MÉTODO PARA TRIAGEM: DE FÁRMACOS OU SUBSTÂNCIAS COM POTENCIAL NEUROPROTETOR, KIT PARA TRIAGEM DE FÁRMACOS OU SUBSTÂNCIAS, E, USO DE UM PAINEL DE GENES CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere ao campo da triagem de fármacos ou substâncias. Mais especificamente, a presente invenção consiste em um método para triagem de fármacos ou substâncias com potencial neuroprotetor. A presente invenção se refere ainda ao kit para triagem de fármacos ou substâncias com potencial neuroprotetor e ao uso do painel de genes desenvolvido para a dita testagem.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] O Zika vírus (ZIKV) é um arbovirus da família Flaviviridae, transmitido para humanos principalmente pela picada do mosquito vetor Aedes aegypti (1). Normalmente a infecção resulta em uma forma assintomática ou de sintomas pouco específicos, sendo os mais comuns febre baixa (menor que 38,5°C), dores de cabeça, dores musculares e nas articulações, exantema maculopapular, conjuntivite não purulenta e mal-estar, podendo ser confundidos com aqueles apresentados em outras infecções por flavi vírus, como Dengue e Chikungunya, o que pode dificultar o diagnóstico (Z).

[003] Após a ocorrência de alguns surtos pelo mundo (2, 5), o Brasil enfrentou uma epidemia de infecções pelo ZIKV em 2015, tendo sido primeiramente identificada no semiárido da região Nordeste do país (4, 5). Coincidentemente, no mesmo período, foi observado um aumento surpreendente no número de casos de microcefalia congênita, sinal clínico caracterizado por redução do perímetro cefálico da criança e que pode acarretar prejuízos ao seu desenvolvimento cognitivo e físico. Posteriormente, constatou-se a associação da ocorrência da infecção e de anormalidades no desenvolvimento fetal e neonatal, que passaram a ser descritas conjuntamente como Smdrome congênita do ZIKV (SCZ) (6-8).

[004] Segundo o Boletim da Situação Epidemiologic a da Síndrome

Congênita Associada à Infecção pelo ZIKV (6, 9), publicado pelo Ministério da Saúde, entre 2015 e 2020, foram notificados 19.622 casos suspeitos de SCZ, dentre os quais 18,2% foram confirmados. No ano de 2020, foi notificado um total de 1.007 casos. Destes, 3,5% foram confirmados e 59,3% ainda permanecem em investigação. No período de 2015 a 2018, a maioria das notificações ficou concentrada na região Nordeste do Brasil (58,3%) seguida do Sudeste (25,2%) e Centro-Oeste (7,6%). Entretanto, em 2019, a notificação de casos passou a se concentrar na região Sudeste (39,3%), seguida da região Nordeste (36%) e Centro-Oeste (9,2%).

[005] O genoma do ZIKV é composto de RNA de fita simples de sentido positivo. O vírus apresenta diâmetro aproximado de 50 nm e nucleocapsídeo envolto em uma bicamada lipídica, na qual se localizam suas proteínas estruturais precursor de membrana (PrM/M) e envelope (E) organizadas em simetria icosaédrica (10). Seu genoma de aproximadamente 10,8 kb é composto de duas regiões não codificantes (UTR) 5’ e 3’ e uma open reading frame longa. Esta última transcreve uma poliproteina que se cliva em 10 proteínas, sendo três estruturais: capsídeo (Cap), E e PrM; e sete não estruturais: NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5 (11, 12). O ZIKV foi inicialmente isolado a partir do soro de macacos Rhesus, da floresta Zika na Uganda, em 1947 (13).

[006] O ZIKV se originou, provavelmente, na África entre o final do século XIX e o início do século XX e apresenta duas linhagens distintas, a africana e a asiática (14, 15). Os isolados circulantes nas Américas têm origem na linhagem asiática e compartilham um ancestral comum com a cepa circulante na Polinésia Francesa durante o surto de Zika ocorrido em 2013 (16). No presente estudo foram comparados dois isolados da linhagem asiática com 99,9% de semelhança ao nível nucleotídico e 99,97% de semelhança ao nível de aminoácidos (77). O primeiro é o PE243 (ZIKV/H. sapiens/Brazil/PE243/2015; GenBank: KX197192), isolado de um paciente com sintomas clássicos associados à Zika, em 2015, no estado do Pernambuco, região Nordeste do Brasil (77). O segundo é o SPH2015 (ZikaSPH2015; GenBank: KU321639), isolado no estado de São Paulo, região sudeste do Brasil (76). A principal diferença no nível de aminoácidos entre ZIKV PE243 e ZIKV SPH2015 é encontrada na proteína não estrutural 1 (NS1) (77). Qualquer alteração na proteína NS1 pode ter um impacto relevante na patogênese do ZIKV, uma vez que esta proteína tem uma importante interação com o hospedeiro. Foi demonstrado que as NS1 dos vírus Zika, dengue, West Nile, encefalite japonesa e febre amarela se ligam seletivamente e alteram a permeabilidade das células endoteliais humanas do pulmão, derme, cordão umbilical, cérebro e fígado in vitro e causam extravasamento vascular tecido específico em camundongos, refletindo a fisiopatologia de cada flavivírus (18). Anticorpos anti-NSl de ZIKV protegem contra a infecção congênita (79). A NS1 tem papel crucial na remodelação do retículo endoplasmático durante a replicação do ZIKV. Este processo é dependente da inserção da proteína na membrana hidrofóbica e, portanto, depende de sua estrutura (20). Além disso, a NS1 é importante na evasão imune do ZIKV, suprimindo a resposta do hospedeiro ao manipular a interação entre o inflamassoma e a sinalização de IFN tipo 1. Neste caso, por meio de interações específicas entre NS1 e caspase- 1, que promovem a clivagem de cGAS (27).

[007] O ZIKV é capaz de infectar células precursoras neurais, neurônios imaturos e neurônios maduros. A infecção destas células induz a desregulação do ciclo celular e a apoptose (22-25). As lesões no cérebro fetal causadas pela infecção por ZIKV estão associadas à desorganização de células-tronco neurais, perda significativa de células progenitoras intermediárias e dismorfia de circuitarias neuronais no giro denteado do hipocampo, como demonstrado na infecção experimental de Macaca nemestrina (26). A rica vascularização e proximidade aos ventrículos preenchidos com líquido cefalorraquidiano aumentam a exposição do hipocampo ao ZIKV circulante comparado a outras estruturas cerebrais (27, 28).

[008] O hipocampo é uma estrutura cerebral relacionada à formação da memória espacial e de novas memórias episódicas (29). Componente do sistema límbico, abriga em sua camada subgranular do giro denteado células progenitoras neurais, constituindo-se em uma das principais regiões de neurogênese cerebral (30, 31). Estas são capazes de autorrenovação ou diferenciação em novos neurônios, astrócitos ou oligodendrócitos (29, 30). No presente estudo, é utilizado um modelo de culturas organotípicas de hipocampo (COHs) de ratos infantes cultivadas em interface líquido-gasosa. Esse modelo permitiu a investigação de processos iniciais da infecção por ZIKV e a avaliação dos impactos da infecção pelos isolados de ZIKV PE243 e SPH2015 em aspectos fenotípicos e na assinatura transcricional do hipocampo. Utilizando esse modelo foi possível identificar um painel de genes biomarcadores do balanço entre morte neuronal e neurogênese e da resposta inflamatória característicos da etapa inicial da infecção e que são determinantes do desfecho observado posteriormente. A presente invenção utiliza esse painel de genes em um método para triagem de fármacos, substâncias ou moléculas com potencial neuroprotetor, e no desenvolvimento de um kit para triagem de fármacos ou substâncias com potencial neuroprotetor, possibilitando a elucidação de seus respectivos mecanismos de ação.

[009] Até o presente momento, não existe tratamento específico para a infecção por ZIKV, tampouco para a SCZ. A descoberta de novos fármacos é um processo geralmente lento e sujeito a grandes riscos de fracasso (“attrition”). Soma-se a esses desafios a necessidade de elucidação, ainda que parcial, do modo de ação das drogas como pré-requisito para que as agências reguladoras autorizem seu uso ou reposicionamento em humanos. A utilização de COHs permite a avaliação do potencial neuroprotetor de fármacos ou substâncias, bem como a elucidação de seu mecanismo de ação, em um contexto tecidual muito próximo à realidade do sistema nervoso central. O modelo de COHs reduz significativamente o número de animais necessários ao estudo e seu sofrimento, em comparação a modelos in vivo. Esse modelo supera ainda importantes limitações de modelos in vitro, como culturas de células, neurosferas e organóides, preservando a arquitetura e a organização tridimensional do tecido, além da diversidade e interconexão celular (32, 33). O modelo de COHs contém micróglia, células imunes de origem hematopoiética (Revisado em: 34), que normalmente não estão presentes nos modelos in vitro. Mesmo os modelos in vitro que incorporam esse e outros tipos celulares, como alguns brains-on-a-chip, a incorporação é feita de forma artificial e a integração dos diferentes tipos celulares é um desafio. (Ben M. Maoz. Brain-on-a-Chip: Characterizing the next generation of advanced in vitro platforms for modeling the central nervous system. APL Bioengineering 5, 030902 (2021)). Ademais, a indução laboratorial da diferenciação de células-tronco pluripotentes para formação de neurosferas e organoides em determinados modelos altera sua programação epigenética natural, podendo mascarar diferenças profundas em relação às células do sistema nervoso central (SNC) em seu estado natural (25).

ANTECEDENTES DA PRESENTE INVENÇÃO

[0010] Existem relatos no estado da técnica da utilização de culturas organotípicas de hipocampo (COHs) como modelo de infecção por ZIKV. Büttner e Caroline et al. (Zika Virus-Mediated Death of Hippocampal Neurons Is Independent From Maturation State, Frontiers in cellular neuroscience vol. 13 389), por exemplo, utilizam uma cultura organotípica obtida a partir de cortes do hipocampo de camundongos para analisar os efeitos da infecção por ZIKV no desenvolvimento do hipocampo.

[001 1] Também existem métodos para triagem de drogas contra ZIKV que utilizam diferentes tipos de culturas organóides cerebrais. Esses modelos baseiam-se em diferentes assinaturas gênicas da revelada na presente invenção e nem sempre possuem como objetivo realizar a triagem de drogas com potencial neuroprotetor.

[0012] Xiao Xu e colaboradores, por exemplo, revelam um método que utiliza culturas organóides tridimensionais para a triagem de drogas contra ZIKV, monitorando a expressão da proteína NS1, indicadora da replicação do ZIKV e a atividade de caspase-3 (indicadora de apoptose das células hospedeiras), além da viabilidade celular. (Miao Xu et al. Identification of small molecule inhibitors of Zika virus infection and induced neural cell death via a drug repurposing screen. Nat Med. 2016 Oct; 22(10): 1101— 1107). O modelo da presente invenção avalia genes associados aos mecanismos de inflamação, neurogênese e morte neuronal nas COHs, possibilitando inferências sobre o mecanismo de ação das substâncias testadas.

[0013] O documento W02019079360 propõe a identificação de assinaturas gênicas associadas a doenças (incluindo infecção por ZIKV) em diversos tipos de culturas celulares. Um dos possíveis usos mencionados é utilizar essas culturas para triar compostos químicos e fármacos a partir do acompanhamento de alterações nos marcadores estabelecidos. No modelo do dito documento não há redução à prática com ZIKV e tampouco são utilizadas culturas organotípicas.

[0014] WO20 17083705 revela um biorreator giratório para cultivo 3D de células em larga escala. Mais especificamente, o pedido descreve organóides produzidos nesse biorreator a partir de células tronco pluripotentes humanas que mimetizam regiões cerebrais e são utilizados para modelar a exposição a ZIKV. Os autores sugerem que esses organóides podem ser utilizados na triagem de drogas, incluindo antivirais com atividade contra ZIKV.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0015] A presente invenção descreve método de triagem de fármacos ou substâncias com potencial neuroprotetor baseado em um painel de biomarcadores associados à neurodegeneração e à resposta inflamatória induzida pela infecção por ZIKV em um modelo de COHs. Esse painel foi identificado a partir da avaliação dos impactos da infecção por dois isolados de ZIKV nos aspectos fenotípicos e na assinatura transcricional das COHs, PE243 e SPH2015. Estes são isolados geneticamente semelhantes que circularam no Brasil durante o pico epidêmico de 2015-16. Apesar de geneticamente semelhantes, esses isolados diferem ao nível de aminoácidos principalmente na proteína não estrutural NS1, implicada no escape imune. Esse painel de genes biomarcadores pode ser utilizado para identificar compostos com potencial neuroprotetor a partir da comparação da sua expressão em modelos de infecção de COHs por ZIKV, possibilitando a elucidação do mecanismo de ação dos compostos selecionados. A presente invenção se refere ainda a um kit para triagem de fármacos ou substâncias com potencial neuroprotetor.

[0016] Para a seleção do painel de genes biomarcadores da presente invenção foi primeiramente demonstrado, utilizando técnicas de imunofluorescência, microscopia confocal, RNA-Seq e Bioinformática, que os isolados PE243 e SPH2015 de ZIKV podem infectar e se replicar em COHs. A resposta hipocampal à infecção pelos isolados foi avaliada e os mecanismos conservados na infecção por ambos isolados foram identificados, gerando um painel de genes biomarcadores dos processos de morte neuronal/neurogênese e resposta inflamatória no início da infecção. O monitoramento desses biomarcadores, assim como das características fenotípicas associadas, constitui um processo inédito para triagem de fármacos ou substâncias com propriedades neuroprotetoras e possibilita a elucidação de seus mecanismos de ação usando o modelo de infecção de COHs pelo ZIKV.

[0017] Em uma primeira concretização, a presente invenção fornece um método para triagem de fármacos ou substâncias com potencial neuroprote tor, compreendend o : a) prover culturas organotípicas do hipocampo, sendo: i) pelo menos uma cultura controle, não infectada e não tratada com o fármaco ou substância a ser triada; ii) pelo menos uma cultura que será infectada com o agente da etapa b) e não será tratada com o fármaco ou substância a ser triada; iii) pelo menos uma cultura controle que será tratada com o fármaco ou substância a ser triada; e iv) pelo menos uma cultura que será infectada com o agente da etapa b) e será tratada com o fármaco ou substância a ser triada; b) infectar as culturas estabelecidas em ii e iv com um agente infeccio so ne uroinflamatório ; c) incubar as culturas estabelecidas em iii e iv com um fármaco ou substância com potencial neuroprotetor a ser triado; d) extrair pelo menos um RNA mensageiro ou proteína de cada uma das pelo menos quatro subculturas estabelecidas; e e) determinar o padrão de expressão com base em um painel de biomarcadores de cada uma das pelo menos quatro subculturas estabelecidas e, assim, predizer o potencial neuroprotetor do fármaco ou substância triada.

[0018] Em uma outra forma de realização da presente invenção, as culturas organotípicas do hipocampo são cultivadas durante pelo menos 14 dias para estabilização.

[0019] Em uma outra forma de realização da presente invenção, o agente infeccioso n euroin flamatório utilizado para infecção das culturas é o ZIKV.

[0020] Em uma outra forma de realização da presente invenção, os agentes infecciosos isolados de ZIKV são PE243 e SPH2015.

[0021] Em uma outra forma de realização da presente invenção, o fármaco ou substância a ser tríada para o potencial neuroprotetor está em uma concentração de cerca de 0,5 pM.

[0022] Em uma outra forma de realização da presente invenção, a extração do ácido nucleico da etapa d) ocorre 16h após a realização das etapas b) e c).

[0023] Em uma outra forma de realização da presente invenção, a determinação do padrão de expressão em um painel de biomarcadores da etapa e) é realizada com base na expressão dos genes Adgrel, Ccl3, Dbx2, Disp3, Gmr3, Igfí- Illb, Rac2, Rasgrp3, SiglecS em relação ao padrão de expressão dos mesmos genes nas culturas controle.

[0024] Em uma outra forma de realização da presente invenção, o ácido nucleico extraído é RNA.

[0025] Em uma outra forma de realização da presente invenção, a avaliação da expressão do painel de biomarcadores é realizada por RT-qPCR após transcrição reversa, Northern Blot, PCR digital ou técnicas equivalentes. [0026] Em uma forma preferida da segunda concretização, a doença neuroinflamatória é causada por infecção pelo vírus da ZIKV.

[0027] Em urna terceira concretização, a presente invenção revela um kit para triagem de fármacos ou substâncias com potencial neuroprotetor.

[0028] Em uma quarta concretização, a presente invenção fornece um método para triagem de fármacos ou substâncias para controle da neuroinflamação e a prevenção da neurodegeneração associadas à infecção do sistema nervoso central pelo ZIKV.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0029] Figura 1 - Metodologia para obtenção do painel de biomarcadores da presente invenção: Após a eutanásia, os hipocampos dos animais foram dissecados e fatiados a 400pm e as fatias distribuídas em insertos para cultivo. De acordo com o desenho experimental, as COHs foram infectadas com o isolado SPH2015 ou o PE243 ou submetidas à infecção simulada sem o vírus. Posteriormente, foram realizadas análises moleculares e de imunofluorescência e microscopia confocal para avaliação da dinâmica de infecção, análises fenotípicas e tran seriei on al das culturas. COHs = culturas organotípicas de hipocampo; p.i. = pós-infecção.

[0030] Figura 2 -- Infecção e proliferação do ZIKV nas COHs: A Intensidade de Fluorescência (IF) de NS1 normalizada pela área de tecido (DAPI+) (IF NS1/mm ² ) foi quantificada nos dois isolados (PE243 e SPH2015) às 8, 24 e 48h pós infecção (p.i.) (n ≥ 12). Amostras fora do intervalo entre os quartis inferior e superior da mediana de seus respectivos grupos (intervalo interquartil) foram excluídas da análise. Foi utilizado teste ANOVA bidirecional seguido pelo teste de múltiplas comparações de Tukey. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. *P < 0,05; ***P < 0,001; ****P < 0,0001..

[0031] Figura 3 - Infecção neuronal por ZIKV: A - A razão de neurônios maduros (NeuN+) infectados pelo ZIKV (NeuN+ NS1+) 8, 24 ou 48h p.i. foi estimada (n > 12). Amostras fora do intervalo entre os quartis inferior e superior da mediana de seus respectivos grupos (intervalo interquartil) foram excluídas da análise. Foi utilizado teste ANOVA bidirecional seguido pelo teste de múltiplas comparações de Tukey. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. ****p < 0,0001. B - Micrografias (60x) obtidas de COHs 8h p.i.. Marcações em azul representam núcleos celulares (DAPI), em vermelho neurônios maduros (NeuN) e em verde ZIKV (NS1). Merge representa a sobreposição dos três canais, com setas que representam a colocalização de ZIKV e NeuN. Barra de escala = [0032] Figura 4 - Densidade neuronal das COHs no período inicial da infecção por ZIKV: O número de neurônios maduros (NeuN+) por área de tecido (DAPI+) foi quantificado (NeuN+/mm ² ) nas COHs dos grupos controle (CTRL) e infectados com ZIKV PE243 ou SPH2015 às 8, 24 e 48h p.i. (n > 9). Amostras fora do intervalo entre os quartis inferior e superior da mediana de seus respectivos grupos (intervalo interquartil) foram excluídas da análise. Foi utilizado teste ANOVA bidirecional seguido pelo teste de múltiplas comparações de Tukey. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. * *P 0,01; * ***P 0,001.

[0033] Figura 5 -- Densidade neuronal das COHs em tempos avançados da infecção por ZIKV: O número de neurônios maduros (NeuN+) por área de tecido (DAPI+) foi quantificado (NeuN+/mm ² ) nas COHs dos grupos controle (CTRL) e infectados com ZIKV PE243 ou SPH2015 5, 7 e 10 dias p.i. (n > 18). Amostras fora do intervalo entre os quartis inferior e superior da mediana de seus respectivos grupos (intervalo interquartil) foram excluídas da análise. Foi utilizado teste ANOVA bidirecional seguido pelo teste de múltiplas comparações de Tukey. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. *P < 0,05; < 0,01; < 0,0001.

[0034] Figura 6 - A morte neuronal induzida por ZIKV nas COHs envolve apoptose: A - Os neurônios apoptóticos presentes nas COHs foram avaliados nos grupos controle (CTRL) e infectados por PE243 e SPH2015 4 dias p.i. através da marcação com NeuN e TUNEL (NeuN+ TUNEL+) e normalizados pelo total de neurônios (NeuN+) (n > 3). As variâncias dos grupos foram comparadas utilizando o teste ANOVA unidirecional seguido pelo teste de múltiplas comparações de Tukey. Outliers foram identificados com o teste de Grubbs (alfa = 0,1) e excluídos. **P < 0,01; ***P < 0,001. B - Micrografias por microscopia confocal (100x) obtidas de COHs 4 dias p.i.. Marcações em azul representam núcleos celulares (DAPI), em vermelho, neurônios maduros (NeuN) e em verde, sinais apoptóticos (TÚNEL). Merge representa a sobreposição dos três canais, com as colocalizações das marcações de TUNEL, NeuN e DAPI. As setas brancas indicam pontos de colocalização entre TUNEL e NeuN. Barra de escala = 10pm.

[0035] Figura 7 - Os isolados PE243 e SPH2015 causam dinâmicas distintas de ativação da micróglia nas COHs: A - A área correspondente à micróglia ativadas (Ibal+) normalizada pela área do tecido (DAPI+) foi avaliada nos isolados SPH2015 e PE243 8h e 24h p.i. (n > 2) e comparada ao grupo controle (CTRL). Foi utilizado teste ANOVA bidirecional seguido pelo teste de múltiplas comparações de Tukey. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. *P < 0,05. B - Micrografias por microscopia confocal (60x) obtidas de COHs 8h p.i.. Marcações em azul representam núcleos celulares (DAPI), em vermelho, neurônios maduros (NeuN) e em verde, micróglia ativada (Ibal). Merge representa a sobreposição dos três canais, com as colocalizações das marcações de Ibal, NeuN e DAPI. Barra de escala = lOpm.

[0036] Figura 8 - Alterações epigenéticas induzidas de forma distinta pelos isolados de ZIKV: A marca epigenética H3K4me3 foi avaliada nas COHs do grupo controle (CTRL) e infectados com os isolados SPH2015 e PF243 5, 7 e 10 dias p.i., estimando-se a intensidade de fluorescência (IF) de H3K4me3 em neurônios maduros. Esses valores foram normalizados pelo número de neurônios positivos para essa marca (NeuN+ H3K4me3+) (n > 8). Amostras fora do intervalo entre os quartis inferior e superior da mediana de seus respectivos grupos (intervalo interquartil) foram excluídas da análise. Foi utilizado teste ANOVA bidirecional seguido do teste de múltiplas comparações de Tukey e os dados foram expressos segundo média ± desvio padrão. *P < 0,05; ***P < 0,001 ; * ***P < 0,0001.

[0037] Figura 9 -- Diagrama de Venn representando os genes diferencialmente expressos pelas COHs infectadas com os isolados PE243 ou SPH2015 às 16h p.i.: Genes com Fold Change maior que 1,2 e valor de P menor que 0,05 foram considerados diferencialmente expressos.

[0038] Figura 10 - Alterações nos processos de sobrevivência, proliferação e diferenciação de células neurais induzidas pela infecção com os isolados PE243 ou SPH2015 (SPH). O padrão de neurodegeneração observado pode implicar em prejuízos ao neurodesenvolvimento.

[0039] Figura 11 - A infecção por PE243 ou SPH2015 (SPH) induz padrões distintos de resposta inflamatória no início da infecção.

[0040] Figura 12 - Validação por RT-qPCR dos genes biomarcadores dos processos de balanço entre morte neuronal e neurogênese e resposta inflamatória regulados pelos isolados PE243 e SPH2015 de ZIKV no início da infecção hipocampal. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. * = P < 0,05; ** = P < 0,01; *** P < 0,001; **** = P < 0,0001. N amostrai > 4.

[0041] Figura 13 - Fluxograma do modelo estabelecido para triagem de fármacos ou moléculas com potencial neuroprotetor em COHs. Culturas organotípicas de hipocampo (COHs) de ratos infantes com cerca de 7 dias de idade são produzidas a partir de fatias do órgão com aproximadamente 400 micrômetros de espessura cultivadas para estabilização por, pelo menos, 14 dias. As COHs são então desafiadas pela infecção com ZIKV por meio de sua exposição a suspensões de meio de cultura contendo 6x10 ⁵ unidades formadoras de placas (UFP) por mililitro durante duas horas. Ao final dessas duas horas, os vírus não adsorvidos às células das COHs são removidos por lavagem com meio de cultura fresco e as culturas são incubadas por 16h em meio fresco contendo o fármaco ou substância cujo potencial neuroprotetor será testado. São incluídas nos testes COHs falsamente infectadas, expostas ao procedimento de infecção, mas com meio sem vírus, que servem de controles para avaliação da toxicidade das substâncias testadas em ausência da infecção e COHs infectadas tratadas com meio contendo o excipiente, mas não o fármaco ou substância testados, que servem de controles da eficiência da infecção. Após a incubação por 1611, são extraídos os RNAs (ou proteínas) e os níveis de expressão dos genes biomarcadores são quantificados por técnicas tais como RT-qPCR, por exemplo. Os gráficos de radar A e B exemplificam avaliações do efeito neuroprotetor e da possível toxicidade, respectivamente, de uma substância hipotética testada com o modelo aqui proposto.

[0042] Figura 14 - Avaliação do potencial neuroprotetor do cinamaldeído utilizando a metodologia da presente invenção. Tratamento farmacológico de culturas organotípicas hipocampais infectadas ou não com Zíka vírus. Avaliação do efeito da droga (A) e sua toxicidade (B). Concentração da droga: 0,5pM. Os grupos foram comparados usando o teste T não pareado. Os dados são representados como a média dos valores 2 ^Λ (- DCt) em escala logarítmica. * Simulado não tratado vs infectado não tratado; * Simulado não tratado vs infectado tratado com a droga;* P < 0,05; ** P < 0,01.

[0043] Figura 15 - Avaliação do potencial neuroprotetor da difenidramina utilizando a metodologia da presente invenção. Tratamento farmacológico de culturas organotípicas hipocampais infectadas ou não com Zika vírus. Avaliação do efeito da droga (A) e sua toxicidade (B). Concentração da droga: 0,5pM. Os grupos foram comparados por meio do teste T não pareado ou teste de Mann- Whitney. Os dados são representados como a média dos valores 2 ^Λ (-DCt) em escala logarítmica. * Simulado não tratado vs infectado não tratado; * Simulado não tratado vs simulado tratado com a droga.* P < 0,05; ** P < 0,01.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0044] Embora a presente invenção possa ser suscetível a diferentes concretizações, é mostrada nos desenhos e na seguinte discussão detalhada, uma concretização preferida com o entendimento de que a presente descrição deve ser considerada uma exemplificação dos princípios da invenção e não pretende limitar a presente invenção ao que foi ilustrado e descrito aqui.

DEFINIÇÕES

[0045] No presente pedido, a expressão “culturas organotípicas do hipocampo (COHs)” refere-se a hipocampos fatiados a 400pm, dissecados em meio de cultivo e resfriados a 4°C.

[0046] No presente pedido, o termo “RT-qPCR” é usado quando o material de partida é RNA. Neste método, o RNA é primeiro transcrito em DNA complementar (cDNA). O cDNA é então usado como modelo para a reação de qPCR. RT-qPCR é usado em uma variedade de aplicações, incluindo análise de expressão do painel de biornarc adores. A referida análise de expressão pode ser realizada não somente por RT-qPCR, mas também por Northern blot, PCR digital e técnicas equivalentes.

[0047] No presente pedido, o termo “primers” refere-se a iniciadores desenhados para serem usados na reação de qPCR, para detectar a expressão dos genes candidatos a biomarcadores Adgrel, Ccl3, Dbx2, Disp3, Gmr3, Igfl, Illb, Rac2, Rasgrp3, Siglec5

Método para triagem de fármacos ou substâncias com potencial neuroprotetor

[0048] Em uma primeira concretização, a presente invenção fornece um método para triagem de fármacos ou substâncias com potencial neuroprotetor, compreendendo: a) prover culturas organotípicas do hipocampo, sendo: i) pelo menos uma cultura controle, não infectada e não tratada com o fármaco ou substância a ser triada; ii) pelo menos uma cultura que será infectada com o agente da etapa b) e não será tratada com o fármaco ou substância a ser triada; iii) pelo menos uma cultura controle que será tratada com o fármaco ou substância a ser triada; e iv) pelo menos uma cultura que será infectada com o agente da etapa b) e será tratada com o fármaco ou substância a ser triada; b) infectar as culturas estabelecidas em ii e iv com um agente infeccioso neuroinflamatório; c) incubar as culturas estabelecidas em iii e iv com um fármaco ou substância com potencial neuroprotetor a ser triado; d) extrair pelo menos um RNA mensageiro ou proteína de cada uma das pelo menos quatro subcultures estabelecidas; e e) determinar o padrão de expressão com base em um painel de biomarcadores de cada uma das pelo menos quatro subcultures estabelecidas e, assim, predizer o potencial neuroprotetor do fármaco ou substância triada. Em outra concretização, as culturas organotípicas do hipocampo são cultivadas por ao menos 14 dias para estabilização. Em outra concretização, o agente infeccioso neuroinflamatório utilizado para infecção das culturas é o ZIKV. Em outra concretização, os agentes infecciosos são os isolados de ZIKV PE243 e SPH2015. Em outra concretização, o fármaco ou substância a ser triada para o potencial neuroprotetor está em uma concentração de cerca de 0,5pM. Em outra concretização, a extração do ácido nucleico da etapa d) ocorre 16h após a realização das etapas b) e c). Em outra concretização, a determinação do padrão de expressão em um painel de biomarcadores da etapa e) é realizada com base na expressão de um ou mais dos genes Adgrel, Ccl3, Dbx2, Disp3, Gmr3, Igfl, Illb, Rac2, Rasgrp3, Siglec5 em relação ao padrão de expressão dos mesmos genes nas culturas controle. Em outra concretização o ácido nucleico extraído é RNA. Em outra concretização, a avaliação da expressão do painel de biomarcadores é realizada por RT-qPCR após transcrição reversa, Northern Blot, PCR digital, e técnicas equivalentes. Em uma outra concretização a metodologia é utilizada para a triagem de fármacos ou substâncias para controle da neuroinílamação e a prevenção da neurodegeneração associadas à infecção do sistema nervoso central pelo ZIKV.

Kit

[0049] Em uma segunda concretização, a presente invenção revela um kit para triagem de fármacos ou substâncias com potencial neuroprotetor. EXEMPLOS

[0050] Preparação das culturas organotípicas do hipocampo e avaliação da dinâmica de infecção, análises fenotípicas e transcricional das culturas, como representado (Figura 1)

ZIKV

[0051] Amostras dos isolados PE243 e SPH2015, cultivadas em células C6/36, foram cedidas pelo laboratório de Imunologia de Doenças Virais (IDV) do Instituto René Rachou (IRR)/ FIOCRUZ para a realização dos experimentos e armazenadas a -80°C.

Animais

[0052] Os ratos Wistar neonatos (7-10 dias) utilizados na produção das culturas organotípicas de hipocampo (COHs) foram obtidos do Instituto de Ciência e Tecnologia em Biomodelos (ICTB) (FIOCRUZ) e trazidos para o biotério de experimentação do IRR/ FIOCRUZ com uma fêmea lactante no dia anterior ao do experimento. Estes permaneceram com água e alimentos ad libitum, sob ciclos claro/escuro de 12-12 horas e em temperatura e umidade controladas (20-26°C, 40-60%, respectivamente). O presente método foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da FIOCRUZ (licença LW- 10/18).

Preparação das culturas organotípicas de hipocampo

[0053] As COHs foram preparadas segundo o método descrito por Stoppini et al. (35) com modificações. Após a eutanásia dos animais por decapitação, os cérebros foram removidos e os hipocampos dissecados em meio de cultivo (constituído de meio MEM Eagle + HEPES (Vitrocell Embriolife, Campinas, Brasil) acrescido de 25% de solução balanceada de Hanks 1x (Sigma, Basel, Suiça)), resfriado a 4°C. Em seguida, os hipocampos foram fatiados a 400pm utilizando-se um tissue chopper McIlwain (Mickle Laboratory Engeneering Co Ltda, Gomshal, Reino Unido).

[0054] Seis fatias provenientes de diferentes animais foram dispostas em cada inserto para cultura organotípica PICM0RG50 (Merck Millicell, Darmstadt, Alemanha), em uma placa de cultura de seis poços. Durante a primeira semana, as COHs foram cultivadas em 1 mL de meio de cultivo acrescido de 25% de soro equino (Bio Nutrientes do Brasil Ltda., Barueri, Brasil) inativado por calor. A partir do início da segunda semana, utilizou-se meio de cultivo sem o soro equino. Durante todo o experimento, as COHs foram mantidas em estufa com 5% de CO2, a 37°C, trocando-se metade do volume de meio a cada 2-3 dias. Após a fase de estabilização, as COHs apresentavam espessura média próxima de 40pm.

Infecção das COHs com ZIKV

[0055] A infecção das COHs com ZIKV foi realizada após ao menos 14 dias de cultivo (fase de estabilização). As culturas foram divididas em três grupos: controle (não infectado), infectado com o isolado PE243 e infectado com o isolado SPH2015.

[0056] Para a infecção, o meio de cultivo foi substituído por meio fresco contendo 6x10 ⁵ ufp/mL de ZIKV, sendo 1 mL abaixo das membranas e 0,2 mL acima de forma a cobrir as COHs. Para obtenção da concentração virai correta no meio, das alíquotas de estoque de SPH2015 e PE243 foram diluídas 48 vezes. As placas foram incubadas por duas horas em estufa a 37°C e 5% de CO ₂ , com agitação a cada 20 minutos. Ao final deste tempo, o meio com vírus foi removido e as membranas foram lavadas três vezes com meio sem ZIKV. A lavagem das COHs garante que apenas os viras que adsorveram as células permaneçam, evitando um novo ciclo de infecção proveniente de vírus restantes no meio. Finalmente, foi adicionado 1 mL de meio sob a membrana e a placa foi recolocada na estufa. Os controles foram igualmente submetidos ao mesmo protocolo, porém utilizando-se meio de cultura sem vírus.

Imunofluorescência

[0057] As COHs foram imunocoradas seguindo o método descrito por Gogolla e colaboradores (36) com adaptações. No tempo final de cada experimento, as COHs foram fixadas para imunocol oração nas seguintes soluções: paraformaldeído (PFA) 4% gelado (pH 7,2) por 5 minutos, metanol 20% gelado em tampão fosfato-salino (PBS) lx por 5 minutos, Tween 0,05% em PBS lx overnight e albumina do soro bovino (BSA) 20% em PBS 1x overnight. Foram realizadas lavagens com PBS lx entre as incubações. As COHs foram, então, escindidas dos insertos e seguiram para incubação com anticorpos. Para determinação da densidade de neurônios maduros nas COHs 8h, 24h, 48h, 5, 7 e 10 dias pós infecção (p.i.), foi realizada marcação de NeuN, proteína expressa no núcleo de neurônios maduros, com anticorpo anti-NeuN monoclonal de camundongo (1: 100, MAB377C3, Merck) ou policlonal de coelho (1:100, ABN78C3, Merck) conjugados com o fluoróforo Cy3. Para estimativa da densidade de partículas virais presentes nas COHs 8, 24 e 48h p.i., foi utilizado o anticorpo policlonal de coelho anti-NSl de ZIKV não conjugado (1 : 1.000). A avaliação da microglia ativada 8h, 24h e 48h p.i., foi realizada através da marcação de Ibal pelo anticorpo monoclonal de coelho anti-Ibal não conjugado (1:100, AB178847, ABCAM, Cambridge, Reino Unido) e a detecção da histona H3 trimetilada na lisina 4 (H3K4me3) 5, 7 e 10 dias p.i. foi feita com o anticorpo de camundongo anti-H3K4me3 não-conjugado (1:500, 05-1339, Merck ). Para marcação dos anticorpos não conjugados, foi utilizado anti-IgG de coelho (1:400, A 11034, ThermoFisher, Waltham, MA) ou de camundongo (1 :20.000, A10684, ThermoFisher) conjugados ao fluoróforo Alexa Fluor 488. Além disso, para identificação de células em apoptose 4 dias p.i., foi realizado o ensaio TUNEL com o kit Click-iT TUNEL AlexaFluor Imaging Assay Protocol (C10245, Thermo Fisher) seguindo as instruções do fabricante. Finalmente, todas as COHs foram marcadas com DAPI (4’,6’-diamino-2-fenil-indol) (1μg/mL, D1306, ThermoFisher) e as lâminas montadas com meio de montagem ProLong Diamond Antifade Mountant (P36961 , ThermoFisher). [0058] Foram produzidas lâminas de controle negativo, coradas apenas com DAPI ou com DAPI e anticorpo secundário, com o objetivo de ajustar os parâmetros para obtenção das imagens, excluindo, desta forma, possíveis pontos de autofluorescência do tecido e ruídos de fundo.

Microscopia Confocal

[0059] A captura das imagens das lâminas foi feita com o microscópio confocal Nikon Eclipse Ti (Nikon, Tóquio, Japão) com filtro de comprimentos de onda 488/561. As imagens foram obtidas no aumento de 10x, buscando-se áreas representativas, com maior cobertura de tecido celular. Para fotos representativas de detalhes das COHs utilizou-se o aumento de 60x ou 100x. Os parâmetros de fotografia foram definidos segundo o controle negativo.

[0060] As imagens foram analisadas com o auxílio do software NIS- Elements Analysis (Nikon). Os canais correspondentes às marcações DAPI+, NeuN+ e Ibal+ foram tratados com as ferramentas Noise Reduction, Gauss- Laplace Sharpen e Local Contrast. A área total de tecido foi determinada por meio da criação de uma máscara binária automática a partir do canal com a fluorescência DAP1+, seguida do uso da ferramenta Interest Region Manager (ROI). Para a contagem dos neurônios maduros, foi criada uma camada binária a partir da marcação NeuN+ (canal Cy3), selecionando e quantificando elementos com limiar de fluorescência > 10 AU. Esta quantificação foi posteriormente normalizada pela área tecidual (NeuN+/mm ² ).

[0061] Para detecção da área de marcação (Ibal+) e de regiões de interseção nas marcações dos canais de Cy3 e Alexa Fluor 488 (NeuN+ e NS1+, NeuN+ e TUNEL+ e NeuN+ e H3K4me3+) também foi criada uma máscara binária seguida de uma ROL Para quantificação da densidade de micróglia ativada através de Ibal, foram obtidos os valores de área identificados com a ROI e obtidos foram posteriormente divididos pela área total da fatia (área Ibal+/mm ² ). Para identificação da infecção viral, foi estimada a colocalização da marcação de NS1 (Alexa Fluor 488) com a de NeuN+ (Cy3) (número de células NeuN+ e NS1+ / número de células NeuN+) e a intensidade de fluorescência (IF) de NS1 por área de tecido (IF NSl/mm ² ). A marcação TUNEL+ (Alexa Fluor 488) foi colocalizada com a NeuN+ (Cy3) para estimar a razão de neurônios maduros apoptóticos (número de células NeuN+ e TUNEL+ / número de células NeuN+). Por fim, a IF da marcação para H3K4me3 (Alexa Fluor 488) foi normalizada pelo número de células NeuN+ (Cy3) e H3K4me3+ (IF H3K4me3+ / número de células NeuN+ e H3K4me3+), para estimar a intensidade desta marca epigenética em neurônios maduros.

Obtenção das amostras de RNA

[0062] O RNA total das COHs foi extraído utilizando-se uma combinação de Trizol (ThermoFisher) e clorofórmio (Merck), seguindo o protocolo do fabricante. Posteriormente, o RNA total foi purificado em uma coluna do kit miRNeasy Mini (217004, Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante, quantificado por fluorometria utilizando o kit Qubit RNA HS Assay (Q32852, Invitrogen, Carlsbad, CA) e o Fluorômetro Qubit 2.0 (Invitrogen) e avaliado quanto a sua pureza com o NanoDrop (Thermo Fisher).

RNA-Seq e análises de Bioinformática

[0063] As bibliotecas para sequenciamento foram produzidas utilizando-se o Kit rnRNA TruSeq Stranded (Illumina, San Diego, CA) e os fragmentos indexados foram sequenciados utilizando-se o Kit high throughput NextSeq 500/550 v2 (Illumina, San Diego, CA).

[0064] Para processamento das leituras brutas e remoção de bases de baixa qualidade ou leituras muito curtas (menos de 36 nucleotídeos) foi utilizado o software Trimmomatic (37). As leituras limpas foram então alinhadas ao genoma de referência de Rattus norvegicus (release 94) utilizando o software STAR (Spliced Transcripts Alignment to a Reference) (38), sendo as leituras situadas em um único sítio genômico utilizadas para o cálculo do número de leituras e do número de leituras por quilobase de transcrito por milhão de leituras mapeadas de cada gene (39). A análise de contraste entre os grupos infectados e o controle foi realizada utilizando-se o software DESeq2 (40). Genes com alteração de Fold Change maior que 1,2 e valor de P menor que 0,05 foram considerados diferencialmente expressos. Após o processamento dos dados, a análise de enriquecimento funcional foi realizada com o software Ingenuity Pathways Analysis (IPA), com parametrização default (QIAGEN Inc., https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuitypathw ay-analysis), a partir dos ENSEMBLE GENE IDs dos genes e seus respectivos valores de Fold. Change e de P (Tabelas 2 e 3).

Validação de genes biomarcadores por RT-qPCR

[0065] As amostras de RNA foram obtidas conforme descrito acima, a partir de pools de 6 COHs (duas por animal) dos grupos controle, infectado com o isolado PE243 ou infectado com o isolado SPH2015 às 16h p.i. O cDNA foi sintetizado a partir de 0,4 a 1 pg de RNA total utilizando o High- Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (ThermoFisher), de acordo com o protocolo do fabricante. As reações de qPCR foram feitas com Fast SYBR™ Green Master Mix (ThermoFisher) acrescido de 2 ng/pL de cDNA em volume final de 10 pL. Primers específicos para rato foram desenhados com o auxílio do software Primer-BLAST (NCBI, Bethesda, MD, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) para detectar os genes candidatos a biomarcadores Adgrel, Ccl3, Dbx2, Disp3, Gmr3, Igfl, Illb, Rac2, Rasgrp3, Siglec5 (Tabela 1). Os níveis de expressão destes genes foram normalizados para os níveis do gene endógeno Ppia. A ciclagem térmica e detecção de florescência foi realizada utilizando o sistema de PCR em tempo real ViiA 7 (ThermoFisher) de acordo com as recomendações do fabricante. A expressão relativa dos genes-alvos foi calculada através do método

2 ^Λ (-DCt).

Tabela 1 - Oligonucleotídeos usados para a quantificação, por RT-qPCR, da expressão de genes biomarcadores dos processos de neurodegeneração e resposta inflamatória regulados pelos isolados PE243 e SPH2015 de

ZIKV no início da infecção hípocampal

Análises estatísticas

[0066] As análises estatísticas foram realizadas com o software GraphPad Prism (versão 8.0.2) (GraphPad Software Inc., Irvine, CA). Os dados foram avaliados quanto à sua normalidade utilizando os testes de Anderson-Darling, D’Agostino & Pearson, Shapiro-Wilk e Kolmogorov- Smirnov. Para as comparações entre dois grupos de dados paramétricos foi utilizado teste t de Student não pareado, sendo os dados expressos como média ± desvio padrão. Para as comparações entre dados não paramétricos foi utilizado teste de Mann-Whitney e os dados foram expressos como mediana ± intervalo interquartil . Para a comparação entre três grupos ou mais, com dados paramétricos, foi utilizada a análise de variância (ANOVA) unidirecional com o pós-teste de múltiplas comparações de Tukey. Para dados não paramétricos, foi utilizado o teste de Kruskal- Wallis com pós-teste de múltiplas comparações de Dunn. Ainda, quando as comparações envolviam o efeito de dois fatores (ex: tempo e infecção), foi utilizado ANOVA bidirecional com pós-teste de múltiplas comparações de Tukey. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando os valores de P foram menores que 0,05.

Triagem de fármacos ou substâncias com potencial iieuroprotetor.

[0067] Culturas organotípicas de hipocampo (COHs) de ratos infantes com cerca de 7 dias de idade foram produzidas a partir de fatias do órgão com aproximadamente 400 micrômetros de espessura cultivadas para estabilização por, pelo menos, 14 dias. AS COHs foram então desafiadas pela infecção com ZIKV por meio de sua exposição a suspensões de meio de cultura contendo 6x10 ⁵ unidades formadoras de placas (UFP) por mililitro durante duas horas. Ao final dessas duas horas, os vírus não adsorvidos às células das COHs foram removidos por lavagem com meio de cultura fresco e as culturas foram incubadas por 16h em meio fresco contendo o fãrmaco ou substância cujo potencial neuroprotetor será testado. Foram incluídas nos testes COHs falsamente infectadas, expostas ao procedimento de infecção, mas com meio sem vírus, que servem de controles para avaliação da toxicidade das moléculas testadas em ausência da infecção e COHs infectadas tratadas com meio contendo o excipiente, mas não o fármaco ou substância testadas, que servem de controles da eficiência da infecção. Após a incubação por 16h, foram extraídos os RNAs (ou proteínas) e os níveis de expressão dos genes biomarcadores foram quantificados por RT-qPCR. Os resultados foram analisados na forma de gráficos de radar, evidenciando o efeito neuroprotetor e a possível toxicidade, respectivamente, do fármaco, substância ou molécula testada. Exemplo 1

Os isolados PE243 e SPH2015 infectam as COHs apresentando dinâmicas de proliferação distintas

[0068] Para verificar a adequação do modelo ao estudo proposto, a infecção e proliferação virai nas COHs foi avaliada por imunofluorescência e microscopia confocal, nos tempos iniciais da infecção, através da marcação de NS1. A NS1 é uma importante proteína não estrutural do ZIKV que atua na replicação virai e na regulação da resposte imune antiviral. Ela pode, ainda, induzir o remodelamento da membrana do retículo endoplasmático de forma a estabelecer um compartimento de replicação para o vinis (Revisado em: 41). A detecção do vinis através de uma proteína não estrutural permite comprovar sua replicação, excluindo-se ruídos que poderiam ser causados por vírus remanescentes da suspensão usada no processo de infecção experimental. [0069] A quantificação, por imunofluorescência e microscopia confocal, da proteína viral NS1 tempos iniciais da infecção demonstrou que ambos isolados de ZIKV infectaram e se replicaram satisfatoriamente nesse modelo. A avaliação da IF por área tecidual indicou que a expressão de NS1 pelo isolado SPH2015 aumentou significativamente entre 8h e 48h p.i.. Já a expressão de NS1 pelo isolado PE243 aumentou entre 8 e 24h p.i. e, em seguida, diminuiu às 48h (Figura 2). Portanto, os dois isolados de ZIKV apresentam dinâmicas de replicação distintas nesse modelo, o isolado PE243 proliferando mais rapidamente nas COHs que o PE243.

Exemplo 2

Os isolados PE243 e SPH2015 infectam neurônios maduros e têm tropismos diferentes por essas células

[0070] O ZIKV é capaz de infectar diversas células do SNC, como células progenitoras neurais (42), oligodendrócitos (43), micróglia (44), astrócitos, que parecem propagar a infecção no cérebro de embriões de camundongo (45) e em neurônios maduros (23). A infecção por ZIKV em células precursoras neurais já foi objeto de diversos estudos, entretanto, conhece-se menos sobre a infecção em outros tipos celulares e sobre a susceptibilidade à infecção no SNC maduro (22, 42, 46).

[0071] A análise da colocalização das proteínas NS1 e Neu N comprovou que os dois isolados do ZIKV infectam neurônios maduros no modelo de COHs (Figura 3). Às 8h p.i., o isolado SPH2015 foi capaz de infectar cerca de 10% dos neurônios maduros, enquanto o isolado PE243 infectava menos de 3% dessas células. Portanto, o SPH2015 tem maior tropismo por neurônios maduros nos períodos iniciais da infecção, quando comparado ao PE243. Os percentuais de neurônios infectados decresceram significativamente nos tempos posteriores de 24 e 48h. Como a análise de IF para NSl/mm ² das COHs demonstrou níveis elevados de infecção por SPH2015 e PE243 também após as 8h p.i., conclui-se que, com o passar do tempo, o vírus infecta com maior tropismo outros tipos celulares que não os neurônios maduros.

Exemplo 3

PE243 e SPH2015 causam alterações fenotípicas diferentes nas COHs

[0072] Buscou-se, então, determinar os impactos da infecção com esses diferentes isolados do ZIKV em dois aspectos críticos do fenótipo das COHs, quais sejam, a densidade neuronal e a ativação da micróglia.

[0073] Inicialmente, avaliou-se o efeito da infecção na densidade neuronal (NeuN+ / mm ² ) das COHs ao longo do tempo, desde 8h até 10 dias p.i. (Figuras 4 e 5). A área das COHs (DAPI+) não apresentou variação significativa ao longo deste período. Às 8h p.i., observou-se o aumento significativo da densidade de neurônios nas COHs infectadas em relação ao controle, indicando que a infecção por SPH2015 ou PE243 induz a neurogênese hipocampal. Entretanto, nos tempos seguintes, enquanto PE243 induziu a perda progressiva de neurônios até as 48h p.i., SPH2015 causou a perda pronunciada dessas células entre 8 e 24h p.i., seguida de um aumento entre 24 e 48h p.i. (Figura 4). Assim, evidenciam-se duas dinâmicas claramente distintas de neurodegeneração / neurogênese causadas pelos isolados PE243 e SPH2015 de ZIKV nos períodos iniciais da infecção.

[0074] O efeito da infecção na densidade neuronal também foi avaliado em tempos mais avançados (Figura 5). Entre cinco e dez dias p.i., as COHs infectadas com os dois isolados apresentavam a mesma densidade de neurônios, aproximadamente 75% do observado no grupo controle (Figura 5). Estes achados corroboram o relato prévio de que o ZIKV também causa perda neuronal em tempos tardios da infecção em modelo de COHs de camundongos neonatos (47). Comprovou-se, assim, a adequação do modelo aqui proposto de COHs de ratos infantes para o estudo da neurodegeneração associada à infecção pelo ZIKV.

[0075] A seguir, investigou-se a contribuição do processo de morte celular programada (apoptose) na perda neuronal causada pelo ZIKV nas COHs. Para isto, utilizou-se a marcação com TUNEL e NeuN seguida de microscopia confocal em COHs no quarto dia p.i. Observou-se que, pelo menos em parte, é possível atribuir o declínio da população neuronal à morte por apoptose, significativamente maior nas COHs infectadas (Figura 6).

[0076] Os resultados da análise por imunofluorescência e microscopia confocal da expressão da proteína Ibal, marcador de microglia ativada, demonstraram que a micróglia também se comportou de forma diferente a depender do isolado avaliado (Figura 7). A micróglia é uma população de células fagocíticas e mononucleates residentes no SNC, que respondem a estímulos potencialmente nocivos como infecções, dano tecidual e neurodegeneração alterando seus padrões de proliferação, transcrição e sua morfologia (Revisado em: 48). Se, por um lado, a infecção das COHs com SPH2015 ou PE243 não induziu a ativação da micróglia em comparação com as COHs do grupo controle, como evidenciado pela avaliação da expressão de Ibal nos tempos 8h e 24h p.i,., o segundo isolado inibiu esta resposta no tempo 8h. Conjuntamente, esses dados indicam que estes dois isolados de ZIKV, coletados durante o mesmo surto e com 99,9% de semelhança ao nível nucleotídico e 99,97% ao nível de aminoácidos (17), têm dinâmicas de infecção diferentes e induzem alterações fenotípicas distintas nas COHs.

Exemplo 4

Os isolados SPH2015 e PE243 induzem padrões distintos de alterações epigenétieas em neurônios maduros sobreviventes à infecção nas COHs [0077] Alterações epigenétieas são modificações na estrutura da cromatina ou de suas proteínas constituintes que levam ao aumento ou diminuição da expressão gênica. Estas modificações podem ser acetilações, metilações, entre outras (49). Outros membros da família Flaviviridae, como o vírus da dengue, podem induzir alterações epigenétieas nas células do hospedeiro como estratégia de evasão imune (50). Para investigar o possível efeito da infecção pelo ZIKV na funcionalidade dos neurônios das COHs, foi avaliada a marca epigenética H3K4me3, associada à eucromatina e estado ativo de expressão gênica, em tempos tardios da infecção. Interessantemente, o isolado SPH2015 causou um aumento pronunciado e progressivo da marca H3K4me3 nos dias 7 e 10 p.i.., enquanto o isolado PE243, por sua vez, causou um aumento menos expressivo desta marca nos dias 5 e 10 p.i. (Figura 8) Portanto, os isolados PE243 e SPH2015 podem afetar diferentemente a funcionalidade de neurônios maduros sobreviventes em tempos tardios da infecção.

Exemplo 5

Os isolados PE243 e SPH2015 causam padrões distintos de alterações do transcriptoma das COHs

[0078] A fim de investigar o efeito dos isolados PE243 e SPH2015 e nos padrões de expressão gênica global do hipocampo, o transcriptoma das COHs foi analisado às 16h p.i., tempo intermediário entre os períodos de neurogênese e neurodegeneração observados nas COHs infectadas. Foram observados 32 genes diferencialmente expressos nas COHs infectadas por PE243 e 113 genes diferencialmente expressos nas COHs infectadas por SPH2015 (Figura 9 e Tabelas 2 e 3).

Tabela 2 - Genes diferencialmente expressos nas COHs em resposta à infecção com o isolado PE243 16h p.i.

Nota: Em negrito estão destacados os genes com expressão diferencial em resposta à infecção tanto pelo PE 243 quanto pelo SPH2015

Tabela 3 - Genes diferencialmente expressos nas COHs em resposta à infecção com o isolado SPH2015 16h p.i.

Nota: Em negrito estão destacados os genes com expressão diferencial em resposta à infecção tanto pelo PE243 quanto pelo SPH2015.

[0079] A análise de enriquecimento funcional do conjunto de genes diferencialmente expressos, realizada com o software IPA, indicou importantes diferenças nos processos biológicos afetados em reposta à infecção pelos isolados PE243 e SPH2015 do ZIKV às 16h p.i.. Estes achados explicam, em grande parte, as diferenças fenotípicas observadas.

[0080] Corroborando a queda da população neuronal induzida pela infecção no período entre 8h e 24h p.i., os dois isolados causaram alterações na expressão de genes reguladores de processos de desenvolvimento de células do SNC. A infecção por SPH2015 induziu a regulação negativa de processos como o desenvolvimento de neurônios, diferenciação do tecido nervoso e diferenciação de oligodendrócitos, enquanto PE243 induziu a regulação negativa do processo mais genérico de proliferação de células cerebrais. Além disso, o isolado PE243 regulou positivamente os processos de apoptose e morte de neurônios. Os resultados indicam também que estes isolados do ZIKV podem induzir prejuízos ao desenvolvimento cognitivo- comportamental dos infectados, uma vez que os processos biológicos de memória espacial, neurotransmissão e mielinização do sistema nervoso tiveram regulação negativa predita (Figura 10). Conjuntamente, estes resultados corroboram fortemente as diferenças observadas nas variações de densidade neuronal nas COHs em resposta à infecção pelos isolados PE243 e SPH2015.

[0081] Além disso, os isolados PE243 e SPH2015 induziram padrões distintos de expressão diferencial de genes inflamatórios nas COHs às 16h p.i., corroborando o resultado de ativação de micróglia demonstrado por imunofluorescência para Ibal logo no início da infecção experimental (Figura 11). A resposta inflamatória foi predita como fortemente ativada por SPH2015 com aumento da expressão de mediadores pró-inflamatórios como Ccl2 (C-C motif chemokine ligand 2), Ccl3l3 (C-C motif chemokine liga nd 3 like 3), Cell (C-C motif chemokine ligand 4), Cxcló (C-X-C motif chemokine ligand 6), Ccl7 (C-C motif chemokine ligand 3) e Illb. As COHs infectadas com este isolado tiveram, ainda, predição positiva para os processos de ativação de neuroglia, astrocitose e gliose. Já para o isolado PE243 foi predita uma ativação tímida da resposta inflamatória às 16h p.i. Nota-se que os dois isolados regularam igualmente a expressão dos genes inflamatórios Ccl3, Rac2, Illb e Igfl. Ainda, em COHs infectadas pelo PE243, a produção de espécies reativas de oxigênio e a geração de superóxido estão preditas como inibidas e a síntese de óxido nítrico está predita como aumentada, A quantidade de cálcio foi predita como aumentada nas COHs infectadas pelo SPH2015 e reduzida pelo PE243 (Figura 11).

[0082] Os dois isolados de ZIKV induziram a expressão diferencial de 10 genes em comum: Adgrel {adhesion G protein-coupled receptor El), Ccl3l3 (C-C motif chemokine ligand 3 like 3), Dbx2 {developing brain homeobox 2), Disp3 (dispatched RND transporter family member 3 ), Gmr3 (glutamate metabotropic receptor 3), Igi'l {insulin like growth factor 1), Illb (interleukin 1 beta), Rac2 (Rac family small GTPase 2), Rasgrp3 (RAS guanyl releasing protein 3) e Siglec8 (sialic acid binding Ig like lectin 8) (Figura 9 e Tabelas 2 e 3). A expressão diferencial induzida pela infecção PE243 ou SPH2015 foi testada por RT-qPCR para oito desses genes representativos dos processos de morte neuronal e neurogênese e resposta inflamatória em um conjunto independente de amostras e os resultados confirmaram os achados do RNA-Seq (Figura 12),

[0083] Foi observada a diminuição da expressão dos genes Disp3 e Dbx2 nas COHs infectadas. O aumento da expressão de Disp3 estimula a proliferação e inibe a diferenciação de células progenitoras neurais (51). No mesmo sentido, o aumento da expressão de Dbx2 inibe a neurogênese primária em embriões de Xenopus in vitro (52). Portanto, uma inibição da expressão desses genes pode estimular a neurogênese. Este padrão de expressão pode ser um resquício da programação genética do hospedeiro ativada logo no início da infecção, que leva ao fenótipo observado às 8h p.i., quando as COHs infectadas apresentam maior densidade neuronal em relação aos controles.

[0084] Concomitantemente, observou-se a superexpressão de Illb e Ccl3, importantes mediadores inflamatórios. A citocina IL-1β, como destacado anteriormente, pode estar relacionada a mecanismos de excitotoxicidade e morte celular (53). CCL3, por sua vez, é importante para o recrutamento de células inflamatórias para o sítio do insulto e foi demonstrado que, no hipocampo, possui efeitos negativos na transmissão sináptica, plasticidade e memória (54). Outro importante gene associado à inflamação é o Adgrel, que mostrou aumento da expressão às 16h p.i. Este gene codifica o antígeno F4/80, expresso pela micróglia hipocampal (55). Sua expressão aumentada indica a proliferação da micróglia nas COHs às 16h p.i.. Também com expressão aumentada, o gene Rac2 codifica um membro da superfamília Ras de pequenas proteínas metabolizadoras de guanosina trifosfato (GTP). Essa proteína regula a atividade de NADPH oxidase, que, por sua vez, media a geração de ROS em células como leucócitos fagocíticos e micróglia (56, 57). Ademais, Siglecó teve sua expressão aumentada pela infecção. Siglecs são proteínas de superfície membros da superfamília das imunoglobulinas que se ligam ao ácido siálico e são expressas principalmente em células hematopoiéticas (58). A sinalização via Siglec inibe a resposta imune pró-inflamatória e a fagocitose na micróglia (Reviewed in: (59)). Em seu conjunto, a expressão aumentada de Adgrel e Rac2 e diminuída de Siglec5 apontam para mecanismos aparentemente antagônicos de estímulo à proliferação da micróglia e concomitante inibição de sua atividade pró- inflamatória.

[0085] O gene Igfl teve sua expressão diminuída pela infecção com ZI KV. A ligação da proteína IGF1 ao seu principal receptor IGF1R ativa as vias de PI3K/AKT (Phosphatidylinositol 3-kinase/Protein kinase B) e MAPK (Mitogen activated protein kinase), principalmente a via ERK (Extracellular signal-regulated kinase). A via PI3K/AKT está relacionada à regulação de processos como proliferação celular, autofagia e apoptose e também é importante na resposta antiviral. A ativação induzida por vírus de PI3K/AKT está relacionada à inibição de apoptose, o que possibilita um maior potencial de replicação virai. Entretanto, esse bloqueio causado pelo vírus geralmente desencadeia a expressão de ISGs. A via ERK/MAPK está relacionada ao aumento da diferenciação e proliferação celular (Revisado em:60). Rasgrp3, cuja expressão foi inibida pela infecção com ZIKV, está envolvido na ativação da via ERK/MAPK através da proteína Ras (61).

[0086] Com expressão diminuída, o gene Grm3 codifica o receptor de glutamato acoplado à proteína G 3 (mGluR3), expresso em neurônios e células da glia em regiões como o giro denteado do hipocampo (62). mGLUR3 está presente nos terminais pré- e pós-sinápticos e atua em canais de cálcio dependentes de voltagem, participando, assim, da modulação da neurotransmissão (63). A diminuição da expressão desse gene às 16h p.i. pode ser consequência da perda de neurônios observada entre 8h e 24h p.i..

[0087] Este painel de biomarcadores representa um resquício da programação genética responsável pela neurogênese observada até as 8h p.i., ao mesmo tempo em que corrobora o fenótipo de perda neuronal no período entre 8h e 24 h e o importante papel da resposta inflamatória no início da infecção pelos dois isolados de ZIKV testados.

Exemplo 6

Demonstração do potencial neuroprotetor do Cinamaldeído e a Difenidramina no modelo de COHs da presente invenção

[0088] Dois fármacos neuroprotetores foram selecionados a partir de uma análise da literatura científica para avaliação do seu efeito na modulação do painel de biomarcadores da presente invenção e validação da presente metodologia: o cinamaldeído (Drugbank ID: DB 14184) e a difenidramina (Drugbank ID: DB01075). O cinamaldeído (Drugbank ID: DB14184), presente na casca das espécies de Cinnamomum possui múltiplas propriedades funcionais, incluindo propriedades anticâncer, anti-inflamatórias e antíoxidantes. A supressão dos receptores de NMDA foi apontada como parte do mecanismo de ação neuroprotetora do cinamaldeído contra a neuro toxicidade do amiloide beta (64). O cloridrato de difenidramina é um anti-histamínico, bloqueador de receptores Hl, de primeira geração, com atividade anticolinérgica, indicado para prevenção e tratamento de reações alérgicas relacionadas à transfusão de sangue ou plasma e como adjuvante da epinefrina na anafilaxia. Recentemente, foi demonstrado o efeito neuroprotetor da difenidramina em modelo experimental de lesão cerebral por trauma em ratos. O mecanismo de ação envolve a atenuação do estresse oxidativo, da inflamação e das vias mitocondriais de apoptose (65).

[0089] Seguindo o fluxograma da Figura 13, o potencial neuroprotetor desses dois fármacos foi avaliado. Como demonstrado nas Figuras 14 e 15, respectivamente, tanto o Cinamaldeído quanto a Difenidramina modularam a expressão dos genes biomarcadores desta invenção, revertendo parcialmente o efeito da infecção com o ZIKV sobre esses biomarcadores.

[0090] O tratamento com esses fármacos aumentou a expressão do gene Dbx2, que inibe a neurogênese primária. Desta forma, os dois fármacos atenuam o efeito estimulador da diferenciação exacerbada e precoce das células progenitoras neurais pela infecção com o ZIKV contribuindo para a preservação do plantei destas células.

[0091] Além disso, o tratamento com cinamaldeído ou difenidramina reduziu a expressão do gene Siglec 5 e aumentou a expressão de Adgrel. A sinalização via Siglec inibe a resposta imune pró -inflamatória e a fagocitose na microglia e o aumento da expressão de Adgrel, que codifica o antígeno F4/80, indicando a proliferação da microglia. Portanto, os dois fármacos contribuem para a proliferação da micróglia e a ativação de sua atividade fagocítica, favorecendo assim a eliminação das células infectadas e resíduos de células mortas ou inviáveis no tecido hipocampal.

[0092] O tratamento com difenidramina inibiu a expressão do gene Rac2, que codifica um membro da superfamília Ras de pequenas proteínas metabolizadoras de guanosina trifosfato (GTP). Essa proteína regula a atividade de NADPH oxidase, que, por sua vez, media a geração de espécies reativas de oxigênio em células de micróglia. Portanto, a difenidramina contribui para a redução do estresse oxidativo na neuroinflamação causada pela infecção pelo ZIKV.

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