[01] A presente invenção trata-se de um processo de produção de microparticulas simbióticas, microparticulas simbióticas e seu uso.

[02] A invenção se insere no campo da engenharia de bioprocessos e alimentos, especificamente na incorporação em alimentos funcionais, sendo preferencialmente iogurtes, margarinas e bebidas lácteas ou sem lactose.

Fundamentos da invenção:

[03] Resíduos agroindustriais, além de abundantes, são fonte de diversos componentes de interesse industrial, que podem ser explorados e utilizados para a produção de moléculas bioativas de alto valor agregado de maneira barata, renovável e sustentável.

[04] O processamento da cana-de-açúcar é responsável por grande parte da produção agrícola nacional, gerando subprodutos como bagaço e palha. Estes, por serem abundantes, representam fonte de matéria prima barata e renovável para produção sustentável de biomoléculas de alto valor agregado (GONÇALVES et al., 2012). São constituídos majoritariamente por celulose, hemicelulose e lignina, materiais estruturais da parede celular das plantas (ZHANG et al., 2012).

[05] A xilana é o principal componente da fração hemicelulósica da parede celular. Sua despolimerização depende da ação de um complexo enzimático variado, formando xilobiose e xilo-oligossacarídeos (XOS), constituintes da fibra alimentar e parcialmente digeridos por humanos.

[06] As porções não digeríveis dos XOS servem de alimentos para bactérias da flora intestinal (GIESE et ai., 2011), atuando como prebióticos, estimulando crescimento e atividade de bactérias intestinais benéficas (SINGH, BANERJEE, ARORA, 2015), aumentando a produção de ácidos graxos voláteis antiulcerogênicos (VÁZQUEZ et ai., 2000) e inibindo o crescimento de bactérias maléficas. Trata-se de uma fibra não digerível de baixa caloria que contribui, inclusive, para o retardamento da absorção de carboidratos no trato gastrointestinal, tendo inclusive evidências de efeito benéfico sobre diabetes mellítus tipo 2 (AKPINAR, ERDOGAN, BONSTANCI, 2009; SHEU et ai., 2008).

[07] Xilo-oligossacarídeos oferecem vantagens quando comparados a outros oligossacarídeos em termos de estabilidade ao calor e meios ácidos (VÁZQUEZ et ai., 2000), e efeitos benéficos de estimulação do crescimento de microrganismos probióticos, como Lactobacíllus spp. e Bifidobacterium bifidum, proporcionando benefícios para os sistemas digestivo e imunológico (CHAPLA; PANDIT; SHAH, 2012; SUWA et ai., 1999). Além disso, possuem baixo valor calórico, sabor aceitável e não são cariogênicos (VÁZQUEZ et ai., 2000) . Essas características conduzem à potencial aplicação em alimentos simbióticos .

[08] Com o objetivo de proteger a bactéria probiótica de meio adverso, a microencapsulação tem se mostrado método promissor para assegurar que uma quantidade adequada do microrganismo chegue ao seu sitio de ação, como o aumento de 22,81% da viabilidade de células encapsuladas em alginato obtido por Ribeiro e colaboradores (2014).

[09] Muitos polímeros têm sido usados como matriz para a elaboração de microcápsulas na indústria de alimentos, e, dentre eles, o alginato tem mostrado excelente biocompatibilidade, estabilidade em meio ácido e não toxicidade, promovendo proteção e controle de distribuição no trato gastrointestinal (COOK et ai., 2011).

[010] No entanto, ainda perduram algumas deficiências relativas à manutenção da viabilidade celular de organismos probióticos encapsulados durante o armazenamento refrigerado, bem como durante a passagem pelo trato gastro intestinal.

[011] A associação sinérgica de prebióticos e probióticos microencapsulados ainda não foi completamente viabilizada no estado da técnica e há o interesse em desenvolver veículos que tenham melhores resultados quanto à viabilidade do microrganismo e estabilidade do probiótico.

Estado da técnica:

[012] O documento de patente CN101979640 apresenta como solução um método aplicado em folhas de cana de açúcar, envolvendo etapas de pré-tratamento que incluem a aplicação de altas temperaturas e remoção de impurezas para obtenção de uma solução de xilana, que é então tratada com xilanase. Os xilo- oligossacarídeos obtidos da hidrólise são então purificados, concentrados e secados por atomização. [013] Entretanto, a produção de XOS no documento relacionado se dá sob elevadas temperaturas e tratamento químico. Além disso, é possível identificar problemas técnicos no referido documento, tais como a autohidrólise, que leva à formação de elevada concentração de compostos indesejáveis e inibitórios (furfural, xilose, glicose), carecendo maior trabalho para purificação dos XOS, bem como etapas adicionais.

[014] Em contraste, a presente invenção é um processo que utiliza engenharia genética que permite condições brandas de hidrólise enzimática.A seletividade e especificidade da enzima endoxilanase recombinante adotada sob brandas condições permite obter um hidrolisado mais puro, sem produção de inibidores e menor produção de monossacarídeos; xilana não hidrolisada pode ser precipitada com etanol, facilitando a etapa de purificação dos XOS. Finalmente, na presente invenção os XOS são obtidos a partir da palha, que inclui folhas secas, ponteiro e colmos, elevando os rendimentos de produção de XOS.

[015] O documento CN104130951 revela um método de obtenção de xilanase recombinante em Píchía pastoris GS115, no qual O sobrenadante com a enzima foi aplicado diretamente sobre a biomassa lignocelulósica. Porém, o documento relacionado usa do vetor de expressão indutivo pPIC, que faz necessário o uso de metanol, componente tóxico e inadequado para indústria alimentícia.

[016] Já na presente invenção, com o vetor constitutivo, utilizou-se glicose como fonte de carbono, permitindo que o extrato enzimático fosse aplicado na hidrólise da biomassa sem a necessidade de purificação da enzima, eliminando uma etapa do processo. Adicionalmente, a enzima (GH10) produzida se destaca pela sua termoestabilidade, permitindo que a hidrólise seja testada em elevadas temperaturas sem que perca sua atividade .

[017] Em artigo cientifico, Boonchuay et ai(2014) revela a produção de xilo-oligossacarideos a partir da espiga de milho, usando para isso uma endoxilanase obtida de Streptomyces thermovulgaris TISTR1948, que pode causar bacteremia. O principal objetivo do estudo era a obtenção dos XOS devido às propriedades prebióticas dos mesmos.

[018] Diferentemente, a presente invenção se refere a um método de obtenção de xilanase recombinante GH10 em Píchía pastoris GS115. Cabe ainda ressaltar que a enzima GH10 é mais apropriada para obtenção de XOS de cadeia curta, que apresentam maiores efeitos prebióticos e atividade antioxidante, enquanto GH11 produz XOS de cadeias maiores. Além disso, Píchía pastoris é um organismo GRAS e seu uso é mais seguro do ponto de vista sanitário .

[019] A dissertação de mestrado de Nascimento C. E. O. descreve o uso de enzima endoxilanase recombinante em Píchía pastoris para hidrólise de xilana obtida do bagaço de cana de açúcar. A expressão da GH10 ocorre de forma indutiva. A atividade prebiótica dos xilo-oligossacarideos e seu uso na área de alimentos funcionais são também antecipados pelo documento, muito embora não haja construção de microparticulas para tal. Ainda, o documento menciona a indução por metanol (evidenciado pelo uso do meio BMMY), necessitando de uma etapa de purificação da enzima produzida, o que prejudica sua aplicação para fins alimentícios. A extração da xilana foi realizada em múltiplas etapas ao invés de ser conduzida em um processo único.

[020] Apresente invenção, por outro lado, permite produzir XOS empregando extrato enzimático bruto, além de usar a palha de cana, que apresenta teor de hemicelulose de 30 a 35%, comparados a uma média 25% de hemicelulose para o bagaço. Ainda a expressão do GH10 ocorre de forma constitutiva. Dessa forma, palha de cana se apresenta como melhor matéria prima para obtenção de XOS.

[021] No artigo científico de KRASAEKOOPT et al., a microencapsulação de Lactobacillus acidophilus e Lactobacíllus casei é realizada com uma combinação de inulina, galacto- oligossacarídeos (GOS) e alginato revestidos com quitosana. As microcápsulas foram ainda aplicadas em matrizes alimentícias, e foi reportado que a presença de GOS providenciou a melhor proteção aos microrganismos encapsulados. Ainda, as partículas são descritas no artigo com tamanho entre 1,90 e 1,92 mm. Partículas muito grandes como tal prejudicam a distribuição celular no interior da partícula, reduzindo a capacidade de proteção, e apresentam empecilhos na incorporação em alimentos, por alterar por exemplo textura e viscosidade, e podendo ocasionar problemas operacionais. Não foi apresentada análise estrutural das partículas obtidas para o entendimento das interações entre os polímeros e característica da estrutura (tamanho de poro e cristalinidade), que afetam diretamente sua resistência e capacidade de proteção. Além de ter apresentado eficiências de encapsulação mais baixas, a resistência das partículas às condições ácidas foi inferior, demonstrando drástica queda de viabilidade logo nos primeiros 30 minutos de experimento.

[022] Diferentemente, a presente invenção utiliza prebiótico XOS produzido a partir da utilização de resíduo agroindustrial, em contraste com o documento relacionado que aplica prebióticos comerciais. As micropartícuias da presente invenção são formuladas com prebiótico XOS, enquanto as partículas do documento relacionado são formuladas com prebióticos comerciais inulina ou GOS. As micropartícuias descritas na presente invenção possuem tamanho menor do que a descrita no documento e não apresentam problemas de distribuição celular. Ainda, o XOS, aplicado na presente invenção no desenvolvimento de micropartícuias simbióticas, apresentou efeito prebiótico, atividade antioxidante e antiproliferativa superiores a outros prebióticos. Além disso, foi obtido XOS a partir do segundo polissacarídeo mais abundante na natureza, a hemicelulose, fonte barata e renovável, presente em grandes quantidades em resíduos agroindustriais .

[023] O processo de produção das micropartícuias descrito na presente invenção produz, a partir da aplicação de enzima endoxilanase recombinante e associação de XOS à matriz de biopolimeros, micropartícuias com diâmetro adequado, com pequenos poros e estrutura cristalina, apresentando ótima resistência às condições ácidas do estômago e mantendo a viabilidade dos probióticos encapsulados tanto durante o armazenamento quanto durante o ensaio de digestibilidade. A microparticula simbiótica se destina ao uso de uma pluralidade das referidas microparticulas para incorporação em alimentos funcionais. Estes alimentos funcionais se caracterizam como um produto alimentício que compreende as microparticulas tais como definidas na presente invenção e que foram produzidas pelo processo específico da presente invenção, sendo preferencialmente iogurtes, margarinas e bebidas lácteas ou sem lactose.

Breve descrição da invenção:

[024] A presente invenção trata-se de um processo de produção de microparticulas simbióticas, microparticulas simbióticas e seu uso para preparação de produtos alimentícios.

[025] O processo de produção de microparticulas simbióticas compreende as seguintes etapas: a) produzir endoxilanase por meio da expressão heteróloga do gene XynlOCf de forma constitutiva em Píchía pastoris (Komagataella phaffíí) linhagem GS115; b) produzir xilo-oligossacarídeos (XOS): b.l) manter enzima endoxilanase na concentração preferencial de 2U/mL, 1% (m/v) de hemicelulose extraída por álcali de palha de cana de açúcar deacetilada, em pH

5,3, temperatura de 65°C, por 48h; b.2) precipitar a hemicelulose não convertida com etanol; b.3) rotacionar o hidrolisado concentrado em rotaevaporador para atingir de 1 a 5% (m/v) de XOS, preferencialmente 3%; c) Gelificar uma solução compreendendo alginato, gelatina e XOS obtido da etapa (b.3) para encapsulação: c.l) adicionar 1,0 a 2,0% (m/m) de gelatina, preferencialmente 1,5% de gelatina suina Tipo A, à água deionizada aquecida a 45°C e mantido sob agitação por 20 minutos, seguido de resfriamento a 25°C; c.2) adicionar 0,5 a 1,5% de alginato (m/m) preferencialmente 1%; c.3) adicionar 1,0 a 5,0% de XOS (m/v), preferencialmente 3%; e c.4) adicionar entre 10 ⁶ a 10 ¹⁰ UFC/g preferencialmente 10 ⁸ UFC/g, de um probiótico, preferencialmente L. acidophilus.

[026] Microparticulas simbióticas obtidas pelo processo descrito compreendem os seguintes componentes:

0,5 a 1,5% de alginato, preferencialmente 1%;

1,0 a 2,0% de gelatina, preferencialmente 1,5%;

- 1,0 a 5,0% de xilo-oligossacarídeos preferencialmente 3%; e

- entre 10 ⁶ a 10 ¹⁰ UFC/g, preferencialmente 10 ⁸ , de um probiótico, preferencialmente L. acidophilus.

[027] É um objeto adicional o uso das microparticulas simbióticas para incorporação na preparação de produtos alimentícios, sendo preferencialmente iogurtes, margarinas e bebidas lácteas ou sem lactose.

Breve descrição das figuras:

[028] A Figura 1 apresenta um gráfico representando a viabilidade de L. acidophilus encapsulados ao longo de 28 dias de armazenamento refrigerado, em que AGX3 é uma micropartícuia que compreende 3% de XOS; AG é uma microparticulas sem XOS; e A é o Alginato puro.

[029] A Figura 2 apresenta um gráfico representando a viabilidade de L. acidophilus ao longo do ensaio de digestibilidade in vitro.

[030] A Figura 3 apresenta imagens de MEV e DRX do gel obtido pela associação dos polímeros e XOS (3%), evidenciando o tamanho dos poros e a cristalinidade.

[031] A Figura 4 representa-se uma imagem obtida a partir de microscopia ótica da micropartícuia simbiótica com 3% de XOS, sendo possível observar L. acidophilus encapsulados.

[032] A Figura 5 revela-se um espectro infra-vermelho obtido comparativamente para a xilana extraída de palha de cana-de-açúcar e XOS oriundos de sua hidrólise.

Descrição detalhada da invenção:

[033] A presente invenção trata-se de um processo de produção de microparticulas simbióticas, e seu uso para preparação de produtos alimentícios.

[034] O processo de produção de microparticulas simbióticas compreende as seguintes etapas: a) produzir endoxilanase por meio da expressão heteróloga do gene XynlOCf de forma constitutiva em Píchía pastoris (Komagataella phaffíí) linhagem GS115; b) produzir xilo-oligossacarídeos (XOS): b.l) manter enzima endoxilanase na concentração preferencial de 2U/mL, 1% (m/v) de hemicelulose extraída por álcali de palha de cana de açúcar deacetilada, em pH 5,3, temperatura de 65°C, por 48h; b.2) precipitar a hemicelulose não convertida com etanol; b.3) rotacionar o hidrolisado concentrado em rotaevaporador para atingir de 1 a 5% (m/v) de XOS, preferencialmente 3%; c) Gelificar uma solução compreendendo alginato, gelatina e XOS obtido da etapa (b.3) para encapsulação: c.l) adicionar 1,0 a 2,0% (m/m) de gelatina, preferencialmente 1,5% de gelatina suína Tipo A, à água deionizada aquecida a 45°C e mantido sob agitação por 20 minutos, seguido de resfriamento a 25°C; c.2) adicionar 0,5 a 1,5% de alginato (m/m) preferencialmente 1%; c.3) adicionar 1,0 a 5,0% de XOS (m/v), preferencialmente 3%; e c.4) adicionar entre 10 ⁶ a 10 ¹⁰ UFC/g preferencialmente 10 ⁸ UFC/g, de um probiótico, preferencialmente L. acidophilus.

[035] As micropartícuias simbióticas obtidas compreendem os seguintes componentes: 0,5 a 1,5% de alginato, preferencialmente 1%;

1,0 a 2,0% de gelatina, preferencialmente 1,5%;

- 1,0 a 5,0% de xilo-oligossacarídeos preferencialmente 3%; e

- entre 10 ⁶ a 10 ¹⁰ UFC/g, preferencialmente 10 ⁸ , de um probiótico, preferencialmente L. acidophilus.

[036] É um objeto adicional o uso das microparticulas simbióticas para preparação de produtos alimentícios.

[037] As microparticulas simbióticas são geradas através da associação entre alginato (A), gelatina (G), preferencialmente do tipo A, e xilo-oligossacarideos (XOS) obtidos da hidrólise da palha de cana de açúcar, realizada por enzima endoxilanase recombinante expressa em Píchía pastoris GS115.

[038] O processo de produção de microparticulas simbióticas compreende a obtenção de XOS, um probiótico de alto valor agregado, a partir de um resíduo agroindustrial, fazendo uso de ferramenta de engenharia genética, o que eleva a viabilidade industrial do processo. O emprego de enzima recombinante torna o processo mais viável economicamente, por permitir que seja empregado em maior escala. Além disso, a hidrólise enzimática é realizada em condições brandas, com mínima produção de componentes inibitórios e priorizando a conversão de XOS.

PRÉ-TRATAMENTO DA PALHA DE CANA DE AÇÚCAR

[039] A palha, um dos mais abundantes subprodutos do processamento da cana-de-açúcar, geralmente é utilizada na coprodução de etanol ou devolvida ao solo por falta de utilidade comercial. Portanto, a utilização desta palha para propósitos industriais possui grande importância económica.

[040] No desenvolvimento de processo de produção de biomoléculas a partir de subprodutos agroindustriais, deve-se atentar ao critério de disponibilidade da matéria prima em termos de conteúdo de xilana vis a vis sua extrabilidade do material.

[041] Os resultados determinados para a composição da palha de cana deacetilada são apresentados na Tabela 2:

[042] 0 material de palha de cana apresenta 96,66% ± 0,02% de matéria orgânica, dos quais 32,42% ± 1,00% hemicelulose, indicando potencial aplicação do material para produção de XOS devido a sua fração rica de xilana. Assim como outros subprodutos agroindustriais, celulose e hemicelulose são os componentes predominantes, constituindo 75,66% ± 1,44% de peso seco

[043] Devido à sua complexa estrutura, a hemicelulose apresenta resistência à hidrólise enzimática. Logo, é crucial a etapa de pré-tratamento para tornar a biomassa menos recalcitrante e permitir o acesso das enzimas.

[044] Uma vez que o principal componente da hemicelulose é a xilana, esta tornou-se matéria prima potencial e apropriada para a produção do prebiótico xilo-oligossacarideo. No processo de obtenção deste prebiótico, a xilana é primeiramente extraída da biomassa pré-tratada por método alcalino, o mais conveniente para recuperação de hemicelulose, combinado ou não com outro método, como o tratamento com vapor. Comparado com reagentes ácidos ou oxidativos, o tratamento alcalino tem se demonstrado o método mais efetivo para quebrar ligações éster entre lignina, hemicelulose e celulose, evitando a fragmentação dos polímeros de hemicelulose.

[045] O pré-tratamento alcalino do material lignocelulósico é eficiente para a remoção dos grupos acetila presentes, os quais são interferentes na obtenção de maiores rendimentos de XOS, além de ser prático, processado em condições brandas e sem geração de componentes tóxicos. A desacetilação tem como objetivo a remoção dos grupos acetila ligados diretamente a cadeia hemicelulósica da palha de cana- de-açúcar, utilizando baixas concentrações de hidróxido de sódio, removendo grupos acetil e diferentes substituições de ácidos urônicos, aumentando a porosidade da biomassa e garantindo melhor disponibilidade de xilana para extração. É realizado a baixas temperaturas e não necessita de reatores complexos.

[046] Outros pré-tratamentos, como o hidrotermal, podem levar a autocatálise da hemicelulose, gerando XOS. Entretanto, deve se ter em mente que a obtenção de XOS por hidrólise aplicando ácido concentrado e/ou sob elevadas temperaturas pode gerar compostos inibitórios indesejáveis. [047] O material lignocelulósico resultante do pré- tratamento alcalino, no caso a palha de cana desacetilada, permite extração mais eficiente de hemicelulose, aumentando os rendimentos para obtenção de xilo-oligossacarideos, por permitir melhor acessibilidade às enzimas xilanolíticas.

[048] Com o objetivo de extrair os grupos acetila presentes na hemicelulose, o método alcalino mostrou-se uma opção ótima de pré-tratamento da biomassa empregada. Portanto,a presente invenção empregou o método de extração alcalina da hemicelulose, seguida de hidrólise enzimática para a produção de XOS a partir de palha de cana de açúcar desacetilada.

[049] A biomassa lignocelulósica pré-tratada de palha de cana-de-açúcar desacetilada, tinha aproximadamente 10% de umidade, e foi triturada em moinho de facas.

[050] Palha de cana desacetilada Mesh 60 foi imersa em água a 60°C por 16 horas em banho agitado. Posteriormente, extraiu- se a hemicelulose com 17 mL de KOH 24% incluindo NaBH41% (m/v) para cada 2g de palha, por seis horas a 35°C em banho agitado. O extraído foi centrifugado a 3200g por 10 minutos seguido de filtração a vácuo em papel Whatman 1. O ponto isoelétrico da xilana foi atingido pela adição de ácido acético glacial até pH 5,0. A hemicelulose foi precipitada pela adição de 10 volumes de etanol frio. O precipitado foi separado, após repouso overnight, por centrifugação a 3200g por 10 minutos, lavado com água destilada para remoção do excesso de etanol, centrifugado novamente e ressuspendido em tampão de acetato de sódio pH 5,3. Amostras foram secas em estufa a 95°C para determinação da massa seca contida na solução e concentração de sólidos.

[051] A recuperação da xilana da palha obtida após extração alcalina aplicando 24% KOH e 1% NaHBH4, seguido de neutralização com ácido acético glacial e precipitação com etanol gelado e repouso overnight, foi de 76,9211,35%. O material utilizado no presente trabalho, devido ao pré- tratamento, possui baixo teor de acetato e ácido urônico, confirmado pela ausência de sinal a 1730 cm ^-1 , no espectro de infra-vermelho (Figura 5), o que contribuiu para uma mais elevada recuperação de xilana.

[052] Pela Figura 5 ilustra-se o espectro infra-vermelho obtido comparativamente para a xilana extraída da palha de cana-de-açúcar e XOS oriundos de sua hidrólise. O perfil observado na região compreendida entre 1200 e 900 cm ^-1 é típico de oligômeros e polímeros de arabinoxilanas com baixo grau de ramificação, indicado pela presença de pico a 968 cm ^-1 (ROBERT et ai., 2005).

[053] A presença de cadeias laterais de arabinose é evidenciada pelo pico a 1161 cm ^-1 , que corresponde ao alongamento C=0 e C-O-C com contribuições de hidroxilas (PENG et ai., 2009). O máximo de absorção a 1045 cm ^-1 é indicativo das ligações glicosídicas típicas de xilanas, sendo o pico a 894 cm ^-1 característico do domínio das ligações glicosídicas tipo b entre as unidades de açúcar. A ausência de sinal a 1730 cm ^-1 , característico de grupo carbonila, implica a ausência de grupos acetil, removidos durante o pré-tratamento da palha e clivados durante a extração alcalina da hemicelulose.

[054] No material extraído, não foram detectados níveis de açúcares redutores. Após a caracterização, a pureza de hemicelulose da massa extraída foi de 88,6%, sendo 75,10±0,65% referente às unidades de xilose e 13,50±0,79% arabinose, além disso foi identificado um teor de 5,01±0,53% de glicose referente a decomposição de lignina, e massa remanescente de cinzas. Sabe-se que esta glicose é oriunda de lignina pois no processo de extração, a celulose não é solúvel em hidróxido de potássio. Embora o álcool não precipite a lignina, as ligações éster e éter entre os as cadeias de xilana e lignina fazem com que uma pequena fração de lignina seja extraída juntamente com a xilana.

[055] A metodologia de extração de xilana que consistiu em separar em duas etapas distintas, neutralização e precipitação, permitiu um aumento de 50% para 98% do rendimento de extração da massa total de hemicelulose. A adição de ácido acético separadamente do etanol gelado garante atingir o exato ponto isoelétrico da xilana, que varia com a fonte, otimizando sua precipitação. Portanto, a xilana obtida da palha de cana por extração alcalina permitiu elevada recuperação de xilana livre de açúcares redutores, comprovando potencial para obtenção de xilo-oligossacarídeos.

EXPRESSÃO HETERÓLOGA E HIDRÓLISE ENZIMÁTICA

[056] Devido à natureza heterogénea do substrato, a hidrólise enzimática da hemicelulose requer a ação de um repertório enzimático com diversas especificidades e modos de ação.

[057] O sistema de hidrólise da xilana é composto por um complexo de enzimas hidroliticas (O-glicosidases hidrolases, EC 3.2.1.x), que agem cooperativamente na conversão da xilana: b-l,4-endoxilanase (E.C.3.2.1.8), b-xilosidase (E.C. 3.2.1.37), acetilxilanaesterase (EC 3.2.1.72), α- arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55), α-glucuronidase (EC 3.2.1.139), ácido p-coumárico esterase (EC 3.1.1.-) e ácido ferúlico esterase (EC 3.2.1.73).

[058] Entretanto, apenas as endoxilanases agem na cadeia principal da xilana, hidrolisando ligações b-1,4 entre os resíduos de xilose em xilo-oligossacarídeos variados.As demais enzimas apresentam função cooperativa na hidrólise total da cadeia de xilana.

[059] Logo, apesar de todo o complexo enzimático exercer importante papel na hidrólise da xilana, as endoxilanases apresentam maior potencial para obtenção de xilo- oligossacarídeos por atuarem na cadeia principal da xilana.

[060] A expressão heteróloga em leveduras proporciona vantagens em relação a expressão em bactérias ou fungos filamentosos, como capacidade de crescimento em densidades celulares elevadas e capacidade de secreção da enzima recombinante no meio de cultura, facilitando o processo de purificação. Além disso, não possuem toxinas e são reconhecidamente seguras (GRAS, generally recognized as safe) pela Food and Drug Administration (FDA).

[061] A levedura Píchía pastoris é considerada um excelente hospedeiro para expressão heteróloga, devido a: eficiência em secreção; elevada densidade celular alcançada em meio de cultura, o qual é de baixo custo; similaridade de técnicas necessárias para a manipulação genética com as técnicas empregadas em Saccharomyces cerevisiae, o modelo melhor caracterizado e já estabelecido como um organismo industrial; e aumento de escala industrial relativamente fácil.

[062] Devido ao rápido crescimento, meio de cultura barato e seu elevado grau de secreção de proteínas recombinantes no meio de fermentação, P. pastoris se tornou um sistema viável de expressão heteróloga, produzindo proteínas recombinantes funcional e estruturalmente corretas.

[063] Dessa forma, para a presente invenção a P. pastoris foi selecionada e a expressão heteróloga do gene XynlOCf foi realizada de forma constitutiva em Pichia pastoris (Komagataella phaffii) linhagem GS115, sendo Zeocina usado como marcador de seleção. Foi utilizado o vetor pGAPZaA (Invitrogen), contendo o sinal de secreção fator-a (peptídeo N-terminal de Saccharomyces cerevisiae), e cauda de poli- histidina (6xHis) no peptídeo C-terminal, para auxiliar, caso fosse o caso, na purificação das proteínas de fusão recombinantes .

[064] O preparo das células competentes de P. pastoris e a transformação foram realizados de acordo com o protocolo proposto pelo fabricante (Invitrogen). Em síntese, 40 μL de células foram misturados com 5 pg de plasmídeo linearizado com a enzima BspHI (5 ^' ...T ^{^} CATGA...3 ^' , New England Biolabs) e purificado por diálise com filtro de membrana de PVDF 0.45pm

Millipore em cubetas de 0,2 cm geladas, e mantidos em banho de gelo por cinco minutos.

[065] A eletroporação foi realizada no equipamento Gene Pulser (BioRad), utilizando os parâmetros 2000 V, 25 pF e 200 W. Após transformação, as células foram rapidamente ressuspendidas em 1 mL de sorbitol 1 M gelado e incubadas a 30°C por duas horas. Aliquotas de lOOpL foram plaqueadas em YPDSA (1% extrato de levedura, 2% peptona, 2% glicose, 1M sorbitol, 2% ágar) contendo 100 pg/mL de Zeocina.

[066] Após 2 dias de incubação a 30°C, algumas colónias foram isoladas em novas placas YPDSA 100 pg/mL de Zeocina. A confirmação da transformação foi determinada pela presença de atividade enzimática da endoxilanase recombinante pelo ensaio de hidrólise com xilana de bétula.

[067] A seleção do melhor clone foi realizada pela quantificação da atividade enzimática, por screeníng em caldo YPD (1% extrato de levedura, 2% peptona, 2% glicose), utilizando Erlenmeyers aletados, e a atividade enzimática ao longo do tempo de incubação do melhor clone selecionado foi analisada em meio YPD e YPG (1% extrato de levedura, 2% peptona, 2% glicerol).

[068] A produção da enzima recombinante foi realizada empregando o clone transformado selecionado por atividade enzimática, em batelada alimentada no biorreator de mistura

BioFlo III® (New Brunswick Scientific), utilizando dorna de

3L. [069] O inoculo foi crescido em Erlenmeyer aletado de 500mL contendo 50mL de meio YPD (1% Extrato de Levedura, 2% Peptona, 0,00004% Biotina, 2% Glicose), a 30°C e 200RPM overnight.

[070] Atingida a OD600de 4, o inoculo foi transferido para o fermentador contendo 1,2L de meio constituído por 40g/L de Glicose, 20g/L de peptona, lOg/L de extrato de levedura e 5% de antiespumante C, previamente esterilizado a 121°C por 20 minutos. Adicionou-se 0,8% de solução traço de sais (6g/L CuS0 ₄ , 0,08g/L Kl, 3g/L MnS0 ₄ , 0,2g/L Na ₂ Mo0 ₄ , 0,02g/L H ₃ B0 ₃ , 0,5g/L C0CI2, 20g/L ZnCl ₂ , 65g/L FeS0 ₄ .7H ₂ 0, 0,2g/L biotina, 5mL/L H ₂ S0 ₄ 98%) esterilizada por filtração em membrana da Millipore de PES 0,22 μm (XIE et ai., 2005). A batelada foi realizada a 30°C, pH 6,0 controlado por alimentação com hidróxido de amónio 30%, mantendo-se a concentração de oxigénio dissolvido entre 20% e 30% (condição mantida com uma aeração de 0,lvvm de oxigénio).

[071] Após 24h da batelada, foi iniciada a fase de alimentação com 50% m/v de glicose contendo 1,2% v/v de solução traço de sais a uma taxa de 15mL/h.L por 60 horas.

[072] Ao fim do processo, as células foram separadas por centrifugação a 1300g por 5 minutos, e o sobrenadante utilizado na determinação de atividade enzimática.

[073] Após a fermentação em biorreator de bancada, o sobrenadante foi concentrado por ultraf iltração usando ultrafiltro centrífugo Amicon® (Millipore, lOkDa) de acordo com as instruções do fabricante.

[074] A produção de XOS foi obtida empregando a enzima recombinante na concentração de 2U/mL, 1% (m/v) de hemicelulose extraída por álcali de palha de cana de açúcar deacetilada, em pH 5,3, temperatura de 65°C, por 48h. A hemicelulose não convertida foi precipitada com etanol, e o hidrolisado concentrado em rotaevaporador para atingir 3% (m/v) de XOS.

MICROENCAPSULAÇÃO

[075] O sucesso de um processo de encapsulação depende da interação molecular dos polímeros que constituem o material de parede, proporcionando características físico-química adequadas da microestrutura. O conhecimento destas características permite moldar este perfil, de forma a atender as necessidades do produto no qual interessa sua incorporação e desenvolver um processo estável.

[076] Na indústria de alimentos, diversos materiais biopoliméricos vem sendo empregados em sistemas de encapsulação, sejam eles polissacarídeos, proteínas ou lipídeos. A micropartícuia formada por processo químico ou mecânico deve ser capaz de proteger os compostos ativos incorporados e proporcionar sua liberação sob condições específicas, por ação de temperatura, pH, solubilidade no meio, entre outras condições, de forma a garantir que a quantidade adequada do componente ativo seja distribuída em seu sítio de ação (CHEN et al., 2005).

[077] O alginato, polissacarídeo natural de excelente biocompatibilidade, apresenta grupos carboxílicos capazes de formar hidrogéis por interação eletrostática na presença de ions de cálcio, o que o torna um dos biopolimeros mais atraentes para produção de microcápsulas para a liberação sustentada de componentes. Os microgéis podem ser obtidos por extrusão, no qual o contato imediato das partículas com a solução de cálcio promove a formação de géis insolúveis.

[078] A associação com outros polímeros pode promover maior estabilidade da estrutura das micropartícuias, melhorando a capacidade de proteção dos compostos encapsulados, por diminuir o tamanho dos poros da matriz e alterar sensibilidade a alterações de pH.

[079] Alginato e gelatina são associados para produção de matrizes biopoliméricas, uma vez que as ligações de hidrogénio e as interações iônicas da gelatina com as cadeias de alginato proporcionam modificações estruturais favoráveis para o desenvolvimento de matrizes mais resistentes (LI et ai., 2011; DONG, WANG, DU, 2006).

[080] Prebióticos associados a matrizes biopoliméricas se configuram como alternativa para melhorar a estabilidade de micropartícuias por proporcionar modificações estruturais dos géis, atuando na proteção e manutenção de probióticos encapsulados, mantendo a viabilidade celular nos alimentos adicionados e protegendo das condições gastrointestinais do processo de digestão.

[081] Desse modo, o referido processo para produção das micropartícuias compreende essencialmente as etapas de: a) produzir endoxilanase por meio da expressão heteróloga de um gene de forma constitutiva em microorganismo; b) produzir xilo-oligossacarídeos (XOS) por meio da enzima endoxilanase em palha de cana de açúcar desacetilada; e c) Gelificação de uma solução compreendendo alginato, gelatina e XOS obtido da etapa (b) para encapsulação.

[082] Na presente invenção, considerando a etapa (c) de gelificação, verifica-se que a influência da adição de diferentes concentrações de XOS ao sistema biopolimérico constituído por alginato e gelatina foi avaliada para determinação de microgel de maior estabilidade, ao que foi observada uma maior capacidade de formar um sistema com maior equilíbrio e interação molecular, que garanta maior viabilidade celular de probióticos encapsulados durante armazenamento e passagem pelo sistema gastrointestinal.

[083] A micropartícuia simbiótica compreende: 0,5 a 1,5% de alginato; 1,0 a 2,0% de gelatina; 1,0 a 5,0% de xilo- oligossacarídeos; pelo menos 10 ⁶ UFC/g de um probiótico encapsulado; uma fase aquosa majoritária. Este equilíbrio de componentes permite a obtenção de micropartícuias simbióticas com tamanho de poro adequado e forte interação molecular, após finalizado o processo de gelificação, mantendo-se a eficiência de encapsulação.

[084] Para a produção de teste das micropartícuias simbióticas, preferencialmente 1,5% (m/m) de gelatina foi adicionado a água deionizada aquecida a 45°C e mantido sob agitação por 20 minutos, seguido de resfriamento a 25°C antes da adição de preferencialmente 1% de alginato (m/m) e preferencialmente 3% de XOS (m/v). As soluções foram estocadas overnight antes da adição de L. acidophilus. [085] Para o preparo preferencial dos sistemas biopoliméricos foram utilizados gelatina suina Tipo A - Bloom 280, alginato e xilooligossacarideos obtido em uma das etapas do processo da presente invenção. Utilizou-se CaCÍ2 dihidratado para o preparo da solução reticulante. Os demais materiais utilizados foram de grau analítico.

[086] Para a produção da solução biopolimérica preferencial contendo gelatina 1,5% (m/m), o pó de gelatina Tipo A (Bloom 280, Gelco, Pedreira - SP, Brasil) foi adicionado em água deionizada aquecida a 45°C, sob constante agitação por aproximadamente 15 minutos. Posteriormente a solução foi resfriada a temperatura ambiente (25°C) antes da adição de alginato 1% (m/m) e XOS a 3% (m/m). A solução foi mantida sob agitação constante até completa homogeneização e estocada overnight a temperatura ambiente (25°C) antes da caracterização e preparo dos microgéis.

[087] As micropartícuias foram preparadas pelo método de extrusão molecular em atomizador utilizando bico de 0,7mm de diâmetro e bomba peristáltica a preferencialmente 90 RPM. A solução foi atomizada a temperatura ambiente sobre a solução de CaCÍ2 150mM, mantida sob constante agitação. A distância entre o bico do atomizador e a solução de CaCÍ2 foi mantida a aproximadamente 15cm, e a pressão do compressor fixada a preferencialmente 1 bar, com vazão de ar de preferencialmente 0,12m ³ /h. As micropartícuias foram mantidas em CaCÍ2 por aproximadamente meia hora para gelificação, filtradas em peneira de preferencialmente 0,053mm de diâmetro e enxaguadas com água destilada antes de serem transferidas para frascos esterilizados sob armazenamento refrigerado a 4°C preferencialmente .

CARACTERIZAÇÃO DAS MICROPARTÍCULAS

[088] Os resultados apresentados no teste de viabilidade dos microrganismos encapsulados armazenados sob refrigeração ao longo de 28 dias (Figura 1) mostram que matrizes contendo xilo-oligossacarídeos foram mais eficientes para a manutenção da viabilidade de L. acidophilus, em relação a uma matriz compreendendo somente Alginato e Gelatina e uma matriz compreendendo somente Alginato.

[089] Aos 7 dias dos microgeis formulados com 3% XOS observou-se um índice de sobrevivência superior a 100%. A matriz de alginato, gelatina e XOS foi eficiente tanto para proteção, como para manutenção da viabilidade dos microrganismos durante o período avaliado, em relação a uma uma matriz compreendendo somente Alginato e Gelatina, bem como em relação.

[090] Com base nos resultados obtidos da associação de alginato, gelatina e XOS, as micropartícuias simbióticas com a concentração de 3% de XOS foram analisadas por digestão ín vitro, relacionando com o perfil de viabilidade e liberação dos microrganismos.

[091] Micropartícuias de alginato e gelatina se mostraram mais eficientes para a proteção dos microrganismos do ambiente ácido estomacal, como esperado (Figura 2).

[092] Durante a fase intestinal, contabilizou-se gradual aumento de microrganismos no meio externo das micropartícuias, constatando que as mesmas desempenham seu papel na liberação controlada. Quanto à contagem total de organismos, dentro e fora das partículas, foi apresentada ligeira queda na viabilidade celular, sendo que os organismos encapsulados com XOS apresentaram viabilidade superior. Esta queda de viabilidade pode ser atribuída à intolerância a sais biliares (GOMES, MALCATA, 1999) e também à toxicidade do oxigénio presente no ambiente aeróbico no qual foi realizado o ensaio. Um resultado mais realista poderia ser obtido se as amostras fossem incubadas nas mesmas condições anaeróbicas encontradas no trato intestinal.

[093] Notável é o efeito protetor das micropartícuias para garantir que maior quantidade de probióticos chegue viável ao intestino. Entretanto observa-se que neste ambiente em pouco tempo (no tempo 210 minutos) houve total liberação dos organismos. Por ser estritamente dependente do pH, as micropartícuias de alginato possuem elevada taxa de dissolução em meio alcalino, apresentando pouco tempo de retenção para garantir uma liberação mais gradual dos componentes encapsulados .

[094] A avaliação da estrutura formada pela associação de alginato, gelatina e XOS foi realizada com a finalidade de analisar a cristalinidade, interações intermoleculares e porosidade em relação à capacidade de proteção de compostos ativos encapsulados.

[095] A partir dos resultados obtidos por MEV, a adição de XOS à formulação constituída apenas por alginato resultou em uma estrutura com maior porosidade, contudo observou-se diminuição do tamanho dos poros com o incremento da concentração de XOS. Por outro lado, para as formulações de alginato e gelatina, a adição de XOS resultou na diminuição da porosidade, constatando-se que a formulação AGX3 (alginato 1%, gelatina 1,5% e XOS 3%) obteve partículas com a menor porosidade, resultado de uma estrutura mais coesa, em concordância com o difratograma obtido (Figura 3).

[096] A incorporação de gelatina e XOS ao sistema biopolimérico composto por alginato, melhorou a sobrevivência dos L. acidophilus, uma vez que o XOS exerce ação de substrato, contribuindo para manutenção da viabilidade dos probióticos encapsulados. Os resultados obtidos anteriormente para a formulação AGX3 corroboram com o obtido para a viabilidade dos probióticos encapsulados. Na Figura 4, a morfologia da micropartícuia desta formulação pode ser observada.

[097] A eficiência do processo de microencapsulação, a princípio, não depende do tipo ou concentração de prebióticos adicionados, porém, sua presença pode proporcionar variações na resistência e no tamanho das cápsulas, consequentemente afetando o número de células aprisionadas, variações relacionadas a força estrutural devido às interações intermoleculares obtidas entre os polímeros. Para as formulações testadas, a eficiência do processo de microencapsulação não foi afetada pela adição de prebióticos às matrizes, conforme resultados da Tabela a seguir, em que AGX1, AGX3 e AGX5, compreendem 1%, 3% e 5% de xilo- oligossacarideos (XOS):