本発明は、樹状細胞前駆細胞を複数のサイ� ��カインの存在下で培養する工程を含む、樹� ��細胞を製造する方法に関する。当該工程に� ��り、DC前駆細胞を効率的に増幅および/また� ��分化させることができる。本発明の方法は� ��複数のサイトカインを添加した培地中で、D C前駆細胞を培養することにより実施する。� �数のサイトカインとしては、SCFおよびイン� �ーロイキン-3(IL-3)を含むことが好ましく、よ り好ましくはFLT-3リガンド(FLT-3L)またはイン� �ーロイキン-6(IL-6)をさらに含む。すなわち、 FLT-3L、SCF、IL-3、およびIL-6のすべてを添加し� ��培地を好適に用いることができ、患者から� ��取したDCが少なくても、治療効果を得るの� �十分な細胞数のDCを調製することが可能とな る。
 さらに好ましくは、FLT-3L、SCF、IL-3、および IL-6のすべてを添加した培地の存在下で培養� �た工程の後で、(i) GM-CSFおよびIL-4、または  (ii) GM-CSFおよびSCFの存在下で培養する工程を さらに含むことが好ましい。DC前駆細胞を効� ��よくDCへ分化する上で有効である。すなわ� �、患者から採取したDCが少なくても、治療効 果を得るのに十分な細胞数のDCを効率よく調� ��することが可能となる。

 本発明において樹状細胞(Dendritic cell; DC)と は、成熟状態において樹枝状形態をとり、抗 原を提示してT細胞を活性化する能力を持つ� �胞である。また本発明において樹状細胞前� �細胞とは、適当なサイトカイン(すなわちG-CS F、GM-CSF、TNF-α、IL-4、IL-13、SCF (c-kitリガンド )、Flt-3リガンド、またはそれらの組み合わせ )の存在下でDCに分化する細胞を言い、好まし くは4週間以内、より好ましくは20日以内、よ り好ましくは18日以内、より好ましくは16日� �内に樹状細胞に分化できる細胞である。こ� �ような細胞には、CD34 ⁺ 幹細胞、造血始原細胞、骨髄単核球等が挙げ られる。これらの細胞は、例えば細胞画分と して調製することができる。細胞画分とは、 細胞の分離(または分画)により得られた細胞� ��団である。細胞画分は、細胞および薬学的� ��許容される担体を含む組成物であってよい� ��担体としては、生理食塩水、リン酸緩衝生� ��食塩水(PBS)、培養液、血清など、生細胞を� �濁することができる所望の溶液が挙げられ� �。樹状細胞への分化は、例えばSCF (50 ng/ml)� ��GM-CSF (500 U/ml)、TNF-α (50 ng/ml) の存在下で 3日間程度培養後、SCF (50 ng/ml)、GM-CSF (500 U/ ml)、IL-4 (250 U/ml)、TNF-α (50ng/ml) の存在下で 培養することで実施することであってよい。 より好ましくは、GM-CSF(20 ng/ml)およびIL-4(20 n g/ml)の存在下、あるいはGM-CSF(20 ng/ml)およびSC F(10 ng/ml)の存在下で培養する。

 樹状細胞には、生体内各種組織器官に分� ��する骨髄細胞由来の樹枝状形態をとる細胞� ��、および骨髄または血液由来の幹細胞から� ��in vitroでサイトカイン等を利用して分化誘� ��をかけた生体内組織器官に分布する樹枝状� ��態をとる細胞、およびそれと同等の細胞群� ��含まれる。具体的には、樹状細胞には、例� ��ばリンパ球系樹状細胞(Th2への誘導または免 疫寛容を誘導するものであってもよい)、骨� �球系樹状細胞 (一般的に用いられる樹状細� �。未熟樹状細胞および成熟樹状細胞を含む)� ��ランゲルハンス細胞(皮膚の抗原提示細胞で 重要な樹状細胞)、相互連結細胞(リンパ節、� ��臓のT細胞領域にあり、T細胞への抗原提示� �働いていると考えられている細胞)、ろ胞樹� ��細胞(B細胞への抗原提示細胞として重要、� �原と抗体複合体、抗原と補体複合体を抗体� �セプター、補体レセプターにより、樹状細� �上に提示することで、B細胞に抗原提示して� ��る。)などを含むものであり、好ましくは、 MHCクラスIおよびクラスIIを高発現しており、 さらに好ましくはCD11cを発現している細胞で� ��る。本発明においては、より好ましくは、� ��髄または末梢血から回収された細胞からDC� �たはDC前駆細胞が用いられる。またDCの由来� ��る生物種は特に限定されず、ヒト、サルな� ��の霊長類、マウス、ラットなどのげっ歯類� ��ウサギ、ウシ、ヤギなどの哺乳類のDCであ� �てよい。

 また、樹状細胞は、樹枝状形態を有し、CD11 c、HLA-class II (HLA-DR、-DP、または -DQ)、CD40、 およびCD1aからなる群より選択される表面マ� �カーの2つ以上が陽性の細胞であってよい。� ��発明において樹状細胞は、より好ましくは� ��HLA-class II ⁺ およびCD11c ⁺ の細胞、より好ましくはCD1a ⁺ 、HLA-class II ⁺ 、およびCD11c ⁺ の細胞で、かつ系統マーカーが陰性(Lin ^- )、すなわちT細胞マーカー(CD3)、B細胞マーカ� ��(CD19、CD20)、NK細胞マーカー(CD56)、好中球マ� ��カー(CD15)、単球マーカー(CD14)を発現してな� ��細胞である。骨髄球系樹状細胞(Myeloid DC)の 場合、CD11bをさらに発現していることが好ま� ��い。例えば、CD11b ⁺  CD11c ⁺  細胞は、本発明においてDCに含まれる。リ� �パ球系樹状細胞(Lymphoid DC)においては、CD8を さらに発現していてよい。

 また、本発明において樹状細胞には成熟樹� ��細胞および未成熟樹状細胞が含まれる。未� ��熟樹状細胞とは、成熟状態に比べT細胞活性 化能力が有意に低い樹状細胞を言う。具体的 には、未成熟樹状細胞は、LPS (1μg/ml) を添� �し2日間培養して成熟を誘導した樹状細胞に� ��べ、抗原提示能が1/2未満、好ましくは1/4未� ��のものであってよい。抗原提示能は、例え� ��アロT細胞活性化能(混合リンパ球試験;アロT 細胞と樹状細胞の混合培養で、T細胞対樹状� �胞の割り合いは1:10で培養、好ましくはその� ��率を変化させて培養したもので、培養終了8 時間前に ³ H-thymidineを添加し、そのT細胞のDNA内の取込み 量によって、T細胞増殖能力を定量したもの;� ��献 Gene Therapy 2000; 7; 249-254)、あるいはペ� ��チドを用いた特異的細胞傷害性T細胞(CTL)の� ��導能試験(樹状細胞に、ある抗原のあるClass� �I 拘束性の既知のペプチドを添加して、樹� �細胞を採取したのと同じ健常人末梢血のT細� ��を共培養(3日目以降はIL-2を25U/ml、好ましく� ��100U/ml)(好ましくは21日間3回の樹状細胞によ� ��刺激、更に好ましくは14日間2回の樹状細胞� ��刺激)し、得られたエフェクター細胞と ⁵¹ Crでラベルされたターゲット細胞(ペプチドの 拘束性のClass I陽性の腫瘍細胞)を100:1~2.5:1(100 :1、50:1、25:1、20:1、12.5:1、10:1、5:1、または 2 .5:1)、好ましくは10:1 で4時間混合培養してタ ーゲット細胞の ⁵¹ Cr遊出量で定量したもの(文献 Arch Dermatol Res  2000; 292; 325-332))により定量することができ る。また未成熟樹状細胞は、好ましくは抗原 貪食能を持ち、更に好ましくはT細胞活性化� �ための副刺激を誘導する受容体の発現が低� �現(例えば上記のようにLPS誘導した成熟DCに� �べ有意に)あるいは陰性である。一方で、成� ��樹状細胞とはT細胞活性化などの為の抗原提 示能力が未成熟状態に比べて有意に高い樹状 細胞を言う。具体的には、成熟樹状細胞は、 LPS (1μg/ml) を添加し2日間培養して成熟を誘� ��した樹状細胞の抗原提示能の1/2以上、好ま� ��くは同等以上の抗原提示能を持つ細胞であ� ��てよい。また成熟樹状細胞は、好ましくは� ��原貪食能が低いか、または持たず、更に好� ��しくはT細胞活性化のための副刺激を誘導す る受容体の発現が陽性のものをいう。また、 樹状細胞の活性化とは、未成熟樹状細胞から 成熟樹状細胞への移行を言い、活性化樹状細 胞には、成熟樹状細胞、および、活性化刺激 により副刺激を誘導するCD80、CD86の発現を上� ��させている途中経過の樹状細胞が、その範� ��に含まれる。

 成熟ヒト樹状細胞は、CD40、CD80、CD86およ� ��HLA-class IIの発現が陽性の細胞である。例え ば、CD80、およびCD86からなる群より選択され� ��マーカーを基に、未成熟樹状細胞と成熟樹� ��細胞を見分けることができる。未成熟樹状� ��胞ではこれらのマーカーは弱いか、好まし� ��は陰性であるが、成熟樹状細胞では陽性で� ��る。

 上記のように、未成熟樹状細胞は、通常� ��高い貪食能を保持している。樹状細胞にLPS� �(1μg/ml) を添加し2日間培養すると、樹状細� �は活性化され貪食能は低下する。貪食能は� �樹状細胞内への小分子の取り込み量または� �り込み細胞の割合を測定して知ることがで� �る。好ましくは、貪食能は、樹状細胞内へ� �小分子の取り込み量で決定される。例えば� �直径 1μm程度の着色ビーズを用いて、樹状� �胞内へのビーズの取り込みを測定すること� �できる。4℃で陽性となるバックグランドを� ��し引いて定量する。高い貪食能とは、樹状� ��胞内への小分子の取り込み量が、樹状細胞� ��上記のようにLPS (1μg/ml) で2日間刺激した� �状細胞の4倍以上、より好ましくは5倍以上、 より好ましくは6倍以上の貪食能を言う。あ� �いは、小分子の取り込み細胞の割合が2倍以� ��、より好ましくは3倍以上である。低い貪食 能とは、樹状細胞内への小分子の取り込み量 が、LPS (1μg/ml) で2日間刺激した樹状細胞の4 倍未満、より好ましくは2倍未満、より好ま� �くは1.5倍未満である。あるいは、小分子の� �り込み細胞の割合で測定した場合に、2倍未� ��、より好ましくは1.5倍未満である。

 成熟樹状細胞の判別は当業者が通常行っ� ��おり、上記の各マーカーおよびその発現の� ��定方法も当業者に周知である。例えばCD11c� �約150 kDの接着糖蛋白 (p150, インテグリンα� ��) である。CD11cはCD18と結合してCD11c/CD18複合 体を形成し、フィブリノーゲンへの結合力を 有し、また、iC3bおよびICAM-1の受容体となる� �とが報告されている。また、CD11c/CD18は刺激� ��受けた上皮の受容体に結合する接着分子と� ��て働きうることが報告されている(Knapp, W.  et al., eds., 1989, Leucocyte Typing IV: White Cell� �Differentiation Antigens, Oxford University Press, New  York; Barclay, N.A. et al., eds., 1993, The Leucoc yte Antigen FactsBook, CD11 Section, Academic Press I nc., San Diego, California, p. 124; Stacker, S.A. an d T.A. Springer, 1991, J. Immunol. 146:648)。

 CD1aは約49 kDのポリペプチドでβ 2ミクロ� ��ロブリンと結合する。CD1aはMHC class I抗原� �構造的に類似しており、抗原提示に機能す� �とみなされる(Knapp, W. et al., eds., 1989, Leuc ocyte Typing IV: White Cell Differentiation Antigens,� �Oxford University Press, New York; Schlossman, S. et  al., eds., 1995, Leucocyte Typing V: White Cell Di fferentiation Antigens. Oxford University Press, New Y ork; Hanau, D. et al., 1990, J. Investigative Dermat ol. 95: 503; Calabi, F. and A. Bradbury., 1991., Ti ssue Antigens 37: 1)。

 CD11bは、インテグリンαM鎖、Mac-1、CR3、iC3 bR(complement receptor type 3)、Mo1とも呼ばれる、 分子量が約165~約170のI型膜貫通糖蛋白質であ� ��。補体 (iC3b)、フィブリノーゲン、凝固因� �X のレセプターとして機能し、食細胞運動� �関与する(Todd R.F. et al. J. Immunol.,126,1435-144 2 (1981); Leong A.S.Y. Appl. Immunohistochem. Surg. P athol.,120-128 (1993); Todd R.F. et al. Hybridoma, 1,  329-337 (1982); Cobbold S. et al. Leucocyte Typing� �III, 788-803 (1987); Keizer G. et al. Eur. J. Immu nol., 15,1142-1148. (1985); Laffon A. et al. J.Clin.� �Invest., 88, 546-552 (1991); Acevedo A. et al. J.  Invest. Dermatol., 97, 659-666 (1991))。

 CD11c(インテグリンαXサブユニット、もし� ��はp150白血球表面抗原)は、インテグリンフ� �ミリーの分子であり、他の白血球インテグ� �ン(CD11a、CD11b、CD11d)と同様に、インテグリン β2サブユニット(CD18)と非共有結合的に結合し ている。CD11cは、分子量145-150kDaの膜貫通糖タ ンパクで、樹状細胞のマーカーとしてよく知 られている(Molica S. et al. Blood, 81, 2466 (199 3); Van der Vieren M. et al. Immunity, 3, 683-690  (1995); Hogg N. et al. Leucocyte Typing III, 576-602  (1987))。

 CD14は53-55 kDのグリコシルホスファチジル イノシトール (GPI) アンカー型単鎖糖蛋白で 、細網樹状細胞およびある種のランゲルハン ス細胞で発現する。CD14はLPSと血清LPS結合蛋� �質 (LPB) の複合体に対する高親和性の表面� �容体として同定された(McMichael, A.J. et al.,  eds., 1987, Leucocyte Typing III: White Cell Differen tiation Antigens, Oxford University Press, New York;  Knapp, W. et al., eds., 1989, Leucocyte Typing IV:  White Cell Differentiation Antigens, Oxford University� �Press, New York; Schlossman, S. et al., eds., 1995,  Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antig ens. Oxford University Press, New York; Wright , S.D . et al., 1990, Science 249:1434)。

 CD40は45-48 kDのI型膜嵌入型蛋白質(type I inte gral membrane glycoprotein)であり、抗CD40抗体は細 胞マーカーとしてよく使用されている(Schlossm an, S. et al., eds., 1995, Leucocyte Typing V: Whit e Cell Differentiation Antigens. Oxford University Pre ss, New York; Galy, A.H.M.; and H. Spits, 1992, J.� �Immunol. 149: 775; Clark, E.A. and J.A. Ledbetter,  1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 4494; Itoh, H. et� �al., 1991, Cell 66: 233; Barclay, N.A. et al., 199 3, The Leucocyte Antigen Facts Book., Academic Press) 。
 CD80は約60 kDの膜貫通型糖蛋白であり Ig sup ergene familyの一員である。CD80はT細胞で発現� �るCD28およびCD152 (CTLA-4) のリガンドである(S chlossman, S. et al., eds., 1995, Leucocyte Typing V : White Cell Differentiation Antigens. Oxford Universi ty Press, New York; Schwarts, R.H., 1992, Cell 71:  1065; Azuma, M. et al., 1993, J. Exp. Med. 177: 84 5; Koulova, L. et al., 1991, J. Exp. Med. 173: 759 ; Freeman, G.J. et al., 1998, J. Immunol. 161: 2708 ; Behrens, L. et al., 1998, J. Immunol., 161(11):594 3; Guesdon, J.-L. et al., 1979, J. Histochem. Cytoch em. 27: 1131-1139)。

 CD83は約45 kDの膜貫通蛋白質でIg superfamilyの 一員である。CD83は短鎖のV型Igの細胞外ドメ� �ンとC末の細胞質tailを持つ。CD83は主にろ胞� �状細胞、循環樹状細胞、リンパ組織の相互� �結 (interdigitating) 樹状細胞、in vitroで生成� �せた樹状細胞、および胸腺樹状細胞に発現� �る(Zhou, L-J., and T.F. Tedder, 1995, J. Immunol.  154. 3821; Zhou, L-J. et al., 1992, J. Immunol. 149 : 735; Summers, K.L. et al., 1995, Clin Exp. Immuno l. 100:81; Weissman, D. et al., 1995, Proc. Natl. A cad. Sci USA. 92: 826; Hart, D.N.J., 1997, Blood 90 : 3245)。
 CD86 (B70/B7-2) は約75 kDの細胞表面蛋白質でC D28およびCTLA-4の第2のリガンドであり初期免� �応答におけるT細胞の副刺激に重要な役割を� ��つ(Azuma M. et al., 1993, Nature 366: 76; Nozawa� �Y. et al., 1993, J. Pathology 169: 309; Engle, P.� �et al. 1994., Blood 84: 1402; Engel, P. et al., C D86 Workshop Report. In: Leukocyte Typing V. Schlossm an, S.F. et al. eds., 1994, Oxford University Press;  Yang, X.F. et al., 1994, Upregulation of CD86 anti gen on TPAstimulated U937 cells, 1994, (abstract). Am erican Society of Hematology, Nashville, TN; Guesdon,� �J.-L.et al., 1979, J. Histochem. Cytochem. 27: 1131- 1139)。

 CCR7はBLR-2、EBI-1、およびCMKBR7とも呼ばれ� �7回膜貫通型G蛋白質結合受容体であり、CCケ� ��カインである MIP-3β/Exodus 3/ELC/CCL19 および  6Ckine/Exodus 2/SLC/TCA4/CCL21 の受容体である(Sal lusto, F. et al., 1999, Nature 401:708-12; Lipp, M.� �et al., 2000, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 251:173 -9; Birkenbach, M.et al., 1993, J. Virol. 67:2209-20;  Schweickart, V. L. et al., 1994, Genomics 23:643-50 ; Burgstahler, R. et al., 1995, Biochem. Biophys. Re s. Commun. 215:737-43; Yoshida, R. et al., 1997, J.� �Biol. Chem. 272:13803-9; Yoshida, R. et al., 1998,  J. Biol. Chem. 273:7118-22; Yoshida, R. et al., 1998 , Int. Immunol. 10:901-10; Kim, C. H. et al., 1998,  J. Immunol. 161:2580-5; Yanagihara, S. et al., 1998 , J. Immunol. 161:3096-102)。

 HLA-class IIはDR, DP, およびDQがあり、その 全てに結合する抗体により網羅的に検出する ことができる(Pawelec, G. et al., 1985, Human Imm unology 12:165; Ziegler, A. et al., 1986, Immunobiol.  171:77)。HLA-DRはMHCのヒトclass II抗原の1つでα 鎖 (36 kDa) とβサブユニット (27 kDa) から� �る膜貫通糖蛋白質である。表皮のランゲル� �ンス細胞ではCD1a抗原と共発現する。CD1aは抗 原提示において細胞の相互作用に主要な役割 を果たす(Barclay, N.A. et al., 1993, The Leucocyte  Antigen Facts Book. p. 376. Academic Press)。

 上記のマーカー遺伝子およびそれらの相� ��遺伝子産物を指標に、ヒトおよびヒト以外� ��哺乳動物に関して樹状細胞を特定すること� ��できる。これらのマーカーに対する抗体は� ��例えばBD Biosciences社(BD PharMingen)より入手す ることができ、その詳細は同社または販売代 理店のウェブサイトで知ることができる。

 また、樹状細胞マーカーに関しては、以� ��のKiertscherらおよびOehlerらの文献も参照のこ と(Kiertscher SM, Roth MD, Human CD14+ leukocytes ac quire the phenotype and function of antigen-presenting  dendritic cells when cultured in GM-CSF and IL-4,  J. Leukoc. Biol., 1996, 59(2):208-18; Oehler, L. et  al., Neutrophil granulocyte-committed cells can be dri ven to acquire dendritic cell characteristics., J. Ex p. Med., 1998, 187(7):1019-28)。また、フローサイ トメトリーに関しては、Okanoら、およびStites� ��の文献を参照することができる(Okano, S. et� �al., Recombinant Sendai virus vectors for activated  T lymphocytes., Gene Ther., 2003, 10(16):1381-91; Stit es, D. et al., Flow cytometric analysis of lymphocyt e phenotypes in AIDS using monoclonal antibodies and� �simultaneous dual immunofluorescence., Clin. Immunol.  Immunopathol., 1986, 38:161-177)。各マーカーの発� �については、例えば、isotype control antibodyで 染色した時に、陽性率が1%以下の蛍光強度を� ��界として、それ以上は陽性、それ未満は陰� ��と判断される。

 樹状細胞またはその前駆細胞の調製は、公� ��の方法に従ってまたは準じて行うことがで� ��る。例えば、血液(例えば末梢血または臍帯 血)、骨髄、リンパ節、他のリンパ器官、脾� �、皮膚などから分離することができる(Bishop� �et al., Blood 83: 610-616, 1994; Bontkes, H. J. et  al. (2002) J. Leukoc. Biol. 72, 321-329; Katsuaki,� �S. et al. (1998) CRYOBIOLOGY 37, 362-371; Ladan, K.  et al. (2006) Stem Cells 24, 2150-2157; Ueda, T.  et al. (2000) J. Clin. Invest. 105: 1013-1021)。好� ��しくは、樹状細胞は、本発明に使用するた� ��に血液または骨髄から得られる。また、本� ��明で用いられる樹状細胞は、皮膚のランゲ� ��ハンス細胞、輸入リンパ管のベール細胞、� ��胞樹状細胞、脾臓の樹状細胞、およびリン� ��器官の指状突起細胞などであってもよい。� ��た本発明で用いられる樹状細胞は、CD34 ⁺ 由来樹状細胞、骨髄由来樹状細胞、単球由来 樹状細胞、脾細胞由来樹状細胞、皮膚由来樹 状細胞、濾胞樹状細胞、および胚中心樹状細 胞からなる群から選択される樹状細胞が含ま れる。DC前駆細胞としては、特に骨髄または� ��梢血から得られた造血幹細胞または造血始� ��細胞等が好ましい。造血幹細胞または造血� ��原細胞は、市販のキットなどを用いたネガ� ��ィブセレクションや、CD34 ⁺  などのポジティブセレクションにより単離� ��ることができる(米国特許出願 08/539,142参照 )。例えば、磁気ビーズ、蛍光ラベルによる� �ーティング、ビオチンまたはアビジン結合� �体等により、表面抗原を利用した細胞の単� �方法が知られている(Berenson et al., J. Immunol . Meth., 91:11, 1986; WO 93/08268)。

 DCやDC前駆細胞とそれ以外の細胞とを含む 組成物からDCやDC前駆細胞を選択(または濃縮) する場合は、DCおよびDC前駆細胞以外の細胞� �取り除くいわゆるネガティブ選択を実施す� �ことが好ましい。ネガティブ選択を用いる� �とにより、DC-granulocytesのprecursor(J. Exp. Med.,� �1998, 187: 1019-1028; Blood, 1996, 87: 4520-4530) � �除去されずに残り、接着性のCD14細胞から分� ��したDCだけでなく、それらのprecursorから分� �したDCをあわせて回収することが可能と考え られる。これにより、DCにベクターを導入す� ��際などにおける細胞障害性を軽減すること� ��期待できる。

 例えば、T細胞、NK細胞、B細胞などに特異 的な抗体を用いて、これらの細胞を取り除く ことにより、DCを濃縮することが可能である� ��具体的には、例えば、CD2、CD3、CD8、CD19、CD5 6、CD66bから選択される表面マーカーまたはそ の任意の組み合わせの発現がlowまたはnegative� ��細胞を得ることが好ましい。より好ましく� ��、CD2、CD3、CD8、CD19、CD56、およびCD66bの全て がlowまたはnegativeの細胞である。そのために� ��これらのマーカーに対する抗体を用いて、� ��れらのマーカーを発現する細胞を除去する� ��よい(Hsu et al. (1996) Nature Med. 2: 52)。な� �、ネガティブ選択においては多価抗体を用� �て行うことができるし、あるいは磁気細胞� �離 (MACS) のためにビーズ等を用いても、同� ��のセレクションを実施することが可能であ� ��。血球分離等を用いて単核球を採取するな� ��、細胞を大量に調製する場合は、ビーズを� ��いることが好ましい。例えば生体から得た� ��胞溶液から単球をエンリッチし、これに対� ��てネガティブ選択を行って調製したDC前駆� �胞を本発明において好適に用いることがで� �る。

 樹状細胞の具体的な単離方法は、例えば� �Cameron et al., 1992, Science 257: 383、Langhoff et  al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7998、C hehimi et al., 1993,J. Gen. Viol. 74: 1277、Cameron� �et al., 1992, Clin.Exp.Immunol. 88: 226、Thomas et  al., 1993, J. Immunol. 150: 821、Karhumaki et al.,  1993, Clin.Exp.Immunol. 91: 482 などに記載されて いる。また、フローサイトメトリーによる樹 状細胞の単離については、例えば、Thomas et  al., 1994, J.Immunol. 153: 4016、Ferbas et al., 1994 , J.Immunol. 152: 4649、および O'Dohelrty et al.,� �1994, Immunology 82: 487 に記載されている。ま た、磁気細胞選別については、例えば Milteny i et al., 1990, Cytometry 11: 231-238 に記述され ている。

 また、例えばヒト樹状細胞の単離および増� ��に関しては、Macatonia et al., 1991, Immunol. 74 : 399-406、O'Doherty et al., 1993, J. Exp. Med. 178 : 1067-1078、Markowicz et al., 1990, J. Clin. Invest . 85: 955-961、Romani et al., 1994, J. Exp. Med. 1 80: 83-93、Sallusto et al., 1994, J. Exp. Med. 179:  1109-1118、Berhard et al., 1995, J. Exp. Med. 55:� �1099-1104 などに記載の方法を用いてもよい。 また、骨髄、臍帯血、または末梢血等から得 られるCD34 ⁺ 細胞および末梢血由来の単核細胞からの樹状 細胞形成については Van Tendeloo et al., 1998,� �Gene Ther. 5: 700-707 に記載の方法を用いて実 施してもよい。

 DC前駆細胞は、1または複数のサイトカイ� ��を含む培地中で増幅される。例えば、IL-3単 独でも約10日にわたりDC前駆細胞を増幅する� �とが可能である。しかし、より長期に渡る� �幅は、IL-3単独では見られない。本発明者ら� ��、SCFおよびIL-3を含む培地でDC前駆細胞を培� ��することにより、極めて高い効率でDCへの� �化能を持つ細胞を増幅できることを見出し� �。従って、2週以上の増幅にはIL-3とSCFの組合 せることが好ましい。特に、FLT-3L、SCF、IL-3� �およびIL-6の4種のサイトカインを含む培地で DC前駆細胞を培養することにより、DCへの高� �分化能を持つDC前駆細胞を大量に得ることが できる。本発明は、IL-3およびSCFを含みFLT-3L� �よびIL-6を含まない培地、FLT-3L、SCF、およびI L-3を含みIL-6を含まない培地、あるいはSCF、IL -3、およびIL-6を含みFLT-3Lを含まない培地でDC� ��駆細胞を増幅する工程を含む、DCの製造方� �に関する。また本発明は、FLT-3L、SCF、IL-3、� ��よびIL-6を含む培地、例えばそれらを含み、 G-CSF、GM-CSF、IL-4、およびTNF-αから選択される 1つ以上(またはそれらの任意の組み合わせ)の サイトカインを有意に含まない培地でDC前駆� ��胞を増幅する工程を含む、DCの製造方法に� �関する。

 FLT-3L (Fms様チロシンキナーゼ3リガンド)� �、Flt-3のリガンドであり、造血系前駆細胞の 分化、増殖を促す (Namikawa R. et al., BLOOD 87 : 1881-1890, 1996)。EP 0627487 A2およびWO 94/2839� �記載されている一群のポリペプチドは、本� �明においてFlt-3Lに含まれる。ヒトFLT-3L cDNA� �、accession number ATCC 69382 としてAmerican Type� �Culture Collection (ATCC) より入手できる。SCFは 、c-kitリガンド、マスト細胞増殖因子(MGF)、� �たはスチール因子とも呼ばれる(Zsebo et al.,� �Cell 63: 195-201, 1990; Huan, E. Cell 63: 225-233;� �Williams, D.E., Cell 63: 167-174, 1990; Toksoz. D e t al, PNAS 89: 7350-7354, 1992)。SCFとしては、EP� �423,980 に記載されているポリペプチドが含� �れる。

 IL-3は、活性化T細胞、肥満細胞、好酸球� �よって産生される造血因子である。本発明� �おいてIL-3には、米国特許第5,108,910号に記載� ��れているIL-3ポリペプチドが含まれる。ヒト IL-3蛋白質をコードするDNA配列は、accession num ber ATCC 67747として入手可能である。IL-6はB細 胞の分化誘導因子として発見され、抗体産生 系のみならず、肝における急性期蛋白の生合 成誘導やIL-3との相乗作用に基づく造血幹細� �の増殖促進など多彩な生理活性を有する (Pa ul SR et al., Blood, 1991, 77: 1723-1733)。IL-4は� �にヘルパーT細胞より産生され、T細胞、B細� �および他の血球細胞に広汎な生理活性を有� �る (Mosley et al., Cell 59: 335 (1989); Idzerda e t al., J. Exp. Med. 171: 861 (1990); Galizzi et al ., Intl. Immunol. 2: 669 (1990))。GM-CSFは、マク� �ファージまたは顆粒球を含有するコロニー� �成長を刺激した因子として単離されたサイ� �カインである(米国特許第5,108,910号および5,22 9,496号)。GM-CSFは、顆粒球およびマクロファー ジの前駆細胞の成長および発生に必須の因子 であり、骨髄芽球および単芽球を刺激し分化 を誘導する。

 各サイトカインの濃度は適宜調整してよい� ��、FLT-3Lであれば 5~35 ng/ml、好ましくは 10~3 0 ng/ml、より好ましくは 15~25 ng/ml、より好� �しくは約20 ng/ml である。SCF、IL-3、IL-6につ� ��ては、例えばFS36などのGM-CSF不含の培地を用 いる場合は、3~20 ng/ml、好ましくは 5~15 ng/ml 、より好ましくは 7~12 ng/ml、より好ましく� �約10 ng/ml であるが、これらに限定されない 。培地としては、例えばRPMI1640またはIMDMを用 いることができる。培地には、5~20%、好まし� ��は約10%の血清、好ましくはウシ胎児血清 (F BS) を適宜添加する。DC前駆細胞は、1×10 ⁵  ~ 5×10 ⁵  細胞程度、例えば約2.5×10 ⁵  細胞から培養を開始することができる。好� ��しくは3日~4日ごとに継代する。継代時には� ��2×10 ⁶  /ml 以下の濃度となるように細胞数を調整� �ることが好ましい。ヒトCD34 ⁺ 細胞などの霊長類CD34 ⁺  細胞をGM-CSFとSCFを組み合わせて培養する場� ��は、GM-CSFは例えば 1~500 ng/ml(1~200 ng/ml ま� �は 1~100 ng/ml)、より好ましくは 2~300 ng/ml、 例えば 5~200 ng/ml、好ましくは 10~150 ng/ml、� ��り好ましくは 20~120 ng/ml、より好ましくは� �30~100 ng/ml で用いるとよい。SCFは例えば 0.5 ~500 ng/ml(0.5~100 ng/ml または 0.5~50 ng/ml)、よ� ��好ましくは 1~300 ng/ml、より好ましくは 2~2 00 ng/ml、より好ましくは 5~100 ng/ml、例えば� �10~70 ng/ml、より好ましくは 例えば 20~60 ng/ ml、より好ましくは 25~50 ng/ml 程度で用いる とよい。

 本発明者らは、DC前駆細胞の増幅期間を� �3~4週間とすることで、その後のDCへの分化効 率を顕著に高められることを見出した。これ より長い期間培養すれば、より多くの細胞を 得ることができるが、DCへの分化効率は低下� ��る。特にFS36培地において5週間増幅させたDC 前駆細胞は、DCへの分化効率が顕著に低下す� ��。従って、例えばFS36などのGM-CSF不含の培地 を用いる場合は、DC前駆細胞の培養期間は約3 週間から約4週間、好ましくは約3週間にする� ��とが好ましく、例えば 18~24日間、より好ま しくは20~22日間培養し、その期間を超えて同� ��サイトカインの組み合わせを含む培地でDC� �駆細胞を増幅させることは避けることが好� �しい。その期間培養した後、以下に記載す� �ようにDC分化培地で培養し、DCを分化させる� ��例えば、FLT-3L、SCF、IL-3、およびIL-6を含む� �地でDC前駆細胞を培養する場合は、上記の期 間培養後、FLT-3L、SCF、IL-3、およびIL-6の全て� ��む培地以外の培地で培養される。

 増幅したDC前駆細胞は、サイトカインに� �りDCに分化させることができる。例えば顆粒 球コロニー刺激因子 (G-CSF)、GM-CSF、腫瘍ネク ローシスファクター (TNF)-α、IL-4、IL-13、SCF(c -kitリガンド)、Flt-3リガンド、またはそれら� �組み合わせなどにより分化させることがで� �る。例えば、GM-CSF不含の培地(FS36など)で増� �させたDC前駆細胞を、GM-CSFおよびIL-4の存在� �、あるいはGM-CSFおよびSCFの存在下でDCに分化 させることが好ましい。TNF-αでさらに刺激す ることにより成熟樹状細胞へと分化させるこ ともできる。本発明においては、好ましくは 、上記の方法に従いGM-CSF不含の培地(FS36など) で増幅したDC前駆細胞を、(i) GM-CSFおよびIL-4� ��または (ii) GM-CSFおよびSCFの存在下で培養� �る。サイトカインの濃度は適宜調整してよ� �が、GM-CSF不含の培地を用いてDC前駆細胞を増 幅した場合は、GM-CSFおよびIL-4については、� �えば 1~500 ng/ml、より具体的には 2~300 ng/ml� ��例えば 5~100 ng/ml、好ましくは 10~50 ng/ml、 より好ましくは 15~25 ng/ml、より好ましくは� ��20 ng/ml である。SCFについては、例えば 1~2 00 ng/ml、より具体的には 2~100 ng/ml、2~80 ng/m l、または 2~60 ng/ml、より具体的には、例え� �� 3~20 ng/ml、好ましくは 5~15 ng/ml、より好� �しくは 7~12 ng/ml、より好ましくは約10 ng/ml� �である。培地としては、例えばRPMI1640または IMDMを用いることができる。5~20%、好ましくは 約10%の血清、好ましくはウシ胎児血清 (FBS)  を適宜添加する。培養期間は、例えば5~15日� �、好ましくは 6~10日、より好ましくは約7日� ��である。FS36で細胞を増幅した場合は、GM-CSF およびIL-4の存在下で分化させるよりも、GM-CS FおよびSCFの存在下で分化させる方が、より� �率的にDCを得ることができる。

 またヒトCD34+ 細胞などのヒトDC前駆細胞ま� ��は他の霊長類DC前駆細胞であれば、上記の� �うにSCFおよびIL-3(S3)、あるいはFS36で増幅し� �くても、(i) GM-CSFおよびIL-4、または (ii) GM- CSFおよびSCFの存在下で培養することにより、 増幅と同時に分化させることが可能である。 この場合、培養期間は1~10週間、例えば 1~6週 間、好ましくは2~5週間、好ましくは3~6週間、 好ましくは3~5週間、好ましくは4~5週間とする 。霊長類CD34 ⁺  細胞としては、例えば臍帯血由来CD34 ⁺  細胞、骨髄由来CD34 ⁺  細胞、および末梢血由来CD34 ⁺  細胞等を用いることができる。

 培養液としては、適宜所望の培地を用いる� ��とができるが、例えば DMEM(Dulbecco's Modified� �Eagle Medium)、MEM(Minimum Essential Medium)、RPMI-164 0、X-VIVO ^TM (Lonza)、IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)等が 挙げられる。最も好ましくは IMDM が用いら� ��る。適宜血清を添加することが好ましく、� ��えば 1~20%(v/v)、より好ましくは 2~20%、より 好ましくは 5~15%、より好ましくは 5~10%(例え ば 約10%)を添加する。血清は、ウシ由来の血 清が好ましく、最も好ましくはウシ胎児血清 (FCS)である。ヒトCD34 ⁺  細胞からiDCを増幅する際には、TNF-αおよび/ またはIL-4を添加しないことが好ましい。例� �ば培地中のTNF-αおよびIL-4濃度は、加える血� ��中に含まれる各濃度と比較して、それを著� ��く超えない範囲、例えば血清(例えば正常FCS )中の各サイトカイン濃度の3、2、または1倍� �下であることが好ましく、好ましくは 1/2以 下、より好ましくは1/3以下、または1/5以下、 具体的には 50 ng/ml以下、好ましくは 40、30� ��20、10、5、3、または 1 ng/ml 以下である。� ��トCD34 ⁺  細胞からiDCを増幅するための培地は、好ま� ��くはサイトカインとしてはGM-CSFおよびSCFの� ��が添加された培地である。培地は、好まし� ��は、サイトカインとしてはGM-CSFおよびSCFの� ��を含み、他のサイトカインを含まない。

 本発明は、GM-CSFおよびSCFを含む、樹状細胞� ��幅用組成物、樹状細胞調製用組成物、樹状� ��胞製造用組成物、樹状細胞増幅用培地、樹� ��細胞調製用培地、および樹状細胞製造用培� ��を提供する。組成物は、適宜滅菌水、緩衝� ��、塩等を含んでもよい。また培地としては� ��上記に記載した培養液などが挙げられるが� ��それらに限定されない。培地は、血清を含� ��でもよいし、含まなくてもよい。また、抗� ��物質を含んでもよいし、含まなくてもよい� ��また本発明は、これらの組成物または培地� ��製造における、GM-CSFおよびSCFの使用にも関� ��る。また本発明は、GM-CSFおよびSCFをキット� ��要素として含む、樹状細胞増幅用キット、� ��状細胞調製用キット、樹状細胞製造用キッ� ��にも関する。当該キットは、培養液(例えば 血清を含まない)または培養液を調製するた� �の粉末(アミノ酸や塩等を含み、血清や抗生� ��質等が含まれていないもの)をさらに含んで もよい。これらの組成物、培地、およびキッ トは、好ましくはヒトを含む霊長類樹状細胞 を増幅、調製、および製造するためのもので あり、より好ましくはヒトを含む霊長類CD34 ⁺ 細胞から樹状細胞を増幅、調製、および製造 するためのものである。これらは、TNF-αおよ び/またはIL-4を含まないことが好ましい。例� ��ば組成物および培地中のTNF-αおよびIL-4濃度 は、血清を含む場合は血清中に含まれる各濃 度と比較して、それを著しく超えない範囲、 例えば血清(例えば正常FCS)中の各サイトカイ� ��濃度の3、2、または1倍以下であることが好� ��しく、好ましくは 1/2以下、より好ましく� �1/3以下、または1/5以下、具体的には 50 ng/ml 以下、好ましくは 40、30、20、10、5、3、また は 1 ng/ml 以下である。血清を含まない場合 は、好ましくはサイトカインとしてはGM-CSFお よびSCFのみを含む。

 本発明の方法に従えば、CD34 ⁺  細胞からDCを例えば 10 ² 倍、好ましくは 0.5×10 ³ 倍、より好ましくは 1×10 ³ 倍、より好ましくは 0.5×10 ⁴ 倍、より好ましくは 1×10 ⁴ 倍、より好ましくは 0.5×10 ⁵ 倍、より好ましくは 1×10 ⁵ 倍、より好ましくは 0.5×10 ⁶ 倍以上に増幅して得ることができる。細胞は 、例えば1週間の培養で5倍、好ましくは6、7� �8、9、10、11、12、または13倍以上の速度で増� ��させることができる。増幅された細胞は、� ��純度でDC(iDC)を含む。増幅された細胞のCD11c� ��性率(全細胞中のCD11c ⁺ 細胞の割合)は、例えば30%以上、好ましくは40 %以上、より好ましくは50%以上、60%以上、70%� �上、75%以上、80%以上、または85%以上である� �また、iDCをLPSまたはPoly(I:C)、あるいはセン� �イウイルス等で処理することにより、成熟DC を得ることができる。

 本発明の方法により得られる樹状細胞は� ��感染症、癌、その他、免疫誘導により有益� ��効果を期待できる所望の疾患の免疫治療に� ��用なDCワクチンとして有用である。例えば� �腫瘍免疫治療に関しては、樹状細胞に腫瘍� �原を提示をさせるために、腫瘍細胞のcell ly sate (細胞溶解物) と混合、ペプチドでパル� �、または樹状細胞に腫瘍抗原遺伝子を導入� �る方法などにより抗原を提示させ、腫瘍に� �するDC治療に用いることができる。

 例えば樹状細胞に腫瘍抗原を遺伝子導入� ��れば、腫瘍ライセートおよびペプチドパル� ��よりもin vivoでの腫瘍抗原提示時間の延長� �期待でき、さらにHLAの制限(ペプチドの場合;  ペプチドは抗原由来のあるペプチドを使用� ��るが、HLAとの結合の関係上、HLAの種類が変� ��れば、その抗原の中の使用するペプチドの� ��位が変化する)などを受けなくなる利点を有 する。

 樹状細胞に遺伝子を導入するベクターと� ��て、プラスミドを導入するリポソーム法、e lectroporationなどある(Cancer Gene Ther 1997, 4, 17 -25)。より実用的なベクターとして、以下の3� ��類のベクターがある。i) アデノウイルスベ クター(J. Immnotherapy 2002; 25; 445-454, Gene ther apy 2000; 7; 249-254)、ii) レトロウイルスベク� ��ー(J. Leuko. Biol., 1999; 263-267., Br. J. Haemato l. 2000; 108; 817-824)、iii) レンチウイルスベ� �ター(J. Gene Med. 2001; 3; 311-320, J. Immunol. M eth. 2002; 153-165, Mol. Ther., 2002; 283-290, Cancer  Gene Therapy 2002; 9: 715-724)。ベクターと樹状 細胞との接触は、in vivoまたはin vitroで行う� ��とができ、例えば培養液、生理食塩水、血� ��、血漿、血清、体液など所望の生理的水溶� ��中で実施すればよい。

 例えばレンチウイルスベクターなどのレ� ��ロウイルスベクターを用いて、CD34陽性の幹 細胞に遺伝子を導入し、その後 in vitroで樹� ��細胞を得ることができる。また、サル免疫� ��全ウイルス (SIV) の場合、helper constructに� �いてvpx(proviral DNAの核内移行を促進する)を� �すことによって、あるいは、HIVでDNA-flapシー ケンスを挿入(これもproviral DNAの核内移行を� ��進する)することによって、末梢血由来単球 及び分化した樹状細胞への遺伝子導入が可能 となった(Mol. Ther. 2002; 283-290)。

 一方、アデノウイルスに関しては、その� ��い導入効率(約80%)と分化した樹状細胞へ直� �遺伝子導入できることから、樹状細胞遺伝� �導入用ベクターとして期待されている(J. Imm notherapy 2002; 25; 445-454)。但し、遺伝子導入� �率を高くするMOIではアロT細胞の混合リンパ� ��反応(mixed lymphocyte reaction; MLR)を低下させ� �免疫抑制作用がある(Gene Therapy 2000; 7; 249-2 54)ので、高MOIでの使用は注意を要する(特に� �いDC:Tの比率で)。また、episomeの希釈のため� �CD34陽性細胞などの幹細胞に遺伝子導入後に� ��状細胞を分化させるよりも、より分化が進� ��だ段階で導入することが好ましい。

 また、上記のウイルスベクターの他に、� ��イナス鎖RNAウイルスなどのRNAウイルスをDC� �導入することも好適である。マイナス鎖RNA� �イルスベクターによる遺伝子導入は非常に� �期間の接触で終了し、100%近い導入効率を得� ��ことができ、しかもアロT細胞応答の抑制程 度は比較的軽度であり、T細胞の刺激性が保� �される(WO2005/042737)。マイナス鎖RNAウイルス� �は、マイナス鎖(ウイルス蛋白質をコードす� ��センス鎖に対するアンチセンス鎖)のRNAをゲ ノムとして含むウイルスであり、ネガティブ 鎖RNAウイルスとも呼ばれる。本発明において 用いられるマイナス鎖RNAウイルスとしては、 パラミクソウイルス(Paramyxoviridae科; Respiroviru s属, Morbillivirus属, Rubulavirus属, および Pneumo virus属等を含む)、ラブドウイルス(Rhabdoviridae� ��; Vesiculovirus属, Lyssavirus属, および Ephemerov irus属等を含む)、フィロウイルス(Filoviridae科) 、オルトミクソウイルス(Orthomyxoviridae科; Infu luenza virus A, B, C, および Thogoto-like viruses� �等を含む)、ブニヤウイルス(Bunyaviridae科; Bun yavirus属, Hantavirus属, Nairovirus属, および Phle bovirus属等を含む)、アレナウイルス(Arenaviridae 科)などの科に属するウイルスが含まれる。

 本発明においてマイナス鎖RNAウイルスは� ��より好ましくは、パラミクソウイルス亜科( レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、お よびモルビリウイルス属を含む)に属するウ� �ルスまたはその誘導体が用いられ、より好� �しくはセンダイウイルスを含むレスピロウ� �ルス属(genus Respirovirus)(パラミクソウイルス� ��(genus Paramyxovirus)とも言う)に属するウィル� �またはその誘導体が用いられる。誘導体に� �、ウイルスによる遺伝子導入能を損なわな� �ように、ウイルス遺伝子が改変されたウイ� �ス、および化学修飾されたウイルス等が含� �れる。例えばF遺伝子欠損型のマイナス鎖RNA� ��イルスは好適である。様々なマイナス鎖RNA� ��イルスにおいて、組み換えウイルスの製造� ��法が知られている(WO97/16539; WO97/16538; Durbin,  A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan,  S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9 2: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J.� �13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 1 4: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Aca d. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995,  EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Gen es Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T.,� �1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elli ott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1 5400-15404)。

 マイナス鎖RNAウイルスベクターの導入効� ��は、樹状細胞が非活性化状態(未成熟状態)� �方が、成熟樹状細胞に対するものよりも有� �に高い。従って、マイナス鎖RNAウイルスベ� �ターは、未成熟樹状細胞に接触、または未� �熟樹状細胞を含む細胞画分と混合すること� �好ましい。樹状細胞は、細菌またはリポポ� �サッカライド(LPS)、二本鎖RNA、またはRNAウイ ルス等との接触により活性化することができ る。遺伝子導入する樹状細胞をこのような方 法で別途活性化させる場合は、活性化してか らベクターを導入してもよいが、ベクターの 導入効率が低下しないようにするため、活性 化の操作をベクターの導入前ではなく、ベク ターにより遺伝子を導入した後(またはベク� �ーを樹状細胞に接触させるのと同時)に行う� ��とが好ましい。

 例えば本発明の方法により増幅したDC前� �細胞を、GM-CSFおよびSCFの存在下で培養してDC に分化させた後に、LPSまたはRNAウイルス等の 存在下で培養することにより、DCを活性化さ� ��る。培養期間は適宜調整してよいが、例え� ��2~7日間である。例えばマイナス鎖RNAウイル� ��などのRNAウイルスは、免疫賦活(腫瘍免疫な ど)に使用するにあたって遺伝子導入に利用� �きることに加え、RNAウイルスの感染自体が� �状細胞の活性化を惹起するため、導入後の� �イトカインなどでの活性化処理の工程が省� �可能で、細胞のviabilityの維持やコスト削減� �さらなるex vivoでの操作時間の削減に寄与す るものと考えられる。また、RNAウイルスベク ターで遺伝子導入された樹状細胞を用いて、 T細胞移入療法に必要な活性化T細胞、特に腫� ��特異的細胞傷害性T細胞などをex vivoで効率� ��く、短期間、簡単に誘導できる(WO2005/042737;W O2006/001122)。

 DCは、適宜薬学的に許容される担体と組� �合わせて組成物とすることができる。担体� �しては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩� �(PBS)、培養液、血清など、生細胞を懸濁する ことができる所望の溶液が挙げられる。また 組成物は、樹状細胞に提示させる抗原ペプチ ドが含まれていてもよい。また、DCをワクチ� ��として使用する場合、ワクチン組成物には� ��免疫原性を高めるために、サイトカイン、� ��レラ毒素、サルモネラ毒素等の免疫促進剤� ��添加することもできる。またワクチンには� ��ミョウバン、不完全Freund'sアジュバント、MF 59 (オイルエマルジョン)、MTP-PE (マイコバク テリア細胞壁由来の muramyl tripeptide)、およ� � QS-21 (soapbark tree Quilaja saponaria 由来)など のアジュバントを組み合わせることもできる 。

 抗原は、抗原とする細胞ライセートとの� ��合、ぺプチドパルス、またはベクターにコ� ��ドさせた抗原遺伝子をDCに導入することに� �りDCに提示させることができる。抗原として は、感染微生物、ウイルス、寄生虫、病原体 、および癌などに関連する所望の抗原が挙げ られる。これらは、構造タンパク質または非 構造タンパク質であってよい。このような抗 原(またはそのプロセスされたペプチド)は、� ��状細胞表面のMHC分子に結合して細胞表面に� ��示され、免疫応答が誘導される。

 ワクチンとして用いる場合、例えば腫瘍、� ��染症、およびその他の一般的な疾患に対し� ��適用することができる。感染症の治療とし� ��は、例えば感染性微生物の抗原蛋白のエピ� ��ープを解析し、これを樹状細胞で発現また� ��提示させることができる。
 例えば病原体由来の抗原としては、A型肝炎 ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイル� ��、デルタ型肝炎ウイルス、乳頭腫ウイルス� ��原、単純ヘルペスウイルス(HSV)、水痘-帯状� ��疹ウイルス(VZV)、エプスタイン-バーウイル� ��、サイトメガロウイルス(CMV)、HIV、および� �ラリアなどが有する蛋白質またはその部分� �プチドが挙げられる(G.L. Mandell et al. (Ed.)  Hinman et al., Principles and Practice of Infectious� �Diseases,3rd Ed., Churchill Livingstone Inc., NY, pp.  2320-2333)。これらの抗原を提示するDCを、感� ��症に対して予防的および治療的に用いるこ� ��ができる。具体的には、例えばインフルエ� ��ザにおいては、強毒株H5N1型等のエンベロー プ、日本脳炎においては、例えば日本脳炎ウ イルスのエンベロープ蛋白質(Vaccine, vol. 17,� �No. 15-16, 1869-1882 (1999))、エイズにおいては� ��例えばHIV gagまたは SIV gag 蛋白質(J. Immuno logy (2000) vol. 164, 4968-4978)、HIVエンベロープ 蛋白質、Nef蛋白質、その他のウイルス蛋白質 などが挙げられる。コレラにおいては、例え ばコレラ毒素のBサブユニット(CTB)(Arakawa T, e t al., Nature Biotechnology (1998) 16(10): 934-8、Ara kawa T, et al., Nature Biotechnology (1998) 16(3): 2 92-7)、狂犬病においては、例えば狂犬病ウイ� ��スの糖タンパク(Lodmell DL et al., 1998, Nature  Medicine 4(8):949-52)、子宮頚癌においては、ヒ トパピローマウイルス6型のカプシドタンパ� �L1(J. Med. Virol, 60, 200-204 (2000))などが挙げ� �れる。また、日本脳炎のJE-E抗原タンパク質( 特開昭64-74982、特開平1-285498)、ヒト単純ヘル� ��スウイルスの gD2タンパク質(特開平5-252965)� ��C型肝炎ウイルス由来ポリペプチド(特開平5- 192160)、仮性狂犬病ウイルス由来ポリペプチ� �(特表平7-502173)などを用いることもできる。� ��えば、これらの病原性微生物に感染した患� ��由来の細胞を解析して、抗原提示細胞(APC)� �おいて提示された抗原蛋白のエピトープを� �定し、これを用いてもよい。HLA型を適宜選� �することにより、所望のHLA型に対するエピ� �ープを同定して用いることも好ましい。

 腫瘍に対する免疫応答を特異的に促進さ� ��るには、1以上の腫瘍抗原を樹状細胞に提示 させる。腫瘍関連抗原は、例えば腫瘍細胞の 粗抽出液を調製したり、または抗原を部分的 に精製することにより得ることができる(Cohen  et al., Cancer Res. 54: 1055 (1994); Cohen et al. , Eur. J. Immunol. 24: 315 (1994); Itoh et al., J.  Immunol. 153: 1202 (1994))。得られた腫瘍抗原� �さらに精製してもよく、また、組み換えペ� �チドとして合成または発現させてもよい。

 精製した樹状細胞に抗原をパルス(暴露)� �DCに抗原を取り込ませると、抗原はDCにより� ��理され、細胞表面に提示される(Germain, R.N.,  Cell 76: 287 (1994))。樹状細胞を抗原でパル� �する多数の方法が知られており、当業者で� �れば、提示させる抗原に応じて適用な方法� �選択することは日常行われている。本発明� �、本発明の方法により製造したDCに抗原を提 示させたものを含む組成物およびその免疫治 療への使用を提供する。本発明の組成物は、 免疫応答を刺激するために、インジェクショ ン、連続点滴、インプラントからの持続的放 出、もしくは他の適当な技術によって投与さ れ得る。典型的には、生理学的に受容可能な 担体、賦形剤もしくは希釈剤とともに、樹状 細胞を含む組成物を投与する。担体としては 、使用される薬量および濃度において投与個 体に有意な毒性が無いものであり、例えば生 理食塩水が挙げられる。

 腫瘍抗原は腫瘍細胞に特異的なもの(すな わち、腫瘍細胞に存在するが、非腫瘍細胞に は存在しないもの)であっても、同じタイプ� �非腫瘍細胞よりも腫瘍細胞に高レベルで存� �するものであってもよい。この樹状細胞を� �与することにより免疫系が刺激される。CTL� �主なエフェクターとして働く場合は、抗原� �しては細胞内外に発現する所望の腫瘍抗原� �用いることができる。樹状細胞を用いて、CD 4 T細胞の活性化から引き続くB細胞の活性化� ��よる抗体産生を惹起し、抗体をエフェクタ� ��として作用させる場合には、抗原としては� ��胞表面に表出するものが好ましく、例えば� ��細胞表面受容体または細胞接着蛋白質を用� ��ることができる。腫瘍抗原の例としては、� ��巣癌等にするMuc-1 または Muc-1様ムチンタ� �デムリピートペプチド(米国特許第 5,744,144� �)、子宮頸癌を引き起こすヒト乳頭腫ウイル� ��蛋白質E6およびE7、メラノーマ抗原MART-1、MAG E-1、-2、-3、gp100およびチロシナーゼ、前立腺 癌抗原PSA、その他にも、CEA(Kim, C. et al., Can cer Immunol. Immunother. 47 (1998) 90-96)、およびHe r2neu(HER2p63-71、p780-788; Eur. J. Immunol. 2000; 30:  3338-3346)などが挙げられる。

 本発明によって調製される樹状細胞は、� ��および感染症に対する有効な免疫療法にお� ��て有用であり、腫瘍抗原もしくは感染症関� ��抗原の遺伝子が導入された樹状細胞または� ��の樹状細胞で刺激されたT細胞による免疫感 作は、患者において抗腫瘍または抗感染症免 疫を誘導する有効な方法となる。本発明は、 本発明の方法により得られた樹状細胞の免疫 反応の誘導における使用にも関する。すなわ ち本発明は、本発明の方法により得られた樹 状細胞の、免疫療法における使用、具体的に は、例えば腫瘍または感染症の治療における 使用に関する。また本発明は、本発明の方法 により得られた樹状細胞の、免疫活性化剤の 製造における使用に関する。すなわち本発明 は、本発明の方法により得られた樹状細胞の 、免疫治療剤の製造における使用、具体的に は、例えば抗腫瘍剤(腫瘍増殖抑制剤)または� ��染症治療薬の製造における使用に関する。

 また、一般病への適用も考えられる。糖� ��病においては、例えばI型糖尿病患者または そのモデル動物において、インシュリン断片 のペプチドをエピトープとして利用すること が考えられる(Coon, B. et al., J. Clin. Invest.,� �1999, 104(2):189-94)。

 DC組成物には、可溶性サイトカイン受容� �もしくはサイトカインまたは他の免疫制御� �子をさらに含んでもよい(Schrader, J.W. Mol. Im munol. 28: 295 (1991))。これらのサイトカイン� �、DC組成物とは別の組成物として調製し、DC� ��同時に、別々に、または逐次的に投与する� ��ともできる。また、樹状細胞からサイトカ� ��ン類を発現させれば、免疫系を刺激して、� ��染微生物または癌に対する免疫応答を高め� ��ことから、サイトカインをコードする遺伝� ��を導入した樹状細胞も、癌やその他のサイ� ��カイン治療が有効と考えられる疾患の治療� ��おいて有用である。免疫刺激性サイトカイ� ��をコードする遺伝子を搭載するベクターが� ��入された樹状細胞は効果的な免疫誘導剤と� ��る。例えば、免疫刺激性サイトカインとし� ��、インターロイキン(例えば、IL-1α、IL-1β、 IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL- 12、IL-15、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-23、IL-27)� ��インターフェロン(例えば、IFN-α、IFN-β、IFN -γ)、腫瘍壊死因子(TNF)、トランスフォーミン グ増殖因子(TGF)-β、顆粒球コロニー刺激因子( G-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF )、GM-CSF、IL-3とGM-CSFを含む融合蛋白質、イン� ��リン様増殖因子 (IGF)-I、IGF-2、Flt-3リガンド 、Fasリガンド、およびc-kitリガンド、CD40リガ ンド (CD40L)、ならびに他の免疫調節タンパク 質(ケモカインおよびコスティミュラトリー� �子など)が含まれる。これらは単独もしくは� ��み合わせて用いられ得る。

 これらのサイトカインのアミノ酸配列は� ��業者には周知であり、IL-4については、例え ば、Araiら (1989)、J. Immunol. 142(1) 274-282、IL-6 については、例えば、Yasukawaら (1987)、EMBO J. 、6(10): 2939-2945、IL-12は、例えば、Wolfら (1991 )、J. Immunol. 146(9): 3074-3081、IFN-αは、例えば 、Grenら (1984) J. Interferon Res. 4(4): 609-617、� ��よびWeismannら (1982) Princess Takamatsu Symp. 12:  1-22、TNFは、例えば、Pennicaら (1984) Nature 31 2: 724-729、G-CSFは、例えば、Hiranoら (1986) Natu re 324:73-76、GM-CSFは、例えば、Cantrellら (1985)� �Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82(18): 6250-6254 を� �照することができる。より具体的には、GM-CS Fをコードする核酸配列としては Accession numb er NM_000758の84~461番目の配列(アミノ酸配列はN P_000749の18~144番目)を含む配列が挙げられる。 IL-4をコードする核酸配列としては、Accession  number NM_000589の443~829番目の配列(アミノ酸配� �はNP_000580の25~153番目)を含む配列が挙げられ� ��。これらのサイトカインをコードする天然� ��遺伝子または遺伝子暗号の縮重を利用して� ��機能的サイトカインをなおコードする変異� ��伝子を含むベクターを設計し、樹状細胞に� ��入することができる。

 また、これらのサイトカインの改変体を� ��現するように遺伝子改変してもよい。例え� ��、前駆体および成熟体の2つの形態を持つサ イトカイン(例えば、シグナルペプチドの切� �により活性フラグメントを生成するもの、� �たは蛋白質の限定分解により活性フラグメ� �トを生成するものなど)について、前駆体ま� ��は成熟体のいずれかを発現するように遺伝� ��改変してもよい。その他の改変体(例えば、 サイトカインの活性フラグメントと異種配列 (例えば、異種シグナルペプチド)との間の融� ��タンパク質)を用いてもよい。

 樹状細胞は、患者自身のT細胞をin vivoで� ��激するのに有用であり、あるいは樹状細胞� ��T細胞をin vitroで刺激するのにも有用である 。感作したT細胞を患者に投与し、エクスビ� �免疫療法を介して患者の免疫系を刺激する� �ともできる。例えば、抗原を提示させた成� �樹状細胞をT細胞に接触させることで、樹状� ��胞により刺激されたT細胞を作り出すことが できる。樹状細胞で提示させる抗原は、ベク ターから発現させた蛋白質(またはそのプロ� �スされた産物)であってもよいし、外から樹� ��細胞にパルスしてもよい。活性化されたT細 胞によりCTLが誘導される。

 また本発明は、本発明の方法により製造� ��た樹状細胞を用いて、免疫系を刺激する方� ��に関する。例えば感染症または癌などに罹� ��した患者において免疫系を刺激する治療を� ��うことができる。この方法は、樹状細胞ま� ��はT細胞を投与する工程を含む方法である。 この方法は、具体的には本発明により製造さ れたDCまたは該DCにより刺激されたT細胞の治� ��上有効量を患者に投与する工程を含む方法� ��ある。樹状細胞に、抗原ペプチドをパルス� ��て、所望の抗原を提示させることで、所望� ��抗原に対する免疫を誘導することができる� ��インビトロでT細胞と樹状細胞を接触させる 場合、患者からT細胞を採取して、エクスビ� �投与を行うことが好ましい。

 DCまたはT細胞を含む組成物の個体への投与� ��は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状� ��投与目的、投与組成物の形態、投与方法等� ��より異なるが、当業者であれば適宜決定す� ��ことが可能である。投与経路は適宜選択す� ��ことができ、例えば罹患部位に投与される� ��とが好ましい。一般的には、筋肉内、腹腔� ��、皮下もしくは静脈内注射、あるいは、リ� ��パ節への直接注入によって注入することが� ��きる。好ましくは皮下、腹腔内注射または� ��ンパ節への直接注入により、患者に投与す� ��。樹状細胞は、一般的には10 ⁵ ~10 ⁹ 細胞、好ましくは10 ⁶ ~10 ⁸ 細胞、より好ましくは約10 ⁷ 細胞を患者に投与することができる。投与回 数は、1回または臨床上容認可能な副作用の� �囲で複数回可能である。投与対象としては� �に制限はないが、例えば、ニワトリ、ウズ� �、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ネコ、ウ� �、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、サル、およびヒ� �などを含む鳥類、哺乳動物(ヒトおよび非ヒ� ��哺乳動物)、およびその他の脊椎動物が挙げ られる。

 樹状細胞は、抗腫瘍剤として有用である� ��例えば腫瘍抗原を提示させた樹状細胞を腫� ��部位に投与することによって、腫瘍の増殖� ��抑制することができる。腫瘍部位とは、腫� ��またはその周囲(例えば腫瘍から5 mm以内、� ��ましくは3 mm以内)の領域を言う。樹状細胞� ��腫瘍に投与する前に、樹状細胞に腫瘍抗原� ��接触させるとより高い効果を得ることがで� ��る。樹状細胞への腫瘍抗原の接触は、樹状� ��胞と腫瘍細胞のcell lysate (細胞溶解物) と� ��混合する方法、腫瘍抗原ペプチドを樹状細� ��にパルスする方法、あるいは樹状細胞に腫� ��抗原遺伝子を導入して発現させる方法など� ��用いることができる。また、IFN-βまたはIFN- β遺伝子を搭載するベクターでDCを処理した� �、あるいは腫瘍に直接注入することにより� �腫瘍効果が増大されることが期待できる。� �えばIFN-β遺伝子を搭載するRNAウイルスベク� �ー(例えばマイナス鎖RNAウイルスベクター)は 、抗腫瘍剤として優れている。RNAウイルスベ クターを導入した樹状細胞の投与と、IFN-β遺 伝子を搭載するベクターの腫瘍部位への注入 を組み合わせれば、より高い抗腫瘍効果が発 揮される。

 樹状細胞により活性化したT細胞を投与する 場合は、例えばT細胞は、1 m ² の体表面積あたり約10 ⁵ ~10 ⁹ 細胞、好ましくは10 ⁶ ~10 ⁹ 細胞、より好ましくは10 ⁸ ~10 ⁹ 細胞の用量で、静脈内注入によって投与され 得る(Ridellら、1992、Science 257: 238-241 を参照) 。注入は、所望の間隔(例えば、毎月)で繰り� ��され得る。投与後のレシピエントは、必要� ��応じて任意の副作用について、T細胞注入の 間または注入後にモニターされてよい。この とき、T細胞は樹状細胞を得た患者と同じ患� �から得ることが好ましい。あるいは、T細胞� ��患者から採取し、T細胞を刺激するために用 いる樹状細胞は、HLA適合性の健常なドナーに 由来してもよい。または逆に、樹状細胞を患 者から採取し、T細胞はHLA適合性の健常なド� �ーに由来してもよい。

 本発明により製造されるワクチンの有効� ��分である樹状細胞を含む細胞は、ヒト体内� ��治療用のワクチンとして接種することから� ��安全性を高めるために細胞増殖性を無くし� ��おくこともできる。例えば、臍帯血由来の� ��球は分化誘導することにより増殖能が極度� ��低下することが知られているが、細胞ワク� ��ンとしてより安全に利用するため、加熱処� ��、放射線処理、あるいはマイトマイシンC(MM C)処理などで処理し、ワクチンとしての機能� ��残したまま、増殖性をなくすことができる� ��例えば、X線照射を利用する場合、総放射線 量1000~3300 Radで照射することができる。マイ� ��マイシンC処理法は、例えば、樹状細胞に25~ 50μg/mlのマイトマイシン Cを添加し、37℃、30 ~60分間保温処理することができる。熱による 細胞処理方法は、例えば、50~65℃で20分間加� �処理を行うことができる。