Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Dihydroxypyrimidin-Derivaten der allgemeinen Formel

worin R* und R^ gleich oder verschieden sind und ein Wasserstoffatom, Aryl- oder eine C\- C4-Alkylgruppe bedeuten, ausgehend von einer Verbindung der allgemeinen Formel

R ^z

II

CN- -CH- -R ^J

worin R2 die genannte Bedeutung hat und R-* -CN oder COOR ⁴ bedeutet, worin R ⁴ eine Cj- C4-Alkylgruppe ist.

Dihydroxypyrimidin ist ein wichtiges Zwischenprodukt zur Herstellung von Insektiziden wie z. B. zur Herstellung von 4,6-Pyrimidin-diyl-bis-(thiono)(thiol)-phosphor(phosphon)-sà ¤urestern (DE 25 23 324).

Bisher sind mehrere Verfahren zur Herstellung von Dihydroxypyrimidin bzw. deren Derivaten bekannt.

Bekannt ist beispielsweise die Herstellung von Dihydroxypyrimidin, ausgehend von Malonsäurediamid (DE-PS 12 00 308). Dabei wird Malonsäurediamid mit Formamid in Gegenwart von Natriumethanolat zum Dihydroxypyrimidin cyclisiert. Dieses Verfahren hat den Nachteil, dass das Edukt Malonsäurediamid realtiv kostspielig ist.

D. J. Brown (J. Chem. Soc, 1956, S. 2312 - 2314) beschreibt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von Dihydroxypyrimidin, ausgehend von Malonsäurediamid. Dabei wird Malon¬ säurediamid in Gegenwart von Natriumethoxid und Ethylformiat zum Dihydroxypyrimidin cyclisiert. Dieses Verfahren hat zum einen den Nachteil, dass Dihydroxypyrimidin nur in

massiger Ausbeute erhalten wird. Zum anderen ist, wie bereits oben beschrieben, das Edukt Malonsäurediamid relativ kostspielig.

Die JP-4260 umfasst ein Verfahren zur Herstellung von Dihydroxypyrimidin durch Reaktion von Malonat mit Formamid in Gegenwart eines Alkalimetallalkoxids. Nachteilig bei diesem Verfahren ist, dass das Formamid in grossem Ãœberschuss verwendet werden muss.

Die US-PS 17 66 748 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von 2-Aryl-4,6-dihydroxy- pyrimidinen, ausgehend von Malonsäurediethylester. Dabei wird Malonsäurediethylester in Gegenwart eines Amidins einer Arylcarbonsäure zum entsprechenden Produkt cyclisiert. Dieses Verfahren hat den Nachteil, dass die entsprechenden Amidine sehr kostspielig sind.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war, ein wirtschaftlicheres und ökologisch günstigeres Verfahren zur Herstellung von Dihydroxypyrimidinderivaten zur Verfügung zu stellen, wobei Dihydroxypyrimidin in guter Ausbeute und Reinheit isoliert werden kann.

Diese Aufgabe wurde mit dem erfindungsgemässen Verfahren gemäss Anspruch 1 gelöst.

In der ersten Verfahrensstufe wird als Substrat eine Verbindung der allgemeinen Formel

R'

II

CN- CH- -R ^J

worin R2 und R-3 die genannte Bedeutung haben, mittels Mikroorganismen der Gattung Rhodococcus in ein Malonsäurederivat der allgemeinen Formel

worin R ² die genannte Bedeutung hat und R- ⁵ eine C1-C4- Alkoxy gruppe oderNH2 bedeutet, umgesetzt.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel II wie Cyanessigsäuremethyl- oder -ethylester sind käufliche Verbindungen.

Zweckmässig wird die erste Stufe mit Mikroorganismen der Spezies Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp. 5 - 6 oder Rhodococcus equi, vorzugsweise mit Mikroorga¬ nismen der Spezies Rhodococcus sp. 5 - 6 (FERM BP-687), Rhodococcus rhodochrous JI (FERM BP- 1478) oder mit Mikroorganismen der Spezies Rhodococcus equi TG328 (FERM BP-3791 bzw. DSM 6710), durchgeführt. Insbesondere wird die Umsetzung mittels Mikroorganismen der Spezies Rhodococcus rhodochrous (FERM BP- 1478) durchgeführt. Die Mikroorganismen der Spezies Rhodococcus sp. 5 - 6, Rhodococcus rhodochrous JI und

Rhodococcus equi TG328 sind in der Literatur beschriebene Mikroorganismen. Rhodococcus rhodochrous JI (FERM BP-1478) ist in der EP-B 307 928, Rhodococcus sp. 5 - 6 (FERM BP- 687) in der EP-A 0 188 316 und Rhodococcus equi TG328 (FERM BP-3791) in der US-PS 5 258 305 ausführlich beschrieben.

Für das Verfahren ebenfalls geeignet sind die funktionell aequivalenten Varianten und Mutan¬ ten dieser Mikroorganismen. Unter "funktionell aequivalenten Varianten und Mutanten" werden Mikroorganismen verstanden, die im wesentlichen dieselben Eigenschaften und Funktionen wie die Ursprungsmikroorganismen besitzen. Derartige Varianten und Mutanten können zufällig z. B. durch UV-Bestrahlung gebildet werden.

Üblicherweise werden die Mikroorganismen vor der eigentlichen Biotransformation entspre¬ chend der EP-B 307 928 kultiviert (angezüchtet) und die wirksamen Enzyme induziert. Vorzugsweise erfolgt die Biotransformation mit, auf fachmännisch übliche Weise, immobilisierten Mikroorganismen-Zellen.

Zweckmässig wird die Biotransformation in einem pH-Bereich von 3 bis 7 vorzugsweise in einem pH-Bereich von 4 bis 6 durchgeführt.

Die Biotransformation kann bei einer Temperatur von 0 bis 30 °C, vorzugsweise von 3 bis 20 °C durchgeführt werden.

Als Substrate werden Verbindungen der allgemeinen Formel II verwendet, worin R2 ein Wasserstoffatom, Aryl- oder eine C \ -C4-Alkylgruppe und R ³ -CN oder COOR ⁴ bedeutet, worin R ⁴ eine Cι -C4-Alkylgruppe ist. Als C i -C4- Alkylgruppe kann Methyl-, Ethyl-, Propyl-, i-Propyl-, Butyl-, i-Butyl- oder t-Butyl-, verwendet werden. Als Aryl- kann beispielsweise

Phenyl-, substituiert oder unsubstituiert, oder Naphtyl- verwendet werden. Vorzugsweise bedeutet R ² ein Wasserstoffatom und R ³ Methyl-,- Ethyl-, i-Propyl- oder -CN.

Nach einer üblichen Umsetzungszeit von 1 bis 100 h können die gebildeten Amide auf einfache Weise z. B. durch Abtrennen von Wasser isoliert werden.

In der zweiten Verfahrensstufe wird das Malonsäurederivat der allgemeinen Formel

mit einem Carbonsäureamid der allgemeinen Formel

in Gegenwart einer Base zum Endprodukt gemäss Formel I cyclisiert.

Rest R5 bedeutet eine C1-C4- Alkoxygruppe wie Methoxy-, Ethoxy-, Propoxy-, Butoxy-, i- Butoxy-, t-Butoxy- oder -NH2. Vorzugsweise bedeutet Rp Methoxy- oder Ethoxy-. Rest R ² hat die bereits beschriebene Definition.

Rest R ¹ bedeutet entweder C 1 -C4- Alkyl- wie Methyl-, Ethyl-, Propyl-, i-Propyl-, Butyl-, t-Butyl-, i-Butyl- oder ein Wasserstoffatom. Vorzugsweise bedeutet R^ ein Wasserstoffatom.

Zweckmässig wird das Carbonsäureamid in einem Verhältnis von 2 bis 8 mol pro mol Malonsäurederivat, vorzugsweise in einem Verhältnis von 2 bis 3 mol verwendet.

Als Base wird zweckmässig ein Alkalimetallalkoholat wie Natrium- oder Kalium-methanolat, -ethanolat, -propanolat, -butanolat, i-butanolat, t-butanolat, amylat- oder i-amylat verwendet. Vorzugsweise wird Natriummethanolat verwendet.

Die Konzentration der Base kann in einem Bereich von 2 bis 6 mol pro mol Malonsäurederivat, vorzugsweise in einem Bereich von 3 bis 4 mol variieren.

Als Lösungsmittel können für die zweite Stufe polare Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol, Propanol oder Butanol verwendet werden, vorzugsweise wird Methanol verwendet.

Zweckmässig wird die zweite Stufe bei einer Temperatur von 30 °C bis zur Rückflusstempera- tur des entsprechenden Lösungsmittels, vorzugsweise bei Rückflusstemperatur des entsprechenden Lösungsmittels, durchgeführt.

Nach einer weiteren Umsetzungszeit von 1 bis 6 h kann das Dihydroxypyrimidinderivat der Formel I durch übliche Aufarbeitungsmethoden isoliert werden.

Beispiele

Beispiel 1

Herstellung von Malonsäure-monoamid-monoester (Carbamoyl-essigsäure-ester) aus Cyanessigsäuremethylester, Cyanessigsäureethylester und Cyanessigsäureisoproylester

In ein Glasgefäss, welches mit einem Magnetrührer ausgerüstet war, wurden 200 ml Wasser, 0,62 g JI Biomasse (FERM BP- 1478) (berechnet als Trockengewicht) und 50 g des entsprechenden Cyanessigsäure-esters bei Raumtemperatur während 16 Std inkubiert. Der pH- Wert lag etwa bei 5. Mittels GC- Analytik konnte zu diesem Zeitpunkt kein Ausgangsmaterial mehr nachgewiesen werden. Die Biomasse wurde abfiltriert und das Wasser vom Produkt unter reduziertem Druck entfernt. Spuren von Wasser wurden danach durch Zugabe von Toluol zum Rückstand azeotrop entfernt. Die isolierte Ausbeute betrug >90% und die Reinheit der gebildeten Carbamoyl-essigsäure-ester betrug nach GC >95%. Carbamoyl-essigsäure- isopropylester präzipitierte unter diesen Bedingungen während der Biotransformation aus wässeriger Lösung. In diesem Falle wurde die Suspension zuerst auf 50 °C erwärmt, um den Isopropylester in Lösung zu bringen, bevor die Biomasse abfiltriert wurde.

Beispiel 2

Einfluss des pH-Wertes auf die Umsetzung von Cyanessigsäuremethylester zu

Carbamoylessigsäuremethylester.

Für die Versuche wurde ein 1 1 Applikon Fermenter verwendet. Der Biotransformationsansatz enthielt 200 g Cyanessigsäuremethylester, 800 ml Wasser und 1,2 g JI Biomasse (FERM BP- 687) (berechnet als Trockengewicht). Das Gefäss wurde mit 200 UpM gerührt und die Temperatur betrug 12 °C - 17 °C. Die Umsetzung wurde nach 16 h abgebrochen. Zu diesem Zeitpunkt konnte mittels GC- Analytik kein Ausgangsmaterial nachgewiesen werden. Der pH- Wert wurde im Ansatz A nicht konstant gehalten und fiel von einem Anfangswert von 5,7 auf 4,7 am Ende der Reaktion.

Im Ansatz B wurde der pH während der gesamten Reaktionszeit auf einen Wert von 8,0 konstant gehalten. Dazu wurde 30%-NaOH-Lösung verwendet. Die Aufarbeitung erfolgte wie oben beschrieben.

Mittels Titration konnte sowohl in Ansatz A als auch in Ansatz B eine signifikante Menge an Carbamoylessigsäuremethylester nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu Ansatz B war jedoch das Produkt in Ansatz A wesentlich reiner.

Beispiel 3

Umsetzung von Malonsäuredinitril zu Malonsäurediamid mit JI Biomasse

(FERM BP-1478)

In ein Glasgefass, welches mit einem Magnetrührer ausgerüstet war, wurde 90 ml Wasser, 0,3 g JI Biomasse (berechnet als Trockengewicht) und 10 g Malonsäuredinitril bei Raumtemperatur während 6 h inkubiert. Mittels GC-Analytik konnte zu diesem Zeitpunkt kein Ausgangsmaterial mehr nachgewiesen werden. Malonsäurediamid präzipitierte unter diesen Bedingungen während der Biotransformation aus wässeriger Lösung. Die Suspension wurde auf 50 °C erwärmt, um das Produkt in Lösung zu bringen, bevor die Biomasse abfiltriert wurde.

Das Wasser wurde vom Produkt unter reduziertem Druck entfernt. Die isolierte Ausbeute betrug >90% und die Reinheit des gebildeten Malonsäureadiamide betrug >95% (GC).

Beispiel 4

Herstellung von Dihydroxypyrimidin (R ¹ = R ² = H)

Formamid (26,43 g; 575 mmol) wurde zu Natriummethylat Lösung (157,56 g; 875 mmol) bei Raumtemperatur während 5 Minuten zugefügt, wobei sich die Lösung auf 28 °C erwärmte. Die Lösung wurde auf Rückfluss (64 °C) erhitzt und 15 Minuten bei dieser Temperatur gehalten. Zu dieser 64 °C warmen Lösung tropfte man während 60 min Malonsäuremonoamidmonoester, in 30 ml Methanol gelöst, zu. Dabei entstand allmählich eine farblose Suspension. Man kochte die leicht rührbare Suspension 3 h unter Rückfluss und kühlte anschliessend auf Raumtemperatur ab. Man fügte 125 ml Wasser so zu, dass die Temperatur ca 25 °C betrug. Am Ende der Zugabe erhielt man eine leicht gelbe Lösung. Man stellte den pH auf 4,0 mit der Zugabe von 82,0 g konz. HCl-Lösung (die Temperatur lag zwischen 25 und 30 °C) ein. Die Suspension liess man 15 min bei Raumtemperatur rühren, filtrierte den ausgefallenen Feststoff ab und wusch 2mal mit 45 ml Wasser tüchtig nach. Der hellgelbe Feststoff wurde im Vakuumtrockenschrank bei 60 °C während 24 h getrocknet. Es wurden 22,67 g (Gehalt 97,0% nach HPLC), entsprechend einer Ausbeute von 78,5% erhalten.

ΪH NMR (DMSO<#) δ: 5,22 (s, IH);

8,05 (s, IH); 11,5 - 12,2 (s, br, 2H).

¹³ C NMR (DMSOrftf ) δ: 89,99;

149,90; 166,17.