Erhitzen auf eine Temperatur (und Halten der Temperatur) von 70°C oder 75°C oder 80°C oder 90°C oder 100°C, und/oder durch eine Behandlung mit Mikrowellenstrahlung, beispielsweise für 15 Minuten mit einer Leistung von 300 W oder für 10 Minuten mit einer Leistung von 400 W oder für 5 Minuten mit einer Leistung von 500 W; und/oder mit Infrarotbestrahlung, und/oder durch ein Einbringen von kinetischer Energie, beispielsweise durch Ultraschallbehandlung oder Rühren oder Schütteln, des das Fibroin und das erste Lösesystem umfassenden Gemenges beziehungsweise der sich ausbildenden Fibroinrohlösung unterstützt werden.

Das erste Lösesystem kann vorzugsweise eine saure Verbindung, insbesondere Ameisensäure (CH ₂ O ₂ ) oder Essigsäure (CH ₃ COOH), oder eine chaotrope Salzverbindung, insbesondere Calciumchlorid (CaCI ₂ ) oder Kristallwasser- Calciumchlorid (CaCl2-2H ₂ O) oder Lithiumbromid (LiBr) oder Zinkchlorid (ZnCI ₂ ) oder Calciumnitrat (Ca ₂ NOs), letzteres vorzugsweise in Form einer Schmelze, die beispielsweise nach 30 Minuten bei 40°C im Wasserbad erhalten werden kann, umfassen. Zudem kann das erste Lösesystem ein Lösemittel, insbesondere Methanol (CH4O) und/oder Aceton (CsHeO) und/oder Ethylenglycol (C ₂ HeO ₂ ) und/oder Ethanol (EtOH), umfassen, das durch eine Quellwirkung den Löseprozess verbessert. Weiterhin kann das erste Lösesystem Wasser, vorzugsweise destilliertes Wasser, vorzugsweise Reinstwasser ohne (biologische) Kontamination, umfassen. Beispielsweise kann vorgesehen sein, dass das erste Lösesystem eine chaotrope Salzverbindung, ein Lösemittel und gegebenenfalls destilliertes Wasser in einem definierten Verhältnis, beispielsweise in einem Molmassenverhältnis von Calciumchlorid : Ethanol : Wasser von 1 : 2 : 8 oder von Kristallwasser- Calciumchlorid : Ethanol : Wasser von 1 : 2 : 6 oder 1 : 4 : 6 oder von

Calciumnitrat : Ethanol von 1 : 4 oder 1 : 3 oder 1 : 2, umfasst. Insbesondere bei einer Verwendung von Calciumchlorid und Kristallwasser-Calciumchlorid als Bestandteil des ersten Lösesystems kann eine Fibroinlösung realisiert werden, die zu wasserunlöslichen Strukturen verarbeitet werden kann. Wasserlöslichkeit bezeichnet im vorliegenden Kontext den Grad der Lösung und damit die Eigenschaft einer Festkörperstruktur in Kontakt mit Wasser in eine fließfähige und vorzugsweise auch homogene Form überzugehen. Als wasserlöslich sind hierbei Strukturen definiert, die sich in Wasser zu mehr als 80% ihrer Ursprungsmasse lösen. Beschränkt wasserlöslich sind hier Strukturen, die sich in Wasser zwischen 30% und 70% ihrer Ursprungsmasse lösen. Als wasserunlöslich sind hier Strukturen definiert, die sich in Wasser zu weniger als 30% ihrer Ursprungsmasse lösen. Das Reinigen der Fibroinrohlösung kann vorzugsweise über einen Zeitraum von mindestens 12 h und/oder von höchstens 72 h, beispielsweise über einen Zeitraum von ungefähr (d.h. ± 1 h) oder genau 24 h oder 20 h oder 16 h, durchgeführt werden.

Das Entsalzen der Fibroinrohlösung kann mittels Filtration und/oder, vorzugsweise, mittels Dialyse bewirkt werden, wobei bei der Dialyse Salzmoleküle durch eine semipermeable Membran aus der Fibroinrohlösung in eine Empfängerflüssigkeit, vorzugsweise in gereinigtes entsalztes Wasser, das sauer oder neutral oder basisch sein kann, und/oder in Polyethylenglycol (PEG) mit einer Molekülgröße von mehr als 10 kDa diffundieren und dadurch aus der Fibroinrohlösung entfernt werden. Durch die Verwendung von Polyethylenglycol (PEG) kann hierbei zusätzlich der Vorteil realisiert werden, dass durch eine Erzeugung eines osmotischen Druck eine direkte Aufkonzentrierung der Proteinlösung durch Wasseraustritt stattfindet. Als entsalztes Wasser wird dabei Wasser mit einem Leitwert unter 50 pS/cm, vorzugsweise unter 30 pS/cm, verstanden.

Ein Entsalzen mittels Dialyse kann durch das Erzeugen eines Volumenstroms der Fibroinrohlösung, beispielsweise in Kombination mit einer Pumpleistung von 50 ml/min bis 500 ml/min, vorzugsweise 200 ml/min oder 300 ml/min oder 400 ml/min, in der Form einer Diafiltration beschleunigt werden.

Das Entsalzen der Fibroinrohlösung kann vorzugsweise bis zum Erreichen eines Leitfähigkeitswerts der Fibroinlösung von maximal 1000 pS/cm oder maximal 750 pS/cm oder, vorzugsweise, maximal 500 pS/cm oder, besonders bevorzugt, maximal 250 pS/cm durchgeführt werden.

Eine Aufkonzentrierung des Fibroins in der Fibroinlösung kann vorzugsweise durch die Erzeugung eines Überdrucks (zum Umgebungsdruck) der Fibroinrohlösung während des Entsalzens, vorzugsweise eines Überdrucks von maximal 5 bar, vorzugsweise von ungefähr (d.h. ± 0,1°bar) oder (möglichst) genau 3 bar oder 2 bar oder 1 bar, eingestellt werden. Durch eine entsprechende Einstellung des Überdrucks der Fibroinrohlösung kann somit eine sogenannte Diafiltration erreicht werden, so dass die Fibroinrohlösung (und damit die resultierende Fibroinlösung) nicht nur entsalzt, sondern auch aufkonzentriert wird. Dies kann vorzugsweise bis zu einer Konzentration des Fibroins von mindestens 3% oder 10% oder, bevorzugt, 20% oder, besonders bevorzugt, 30% durchgeführt werden. Der Überdruck kann beispielsweise durch ein Verkleinern eines Strömungsquerschnitts, durch den die Fibroinrohlösung gefördert wird, oder durch eine Erhöhung des geförderten Massenstroms der Fibroinrohlösung erzeugt werden.

Durch eine gezielte Einstellung des pH-Werts der Fibroinrohlösung, auf den nach der Reinigung angehoben wurde, kann die Viskosität der zu erzeugenden Fibroinlösung beeinflusst werden. Ein pH-Wert < 5 kann hierbei zu einer viskosen Lösung führen, die bereits nach kurzzeitiger Lagerung in ein festes Gel übergeht. Bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8 kann die resultierende Lösung sehr zähflüssig, jedoch lager- und verarbeitbar sein. Ab einem pH-Wert von 8 entsteht eine Lösung, die trotz hoher Konzentrationen des Fibroins von beispielsweise bis zu 30 Gew.-% ein relativ niedrigviskoses Verhalten aufweist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens kann vorgesehen sein, dass das Bereitstellen des Fibroins durch ein Separieren des Fibroins und mindestens eines Sekundärbestandteils einer Seide bewirkt wird. Als Seide wird im Kontext der Erfindung ein Gemisch von Substanzen verstanden, wobei Fibroin darin zumindest einen wesentlichen Bestandteil (d.h. mindestens 30 Gew.-%) und vorzugsweise den Hauptbestandteil (d.h. mindestens 50 Gew.-%) ausmacht. Das Separieren kann durch ein Einbringen der Seide, beispielsweise in Form des Eintauchens eines oder mehrerer Seidenkokons, in ein zweites Lösesystem, das den Sekundärbestandteil selektiv löst, wodurch ein Gemenge (d.h. ein heterogenes Gemisch) aus dem (festen) Fibroin und der Lösung mit dem Sekundärbestandteil entsteht, und durch ein Entnehmen des Fibroins aus dem zweiten Lösesystems, beispielsweise durch Filterung mittels eines Filters oder Siebs, bewirkt wird.

Ein solcher Prozess wird nachfolgend auch als „Degumming“ bezeichnet. Dies stellt eine einfach durchführbare Möglichkeit zum Bereitstellen von Fibroin aus Seide, die ein natürlicher Lieferanten für Fibroin ist, dar. Dadurch wird ermöglicht, grundsätzlich jede Seide, insbesondere jede Seide eines Seide produzierenden Lebewesens, bevorzugt die Seide des Seidenspinners Bombyx Mori, als Ausgangsprodukt für die Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zu nutzen.

Besonders bevorzugt kann vorgesehen sein, dass der Sekundärbestandteil Sericin ist, das neben dem Fibroin beispielsweise in der Seide, die von dem Seidenspinner Bombyx Mori erzeugt wird, enthalten ist.

Das vorzugsweise zum Separieren des Fibroins und des mindestens einen

Sekundärbestandteils genutzte zweite Lösesystem kann vorzugsweise eine basische Substanz, beispielsweise Natriumcarbonat (Na2COs) oder Natriumhydroxid (NaOH) oder Kaliumhydroxid (KOH) oder Magnesiumhydroxid (MgOH) oder Calciumhydroxid (CaOH), oder Harnstoff (CH4N2O) enthalten. Die Konzentration der basischen Substanz kann dabei vorzugsweise zwischen 0,01 M und 8 M, vorzugsweise ungefähr (d.h. ± 0,01 M) oder (möglichst) genau 1 M oder 0,5 M betragen.

Bei einer Verwendung von Natriumcarbonat kann vorzugsweise vorgesehen sein, dass das Gemenge das Natriumcarbonat, das Fibroin und destilliertes Wasser in einem Verhältnis, das einem Verhältnis von entweder 0,06 M oder 0,04 M oder 0,02 M Natriumcarbonat zu 0,2 kg Fibroin zu 6 I destilliertem Wasser ungefähr (d.h. ± 5% je Wert) oder (möglichst) genau entspricht, umfasst.

Das Separieren des Fibroins und des mindestens einen Sekundärbestandteils kann vorzugsweise durch ein Einbringen von thermischer Energie in das Gemenge, vorzugsweise bis zum Erreichen (und Halten) einer Temperatur des Gemenges von zwischen 70°C und 100°C, insbesondere von ungefähr (d.h. ± 2°C) oder (möglichst) genau 70°C oder 80°C oder 90°C oder 100°C, unterstützt werden. Hierzu kann beispielsweise vorgesehen sein, dass das Gemenge über einen Zeitraum von entweder mindestens 20 Minuten (vorzugsweise zwischen 25 Minuten und 35 Minuten, insbesondere 30 Minuten) oder von mindestens 50 Minuten (vorzugsweise zwischen 55 Minuten und 65 Minuten, insbesondere 60 Minuten) auf eine Temperatur von mindestens 90°C (vorzugsweise mindestens 95°C, besonders bevorzugt 100°C) temperiert wird. Sofern das zweite Lösungsmittel Natriumhydroxid, insbesondere in Form von Natronlauge, umfasst, kann auf ein Einbringen von thermischer Energie auch verzichtet werden, wodurch sich ein erfindungsgemäßes Verfahren vereinfachen kann. Bei der Verwendung von Harnstoff könnte die Temperierzeit auch bis drei Stunden betragen.

Alternativ oder ergänzend kann das Separieren des Fibroins und des mindestens einen Sekundärbestandteils durch ein Einbringen von kinetischer Energie in das Gemenge, vorzugsweise durch Ultraschallbehandlung oder durch ein Rühren oder Schütteln (Erzeugen von Vibrationen) oder durch Schwenken, unterstützt werden.

Das Fibroin kann vorzugsweise nach dem Entnehmen aus der Lösung mit dem Sekundärbestandteil, insbesondere der Sericinlösung, und vor dem Lösen in dem ersten Lösesystems gewaschen und/oder getrocknet werden. Das Waschen kann dabei vorzugsweise durch ein Spülen mit entsalztem oder reinem Wasser bewirkt werden. Als entsalztes Wasser wird dabei Wasser mit einem Leitwert unter 50 pS/cm, vorzugsweise unter 30 pS/cm, verstanden; als reines Wasser wird Wasser, das für intravenöse medizinische Anwendungen geeignet ist, verstanden. Das Trocknen kann beispielsweise in einem Ofen, vorzugsweise bei einer Temperatur von mindestens 70°C und/oder maximal 100°C, vorzugsweise bei einer Temperatur von ungefähr (d.h. ± 2 °C) oder (möglichst) genau 80°C durchgeführt werden. Dadurch wird ein schnelles Trocknen, beispielsweise innerhalb von 5 Stunden, realisierbar. Das Trocknen bei Temperaturen von mindestens 70°C begünstigt zudem eine Inaktivierung und/oder Zerstörung von biologischen Verunreinigungen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens kann vorgesehen sein, dass einer, mehrere oder alle der nachfolgenden Verfahrensschritten durchgeführt werden:

• Reinigen der Lösung mit dem Sekundärbestandteil durch Absenken des pH-Werts der Lösung mit dem Sekundärbestandteil durch ein Einbringen einer sauren Verbindung in die Lösung mit dem Sekundärbestandteil und/oder durch Erhitzen der Lösung mit dem Sekundärbestandteil;

• Anheben des pH-Werts der Lösung mit dem Sekundärbestandteil durch ein Einbringen einer basischen Substanz in die Lösung mit dem Sekundärbestandteil;

• Entsalzen der Lösung mit dem Sekundärbestandteil bis zu einer Leitfähigkeit von maximal 5000 pS/cm oder 3000 pS/cm oder 1000 pS/cm oder 500 pS/cm.

Dadurch kann auch für den Sekundärbestandteil, insbesondere Sericin, ein in der Seide der Seidenraupe Bombyx mori vorkommendes Kleberprotein, das das Fibroin zusammenhält und 20 Gew.-% bis 30 Gew-% der Seide ausmacht, eine vorteilhafte Verwendbarkeit, insbesondere auch mit einer medizinischen Qualität und damit als Medizinprodukt oder für Kosmetika, erreicht werden.

Die für das Reinigen der Lösung mit dem Sekundärbestandteil durch Absenken des pH-Werts und für das Anheben des pH-Werts der Lösung mit dem Sekundärbestandteil und für das Entsalzen der Lösung mit dem Sekundärbestandteil vorgesehenen Prozessparameter und Mittel/Produkte können denjenigen entsprechend, die für das Reinigen der Fibroinrohlösung und für Anheben des pH- Werts der Fibroinrohlösung und für das Entsalzen der Fibroinrohlösung beschrieben sind. Sofern in dieser Beschreibung von „umfassen“ gesprochen wird, ist damit auch die Möglichkeit einer abschließenden Aufzählung (d.h. „bestehen aus“) gemeint.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Ausführungsbeispiel 1 (Standard-Fibroinlösung 1):

Für die Bereitstellung des Fibroins werden 200 g Seidenkokons des Seidenspinners Bombyx mori in einem (zweiten) Lösesystem bestehend aus 6 I kochendem Wasser und 26,8 g Natriumcarbonat (0,04 M) für 60 Minuten unter regelmäßigem Rühren gekocht. Dadurch wurde das Sericin der Seidenkokons in dem zweiten Lösesystem gelöst und dabei von dem faserigen Fibroin separiert. Die Fibroinfasern wurden anschließend durch ein Sieb aus der Sericinlösung entnommen.

Daraufhin erfolgte ein Waschen und Trocknen der Fibroinfasern, indem diese dreimalig für 10 Minuten mit destilliertem Wasser gequollen und anschließend für 4 Stunden bei 80°C in einem Ofen (handelsüblicher Dörrautomat) getrocknet wurden.

Die getrockneten Fibroinfasern wurden anschließend gewogen und in gleichen Teilen auf Gefäße verteilt. In die Gefäße wurde dann ein (erstes) Lösesystem gegeben, wobei dieses Lösesystem die zehnfache Masse bezogen auf die Fibroinfasern aufgewiesen hat (30 g Fibroinfasern + 300 g erstes Lösesystem). Als erstes Lösesystem wurde dabei eine sogenannte Ajisawa-Lösung genutzt, die aus Calciumchlorid, Ethanol und destilliertem Wasser in einem festen Verhältnis von 1 : 2 : 8 besteht (vgl. Ajisawa A. Dissolution of silk fibroin with calciumchloride/ethanol aqueous solution. J. Sericultural Sei. Jpn. 1998;67:91-94.). Durch ein Erwärmen des Gemenges aus Fibroinfasern und Lösesystem in einem Wasserbad bei 75°C und über einen Zeitraum von 60 Minuten wurden die Fibroinfasern in dem ersten Lösesystem gelöst. Dabei wurden die Gefäße nach jeweils 15 Minuten kräftig geschüttelt. Auf diese Weise wurde eine Fibroinrohlösung erzeugt.

Für ein anschließendes Reinigen wurden die Fibroinrohlösung mit 1 M HCI-Lösung in einer Menge, die 1/10 der Masse des gelösten Fibroins entsprochen hat, für 24 h behandelt. Dabei wurde der pH-Wert der Fibroinrohlösung auf einen Wert von < 2 abgesenkt.

Die darauffolgende Neutralisierung durch ein Anheben des pH-Werts der

Fibroinrohlösung auf 7,5 erfolgte unter sterilen Bedingungen mit 1 M NaOH-Lösung, in derselben Menge wie die HCI-Lösung (1/10 der Masse des gelösten Fibroins), die zuvor der Fibroinrohlösung zugegeben wurde.

Für ein Entsalzen wurde die gereinigte Fibroinrohlösung in einem sterilen Dialysator (Polyethersulfon (PES)-Membran oder Zellulose-Membran mit einem molekularen CutOff von 5 bis 10 kDa) so lange entsalzt, bis das Abwasser eine dauerhafte Leitfähigkeit von < 500 pS/cm aufgewiesen hat. Dabei wurde die Lösung auf 30% (Masseanteil des Fibroins in der sich ergebenden Fibroinlösung) aufkonzentriert.

Die daraus hervorgegangene Lösung hatte folgende typische Eigenschaften:

Ausführungsbeispiel 2 (Standard-Fibroinlösung 2):

Für die Bereitstellung des Fibroins werden 200 g Seidenkokons des Seidenspinners Bombyx mori in einem (zweiten) Lösesystem bestehend aus 6 I kochendem Wasser und 26,8 g Natriumcarbonat (0,04 M) für 60 Minuten unter regelmäßigem Rühren gekocht. Dadurch wurde das Sericin der Seidenkokons in dem zweiten Lösesystem gelöst und dabei von dem faserigen Fibroin separiert. Die Fibroinfasern wurden anschließend durch ein Sieb aus der Sericinlösung entnommen.

Daraufhin erfolgte ein Waschen und Trocknen der Fibroinfasern, indem diese dreimalig für 10 Minuten mit destilliertem Wasser gequollen und anschließend für 4 h bei 80 °C in einem Ofen getrocknet wurden.

Die getrockneten Fibroinfasern wurden anschließend gewogen und in gleichen Teilen auf Gefäße verteilt. In die Gefäße wurde dann ein (erstes) Lösesystem gegeben, wobei dieses Lösesystem die zehnfache Masse bezogen auf die Fibroinfasern aufgewiesen hat (30 g Fibroinfasern + 300 g erstes Lösesystem). Als erstes Lösesystem wurde dabei eine sogenannte Ajisawa-Lösung genutzt, die aus Calciumchlorid, Ethanol und destilliertem Wasser in einem festen Verhältnis von 1 : 2 : 8 besteht. Durch ein Erwärmen des Gemenges aus Fibroinfasern und erstem Lösesystem in einem Wasserbad bei 75 °C und über einen Zeitraum von 60 Minuten wurden die Fibroinfasern in dem ersten Lösesystem gelöst. Dabei wurden die Gefäße nach jeweils 15 Minuten kräftig geschüttelt. Auf diese Weise wurde eine Fibroinrohlösung erzeugt.

Für ein erstes Entsalzen wurde die Fibroinrohlösung mittels eines Dialysators so lange entsalzt, bis das Abwasser des Dialysators eine dauerhafte Leitfähigkeit von

< 500 pS/cm aufweist.

Für ein anschließendes Reinigen wurden die Fibroinrohlösung mit 1 M HCI-Lösung in einer Menge, die 1/10 der Masse des gelösten Fibroins entsprochen hat, für 24 h behandelt. Dabei wurde der pH-Wert der Fibroinrohlösung auf einen Wert von < 2 abgesenkt.

Die darauffolgende Neutralisierung durch ein Anheben des pH-Werts der Fibroinrohlösung auf 7,5 erfolgte unter sterilen Bedingungen mit 1 M NaOH-Lösung, in derselben Menge wie die HCI-Lösung (1/10 der Masse des gelösten Fibroins), die zuvor der Fibroinrohlösung zugegeben wurde.

Für ein zweites Entsalzen wurde die gereinigte Fibroinrohlösung in dem sterilen Dialysator so lange entsalzt, bis das Abwasser eine dauerhafte Leitfähigkeit von

< 500 pS/cm aufgewiesen hat. Dabei wurde die Lösung auf 10 % (Masseanteil des Fibroins in der sich ergebenden Fibroinlösung) aufkonzentriert.

Die daraus hervorgegangene Lösung hatte folgende typische Eigenschaften:

Ergänzung zum Ausführungsbeispiel 2 (Sericinlösung): Die nach der Entnahme der Fibroinfasern zurückbleibende Sericinlösung wurde mittels des Dialysators so lange entsalzt, bis das Abwasser eine dauerhafte Leitfähigkeit von < 500 pS/cm aufgewiesen hat.

Anschließend erfolgte eine Aufkonzentrierung der Sericinlösung, bis das minimale Volumen des Dialysators (200 ml) erreicht wurde.

Die konzentrierte Sericinlösung wurde anschließend gereinigt, z.B. durch Autoklavieren in einem hitzestabilen Gefäß oder durch Mikrowellenbestrahlung bei 300 W für 10 Minuten (alle 3 Minuten kurz abkühlen lassen) oder gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren mit 1 M Salzsäure.

Die gereinigte Sericinlösung wurde nach dem Abkühlen steril umgefüllt.

Die daraus hervorgegangene Sericinlösung hat folgende typische Eigenschaften:

Ausführungsbeispiel 3 (Gel-Fibroinlösung):

Für ein Degumming wurden 200 g Seidenkokons des Seidenspinners Bombyx mori in einem (zweiten) Lösesystem bestehend aus 6 I kochendem Wasser und 13,4 g Natriumcarbonat (0,02 M) für 30 Minuten unter regelmäßigem Rühren gekocht.

Dadurch wurde das Sericin der Seidenkokons in dem zweiten Lösesystem gelöst und dabei von dem faserigen Fibroin separiert. Die Fibroinfasern wurden anschließend durch Filterung mittels eines Siebs aus der Sericinlösung entnommen.

Daraufhin erfolgte ein Waschen und Trocknen der Fibroinfasern, indem diese dreimalig für 10 Minuten mit destilliertem Wasser gequollen und anschließend für 4 h bei 80 °C in einem Ofen (handelsüblicher Dörrautomat) getrocknet wurden. Die getrockneten Fibroinfasern wurden anschließend gewogen und in gleichen Teilen auf Gefäße verteilt. In die Gefäße wurde dann ein (erstes) Lösesystem gegeben, wobei dieses erste Lösungsmittel die zehnfache Masse bezogen auf die Fibroinfasern aufgewiesen hat (30 g Fibroinfasern + 300 g erstes Lösesystem). Als erstes Lösesystem wurde dabei eine sogenannte Ajisawa-Lösung genutzt, die aus Calciumchlorid, Ethanol und destilliertem Wasser in einem festen Verhältnis von 1 : 2 : 8 besteht. Durch ein Erwärmen des Gemenges aus Fibroinfasern und Lösesystem in einem Wasserbad bei 75°C und über einen Zeitraum von 60 Minuten wurden die Fibroinfasern in dem ersten Lösesystem gelöst. Dabei wurden die Gefäße nach jeweils 15 Minuten kräftig geschüttelt. Auf diese Weise wurde eine Fibroinrohlösung erzeugt.

Für ein sich anschließendes Reinigen wurden die Fibroinfasern mit 1 M HCI-Lösung in einer Menge, die 1/10 der Masse der Fibroinfasern entsprochen hat, für 24 h behandelt. Dabei wurde der pH-Wert der Fibroinrohlösung auf einen Wert von < 1 abgesenkt.

Die darauffolgende Neutralisierung durch ein Anheben des pH-Werts der Fibroinrohlösung auf 7,5 erfolgte unter sterilen Bedingungen mit derselben Menge an 1 M NaOH, die der Fibroinrohlösung zugegeben wurde.

Für ein Entsalzen wurde die gereinigte Fibroinrohlösung in dem sterilen Dialysator so lange entsalzt, bis das Abwasser eine dauerhafte Leitfähigkeit von < 500 pS/cm aufwies. Dabei wurde die Lösung auf 10 % (Masseanteil des Fibroins in der sich ergebenden Fibroinlösung) aufkonzentriert.

Die daraus hervorgegangene Lösung hatte folgende typische Eigenschaften: Ausführungsbeispiel 4 (Viskose Fibroinlösung):

Für ein Degumming wurden 200 g Seidenkokons des Seidenspinners in einem (zweiten) Lösesystem bestehend aus 2 I 0,5 M Natronlauge für 30 Minuten unter regelmäßigem Schütteln behandelt. Dabei wurden die das Gemenge aus zweitem Lösungsmittel und Seidenkokons umfassenden Gefäße nach jeweils 10 Minuten kräftig geschüttelt. Dadurch wurde das Sericin der Seidenkokons in dem zweiten Lösesystem gelöst und dabei von dem faserigen Fibroin separiert. Daraufhin wurde 1 I 1 M HCI- Lösung für die Neutralisierung hinzugegeben und diese Mischung 15 Minuten abreagiert, wobei die Gefäße nach jeweils 5 Minuten geschüttelt wurden. Die Fibroinfasern wurden anschließend durch Filterung mittels eines Siebs aus der Sericinlösung entnommen.

Daraufhin erfolgte ein Waschen und Trocknen der Fibroinfasern, indem diese dreimalig für 10 Minuten mit destilliertem Wasser gequollen und anschließend für 4 h bei 80°C in einem Ofen (handelsüblicher Dörrautomat) getrocknet wurden.

Die getrockneten Fibroinfasern wurden anschließend gewogen und in gleichen Teilen auf Gefäße verteilt. In die Gefäße wurde dann ein (erstes) Lösesystem gegeben, wobei dieses erste Lösesystem die zehnfache Masse bezogen auf die Fibroinfasern aufgewiesen hat (30 g Fibroinfasern + 300 g erstes Lösesystem). Als erstes Lösesystem wurde dabei eine sogenannte Ajisawa-Lösung genutzt, die aus Calciumchlorid, Ethanol und destilliertem Wasser in einem festen Verhältnis von 1 : 2 : 8 besteht. Durch ein Erwärmen des Gemenges aus Fibroinfasern und erstem Lösesystem in einem Wasserbad bei 75°C und über einen Zeitraum von 60 Minuten wurden die Fibroinfasern in dem ersten Lösesystem gelöst. Dabei wurden die Gefäße nach jeweils 15 Minuten kräftig geschüttelt. Auf diese Weise wurde eine Fibroinrohlösung erzeugt.

Für ein sich anschließendes Reinigen wurde die Fibroinrohlösung mit 1 M HCI-Lösung in einer Menge, die 1/10 der Masse des gelösten Fibroins entsprochen hat, für 24 h behandelt. Dabei wurde der pH-Wert der Fibroinrohlösung auf einen Wert von < 1 abgesenkt.

Die darauffolgende Neutralisierung durch ein Anheben des pH-Werts der Fibroinrohlösung auf 7,5 erfolgt unter sterilen Bedingungen mit derselben Menge an 1 M NaOH. Für ein Entsalzen wurde die gereinigte Fibroinrohlösung in einem sterilen Dialysator so lange entsalzt, bis das Abwasser eine dauerhafte Leitfähigkeit von < 500 pS/cm aufgewiesen hat. Dabei wurde die Lösung auf 10% (Masseanteil des Fibroins in der sich ergebenden Fibroinlösung) aufkonzentriert.

Eine Nutzung der Sericinlösung gemäß der Ergänzung Ausführungsbeispiel 1 ist grundsätzlich und damit bei sämtlichen Ausführungsbeispielen möglich.

Die daraus hervorgegangene Lösung hatte folgende typische Eigenschaften: