ACUÍCOLA

Sector Técnico

La presente invención se relaciona con el campo técnico de la biotecnología, más particularmente se refiere a un método para la producción a gran escala de péptidos de interés mediante la expresión de un concatémero que codifica un polipéptido que contiene secuencias en tándem del péptido de interés, y la escisión de dicho polipéptido para la obtención de una pluralidad de copias individuales de dicho péptido de interés. La invención es particularmente útil para la obtención de neuropéptidos con propiedades inmunomoduladoras y antiinflamantorias para uso en la industria acuícola.

Técnica Anterior

Los péptidos son moléculas pequeñas de entre 2 a 50 aminoácidos, que tienen una gran diversidad de importantes funciones in vivo. En peces, existen de manera natural numerosos péptidos que cumplen funciones clave en el crecimiento, inmunidad y reproducción de éstos como, por ejemplo, el polipéptido del adenilato ciclasa de la pituitaria PACAP (38 aminoácidos), la hormona liberadora de la hormona de crecimiento GHRH (44 aminoácidos), el péptido intestinal vasoactivo PIV (28 aminoácidos), el neuropéptido Y NPY (36 aminoácidos) y la grelina (28 aminoácidos), entre otros. También existen péptidos antimicrobianos que actúan directamente sobre los patógenos y péptidos inmunomoduladores que aumentan la respuesta inmune de los peces, los que permiten mejorar la resistencia a enfermedades y aumentan la eficacia de las vacunas cuando estos se agregan a dichas formulaciones.

Debido al pequeño tamaño de los péptidos, éstos no causan respuestas inmunes serias y además se eliminan rápidamente del organismo, por lo que no se acumulan en órganos específicos, lo que minimiza sus posibles efectos secundarios tóxicos en el organismo. Todas estas ventajas hacen que los péptidos sean moléculas atractivas para el desarrollo de terapias y métodos de diagnósticos para la industria acuícola.

Actualmente, los péptidos se pueden obtener fácilmente por síntesis química o mediante tecnología del ADN recombinante, comparado con moléculas proteicas de mayor i tamaño. Sin embargo, el costo de producción y el precio de mercado todavía es alto para comercializar productos de naturaleza peptídica.

Existen además desafíos técnicos que solucionar como la estabilidad de los péptidos recombinantes, rendimientos durante los procesos de expresión y purificación de los péptidos, y el escalamiento industrial del proceso productivo.

En el estado de la técnica existen propuestas de métodos para la producción de péptidos recombinantes. Por ejemplo, el documento de patente WO2013/138850 A1 se refiere a un método para producir péptidos recombinantes de VSDL, que comprende expresar un polipéptido de fusión con repeticiones concateméricas, donde el péptido contiene en su extremo C-terminal sitios de corte enzimático por tripsina. Por otra parte, el documento de patente US 6,558,924 B1 se refiere a un método para producir el péptido C de insulina, que comprende expresar en una célula hospedera un polipéptido multimérico que comprende múltiples copias de dicho péptido, y cortar el polipéptido expresado para liberar las copias del péptido. El polipéptido incorpora sitios de corte entre cada monómero peptídico, el cual puede ser una combinación entre tripsina y carboxipeptidasa B, donde los sitios de corte comienzan o terminan en residuos de arginina. Sin embargo, todos estos documentos utilizan métodos enzimáticos de corte del polipéptido, lo cual aumenta significativamente el costo de la producción de dichos péptidos.

Debido principalmente a la alta demanda que presentan los salmónidos en la actualidad, la industria acuícola se ha visto obligada a desarrollar condiciones de cultivo intensivo a altas densidades de población para alcanzar los altos niveles de crecimiento requeridos por la industria y el mercado. Estas condiciones de cultivo favorecen la presencia de factores de estrés a los que se ven sometidos los peces. Tales factores de estrés pueden desencadenar una cadena de respuestas moleculares, que a su vez pueden suprimir el sistema inmune y aumentar la susceptibilidad de los peces a las enfermedades, disminuir la tolerancia al agua de mar, inhibir el apetito, afectar el crecimiento y/o supervivencia de los peces. Estas condiciones tienen entre otras consecuencias la disminución de la productividad del cultivo y conlleva habitualmente a cuantiosas pérdidas económicas. Por tanto, la optimización de las estrategias de cultivo que involucren la utilización de productos biotecnológicos que potencien el crecimiento, acortando el ciclo productivo, estimulen el sistema inmune del pez y por tanto la resistencia a las enfermedades, así como que mejoren el apetito durante los períodos con un mayor nivel de estrés y contribuyan a mejorar el proceso de esmoltificación es un aspecto clave para la sostenibilidad de este sector. Existen de manera natural en los peces numerosos neuropéptidos con funciones claves en el crecimiento, la inmunidad, la reproducción como por ejemplos los péptidos PACAP, GHRH, PIV, NPY, GnRH, grelina, entre otros y péptidos antimicrobianos e inmunomoduladores que actúan directamente sobre los patógenos o aumentan la respuesta inmune en los animales, aumentando la resistencia a enfermedades y mejorando la eficacia de las vacunas.

La grelina, por ejemplo, es el ligando endógeno para GHS-R1 a, se produce principalmente por las células en el estómago y sirve como una potente hormona orexigénica circulante que controla la ingesta de alimentos, el gasto de energía, la adiposidad y la secreción de GH. Actualmente se han estado explorando los roles funcionales de la grelina circulante en el sistema inmune y en estados de estrés y lesión inflamatoria. Varios informes de la última década han descrito que la grelina es un potente mediador antiinflamatorio en mamíferos tanto in vitro como in vivo en linfocitos, monocitos y células dendríticas a través de la inhibición del estrés oxidativo, la apoptosis celular, la adhesión celular y la expresión proinflamatoria de citoquinas y la promoción de la expresión de IL-10 y migración celular. Con base en estas actividades, la grelina puede ser un agente terapéutico prometedor en el tratamiento de varios estados inflamatorios y enfermedades autoinmunes y lesiones tisulares. Además, la grelina también ha demostrado promover el desarrollo de linfocitos en los órganos linfoides primarios (médula ósea y timo). A pesar de que la secuencia codificante para grelina ha sido reportada en salmónidos no existen estudios previos que caractericen la función de la grelina en el sistema inmune en peces.

El PIV (Péptido Intestinal Vasoactivo) es un péptido de 28 aminoácidos que se aisló originalmente de extractos intestinales porcinos como un vasodilatador y fue identificado más tarde como un neuropéptido multifuncional en el sistema nervioso central y periférico. Recientemente, se ha demostrado que este neuropéptido pleiotrópico desempeña un papel clave en el mantenimiento de la comunicación neuroendocrina- inmune. Algunos de los péptidos se liberan desde el sistema nervioso central a través del eje hipotálamo-hipófisis como hormonas o pro-hormonas y llegan a los órganos linfoides a través de la circulación. Los linfocitos son la principal fuente de PIV en los órganos linfoides, que expresan y secretan PIV tras la activación mediante diversos estímulos. Usando inmunohistoquímica, varios investigadores han demostrado la presencia de fibras nerviosas PIVérgicas en órganos linfoides centrales (timo) y periféricos (bazo, nodulos linfáticos y tejido linfoide asociado a la mucosa). Durante la última década, PIV ha demostrado ser un potente factor antiinflamatorio que actúa regulando la producción de mediadores tanto antiinflamatorios como proinflamatorios, y ha sido identificado como un candidato potencial en el tratamiento de trastornos inflamatorios y autoinmunes en mamíferos. Se han descrito los roles fisiológicos de PIV en teleósteos. PIV se distribuye en el cerebro de los teleósteos y afectan la liberación de la hormona del crecimiento, la gonadotropina y la prolactina a partir de células cultivadas de pituitaria teleósteas in vitro. Sin embargo, las funciones de PIV en el sistema inmune de los teleósteos y más específicamente su papel en la respuesta inflamatoria aún no se han dilucidado. Además, a pesar de que la secuencia codificante para PIV ha sido reportada en varias especies de peces, no existen reportes de caracterización de dicho gen en Salmo salar u Oncorhynchus mykiss.

En consecuencia, todos los desafíos que afronta la producción a gran escala de estas moléculas peptídicas, son aún más relevantes para productos biotecnológicos destinados a la industria acuícola, ya que un aspecto clave en esta industria es el aumento de los rendimientos productivos con bajos costos de producción. En consecuencia, se requiere una nueva estrategia que permita optimizar el proceso de producción y escalamiento de moléculas peptídicas para su uso en esta industria.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método para la producción de múltiples copias de un péptido recombinante para la producción de péptidos con propiedades inmunomoduladoras y antiinflamatorias en peces dicho método que comprende los pasos de: a) diseñar y sintetizar una secuencia nucleotídica que codifica un concatémero que comprende una pluralidad de copias unidas por la secuencia Asn-Gly de un péptido;

b) clonar dicha secuencia nucleotídica en un vector de expresión;

c) transformar una bacteria con dicho vector de expresión;

d) inducir la expresión del concatémero durante el cultivo de la bacteria;

e) lisar la bacteria para obtener los cuerpos de inclusión a partir de esta;

f) disgregar los cuerpos de inclusión para obtener el concatémero; y

g) escindir el concatémero con un agente químico, para obtener una pluralidad de copias individuales de dicho péptido; y

h) purificar dicho péptido recombinante. En una modalidad preferida del método de la invención la inducción de la expresión del concatémero se realiza con isopropil^-D-1 -tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración entre 0,1 y 1 mM.

En otra modalidad preferida de la invención las bacterias se lisan con una prensa francesa.

Una de las ventajas del método propuesto es que el paso de disgregación de los cuerpos de inclusión se puede llevar a cabo de manera conjunta con la escisión de los concatémeros utilizando para ello hidroxilamina entre el 25 y el 50% (p/v).

En el método de la presente invención el péptido recombinante se purifica mediante pasos consecutivos de lavado y centrifugación, evitándose así el uso de pasos cromatográficos para la purificación.

En una realización preferida de la presente invención, la secuencia nucleotídica que codifica un concatémero del péptido es una secuencia que se selecciona de las secuencias nucleotídicas que codifican para el Péptido Intestinal Vasoactivo (PIV) y para la grelina de Salmo salar, las cuales se clonan en el vector de expresión pET22b en una modalidad preferida.

Este vector de expresión pET22b se utiliza para transformar, en una modalidad particularmente preferida, la cepa de E. coli BL21 (DE3), para obtener monómeros de PIV o grelina recombinantes de Salmo salar.

Los péptidos así obtenidos pueden utilizarse para la preparación de una composición veterinaria para estimular el sistema inmune en Salmo salar, para estimular su crecimiento, para combinarlos en formulaciones de vacunas para potenciar el efecto de estas, y/o para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria en dicho pez.

Breve descripción de las figuras

La FIG. 1 muestra una electroforesis en gel de poliacrilamida al 15% de las fracciones solubles e insolubles que se obtienen luego de la lisis de las células BL21 (DE3) transformadas con el vector pET22b-Péptido 6X y a las cuales se les indujo la expresión del concatémero de péptidos con IPTG 0,4 mM.

La FIG. 2 muestra una electroforesis en gel de poliacrilamida al 15% de la purificación y cuantificación de los cuerpos de inclusión donde están contenidos los concatémeros de péptidos. La FIG. 3 muestra una electroforesis en gel de poliacrilamida al 17% de la escisión con hidroxilamina de los concatémeros de péptidos y la obtención de las copias individuales del péptido de interés.

La FIG. 4 muestra el efecto del Péptido Intestinal Vasoactivo (PIV) y la grelina de Salmo salar obtenidos por vía recombinante.

Divulgación detallada de la invención

La presente invención se refiere a un método para la producción recombinante de moléculas peptídicas de interés a gran escala en bacterias. Particularmente, el método de la invención es particularmente útil para la obtención de péptidos en peces con propiedades inmunomoduladoras y antiinflamantorias. Este método permite aumentar los rendimientos productivos de este tipo de moléculas, comparado con los métodos de producción recombinante y purificación que actualmente existen en el estado de la técnica. Además, una de las principales ventajas del método de la presente invención, es la obtención de las moléculas peptídicas con un alto grado de pureza, sin necesidad de involucrar pasos cromatográficos en el proceso.

Este método sencillo y de bajo costo, permite utilizarlo para la producción de péptidos particularmente útiles para la industria acuícola, donde los costos de los productos biotecnológicos suelen ser altos, de manera que este método incide de manera positiva en los costos productivos de esta industria.

Todos los términos técnicos y científicos utilizados para describir la presente invención tienen el mismo significado entendido para una persona con conocimientos básicos en el campo técnico en cuestión. No obstante, para definir con más claridad el alcance de la invención, a continuación, se incluye una lista de la terminología utilizada en esta descripción y su significado.

Se debe entender por el término “concatémero”, una secuencia nucleotídica que contiene una pluralidad de copias de una misma secuencia nucleotídica dispuestas en serie o tándem. En el caso particular de la presente invención, el concatémero es una secuencia nucleotídica sintética.

Se debe entender por el término“secuencia de nucleótidos o secuencia nucleotídica”, una doble hebra de ADN, o una hebra simple de ADN, natural o sintética, o productos de la transcripción de dicho ADN (por ejemplo, moléculas de ARN). A su vez,“secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de interés”, se debe entender como una secuencia de nucleótidos que transcribe una molécula de ARN funcional, o que codifica un péptido funcional de interés para la presente invención. Se debe entender, que la presente invención no se relaciona a secuencias de nucleótidos genómicos en su estado natural, si no que se refiere a secuencias de nucleótidos en un estado aislado, o purificado, o parcialmente purificado, o recombinante, obtenida mediante cualquier método de ingeniería genética conocido en el estado de la técnica.

Se debe entender en el contexto de la presente invención por el término“secuencia de péptidos o secuencia peptídica o secuencia de aminoácidos o secuencia aminoacídica” una secuencia de aminoácidos pequeña de hasta 50 aminoácidos, natural o sintética, o productos de la traducción de ARN.

Se debe entender por el término“recombinante” cualquier secuencia nucleotídica (ADN, ARN) o aminoacídica modificada mediante cualquier método de ingeniería genética conocido en el estado de la técnica, que genera como resultado una nueva secuencia nucleotídica o aminoacídica distinta a la que se encuentra en la naturaleza.

Se debe entender por el término “cuerpos de inclusión”, agregados proteicos o peptídicos intracelulares que se forman comúnmente en bacterias recombinantes.

Se debe entender por la expresión“disgregar los cuerpos de inclusión” en el contexto de la presente invención, la solubilización de los agregados proteicos o peptídicos que se forman durante el proceso de producción recombinante en E. coli.

Se debe entender por el término“precipitado de ruptura” en el contexto de la presente invención, a la fracción insoluble que se forma como resultado del proceso de ruptura celular y posterior centrifugación.

Se debe entender por el término“sobrenadante de ruptura” en el contexto de la presente invención, a la fracción soluble que se forma como resultado del proceso de ruptura celular y posterior centrifugación.

Se debe entender por el término“debris celular”, restos orgánicos que se producen luego de una lisis celular.

Se debe entender por el término“transformar un microorganismo”, un proceso por el cual se incorpora una secuencia nucleotídica exógena a una célula hospedera, que en este caso y para el contexto de la presente invención, corresponde a una célula procariota.

El método de la presente invención comprende producir moléculas peptídicas a gran escala comenzando con el diseño y síntesis de una secuencia nucleotídica que codifica un concatémero que comprende una pluralidad de copias de un péptido de interés. En el caso particular de la presente invención, dicho péptido de interés es un neuropéptido que tiene propiedades inmunomoduladoras y antiinflamantorias en peces tal como el PIV y la grelina. La producción de estos péptidos de interés en forma de concatémeros mejora la estabilidad de dichos péptidos, las cuales son menos susceptibles a la degradación proteolítica durante el proceso de producción en el microorganismo hospedero.

El concatémero puede contener entre 6 y 8 copias del péptido de interés, sin limitarse a dicha cantidad mencionada. Preferentemente, el concatémero contiene 6 copias en tándem del péptido de interés. Cada secuencia nucleotídica individual que codifica al péptido de interés se encuentra separada por una secuencia nucleotídica que codifica los aminoácidos Asp-Gly. De esa forma, se puede inducir la escisión del concatémero con el compuesto inorgánico hidroxilamina para liberar las copias individuales de los péptidos de interés. Esto le otorga una gran ventaja pues el presente método no utiliza técnicas enzimáticas para el corte del concatémero, lo que reduce los costos de producción de péptidos para la industria acuícola.

La secuencia nucleotídica diseñada que contiene el concatémero del péptido de interés, se clona en un vector de expresión para su posterior expresión en un microorganismo adecuado. La secuencia nucleotídica que contiene el concatémero del péptido de interés puede clonarse en cualquier vector del sistema de expresión pET. Dicho vector de expresión es preferentemente pET22b, el cual contiene un promotor T7, un operador lac y sitios de múltiple clonación útiles para la inserción del concatémero. En una modalidad preferida, el microorganismo preferido para la expresión del concatémero es procarionte, preferentemente E. coli, más preferentemente la cepa BL21 (DE3), aunque puede utilizarse cualquier cepa de E. coli del sistema de expresión pET.

La inducción de la expresión del concatémero se realiza preferentemente con isopropil- b-D-l -tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración entre 0,1 y 1 mM, entre 4 y 18 horas de cultivo y a una temperatura entre 30 y 37 ^e C.

Luego de incubar el cultivo con IPTG durante el periodo de tiempo establecido, el cultivo se centrifuga a una velocidad entre 6000 y 8000 g durante 5 a 15 minutos a una temperatura entre 2 y 6 ^e C para obtener un precipitado de microorganismos. Posteriormente, el precipitado de microorganismos se resuspende en una disolución de lisis apropiada, utilizando medios físicos como, por ejemplo, una prensa francesa para lograr la lisis celular. El debris obtenido luego de la lisis se centrifuga a una velocidad entre 8000 y 10000 g durante 25 a 40 minutos a una temperatura entre 2 y 6 ^e C para separar el sobrenadante de ruptura del precipitado de ruptura donde están contenidos los cuerpos de inclusión, y luego se lava el precipitado nuevamente con la disolución de lisis y se centrifuga nuevamente a una velocidad entre 8000 y 10000 g durante 25 a 40 minutos, a una temperatura entre 2 y 6 ^e C para obtener los cuerpos de inclusión. El precipitado que contiene los cuerpos de inclusión se resuspende nuevamente en la disolución de solubilización y esta suspensión se mantiene en agitación durante 6 a 12 horas a una temperatura entre 21 y 25 ^e C. Luego, se centrifuga a una velocidad entre 8000 y 10000 g durante 15 a 30 minutos a una temperatura entre 2 y 6 ^e C, para obtener así los cuerpos de inclusión solubilizados.

Una vez que se obtienen estos cuerpos de inclusión, se disuelven en disolución de solubilización, a la cual se le agrega hidroxilamina a una concentración entre el 25 y el 50% (p/v), y la mezcla se incuba a 45 ^e C durante entre 12 y 16 horas para producir la escisión de los concatémeros y generar las copias individuales del péptido de interés.

La solución se centrifuga a una velocidad entre 8000 y 10000 g durante 15 a 30 minutos y a una temperatura entre 2 y 6 ^e C, para obtener un precipitado, el cual se lava al menos 4 veces con PBS 1 X para obtener los péptidos con un alto grado de pureza.

Los siguientes ejemplos están destinados a ilustrar la invención y sus modalidades preferidas, pero en ninguna circunstancia deberán considerarse para restringir el alcance de la invención, que estará definido por el tenor de las reivindicaciones que aquí se adjuntan.

Ejemplos de Aplicación

Ejemplo 1. Diseño y síntesis de una secuencia nucleotídica que codifica el concatémero.

Los péptidos de interés que se utilizaron en el presente estudio fueron dos péptidos con propiedades inmunomoduladoras y antiinflamantorias obtenidos de Salmo salar: el Péptido Intestinal Vasoactivo PIV, cuya secuencia aminoacídica es: HSDAIFTDNYSRFRKQMAVKKYLNSVLT y la grelina cuya secuencia aminoacídica es: GSSFLSPSQKPQVRQGKGKPPRV

Para la obtención recombinante de estos péptidos a gran escala, se utilizaron las siguientes secuencias nucleotídicas; Para el PIV:

C AT ATGCACT CAG AT GCCATTTT CACAG ACAACT ACAGT CGCTT CCGCAAA CAG AT GGCTGT AAAGAAAT AT CT G AACT CGGTT CT G ACAAACGGCCACT CA G AT GCCATTTT CACAGACAACT ACAGT CGCTT CCGCAAACAG AT GGCT GT A AAG AAAT AT CT G AACT CGGTT CT G ACAAACGGCCACT CAG AT GCCATTTT C ACAG ACAACT ACAGT CGCTT CCGCAAACAGAT GGCT GT AAAGAAAT AT CT G AACT CGGTT CT G ACAAACGGCCACT CAG AT GCCATTTT CACAGACAACT AC AGT CGCTT CCGCAAACAGAT GGCT GT AAAGAAAT AT CT G AACT CGGTT CT G ACAAACGGCCACT CAG AT GCCATTTT CACAGACAACT ACAGT CGCTT CCGC AAACAG AT GGCT GT AAAGAAAT AT CT G AACT CGGTT CT GACAAACGGCCAC T CAG AT GCCATTTT CACAGACAACT ACAGT CGCTT CCGCAAACAGAT GGCT GT AAAGAAAT AT CT G A ACT CGGTT CT G AC AT G ACTCG AG

Las secuencias marcadas en negritas y subrayadas corresponden a los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción Ndel y Xhol utilizadas para la clonación en el vector de expresión pET22b.

Para la Grelina:

GGGT AAAGGG AAGCCCCCT CG AGTT AACGGCGGGT CCAGCTT CCT CAGC CCCT CCCAG AAACCACAGGT AAG ACAGGGT AAAGGG AAGCCCCCT CG AGT T AACGGCGGGT CCAGCTT CCT CAGCCCCT CCCAG AAACCACAGGT AAG AC AGGGT AAAGGG AAGCCCCCT CG AGTT AACGGCGGGT CCAGCTT CCT CAG CCCCT CCCAG AAACCACAGGT AAG ACAGGGT AAAGGG AAGCCCCCT CG A GTT AACGGCGGGT CCAGCTT CCT CAGCCCCT CCCAG AAACCACAGGT AAG ACAGGGT AAAGGG AAGCCCCCT CG AGTT AACGGCGGGT CCAGCTT CCT CA GCCCCT CCCAG AAACCACAGGT AAG ACAGGGT AAAGGG AAGCCCCCT CG AGTTT G AAAGCTT

Las secuencias marcadas en negritas y subrayadas corresponden a los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción Ndel y Hindlll utilizadas para la clonación en el vector de expresión pET22b.

Estas secuencias se sintetizaron químicamente y se insertaron en el vector de expresión pET22b en los sitios de restricción Ndel/Xhol, para obtener el concatémero de PIV y Ndel/Hindlll para obtener el concatémero de grelina.

Posteriormente la cepa de E. coli BL21 (DE3) se transformó con dicho vector de expresión y se creció en medio sólido LB [Luria-Bertani: Triptona 1 % (p/v), Extracto de levadura 0,5% (p/v), NaCI 171 ,1 mM, pH 7,5, agar bacteriológico al 1 ,5% (p/v)] suplementado con 50 pg/mL de ampicilina. Para la inducción de la expresión de los concatémeros se tomaron colonias aisladas de la cepa E. coli BL21 (DE3) transformadas con las construcciones de interés y se inocularon en cultivos de 300 mi con medio LB líquido suplementado con ampicilina 50 pg/ml (LBA) y se dejaron crecer durante 12 horas. Al cabo de este tiempo se inocularon 50 mi de células crecidas en 1 L de medio LBA y se dejó crecer a 37 ^e C hasta obtener una D.O. a 600 nm entre 0,1 y 1 . Se indujo la expresión de los concatémeros con isopropil-tio^-D-galactósido (IPTG). Para ello se agrega IPTG al medio de cultivo de los microorganismos a una concentración final de 0,4 mM, y el cultivo se incuba durante 6 horas a 37 ^e C.

Ejemplo 2. Obtención de cuerpos de inclusión y purificación de los péptidos PIV y Grelina.

Transcurridas 6 horas el cultivo se centrifuga a 8000 g por 10 minutos a 4 ^e C. Posteriormente, el precipitado de microorganismos se resuspende en una disolución de PBS 1 X-Tritón x 100 al 1 % a razón de 10g/100ml, y se produce la ruptura de células utilizando una prensa francesa. El debris celular obtenido luego de la ruptura se centrifuga a una velocidad de 8000 g durante 30 minutos a una temperatura de 4 ^e C para separar el sobrenadante de ruptura del precipitado de ruptura donde están contenidos los cuerpos de inclusión. Luego se lava el precipitado con una disolución de PBS 1 X- Tritón x 100 al 1 %, NaCI 1 M, a razón de 10g/100ml. Se centrifuga nuevamente a una velocidad de 8000 g durante 25 a 40 minutos a una temperatura entre 2 y 6 ^e C para purificar y obtener los cuerpos de inclusión.

La Figura 1 representa una electroforesis en gel de poliacrilamida al 15% de las fracciones soluble e insoluble que se obtienen luego de la ruptura de las células de BL21 (DE3) transformadas con el vector pET22b-Péptido 6X y a las cuales se les indujo la expresión del concatémero de péptidos con IPTG 0,4 mM, en la cual PM es el patrón de pesos moleculares; S.rup es el sobrenadante de ruptura, es decir la fracción intracelular soluble y C. Inc es precipitado de ruptura, o fracción correspondiente a los cuerpos de inclusión.

En esta figura se muestra una banda entre 25 y 35 kDa en la fracción del precipitado de ruptura, que corresponde al concatémero de péptidos en forma de cuerpos de inclusión.

Para la purificación de los concatémetos, se resuspende el precipitado en una disolución PBS 1 X, Urea 8M, b-Mercapto 10 nM, PMSF 1 mM, pH 8, a razón de 10g/ml. Esta suspensión obtenida se mantiene en agitación durante toda la noche a temperatura ambiente, luego, se centrifuga a una velocidad de 8000 g por 20 minutos a 4 ^e C. Para la escisión de los concatémeros el precipitado se disuelve a razón de 1 g/5 mi de disolución de PBS 1 X, Urea 8M, b-Mercapto 10mM, PMSF 0,1 -1 mM, pH8; 1 mi Tris HC1 1 M, pH 9,5 y 4 mi hidroxilamina (solución al 50% en agua) y se incuba a 45 ^e C durante toda la noche. Este paso permite generar las copias individuales del péptido de interés.

En la FIG. 2 se muestra una electroforesis en gel de poliacrilamida al 15% de la purificación y cuantificación de los cuerpos de inclusión donde están contenidos los concatémeros de péptidos, en la cual PM es el Patrón de pesos moleculares; BSA es la Curva de BSA para la cuantificación de las proteínas; Péptido 6X es el concatémero del péptido de interés contenido en los cuerpos de inclusión.

La mezcla anterior se centrifuga a una velocidad a 8000 g durante 30 minutos a 4 ^e C y luego se lava el precipitado 4 veces con PBS 1 X para obtener los péptidos con un alto grado de pureza.

En la FIG. 3 se muestra una electroforesis en gel de poliacrilamida al 17% de la escisión con hidroxilamina de los concatémeros de péptidos y la obtención de los monómeros del péptido de interés, en la que PM es el patrón de pesos moleculares y Péptido 1 X Cl : el péptido monómerico obtenido luego del corte con hidroxilamina.

Ejemplo 3: Determinación del efecto sobre el sistema inmune de los péptidos obtenidos por vía recombinante.

La actividad biológica de los péptidos producidos utilizando el sistema de expresión recombinante previamente descrito se determinó in vitro mediante el análisis de la expresión de genes relacionados con el sistema inmune.

Las células SHK-1 (células derivadas de riñón anterior de salmón Atlántico, Salmo sa/ar) se incubaron con 20 nM de los péptidos PIV y GRE (Péptido intestinal vasoactivo y Grelina, respectivamente) de Salmo salar obtenidos en los ejemplos 1 y 2. Se determinó la expresión de INFy, I L- 1 b , TNF-D y la quimioquina CCL19 a las 4 y 8 horas post tratamiento. Los valores de expresión relativa se normalizaron con la expresión de ARNm de la proteína de unión poliadelinato 1 (PBP-1 ).

Como resultado se obtuvo que todos los péptidos aumentaron significativamente la expresión de INF-g a las 4 horas de tratamientos, mientras que, a las 8 horas, solo el PIV muestra un aumento significativo en la expresiónde esta citoquina. El INFy es una citocina T _H 1 que es crítica para casi todas las fases de las respuestas inmunes. Al igual que el INFy de mamífero, los INFy de los peces teleósteos median la activación de macrófagos, a través del aumento de la actividad de estallido respiratorio, la producción de óxido nítrico y la fagocitosis, induciendo la expresión de los genes antivirales típicos. El IFNy también induce la apoptosis, especialmente durante la infección viral, e inhibe la proliferación celular. La inmunidad celular de tipo T _H 1 es esencial en la defensa inmune contra virus y bacterias intracelulares.

Los péptidos no produjeron cambios significativos en la expresión de CCL19 a las 4 horas de tratamiento. Por su parte, la expresión de IL-1 b no mostró diferencias significativas a las 4 y 8 horas de administrados los péptidos.

A las 8 horas de tratamiento ambos péptidos disminuyeron significativamente la expresión de CC19. La quimiocina CCL19 interviene en la inflamación aguda y el reclutamiento de linfocitos y otras células. En peces, se ha demostrado que CCL19 induce la proliferación celular, la actividad de estallido respiratorio y la quimiotaxis de leucocitos de sangre periférica (PBL), lo que sugiere su capacidad para ejercer funciones inflamatorias y homeostáticas. Teniendo en cuenta esto, se puede sugerir que los péptidos pueden poseer efectos antiiflamatorios en peces.

En la FIG. 4 se muestra el efecto de los péptidos PIV y GRE obtenidos de manera recombinante como se describió anteriormente sobre la expresión de genes involucrados en la respuesta inmune. Los valores en el gráfico representan la media + DE (n=4). Los datos se analizaron mediante un Test T. ^* significa p<0,05; ^** significan p<0,01 ; ^*** significan p<0,001 . Las células SHK1 se incubaron con 20nm con cada uno de los péptidos. Se midió la expresión INF-g, CC19, I L-1 b y TNF-a a 4 y 8 horas post tratamiento. Los valores de expresión relativa se normalizaron con la expresión de ARNm de la proteína de unión poliadelinato 1 (PBP-1 ).

Ventajas de la solución propuesta

Se ha desarrollado un proceso basado en la expresión recombinante de concatémeros de péptidos en bacterias y la obtención de monómeros peptídicos biológicamente activos mediante la escisión de los concatémeros con hidroxilamina. La invención, entre otras, presenta las siguientes ventajas con respecto a la técnica anterior:

1 ) Permite la obtención por vía recombinante de moléculas peptídicas en forma de concatémeros lo que mejora la estabilidad de dichas moléculas las cuales son menos susceptibles a la degradación proteolítica durante el proceso de producción en el organismo hospedero; 2) Permite la producción de péptidos que pueden ser tóxicos para el microorganismo hospedero donde estos se expresan; y

3) Permite obtener los péptidos biológicamente activos y con un alto grado de pureza sin el uso de técnicas cromatográficas para el proceso de purificación. Estos péptidos, en dependencia de su función biológica, pueden ser utilizados en la acuicultura para aumentar el crecimiento, la sobrevida, la calidad de los alevines y mejorar el sistema inmune y la resistencia a patógenos. También pueden ser utilizados bajo determinadas condiciones como moléculas antiiflamatorias en peces.

El proceso sencillo y de bajo costo desarrollado para la producción de estos péptidos permite utilizarlos en la industria acuícola donde los costos de los productos biotecnológicos que se apliquen deben ser bajos de manera que se pueda incidir de manera positiva en los costos productivos de la industria.