AREVALO RODRIGUEZ MIGUEL (ES)
VELASCO UMPIERREZ ISABEL (ES)
CEBOLLA RAMIREZ ANGEL (ES)
AREVALO RODRIGUEZ MIGUEL (ES)
VELASCO UMPIERREZ ISABEL (ES)
| WO2009034203A1 | 2009-03-19 |
SIVARS U ET AL.: "Affinity partitioning of a poly(histidine)-tagged integral membrane protein, cytochrome bo3 ubiquinol oxidase, in a detergent-polymer aqueous two-phase system containing metal-chelating polymer", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B : BIOMEDICAL APPLICATIONS, vol. 743, no. 1-2, 23 June 2000 (2000-06-23), NL, pages 307 - 316, XP027432456, DOI: doi:10.1016/S0378-4347(00)00113-4
| REIVINDICACIONES 1. Procedimiento para el reparto o separación de proteínas o polipéptidos etiquetados con polihistidina caracterizado porque comprende: a) poner en contacto i) una preparación con una pluralidad de proteínas que contiene al menos una proteína o polipéptido de fusión a polihistidina que se quiere separar ii) una mezcla de agua, polietilenglicol (PEG) y sales u otros polímeros solubles en agua en más de un 5%, con un pH superior a 7,6. La mezcla resultante se estructura espontáneamente en un sistema binario de dos fases acuosas, A y B, donde la fase A contiene una mayor concentración de PEG que la fase B, y donde quedan retenidas mayoritariamente las proteínas o polipéptidos de fusión a polihistidina. b) la posibilidad opcional de suprimir el reparto preferente de las proteínas o polipéptidos de fusión a polihistidina a la fase A mediante la acidificación del sistema inicial a pH menor de 7 o adición de colina a una concentración superior a 50 mM. 2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración total de PEG en el sistema binario está comprendida entre el 3 y el 15%. 3. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 2, caracterizado porque la sal presente en la fase B del sistema binario se selecciona entre una sal de fosfato, una sal de citrato, una sal de sulfato o una mezcla de estas sales. 4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3 caracterizado porque la sal presente en la fase B del sistema binario contiene fosfato potásico a una concentración comprendida entre el 5 y el 15%, y el pH de la mezcla tiene un valor comprendido entre 7,6 y 10,0. 5.- El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 4, caracterizado porque la secuencia de polihistidina contiene al menos 6 residuos de histidinas. 6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 5, caracterizado porque dicha pluralidad de proteínas que contiene las proteínas o polipéptidos fusionados a polihistidina es un extracto celular, medio extracelular o fracción celular de un cultivo de células de mamíferos, insectos, hongos, levaduras, o bacterias. 7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera ae las reivindicaciones anteriores 1 a 6, caracterizado porque dicha pluralidad de proteínas que contiene las proteínas o polipéptidos fusionados a polihistidina es una preparación parcialmente purificada mediante cromatografía por afinidad a iones metálicos (IMAC). 8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 7, caracterizado porque además comprende una etapa de eliminación de las proteínas del extracto celular, del medio extracelular o de la preparación parcialmente purificada, que no se acumulan en la fase A descartando la fase B. 9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque las proteínas que no se separan preferentemente en la fase A se eliminan cuantitativamente mediante las siguientes etapas: i) adición de una cantidad de solución equivalente en composición y volumen a la fase B descartada, ii) mezcla y separación en dos fases, A y B, iii) eliminación de la fase B contraria a la fase rica en PEG; y iv) opcionalmente la repetición de las etapas anteriores. 10. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 9, caracterizado porque la fase A rica en PEG conteniendo la proteína de interés fusionada a polihistidina se utiliza directamente para obtener el polipéptido o proteína de interés en forma purificada. 1 1. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 9, caracterizado porque se suprime el reparto preferente de las proteínas o polipéptidos fusionados a polihistidina hacia la fase A rica en PEG, mediante la adición de una solución equivalente en composición y volumen a la fase B descartada pero a la que se añade colina a una concentración superior a 50 mM. 12. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 9, caracterizado porque se suprime el reparto preferente de las proteínas o polipéptidos fusionados a polihistidina hacia la fase A rica en PEG, mediante la adición de una solución equivalente en composición y volumen a la fase B descartada pero en la que se acidifica el pH a un valor menor de 7. 13. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la proteína o polipéptido fusionado a polihistidina es un catalizador y el sistema binario resultante puede usarse directamente como reactor, para catalizar una reacción de interés en la que dicho catalizador permanece en la fase A rica en PEG y el (los) producto(s) de la reacción pueden ser recuperados de la fase B opuesta, pobre en PEG. 14. Preparaciones de proteínas o polipéptidos recombinantes etiquetados con polihistidina obtenidas según alguna de las reivindicaciones 1 a 12. 15. Kit para realizar un procedimiento de separación de proteínas o polipéptidos etiquetados con polihistidina según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 12 que comprende los siguientes componentes: i) una solución acuosa con una concentración de PEG igual o superior al 3%; ii) una solución acuosa a un pH igual o superior a 7,6 conteniendo una sal de fosfato, o bien una sal de citrato, o bien una sal de sulfato o una mezcla de ellas; y opcionalmente iii) una solución de colina a una concentración superior a 50 mM. iv) una solución de PEG a concentración superior a 2% tamponada a pH menor a 7 con una sal que contenga al menos alguno de los compuestos siguientes: fosfato, citrato, o sulfato.; v) una resina o membrana cromatográfica que contenga iones metálicos de transición inmovilizados, adecuada para realizar purificación mediante IMAC. |
| REIVINDICACIONES MODIFICADAS recibidas por la oficina Internacional el 10 de julio de 2013 (10.07.2013) 1. Procedimiento para el reparto o separación de proteínas o polipéptidos etiquetados con polihistidina caracterizado porque comprende: a) poner en contacto i) una preparación con una pluralidad de proteínas que contiene al menos una proteína o polipéptido de fusión a polihistidina que se quiere separar ii) una mezcla de agua, polietilenglicol (PEG) y sales u otros polímeros solubles en agua en más de un 5%, con un pH superior a 7,6. La mezcla resultante se estructura espontáneamente en un sistema binario de dos fases acuosas, A y B, donde la fase A contiene una mayor concentración de PEXJ que la fase B, y donde quedan retenidas mayoritariamente las proteínas o polipéptidos de fusión a polihistidina. b) la posibilidad opcional de suprimir el reparto preferente de las proteínas o polipéptidos de fusión a polihistidina a la fase A mediante la acidificación del sistema inicial a pH menor de 7 o adición de colina a una concentración superior a 50 mM. 2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración total de PEG en el sistema binario está comprendida entre el 3 y el 15%. 3. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 2, caracterizado porque la sal presente en la fase B del sistema binario se selecciona entre una sal de fosfato, una sal de citrato, una sal de sulfato o una mezcla de estas sales. 4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3 caracterizado porque la sal presente en la fase B del sistema binario contiene fosfato potásico a una concentración comprendida entre el 5 y el 15%, y el pH de la mezcla tiene un valor comprendido entre 7,6 y 10,0. 5. - El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 4, caracterizado porque la secuencia de polihistidina contiene al menos 6 residuos de histidinas. 6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 5, caracterizado porque dicha pluralidad de proteínas que contiene las proteínas o polipéptidos fusionados a polihistidina es un extracto celular, medio extracelular o fracción celular de un cultivo de células de mamíferos, insectos, hongos, levaduras, o bacterias. 7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 6, caracterizado porque dicha pluralidad de proteínas que contiene las proteínas o polipéptidos fusionados a polihistidina es una preparación parcialmente purificada mediante cromatografía por afinidad a iones metálicos (EV1AC). 8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 7, caracterizado porque además comprende una etapa de eliminación de las proteínas del extracto celular, del medio extracelular o de la preparación parcialmente purificada, que no se acumulan en la fase A descartando la fase B. 9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque las proteínas que no se separan preferentemente en la fase A se eliminan cuantitativamente mediante las siguientes etapas: i) adición de una cantidad de solución equivalente en composición y volumen a la fase B descartada, ii) mezcla y separación en dos fases, A y B, iii) eliminación de la fase B contraria a la fase rica en PEG; y iv) opcionalmente la repetición de las etapas anteriores. 10. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 9, caracterizado porque la fase A rica en PEG conteniendo la proteína de interés fusionada a polihistidina se utiliza directamente para obtener el polipéptido o proteína de interés en forma purificada 11. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 9, caracterizado porque se suprime el reparto preferente de las proteínas o polipéptidos fusionados a polihistidina hacia la fase A rica en PEG, mediante la adición de una solución equivalente en composición y volumen a la fase B descartada pero a la que se añade colina a una concentración superior a 50 mM. 12. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 9, caracterizado porque se suprime el reparto preferente de las proteínas o polipéptidos fusionados a polihistidina hacia la fase A rica en PEG, mediante la adición de una solución equivalente en composición y volumen a la fase B descartada pero en la que se acidifica el pH a un valor menor de 7. 13. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la proteína o polipéptido fusionado a polihistidina es un catalizador y el sistema binario resultante puede usarse directamente como reactor, para catalizar una reacción de interés en la que dicho catalizador permanece en la fase A rica en PEG y el (los) producto(s) de la reacción pueden ser recuperados de la fase B opuesta, pobre en PEG. 14. Canceled 15. Kit para realizar un procedimiento de separación de proteínas o polipéptidos etiquetados con polihistidina según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 12 que comprende los siguientes componentes: i) una solución acuosa con una concentración de PEG igual o superior al 3%; ii) una solución acuosa a un pH igual o superior a 7,6 conteniendo una sal de fosfato, o bien una sal de citrato, o bien una sal de sulfato o una mezcla de ellas; y opcionalmente iii) una solución de colina a una concentración superior a 50 mM. iv) una solución de PEG a concentración superior a 2% tamponada a pH menor a 7 con una sal que contenga al menos alguno de los compuestos siguientes: fosfato, citrato, o sulfato.; v) una resina o membrana cromatográfica que contenga iones metálicos de transición inmovilizados, adecuada para realizar purificación mediante IMAC. |
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención se refiere a un método de separación de polipéptidos o proteínas fusionados a secuencias de polihistidina ("His-Tag"), en sistemas acuosos de dos fases (ATPS, del inglés "aqueous two-phase systems"). Este método aprovecha la separación preferente de los péptidos y proteínas etiquetados con histidina en una de las dos fases del sistema acuoso, permitiendo una separación rápida de dichos péptidos y proteínas a partir de una mezcla proteica compleja que se encuentre en un extracto celular, gracias a un proceso sencillo que puede usarse para la purificación de polipéptidos o proteínas de interés. El proceso de purificación puede incluir uno o más pasos de lavado y en su forma preferente de realización, concluye con una inversión de la preferencia de separación del polipéptido etiquetado inducido por un cambio de pH o por la adición de ciertos compuestos, como la colina, lo que lleva a la recuperación de dicho polipéptido en la fase opuesta por aumentar considerablemente la preferencia por la fase rica en sales.
El sector de aplicación de esta invención comprende, por lo tanto, la separación y la eventual purificación de polipéptidos y proteínas de interés biotecnológico, ya sea con fines industriales, agronómicos, terapéuticos o de diagnóstico en biomedicina, o como una herramienta de investigación y análisis de proteínas en el campo de las ciencias de la vida.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La estrategia más extendida en la actualidad para purificar proteínas recombinantes mediante cromatografía de afinidad con fines de caracterización bioquímica y/o estructural consiste en el etiquetado con colas de histidina. Se trata de emplear las técnicas de ADN recombinante para fusionar un pequeño péptido de polihistidina (cola de histidina) generalmente con seis residuos, al extremo amino o carboxilo terminal de la proteína objeto de estudio para, a continuación, proceder a la purificación de la proteína etiquetada mediante cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados (IMAC).
La técnica IMAC fue descrita por Porath et al. en 1975 (Porath J et al. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature 1975; 258:598-599), y se basa en la interacción entre un ion metálico de transición inmovilizado en una matriz, como Co , Ni , Cu o Zn , y las cadenas laterales de ciertos aminoácidos, siendo la histidina el aminoácido que muestra la unión más fuerte con estos iones. Esta técnica se convirtió rápidamente en el método de elección entre los investigadores párá él aislamiento" de pfóteñYafe; realizándose muchas mejoras desde su primera introducción. Probablemente una de las mejoras más importantes fue el uso de etiquetas de polihistidina fusionadas para la purificación de proteínas recombinantes (Hochuli E et al. New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptide containing neighbouring histidine residues. J Chromatogrl 987; 41 1 : 177-184; Hochuli E et al. Genetic approach to facilítate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsorbent. Bio/Technology 1988; 6:1321-1325). Aunque la técnica funciona con un número de entre cuatro y diez histidinas añadidas a los extremos N-terminal o C-terminal del polipéptido que se quiere purificar, las etiquetas con seis histidinas son las que han demostrado tener el mejor balance en especificidad y menor número de aminoácidos añadidos a la proteína de fusión.
En cuanto a los soportes cromatográficos, Porath empleó el ácido iminodiacético (IDA) como ligando para fijar el metal en cuestión a agarosa. Aunque hoy en día aún se usa IDA para la fabricación de muchas resinas IMAC, su eficiencia ha sido mejorada gracias a la invención de otros ligandos quelantes, como el ácido nitrilotriacético (NTA) (Hochuli E et al. New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptide containing neighbouring histidine residues. J Chromatogr 1987; 41 1 :177-184). Actualmente se dispone de un amplio espectro de resinas comerciales con pequeñas diferencias en cuanto a la capacidad y fuerza de unión. Para tener una visión más reciente y completa, ver Block E. et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods in Enzymology 2009; 463 : 439-473.
El procedimiento cromatografía) consiste en añadir al soporte IMAC escogido un extracto crudo celular que contiene, entre las proteínas originales del organismo hospedador (con frecuencia una bacteria), la proteína recombinante etiquetada con histidina. Seguidamente, se procede a eliminar los contaminantes unidos débilmente a la columna. Finalmente, la proteína etiquetada con histidina se eluye de la columna con un gradiente de imidazol que compite con la proteína por la unión al ion metálico inmovilizado (Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentáis to comercial systems. Appl Microbiol Biotechnol 2003; 60:523-533; Gráslund S et al. Protein production and purification. Nature Methods 2008; 5:135-146). Las ventajas que ofrece la purificación IMAC de proteínas etiquetadas con polihistidina, en comparación con otras cromatografías de afinidad son múltiples. Además de su bajo coste y simplicidad de uso, la robustez de este método es la causa de que se haya convertido en la técnica cromatográfica más extendida. Así, la interacción entre la cola de histidina y el ligando metálico es capaz de resistir: condiciones desnaturalizantes como urea o hidrocloruro de guanidinio, condiciones reductoras y oxidantes, y presencia de un amplio rango de reactivos químicos y agentes caotrópicos. Por otra parte, a las ventajas propias de la técnica IMAC, se le suman las ventajas aportadas por la etiqueta de polihistidina que básicamente radican en su pequeño tamaño, el cual se ha demostrado en muchos casos que interfiere mínimamente en la actividad o en la estructura de la proteína objeto de estudio, además de permitir la cristalización de algunas proteínas para la resolución de su estructura tridimensional.
Sin embargo, a pesar de su alta compatibilidad, la purificación IMAC tiene algunas limitaciones. Por ejemplo, es obvio que se debe restringir o incluso evitar el uso de ciertos agentes quelantes como el EGTA y el EDTA, comúnmente utilizado como inhibidor de proteasas, y de agentes reductores como el 2-mercaptoetanol o el ditiotritol (DTT). Otra desventaja de la purificación IMAC consiste en las posibles contaminaciones de imidazol o de trazas de iones metálicos en las preparaciones finales, que son indeseables en aquellos casos en los que se usan las proteínas purificadas para estudiar su interacción con organismos vivos.
Por otro lado, los protocolos usados pueden afectar a la estructura y actividad de metaloproteínas (proteínas que usan iones metálicos como cofactores), que pueden conducir a que la proteína purificada pierda los cofactores metálicos o a la incorporación de otros iones metálicos que no sean los cofactores. En otros casos, el imidazol puede establecer interacciones estables con el cofactor metálico, perturbando la función y la estructura de la proteína (Kokhan et al. 2010 Binding of imidazole to the heme of cytochrome el and inhibition of the bel complex from Rhodobacter sphaeroides I. Equilibrium and modeling studies. J Biol Chem, 285, 22513- 21). Estudios recientes indican que las metaloproteínas pueden representar una proporción considerable de las proteínas celulares. Se calcula que entre una cuarta parte y un tercio de todas las proteínas requieren metales para desempeñar sus funciones, limitando por lo tanto la idoneidad de la tecnología IMAC para la purificación de este tipo de proteínas. Por último, cuando se compara con otras cromatografías de afinidad basadas en diferentes etiquetas, la tecnología IMAC suele proporcionar menor grado de pureza (Lichty et al. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expression and Purification 2005; 41 :98-105). Así, por ejemplo, se ha visto que cuando se emplea Escherichia coli como sistema de expresión, las proteínas de la célula hospedadora pueden copurificar junto con las proteínas etiquetadas con polihistidina y contaminar la purificación interaccionando con el ión metálico inmovilizado (a través de motivos específicos de unión a metales, o debido a la presencia en su estructura de residuos de histidina agrupados y expuestos en la superficie), uniéndose a la matriz que actúa como soporte (por ejemplo, agarosa) o interaccionando directamente con la proteína recombinante (por ejemplo, chaperonas). Para evitar la copurificación indeseable de estas proteínas o bien para prevenir su adsorción, se han propuesto varias soluciones, como realizar algún paso de purificación adicional, ajustar la proporción de proteína etiquetada con polihistidina a la resina o usar iones metálicos alternativos (como Co 2+ en vez de Ni 2+ , por ejemplo), usar alguna estirpe hospedadora modificada para que no exprese ciertas proteínas ocortar la etiqueta y llevar a cabo una cromatografía inversa (Block E et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods in Enzymology 2009; 463: 439-473).
Aparte de los inconvenientes citados, propios de la purificación IMAC, pueden considerarse otros que son comunes al uso de métodos cromatográficos basados en soportes sólidos, como el escalado de los procedimientos cromatográficos para su utilización industrial, lo que conlleva una serie de dificultades técnicas que provienen fundamentalmente de la compresibilidad de los materiales y la necesidad de aplicar altas presiones en la columna, de las limitaciones en la transferencia de masa y de los complejos procedimientos de limpieza y desinfección que se requieren para el reciclaje de la columna. Además, las proteínas capturadas mediante cromatografía de fase sólida pueden estar expuestas a fuerzas de tensión superficial que pueden dar como resultado la pérdida de su estructura nativa.
Por este motivo, se ha emprendido la búsqueda de nuevos métodos que utilicen exclusivamente soluciones líquidas y que constituyan una alternativa al empleo de materiales sólidos. Uno de estos métodos son los sistemas de dos fases acuosos, que se generan espontáneamente por la mezcla de ciertas soluciones de dos polímeros estructuralmente diferentes, o por la mezcla de un polímero, frecuentemente polietilenglicol (PEG), y altas concentraciones de una sal, como el fosfato potásico, que se separan espontáneamente en dos fases líquidas de distinta densidad y composición (Johansson H ed. Aqueous Two-Phase Systems. Methods in Enzymology 1994;228; Guan Y et al. New approaches to aqueous polymer systems: theory, thermodynamics and applications to biomolecular separations. Puré and Applied Chemistry 1995; 67:955-962; Andrews B et al. Correlation for the partition behavior of proteins in aqueous two-phase systems: effect of surface hydrophobicity and charge. Biotechnol Bioeng 2005; 90:380-90). Las propiedades físico-químicas de estas mezclas han sido ampliamente estudiadas y, a través de los valores iniciales de concentración del polímero y de la sal, pueden predecirse la composición final y los volúmenes relativos (Cabezas H. Theory of phase formation in aqueous two-phase systems. J Chromatogr B Biomed Appl 1996; 680:3-30; Johansson H ed. Aqueous Two-Phase Systems. Methods in Enzymology 1994; 228).
Los sistemas acuosos de dos fases tienen una gran utilidad en la separación de materiales biológicos (Hustedt H et al. Applications of phase partitioning in biotechnology. Partitioning in aqueous two-phase systems: theory, methods, uses and applications in biotechnology. Walter, Brooks and Fisher, editors. 1985. Academic Press; 529-587; Persson, J et al. Purification of recombinant and human apolipoprotein A-l using surfactant micelles in aqueous two-phase systems: recycling of thermo separating polymer and surfactant with temperature-induced phase separation. Biotechnol Bioeng 1999; 65:371-81). Entre sus principales ventajas se encuentran la alta biocompatibilidad, la baja tensión superficial, una alta capacidad de carga y rendimiento, y la facilidad de escalado (Albertsson P. Partition of cell particles and macromolecules.1986, New York: Wiley; Walter H et al. Partitioning in aqueous two-phase systems: recent results. Anal Biochem 1991 ; 197: 1-18). El reparto de proteínas entre las dos fases es dependiente de factores tales como la carga, el tamaño y la hidrofobicidad de la proteína en cuestión, y es una cuestión en general poco predecible, lo que constituye la razón principal de que los sistemas acuosos de dos fases no estén más extendidos para la purificación de proteínas. De hecho, la mayor implantación en el mercado de estos sistemas viene limitada por la baja predictibilidad en la partición de las proteínas. En este sentido, recientemente se ha descrito un sistema de partición por afinidad en dos fases acuosas de proteínas fusionadas a dominios de unión a colina (LYTAG) que da lugar a niveles considerables de pureza. Este sistema conduce al reparto de la proteína preferentemente en la fase rica en PEG mediante la interacción específica con este polímero (Maestro B et al. Affínity partitioning of proteins tagged with choline-binding modules in aqueous two-phase systems. Journal of Chromatography A, 2008: 189-196). Otro ejemplo es el etiquetado con tirosina (Fexby S et al. Partitioning and characterization of tyrosine-tagged green fluorescent proteins in aqueous two-phase systems. Biotechnol Prog 2004; 20:793-8) o con secuencias ricas en triptófano (Collen A et al. Genetic engineering of the Trichoderma reesei endoglucanase I (Cel7B) for enhanced partitioning in aqueous two-phase systems containing thermoseparating ethylene oxide-propylene oxide copolymers. J Biotechnol 2001 ; 87:79-91), el etiquetado con dominios hidrofóbicos (patente US20060084164), el etiquetado con epítopos específicos de anticuerpos (patente WO2008088200), o un péptido de unión a polisacáridos (patente US6048715). También se han obtenido resultados prometedores usando la etiqueta de polihistidina (Chung B et al. Metal affínity partitioning. Aqueous Two-Phase Systems. Johansson H editor 1994; 167-277; Birkenmeier G et al. Immobilized metal ion affínity partitioning, a method combining metal-protein interaction and partitioning of proteins in aqueous two-phase systems. J Chromatogr 1991 ; 539:267-77; patente US283339).
Mientras que el sistema de reparto por afinidad en sistemas acuosos de dos fases mediado por polihistidina descrito en las publicaciones citadas anteriormente representa una mejora significativa tanto de la tecnología IMAC como de la tecnología de sistemas acuosos de dos fases, siguen requiriendo el uso de iones metálicos e imidazol. Por esta razón, este método no debería considerarse como la primera opción para la purificación de metaloproteínas o cuandola presencia de trazas de imidazol o de iones metálicos pueda interferir con el material purificado.
La presente invención puede aplicarse a la separación basada en sistemas acuosos de dos fases de péptidos y proteínas etiquetados con secuencias de polihistidina, siguiendo un procedimiento que evita el uso de imidazol e iones metálicos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El objeto de la presente invención es un procedimiento para el reparto, separación y purificación en solución acuosa de polipéptidos o proteínas recombinantes que han sido etiquetadas con colas de histidinas. El desarrollo de este procedimiento se fundamenta en la observación de que los péptidos y proteínas fusionados a colas de polihistidinas en sus extremos N- o C- terminal se localizan preferentemente en la fase rica en PEG cuando se los somete a una separación en dos fases acuosas compuestas por dicho polímero y una sal, preferentemente potasio o fosfato, a pH superiores a 7,6 (preferiblemente a pH entre 8,0 y 9,5). Las cadenas laterales de imidazol de los residuos de histidina no se protonan en su mayoría a pH>7,6 (pKa de la histidina es 6,5), lo que resulta en una interacción más favorable con la fase rica en PEG que con la fase de mayor fuerza iónica. A pH menores de 6,0, las cadenas laterales de la histidina se encuentran en su mayoría protonadas, y al estar cargada positivamente provoca que aumente la preferencia por la fase con mayor fuerza iónica. Por lo tanto, este reparto preferente de las proteínas etiquetadas con polihistidina puede invertirse reduciéndose el pH. Se ha observado que la presencia de aditivos como colina puede invertir también la presencia de reparto de la proteína etiquetada hacia la fase con más fuerza iónica. Tras la separación de las fases, los contaminantes que no se localicen preferentemente en la fase rica en PEG pueden lavarse mediante la separación de la fase rica en PEG, que es la que contiene los péptidos y proteínas etiquetados con histidinas, de la fase opuesta (pobre en PEG), y mezclándola con el mismo volumen de una solución acuosa que tenga una composición equivalente a la fase descartada en cuanto a pH, PEG y sales. Tras la formación de la nueva fase, los péptidos y proteínas etiquetados pueden recuperarse de la fase rica en PEG y separarse de los contaminantes no deseados mediante procedimientos como la dialización, la precipitación con sales o la unión a soportes cromatográficos. Una alternativa para impedir que los péptidos y proteínas etiquetados se repartan preferentemente en la fase rica en PEG es reducir el pH del sistema de dos fases o añadir ciertos compuestos, como la colina, tras el paso de lavado descrito anteriormente. De esta forma, podemos recuperar los péptidos y proteínas etiquetados de la fase pobre en PEG. El método descrito puede, por tanto, emplearse como un procedimiento independiente ~ o ¾ff combinación con uno o más pasos de purificación de proteínas.
La invención descrita representa una alternativa a la tecnología IMAC para la purificación de proteínas etiquetadas con polihistidina producidas mediante expresión recombinante. Presenta varias ventajas sobre otros sistemas, entre ellas la de ser un procedimiento sencillo, rápido y económico, que permite una purificación en condiciones suaves. En primer lugar, su versatilidad se refleja en el amplio rango de concentraciones que pueden utilizarse, permitiendo ajustarse a las necesidades específicas de cada caso en concreto. Además, este procedimiento no necesita soportes sólidos, minimizándose los problemas típicos de la cromatografía en columna, como la necesidad de empaquetamiento, problemas de presión debidos a sobreempaquetamiento, etc. Además, a diferencia de los métodos anteriormente descritos de reparto por afinidad de proteínas etiquetadas con histidina, este procedimiento no requiere el uso de imidazol o de iones metálicos de transición, por lo que puede emplearse para la purificación de metaloproteínas o de proteínas cuyos usos posteriores sean incompatibles con estos agentes.
Aunque por regla general el sistema PEG/fosfato es adecuado para el reparto de proteínas etiquetadas con polihistidina, sería posible sustituir el fosfato por otra sal como citrato o sulfato. En este sentido, la presente invención es muy versátil, ya que hay distintos parámetros sobre los que se puede actuar para adecuar el sistema a cada pro teína de fusión concreta y para mejorar el rendimiento, a saber: peso molecular medio del PEG (de 400 a 8.000 Da), fuerza iónica, temperatura, pH, uso de detergentes, etc. (Johansson H ed. Aqueous Two-Phase Systems. Methods in Enzymology 1994; 228.). Además, el procedimiento puede integrarse en procesos enzimáticos de biotransformación usando enzimas etiquetadas con histidinas. En este tipo de reactores, la recuperación y separación de los catalizadores y los productos de reacción podría hacerse mediante el reparto diferencial entre las distintas fases del sistema.
Protocolo general de purificación de proteínas etiquetadas con polihistidina en sistemas acuosos de dos fases
La presente invención aporta ejemplos de realización en los que se ha utilizado PEG como uno de los componentes de un sistema de dos fases acuosas permitiendo el desarrollo de protocolos de separación de polipéptidos etiquetados con polihistidina.
En un protocolo preferente se cuenta con combinaciones PEG/fosfato para desarrollar el procedimiento de separación. El sistema PEG/fosfato permite la división espontánea en dos fases a distintos rangos de concentraciones de PEG (3-15%) y fosfato potásico (5-15%). Una de las fases es rica en PEG (fase superior, de menor densidad) y la otra es rica en fosfato (fase inferior, de mayor densidad). El protocolo general consiste en primer lugar en la obtención de un extracto celular que sobreexprese una proteína de fusión conteniendo entre cuatro y diez histidinas en uno de sus extremos. Para la realización del extracto se rompen mecánicamente las células del cultivo previamente recogidas por centrifugación y se resuspenden preferentemente en tampón de fosfato potásico 20 mM pH 8,0. A dicho extracto celular, clarificado mediante centrifugación, se añaden los componentes necesarios para la generación de un sistema acuoso de dos fases a pH 8,0, preferentemente PEG y fosfato potásico dibásico (K 2 HP0 4 ). La solución así obtenida se agita suavemente durante un tiempo breve (menos de un minuto), transcurrido el cual se permite su separación en dos fases, mediante centrifugación o por gravedad, pudiendo emplearse en este último caso un embudo de decantación como alternativa a la centrífuga.
Antes de realizar los siguientes pasos, se puede verificar la presencia de la proteína etiquetada con polihistidina en la fase superior, correspondiente a la fase rica en PEG mediante análisis electroforético en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE), por ejemplo, o por métodos inmunológicos (como Western Blot) usando anticuerpos que reconozcan la etiqueta de polihistidina o cualquier otro epítopo de la proteína de interés (Figura 4). Una vez comprobado este extremo, se realizan una serie de lavados consistentes en retirar la fase inferior rica en fosfato utilizando una pipeta o un embudo de decantación, y añadir el mismo volumen de una solución con un pH y una composición de PEG y fosfato similar a la fase descartada. Tomando como base los datos de los diagramas binodales publicados en la literatura puede predecirse esta composición para un sistema acuoso de dos fases concreto (Johansson, H ed. Aqueous Two- Phase Systems. Methods in Enzymology. 1994; 228). Tras una nueva mezcla y separación de fases, puede repetirse el paso de lavado para eliminar mejor las proteínas de la célula hospedadora y otros contaminantes que no se repartan preferentemente en la fase rica en PEG. Tras este paso de lavado, las proteínas o péptidos de interés pueden obtenerse directamente de la fase rica en PEG, o bien separarse de otras proteínas y contaminantes que también se localicen preferentemente en la fase rica en PEG. Este paso adicional puede hacerse descartando la fase inferior, pobre en PEG, y reemplazándola con el mismo volumen de una solución preparada a partir del tampón de lavado pero ajustando el pH para que sea inferior a 7 (Figura 3) o añadiendo cloruro de colina de forma que su concentración sea 50-600 mM (Figura 1 y 2). Las nuevas condiciones del sistema acuoso de dos fases (pH más bajo o presencia de colina) evitará que la proteína etiquetada se localice preferentemente en la fase rica en PEG, permitiendo su recuperación de la fase opuesta, incrementando su pureza y disminuyendo, en el caso de que fuera deseable, el contenido en PEG de la preparación final de la proteína, en aquellos casos en los que este polímero represente un problema para los usos posteriores de la proteína recombinante. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Reparto de GFP, GFP-6xHis y GFP-CLYTAG en un sistema acuoso de dos fases basado en PEG y fosfato. A) Visualización directa del reparto tras la formación de las fases en el paso inicial (primera separación) y después del primer paso de elución. B) Señal GFP medida por fluorescencia (excitación a 485 nm, emisión a 520 nm) en el lisado clarificado y las fases superior (rica en PEG) e inferior (pobre en PEG) tras la primera separación, el paso de lavado y los dos pasos consecutivos de elución inducida por colina. C) Coeficiente de partición (K) para la GFP-6xHis en cada sistema acuoso de dos fases, calculado como el ratio entre la fluorescencia de las fases superior e inferior.
Figura 2. SDS/PAGE y tinción con Coomassie de las fases superior (sup) e inferior (inf) del sistema, generadas tras cada paso del procedimiento. MW, peso molecular estándar de la proteína (del inglés, "molecular weight"); CL, lisado clarificado (del inglés "clarified lysaté , ) usado como muestra de partida para cada experimento de separación de proteínas.
Figura 3. Comparación de la adición de colina frente a la reducción del pH aplicado al paso de elución en la purificación de GFP-6xHis mediante un sistema acuoso de dos fases. El procedimiento de separación llevado a cabo en los experimentos mostrados en las Figuras 1 y 2 se siguió hasta llegar al paso de lavado. A partir de este paso, la fase superior se dividió en dos partes iguales, eluyendo una de ellas mediante la adición de colina 600 mM al tampón de lavado, y la otra mediante la adición de un tampón de lavado con la misma composición pero a pH 7. A) SDS/PAGE y tinción con plata del lisado clarificado (CL), las fases superior (sup) e inferior (inf) obtenidas tras cada paso del procedimiento. B) Señal GFP detectada mediante fluorescencia del lisado clarificado y de ambas fases del sistema. C) Coeficiente de reparto (K) para la GFP-6xHis en cada uno de los sistemas acuosos de dos fases, calculado como el ratio entre la fluorescencia de las fases superior e inferior.
Figura 4. Electroforesis SDS-PAGE de las fases superior (sup) e inferior (inf) del sistema de dos fases inicial (primera separación) y el paso de lavado del procedimiento de separación aplicado a las proteínas de fusión hEDA-6xHis, 6xHis-Lip36, 6xHis-ProtA, 6xHis- GSTT1, 6xHis-Evc y OmpA-estreptavidina-6xHis. Las proteínas de los geles de SDS-PAGE se detectan mediante tinción con Coomassie excepto en el caso de OmpA-estreptavidina-6xHis, que se detecta mediante Western Blot usando anticuerpos monoclonales anti-6xHis. CL, lisado clarificado. Figura 5. Análisis mediante electroforesis SAS-PAGE de las fases superior (sup) e inferior (inf) en el sistema de dos fases inicial del procedimiento de separación aplicado a las proteínas de fusión GFP-6xHis y 6xHis-Lip36, previamente purificadas mediante IMAC. CL, Usado clarificado; FT, flow through; W, lavado (del inglés "vras/i"); E, elución. Las proteínas de los geles de SDS-PAGE se tiñeron con azul Coomassie (GFP-6xHis) o con plata (6xHis-Lip36).
Figura 6. Reparto del dominio soluble del citocromo el de Arabidopsis thaliana, etiquetado con seis histidinas, en un sistema acuoso de dos fases basado en PEG y fosfato. A) Visualización directa del reparto después de la primera separación de las fases, y de los pasos de lavado y elución. B) Análisis mediante SDS-PAGE de la fracción proteica citoplasmática (CF), la fracción proteica periplásmica (PF), las fases superior (sup) e inferior (inf), y la interfase (i/p) durante el procedimiento de separación mediante el sistema acuoso de dos fases. C) Análisis comparativo mediante SDS-PAGE de la fracción proteica periplásmica (concentrada 10 veces) y la fase inferior después del paso de elución.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
Ejemplo 1
Separación de la proteína recombinante GFP-6xHis en un sistema de dos fases PEG- fosfato.
El presente ejemplo muestra cómo la fusión de una etiqueta de colas de histidina (polihistidina) a la proteína fluorescente GFP favorece su reparto en una de las fases de un sistema de dos fases acuosas, fenómeno que puede utilizarse para su purificación.
Para este ejemplo de realización se emplean cepas especializadas de E. coli (BL21-DE3- 4S2, REG0811) que contienen el módulo regulador nahR-xylS, que activa la transcripción desde el promotor Pm en presencia de salicilato o 3-metilbenzoato (Cebolla A et al. 2002 Improvement of recombinant protein yield by a combination of transcriptional amplification and stabilization of gene expression. Appl Environ Microbiol, 68, 5034-41 ; Cebolla A et al. 2001 Rational design of a bacterial transcriptional cascade for amplifying gene expression capacity. Nucleic Acids Res, 29, 759-66) para sobreexpresar tres versiones de la proteína GFP: la proteína GFPmut3 sin etiquetar, la misma proteína GFPmut3 etiquetada en el extremo C-terminal con polihistidina (GFP-6xHis) y GFPmut3 etiquetada con el dominio de unión a colina LYTAG (GFP-CLYTAG) empleándose esta última como control. Las cepas empleadas se transforman con las construcciones correspondientes en plásmidos pMABl-GFP, pMAB33-GFP-6xHis-29 y pMAB 1 -GFP-CLYTA. Las células transformantes BL21-DE3-4S2 [pMABl-GFP], REG0811 [pMAB33-GFP-6xHis-29] y REG0811 [pMAB 1 -GFP-CLYTA] se cultivan a 37°C en 250 mL de medio Terrific Broth (TB) hasta fase exponencial temprana, momento en el que se añade un cóctel de inductores compuesto por lmM de salicilato y 10 mM de 3-metilbenzoato y se baja la temperatura del cultivo a 20°C, manteniéndose estas condiciones de inducción durante una noche. Los cultivos inducidos se recogen por centrifugación a 5.000 g, se resuspenden las células en 25 mL de tampón fosfato potásico 20 mM pH 8,0, se lisan en un homogenizador y se vuelven a centrifugar a 10.000 g para separar los restos celulares de la fracción soluble.
A continuación se procede a separar las proteínas de cada una de las tres fracciones solubles mediante un sistema de dos fases compuesto por PEG-8000 15% y K 2 HP0 4 12,5%. Tras mezclar 20 mL de fracción soluble con 20 mL de PEG-8000 37,5% y 10 mL de K 2 HP0 4 62,5%, formándose de esta forma un sistema acuoso de dos fases de 50 mL, se agita suavemente un minuto y se centrifuga 5 min a 8.000 g obteniéndose una fase superior rica en PEG, y otra inferior rica en fosfato potásico. El reparto de las proteínas GFP puede verse a simple vista (Figura 1A), mediante una separación por electroforesis SDS-PAGE y una tinción con Coomassie (Figura 2) o por fluorescencia con un fluorímetro (Figura IB y 1C). Como puede verse en la figura 1, la proteína GFP sin etiquetar no presenta una preferencia de reparto demasiado fuerte por ninguna de las dos fases, al contrario que la fusión GFP-6xHis, que se acumula en la fase superior, rica en PEG, de forma similar a como lo hace la proteína de fusión GFP-CLYTAG usada como control (Maestro B et al. Affinity partitioning of proteins tagged with choline-binding modules in aqueous two-phase systems. Journal of Chromatography A, 2008: 189-196; patente WO2009034203). El procedimiento continúa con la transferencia de la fase superior a un tubo nuevo y añadiendo un volumen equivalente al de la fase inferior descartada de PEG-8000 2%, K 2 HP0 4 /KH 2 P0 4 32% a pH 8,0 (tampón de lavado). Tras mezclar y centrifugar ambas fases, se repite el paso anterior dos veces más, pero esta vez añadiendo colina 600 mM, PEG-8000 2%, K 2 HP0 4 32% a pH 7,5 (tampón de elución). Como puede verse en las figuras 1 y 2, la adición de colina impide que la proteína de fusión GFP-6xHis se reparta preferentemente en la fase superior, permitiendo recuperarla de la fase inferior, como ocurre en el caso de la proteína control de fusión GFP-CLYTAG.
La elución de la GFP etiquetada con polihistidina, GFP-6xHis, es mucho más eficiente cuando se realiza por acidificación del sistema en vez de por adición de colina. En este caso, tras el paso de lavado, la fase rica en PEG se mezcla con un volumen de tampón de elución, compuesto por PEG-8000 2%, K 2 HP0 4 / H 2 P0 4 pH 7, equivalente al de la fase descartada. Como puede verse en la Figura 3, la reducción del pH da lugar a un reparto más eficiente de la GFP-6xHIS en la fase inferior, permitiendo de este modo una recuperación mayor de pfoftSnas*' etiquetadas con polihistidina en esta fase, y con una pureza mayor.
Como conclusión, este ejemplo muestra cómo un procedimiento basado en un sistema acuoso de dos fases permite una separación y purificación simples y eficientes de una proteína etiquetada con polihistidina, evitando además el uso de imidazol o de iones metálicos de transición.
Ejemplo 2
Purificación mediante un sistema de dos fases PEG-fosfato de varias proteínas etiquetadas con polihistidina (óxHis).
Este ejemplo muestra cómo, aplicando un protocolo simplificado basado en la realización del Ejemplo 1, puede alcanzarse un alto grado de pureza en la purificación de proteínas diversas etiquetadas con polihistidina.
En este caso, se emplean las cepas especializadas de E. coli que contienen construcciones basadas en el promotor Pm para expresar las versiones etiquetadas con histidina del dominio A extra de la fibronectina humana (hEDA-óxHis), un determinante antigénico del parásito Leishmania (6xHis-Lip36), la proteína de unión a inmunoglobulina de Staphylococcus aureus (6xHis-ProtA), la glutatión S-transferasa humana (6xHis-GSTTl), un polipéptido implicado en el síndrome de Ellis-van Creveld (6xHis-Evc), y una versión secretable de la estreptavidina (OmpA-estreptavidina-óxHis). Tras recolectar las células de los cultivos inducidos, se prepara un lisado clarificado y se mezcla con PEG-8000 y fosfato potásico para generar un sistema acuoso de dos fases, tal y como se describe en el ejemplo 1. Después se mezcla y se centrifuga a 8.000 g, lo que dará lugar a la separación en dos fases de las proteínas celulares. Puede observarse, para todos estos polipéptidos, que la fase superior rica en PEG contiene la mayor parte de la proteína etiquetada con polihistidina, mientras que en la fase inferior rica en fosfato quedan la mayoría de las proteínas celulares (Figura 4). Esta preferencia de reparto se mantiene durante el paso de lavado. Cabe señalar que las muestras de proteínas procedentes de la fase rica en PEG muestran una movilidad anómala cuando se analizan por SDS-PAGE. Esta migración irregular puede evitarse mediante dilución o diálisis de la muestra antes de cargarla en el gel. Con este ejemplo se destaca la versatilidad del procedimiento descrito en cuanto a diversidad de polipéptidos purificados de distintos orígenes, que se reparten preferentemente en la fase rica en PEG de un sistema acuoso de dos fases. Este procedimiento puede aplicarse como método para la separación inicial de la proteína de interés del resto de proteínas celulares. Ejemplo 3
Eliminación de impurezas procedentes de una purificación con resina de níquel de una proteína etiquetada con polihistidina
La invención descrita puede aplicarse también a la eliminación de proteínas procedentes de la célula hospedadora que a menudo copurifícan junto a los péptidos y proteínas etiquetados con polihistidina y purificados mediante IMAC. Como ejemplo de esta aplicación, las proteínas etiquetadas con histidina GFP-6xHis y 6xHis-Lip36 descritas en los ejemplos 1 y 2 se purifican empleándose en primer lugar un procedimiento IMAC estándar, y posteriormente un sistema acuoso de dos fases basado en PEG/fosfato. Las células procedentes de los cultivos inducidos descritos en los ejemplos 1 y 2 se recolectan, y se lisan usando 20 mM de fosfato potásico a pH 8,0. El lisado clarificado se añade a columnas con resina de níquel, equilibradas previamente con tampón de fosfato potásico 20mM pH 8,0 + 300 mM de NaCl + 10 mM de imidazol. Se lava con volúmenes equivalentes a 10 veces el volumen de resina, utilizando el mismo tampón de equilibrado y se eluye con tampón fosfato potásico 20 mM pH 8,0 + 300mM de NaCl + 250 mM de imidazol.
Se somete cada elución dializada procedente de la resina de níquel a una separación en dos fases tal y como se describe en los ejemplos 1 y 2, mezclando 20 mL de elución de cada muestra con 20 mL de PEG-8000 37,5% y 10 mL de K 2 HP0 4 62,5%, para generar un sistema acuoso de dos fases de 50 mL compuesto por PEG-8000 15% y K 2 HP0 4 12,5%. Tras agitar suavemente y centrifugar de la misma forma que en los ejemplos 1 y 2, se analiza cada fase mediante electroforesis SDS-PAGE, mostrándose que las proteínas procedentes de la célula hospedadora que contaminan las proteínas purificadas mediante IMAC se localizan preferentemente en la fase pobre en PEG, pudiéndose de esta forma separarlas de las proteínas etiquetadas con histidina, que se localizan preferentemente en la fase rica en PEG.
Ejemplo 4
Purificación de metaloproteínas etiquetadas con polihistidina
Este ejemplo muestra cómo el procedimiento descrito puede aplicarse a la purificación de metaloproteínas, que presentan problemas de actividad cuando se purifican mediante IMAC. En particular, este método de invención puede usarse para purificar el dominio activo soluble del citocromo el de Arabidopsis thaliana, expresado en E. coli como una proteína de fusión etiquetada con polihistidina. Este dominio proteico del citocromo el contiene hierro, que forma parte de un co factor hemo, y que se inactiva con imidazol (Kokhan et al. 2010 Binding of imidazole to the heme of cytochrome el and inhibition of the bcl complex from Rhodobacter sphaeroides: I Equilibrium and modeling studies. J Biol Chem, 285, 22513-21), por lo que no puede purificarse como un producto completamente funcional mediante IMAC estándar. En este ejemplo, el dominio soluble de citocromo el de Arabidopsis thaliana se expresa fusionado a una etiqueta con seis histidinas usando el vector pET-28a(+) (Novagene, USA) en la cepa de E. coli BL21 (DE3) transformada además con el plásmido pEC86, que expresa los genes de maduración de E. coli del citocromo c ccmABCDEFGH (Arslan et al. 1998 Overproduction of the Bradyrhizobium japonicum c-type cytochrome subunits of the cbb3 oxidase in Escherichia coli. Brochem Biophys Res Común, 251, 744-7). La cepa BL21 (DE3) con los dos plásmidos se cultiva en agitación a 30° C y a 200 r.p.m. en medio TB suplementado con cloruro férrico 0,1 mM hasta que alcanza la fase estacionaria temprana. Las proteínas recombinantes maduras que contienen el grupo hemo se extraen del periplasma bacteriano mediante el siguiente procedimiento estándar. Se toman 225 mL de cultivo y se recogen las células centrifugando 20 min a 4.000 g. El pellet celular se resuspendeen 80 mL de Tris Cl 30 mM, 2% de sacarosa a pH 8,0 y se añade gota a gota EDTA 500 mM a la suspensión celular, hasta obtener una concentración final de 5 mM. Tras incubar 10 min en agitación suave en un baño de hielo, se centrifuga la suspensión celular a 4 o C durante 20 min a 8.000 g. El pellet se resuspende en 80 mL de MgS0 4 5 mM enfriado en hielo, y se agita 10 min en un baño de hielo. Finalmente, la suspensión se centrifuga a 4 o C durante 20 min a 8.000 g y el sobrenadante (que contendrá las proteínas periplásmicas, obtenidas mediante estrés osmótico) se emplea como muestra de partida para la purificación del dominio soluble del citocromo cl mediante el sistema acuoso de dos fases.
Tal y como se describe en los ejemplos anteriores, se mezclan 20 mL de la fracción proteica procedente del periplasma con 20 mL de PEG-8000 37,5% y 10 mL de K2HP04 62,5%, para obtener un sistema acuoso de dos fases de 50 mL compuesto por PEG-8000 15% y K2HP04 12,5%. Tras agitar suavemente durante un minuto, la mezcla se centrifuga 5 min a 8.000 g para acelerar la separación de las fases. Tras esta separación, el reparto del dominio soluble del citocromo cl etiquetado con histidina puede detectarse a simple vista (color gris más oscuro en la Figura 6A) o mediante separación por electroforesis SDS-PAGE y tinción con Coomassie (Figura 6B). La elución en la fase inferior se realizó usando una solución con fosfato y PEG a pH 6,2. La proteína de la fase inferior se concentró 10 veces en el paso de elución usándose concentrador Vivaspin 20, 5000 MWCO (Sartorious) y analizándose por SDS/PAGE/Coomassie para compararla con la fracción proteica periplásmica usada como muestra de partida para la separación en el sistema de dos fases. Como se muestra en la Figura 6C, la aplicación del procedimiento descrito a la fracción proteica periplásmica tiene como resultado la eliminación de las proteínas de la célula hospedadora, permitiendo una recuperación de la proteína etiquetada recombinante con un grado significativo de pureza. Los análisis espectrales de las muestras de proteína purificada antes y después de la adición de ascorbato sódico revelan la presencia de un pico de absorción a 552 nm, característico del citocromo el reducido (datos no mostrados), indicando que la proteína permanece plegada de forma correcta durante el proceso de reparto en las dos fases.
Este ejemplo muestra claramente que la invención descrita puede ser aplicada a la purificación de metaloproteínas etiquetadas con histidina en ausencia de imidazol o de iones metálicos de transición, al contrario de lo que ocurre en la purificación mediante la técnica IMAC estándar.