CAMPO TÉCNICO

La presente invención se relaciona con el campo técnico de la síntesis de polímeros, particularmente, se refiere a un método para la síntesis de un copolímero ramificado de ácido hialurónico y ácido poli(láctico-co-glicólico) que utiliza condiciones de síntesis amigables con el medio ambiente.

ANTECEDENTES

El ácido hialurónico (HA) es un polisacárido lineal natural que forma parte de la matriz extracelular de los tejidos biológicos y está formado por unidades repetitivas de ácido D-glucurónico y A/-acetil-D-glucosamina, unidos por enlaces glucosídicos (3(1 ,4) y (3(1 ,3). Este polisacárido es considerado un polímero biodegradable y biocompatible, razón por la cual se utiliza en diferentes aplicaciones cosméticas, médicas y farmacéuticas.

Para mejorar, potenciar o desarrollar nuevas aplicaciones biomédicas se pueden modular sus propiedades estructurales, en este sentido, el ácido hialurónico se puede modificar químicamente para obtener diversos derivados. Por ejemplo, se pueden generar estructuras de ácido hialurónico conjugados con fármacos o con otros polímeros biodegradables y biocompatibles como el ácido poliláctico (PLA), ácido poliglicólico (PGA), o ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) para formar copolímeros con ácido hialurónico que posean nuevas propiedades fisicoquímicas.

Usualmente, la síntesis de un copolímero a partir de ácido hialurónico utiliza solventes orgánicos como dimetil sulfóxido (DMSO) o dimetilformamida (DMF) como disolvente, y requiere la realización de modificaciones en la composición del ácido hialurónico para favorecer su solubilidad en dichos disolventes.

Por ejemplo, el documento de patente US 2007/0031503 A1 describe métodos para obtener un copolímero de ácido hialurónico o su derivado y un polímero como PLA, PGA o PLGA, en el cual el ácido hialurónico o su derivado modificado con un grupo hidrazida o un grupo amina en el grupo carboxílico de la porción de ácido glucurónico del ácido hialurónico, se convierte mediante intercambio de iones a una sal de tetrabutilamonio (TBA), la cual reacciona en DMSO con el polímero activado por 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y /V-hidroxisuccinimida (NHS).

Son GM, et al. (2014) describe un método para obtener un copolímero de ácido hialurónico con PLGA, en el cual el PLGA se activa con EDC/NHS y luego se añade hexametilendiamina (HDMA) para sintetizar PLGA con una amina terminal. Luego, el PLGA-amina se disuelve en DMSO y se hace reaccionar con ácido hialurónico en una mezcla de H2O/DMSO 2:8, en presencia de EDC/NHS. Esta solución se deja reaccionar por 3 días a temperatura ambiente y luego se precipita en exceso de metanol y posteriormente se filtra. El precipitado se lava con metanol y el sólido obtenido se precipita en diclorometano (DCM, fórmula química CH2CI2) para remover el PLGA que no reaccionó (Son GM, et al. Self-Assembled Polymeric Micelles Based on Hyaluronic Acid-g-Poly(D,L-lactide-co-glycolide) Copolymer for Tumor Targeting. Int. J. Mol. Sci. 2014, 15, 16057-16068).

Lee H, et al. (2009) describe un método para obtener nanopartículas de un copolímero de ácido hialurónico y PLGA, en el cual modifican el ácido hialurónico con polieti leng licol (PEG) para que sea soluble en DMSO. Luego, activan los grupos carboxílicos del ácido hialurónico con A/,A/-diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP). Posteriormente, el PLGA se disuelve en DMSO anhidro y se añade a la solución de ácido hialurónico-PEG para obtener el copolímero de ácido hialurónico y PLGA. La mezcla se dializa para eliminar el DMSO y luego se precipita en acetona para remover el PLGA que no reaccionó (Lee H, et al. Poly[lactic-co-(glucolic acid)] -Grafted Hyaluronic Acid Copolymer Micelle Nanoparticles for Target-Specific Delivery of Doxorubicin. Macromol Biosci. 2009, 9(4):336-42).

Los métodos anteriormente descritos presentan desventajas significativas debido a que afectan el cuidado del medioambiente y su producción considera el uso de gran cantidad de recursos económicos. Por ejemplo, puesto que el copolímero de ácido hialurónico que se sintetiza no puede contener trazas de ninguno de los reactivos utilizados debido a que uno de sus principales usos es en aplicaciones de uso humano, los métodos de síntesis anteriormente descritos requieren procesos de purificación más elaborados o temperaturas más altas para la eliminación de los disolventes (DMSO o DMF) debido a sus altos puntos de ebullición. Por ejemplo, el uso de vacío y la rotaevaporación a altas temperaturas conlleva un alto gasto energético. A su vez, el proceso de purificación por diálisis implica un gasto asociado a las membranas de diálisis (consumible de baja capacidad), un sistema de diálisis (equipamiento necesario para las membranas) y horas de trabajo (el proceso tarda entre 2-4 días). Además, el proceso de diálisis implica que la muestra se diluya lo que conlleva a implementar técnicas asociadas a la posterior concentración de la muestra.

Por otra parte, algunos de estos métodos requieren del uso de solventes tóxicos como el DMF o CH2CI2, lo cual genera un grave peligro para el medio ambiente y para la salud humana.

En consecuencia, se requieren nuevos métodos de síntesis de copolímeros de ácido hialurónico que incorporen un menor costo económico, que el protocolo de obtención no posea alta complejidad sobre todo considerando los procesos de escalamiento industrial y que sean amigables con el medio ambiente en términos del uso mínimo de solventes orgánicos y la generación de subproductos que puedan contaminar el medioambiente.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Un primer objeto de la presente invención es un método para la síntesis de un copolímero ramificado de ácido hialurónico y ácido poli(láctico-co-glicólico) que comprende: mezclar ácido poli(láctico-co-glicólico) con reactivos de acoplamiento en un disolvente miscible en agua para obtener una solución con ácido pol i (láctico- co-glicólico) activado; solubilizar ácido hialurónico en una solución de tampón fosfato salino, hasta obtener una solución con ácido hialurónico; y agregar gota a gota la solución con ácido poli(láctico-co-glicólico) activado a la solución con ácido hialurónico, y mezclar para obtener una solución con el copolímero ramificado de ácido hialurónico y ácido poli(láctico-co-glicólico).

En una realización preferida del método de la presente invención, la proporción entre la solución con ácido pol i (láctico-co-g licólico) activado y la solución de ácido hialurónico es entre 1 :15 y 1 :25 v/v. En otra realización preferida, los reactivos de acoplamiento son diciclohexilcarbodiimida y 4-dimetilaminopiridina, preferentemente en una proporción diciclohexilcarbodiimida:4-dimetilaminopiridina de 1 :2 p/p.

En otra realización preferida, el disolvente miscible en agua se selecciona del grupo que consiste en acetonithlo y tetrahidrofurano. Preferentemente, el disolvente miscible en agua es acetonitrilo.

En otra realización preferida, el ácido poli(láctico-co-glicólico) con los reactivos de acoplamiento se mezclan en el disolvente miscible en agua a temperatura ambiente durante alrededor de 8 horas.

En otra realización aún más preferida, el ácido poli(láctico-co-glicólico) con diciclohexilcarbodiimida y 4-dimetilaminopihdina en una proporción 1 :2 p/p se mezclan en acetonitrilo a temperatura ambiente durante alrededor de 8 horas.

En otra realización preferida del método de la presente invención, el ácido hialurónico se solubiliza en una solución de tampón fosfato salino 80 mM. Preferentemente, el ácido hialurónico se solubiliza a un pH básico, más preferentemente a un pH entre 8 y 9.

En otra realización preferida, el ácido hialurónico se solubiliza adicionalmente con carbonato de potasio o carbonato de cesio, preferentemente con carbonato de potasio. Más preferentemente, la concentración de carbonato de potasio que se usa es de alrededor de 10% mol respecto a la concentración de ácido hialurónico.

En otra realización preferida, el ácido hialurónico se solubiliza a una temperatura preferente entre 60 y 70 °C.

En otra realización aún más preferida, el ácido hialurónico se solubiliza en una solución de tampón fosfato salino 80 mM con carbonato de potasio, a una temperatura preferente entre 60 y 70 °C.

En otra realización preferida del método de la presente invención, para obtener el copolímero ramificado, la mezcla de la solución con ácido poli(láctico-co- glicólico) activado y ácido hialurónico se mantiene en agitación a una temperatura preferente entre 60 y 70 °C durante alrededor de 18 horas. En una realización preferida, el método comprende una etapa adicional de filtración de la solución con ácido poli(láctico-co-glicólico) activado. Dicha filtración se realiza preferentemente con tierra de diatomeas, más preferentemente con tierra de diatomeas que tiene partículas con un diámetro preferido entre 0,02 y 0,1 mm.

En otra realización preferida, el método de la presente invención comprende una etapa adicional de filtración de la solución con el copolímero de ácido hialurónico y ácido poli(láctico-co-glicólico) para obtener el copolímero de ácido hialurónico y ácido poli(láctico-co-glicólico) purificado. Preferentemente, dicha purificación se realiza mediante centrifugación con un filtro de ultracentrifugación.

Un segundo objeto de la presente invención comprende un copolímero de ácido hialurónico y ácido poli(láctico-co-glicólico) que se obtiene mediante el método de síntesis previamente descrito. Mediante este método, se obtiene un copolímero ramificado en el que ácido hialurónico tiene un grado de sustitución entre 8 y 13.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La FIG. 1 ¡lustra una realización preferida del método de síntesis de la presente invención. PLGA: Ácido poli(láctico-co-glicólico), DCC: Diciclohexilcarbodiimida, DMAP: 4-dimetilaminopiridina, STP: condiciones estándares de presión y temperatura de trabajo en el laboratorio (NIST, National Institute of Standards and Technology) consideradas como 20 ^S C y 1 atm., HA: Ácido hialurónico.

La FIG. 2 muestra la caracterización térmica del HA. En la FIG. 2A se muestra un gráfico con los resultados del análisis de termogravimetría (TGA). En la FIG. 2B se muestra un gráfico con los resultados del análisis de calorimetría diferencial de barrido (DSC).

La FIG. 3 muestra el espectro de FT-IR del copolímero ramificado de ácido hialurónico y ácido poli(láctico-co-glicólico).

La FIG. 4 muestra el espectro de una espectroscopia de resonancia magnética nuclear ( ¹ H-RMN) del copolímero ramificado de ácido hialurónico y ácido poli(láctico-co-glicólico). La FIG. 5 muestra el perfil de degradación del copolímero HA-g-PLGA como resultado del análisis termogravimétrico (TGA).

La FIG. 6 muestra la caracterización térmica del copolímero HA-g-PLGA, específicamente el análisis de calorimetría diferencial de barrido (DSC). FIG. 6A muestra el comportamiento térmico de HA. FIG. 6B muestra el comportamiento térmico de PLGA. FIG. 6C muestra el comportamiento térmico de HA-g-PLGA.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención comprende un método para la síntesis de un copolímero ramificado de ácido hialurónico y ácido poli(láctico-co-glicólico) que utiliza condiciones amigables con el medio ambiente, de acuerdo con los Principios de la Química Verde.

El método de la presente invención tiene una serie de ventajas en comparación con los métodos descritos en el estado de la técnica. Por ejemplo, el tiempo habitual para la síntesis y purificación de un copolímero de este tipo se estima en dos a tres semanas en un laboratorio de investigación. El método de la presente invención permite sintetizar, purificar y caracterizar el copolímero en menos de una semana.

Otra ventaja del método de síntesis de la presente invención es que elimina la implementación de disolventes como DMSO y DMF, los cuales son considerados desfavorables debido al impacto ambiental que presentan en grandes cantidades y a los procesos de purificación asociados a estos. Además, el copolímero obtenido mediante el método de síntesis de la presente invención no presenta trazas de ninguno de los reactivos empleados para la síntesis, por lo que puede ser utilizado directamente en el desarrollo de aplicaciones destinadas a su uso en humanos.

Adicionalmente, los inventores de la presente invención lograron desarrollar un método en el cual, a diferencia de lo descrito en el estado de la técnica, no requiere la modificación química del ácido hialurónico y, por tanto, éste puede ser solubilizado en agua o en soluciones salinas basadas en agua.

Todos los términos técnicos y científicos utilizados para describir la presente invención tienen el mismo significado entendido para una persona con conocimientos básicos en el campo técnico en cuestión. No obstante, para definir con más claridad el alcance de la invención, a continuación, se incluye una lista de la terminología utilizada en esta descripción.

Se debe entender por “copolímero”, una macromolécula compuesta por dos o más monómeros de diferentes tipos, que se pueden unir de diferentes formas de manera aleatoria, alternada, en bloque o por injertos.

Se debe entender por el término “copolímero de injerto” o “copolímero ramificado”, un tipo de copolímero en el cual uno o más homopolímeros están injertos en una cadena polimérica principal de composición química diferente a dichos homopolímeros, formando una estructura molecular ramificada. Es decir, es un copolímero ramificado con una o más cadenas laterales de homopolímeros unidos mediante enlaces covalentes a la cadena polimérica principal. Normalmente, las ramificaciones laterales están distribuidas en la cadena principal de manera aleatoria.

Se debe entender por el término “reactivo de acoplamiento”, un compuesto que proporciona una unión química entre dos o más polímeros. Para efectos de la presente invención, los reactivos de acoplamiento permiten la unión entre un grupo hidroxilo y un grupo carboxílico.

Se debe entender por los términos “alrededor” o “aproximadamente” usados indistintamente a lo largo de la presente memoria descriptiva, como el valor o rango de un parámetro que incluye una desviación estándar de error según el método o aparato que se emplea para determinar dicho valor o rango, y que está dentro de la tolerancia aceptable o rango estadísticamente significativo para el valor de dicho parámetro. Tal rango estadísticamente significativo puede estar, por ejemplo, dentro del 30%, 20%, 10% o 5% del valor o rango indicado. Es decir, los valores y rangos mencionados no son ni necesitan ser exactos, y pueden ser aproximados, ya sea ¡guales, menores o mayores. El término “entre” al referirse a rangos, debe entenderse como alrededor del valor inferior y alrededor del valor superior mencionado.

Se debe entender por “temperatura ambiente” aquel rango o valor de temperatura que se encuentre en los alrededores de donde se lleva a cabo el método de la presente invención. Una persona versada en la materia entenderá que dichos valores de temperatura varían en dependencia de múltiples factores tales como las estaciones del año, dispositivos o equipamiento que se encuentren en las cercanías que puedan estar produciendo un aumento o disminución de la temperatura, entre otros. Típicamente, la temperatura ambiente es entre 20 - 25 °C aproximadamente, no obstante, puede ser mayor o menor a ese rango, sin afectar el método ni el resultado obtenido a partir de dicho método.

El método de la presente invención comprende un método para la síntesis de un copolímero ramificado de ácido hialurónico (HA) y ácido poli(láctico-co- glicólico) (PLGA) que comprende esencialmente tres etapas, las cuales se definen como una primera, segunda y tercera etapa a lo largo de la presente memoria descriptiva. Es importante destacar que las etapas denominadas como primera y segunda, no necesariamente deben realizarse en ese orden y pueden ser intercambiadas o realizarse de manera paralela, lo cual no altera de ninguna forma el resultado que se obtiene mediante este método.

La primera etapa de la presente invención comprende activar el PLGA. Esta activación se refiere a que el PLGA carboxilo terminal (PLGA-COOH) se convierte en un compuesto más reactivo utilizando los reactivos de acoplamiento con el fin de favorecer la reacción entre PLGA y HA. En una modalidad preferida, el PLGA tiene un peso molecular entre 30 - 60 kDa. En una modalidad preferida, en el método de la presente invención se mezcla el PLGA con reactivos de acoplamiento A/,A/ -diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP) en un disolvente miscible en agua, para obtener una solución con ácido PLGA activado. En la FIG. 1 se ¡lustra dicha realización preferida de la invención.

En una realización preferida de esta primera etapa del método de la presente invención, los reactivos de acoplamiento se mezclan en una proporción DCC:DMAP de 1 :2 p/p. En otra realización preferida de la presente invención, el PLGA con los reactivos de acoplamiento se mezclan en el disolvente miscible en agua durante un periodo de alrededor de 8 horas. Es importante señalar que este periodo es variable en dependencia de la naturaleza del copolímero utilizado. Se sugiere mezclar durante alrededor de 8 horas cuando se utiliza PLGA con un peso molecular 43,5 kDa. En una modalidad preferida, esta primera etapa del método se realiza a temperatura ambiente. En otra realización preferida de esta primera etapa del método de la presente invención, el disolvente miscible en agua puede ser acetonitrilo (ACN), o tetrahidrofurano (THF). Más preferentemente, el disolvente miscible en agua es ACN. En una realización preferida, el disolvente es ACN seco, es decir, que tiene un porcentaje de agua menor o alrededor de 0,1 %, preferentemente menor o alrededor de 0,05%, aún más preferentemente menor o alrededor de 0,005%.

En una realización preferida, el método comprende una etapa adicional de filtración de la solución con PLGA activado. Dicha filtración se realiza preferentemente con tierra de diatomeas que tiene partículas con un diámetro preferido entre 0,02 y 0,1 mm. En otra realización preferida, la tierra de diatomeas se lava con el disolvente miscible en agua, preferentemente ACN seco, hasta obtener la solución de PLGA activado.

El método de síntesis de la presente invención incluye una segunda etapa que comprende solubilizar HA en una solución de tampón fosfato salino (PBS), preferentemente en una solución de tampón fosfato salino 80 mM. En una realización preferida, el HA es de peso molecular medio, preferentemente entre 100 - 150 kDa. La solución de tampón fosfato salino es una solución acuosa que comprende, generalmente, sales de fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) y fosfato de potasio dibásico (K2HPO4). Preferentemente, la solución de tampón fosfato salino que se utiliza en la presente invención comprende KH2PO4 entre 3,3 mM, y K2HPO4 entre 76,6 mM.

La solubilización del ácido hialurónico se realiza a un pH básico, preferentemente a un pH entre 8,0 y 9,0 aproximadamente, y a una temperatura preferente entre 60 y 70 °C, aproximadamente. Preferentemente, la solubilización se mantiene dentro de ese rango de temperatura mediante el uso de una placa calefactora, o cualquier otro medio para este fin.

En una realización preferida de esta segunda etapa del método de la presente invención, el HA se solubiliza con una cantidad catalítica de carbonato de potasio (K2CO3) o carbonato de cesio (CS2CO3). En una realización preferida, el HA se solubiliza con carbonato de potasio. Dicha cantidad catalítica se refiere a una concentración de carbonato de potasio de alrededor de 10% mol respecto a la concentración de HA. Preferentemente, el HA se solubiliza con el carbonato de potasio en la solución de tampón fosfato salino durante al menos 1 hora, preferentemente alrededor de 1 hora.

El método de síntesis de la presente invención incluye una tercera etapa que comprende agregar gota a gota la solución con PLGA activado a la solución con HA, y mezclar para obtener una solución con el copolímero ramificado de ácido hialurónico y ácido poli(láctico-co-glicólico) (HA-g-PLGA, siendo g de “grafted’). Una gota se define como una unidad de volumen aproximado, el cual puede variar según la viscosidad, densidad y tensión superficial de la solución. No obstante, una persona versada en la materia entiende que una gota es aproximadamente entre 0,025 - 0,05 mi, preferentemente alrededor de 0,025 mi. El volumen exacto de la gota para efectos de la presente invención no es relevante, ya que el método continúa siendo reproducible y el resultado no se ve afectado por este parámetro.

La solución de PLGA se añade a la solución de HA gota a gota, preferentemente de forma lenta. En una realización preferida, se añade entre 1 gota cada 20 segundos y 1 gota cada 40 segundos, preferentemente 1 gota cada 30 segundos. No obstante, la cantidad de gotas por segundo no es relevante ya que el método continúa siendo reproducible, siempre y cuando la solución de PLGA se añada gota a gota.

En una realización preferida de la tercera etapa del método de la presente invención, la solución con PLGA activado tiene una concentración de alrededor de entre 4 - 10 mg/ml. La solución de PLGA activado se agrega a la solución con HA en una proporción preferida de solución PLGA : solución HA entre 1 :15 a 1 :25 v/v, preferentemente 1 :20 v/v.

En otra realización preferida de esta tercera etapa, la solución con PLGA activado y HA se mantiene en agitación a una temperatura preferente entre 60 y 70 °C. En una realización preferida, para mantener la temperatura constante se utiliza un baño termorregulado, el cual puede ser un baño de agua, baño de aceite, baño de silicona, con o sin circulación, o cualquier otro método para estos fines. También se puede utilizar un microondas, siempre que éste permita la adición de la solución de PLGA sobre la solución de HA gota a gota. Cuando se utiliza una placa calefactora con baño de silicona, la mezcla de las soluciones de PLGA activado con HA se mantiene en agitación durante al menos 12 horas, preferentemente entre 12 y 18 horas, más preferentemente durante alrededor de 18 horas.

En otra realización preferida, el método de la presente invención comprende una etapa adicional de filtración de la solución con el copolímero de ácido hialurónico y ácido poli(láctico-co-glicólico) para obtener el copolímero de ácido hialurónico y ácido poli (láctico-co-glicólico) purificado y eliminar el PLGA activado y los reactivos de acoplamiento (DCC y DMAP) que no hayan reaccionado. Preferentemente, dicha purificación se realiza mediante centrifugación, más preferentemente mediante ultrafiltración, idealmente con un filtro centrífugo con un corte de peso molecular de 30.000 Da. En una realización preferida, la centrifugación se realiza a 490 - 1 110 g, durante al menos 30 minutos, a temperatura ambiente.

Un segundo objeto de la presente invención comprende un copolímero ramificado de ácido hialurónico y ácido poli(láctico-co-glicólico) (HA-g-PLGA) que se obtiene mediante el método de síntesis previamente descrito. Mediante este método, se obtiene un copolímero ramificado o copolímero de injerto en el que el ácido hialurónico tiene un grado de sustitución entre 8 y 13, preferentemente con un grado de sustitución de 10.

Los siguientes ejemplos están destinados a ¡lustrar la invención y sus modalidades preferidas, pero en ninguna circunstancia deberán considerarse para restringir el alcance de la invención, que estará definido por el tenor de las reivindicaciones que aquí se adjuntan.

EJEMPLOS

Se realizaron una serie de experimentos en los cuales se ensayaron diversos disolventes y parámetros para obtener el método de síntesis de HA-g-PLGA de la presente invención.

Se utilizó ácido hialurónico de un peso molecular medio (100 - 150 kDa) para todos los experimentos que se describen a continuación. Efectos de la sobre el polímero HA

Se realizó un análisis térmico mediante termogravimetría (TGA) y calorimetría diferencial de barrido (DSC) para determinar los efectos de la temperatura sobre el HA. Para los análisis de TGA se realizaron mediciones entre 25 y 900 °C, utilizando una pendiente de calentamiento de 20 °C/min. Para los análisis de DSC, se realizaron mediciones en un rango de temperatura entre -40 a 1 10 °C, utilizando un incremento de 20 °C. Los análisis se realizaron en una atmósfera de N2. Se determinó que el HA experimentó una pérdida de masa a temperaturas cercanas a los 100 °C (FIG. 2A).

Mediante el análisis DSC, se observó que el HA experimenta un proceso endotérmico a 52 °C y un proceso exotérmico a 62 °C los cuales dan cuenta de procesos locales de transición vitrea y cristalización del HA (FIG. 2B). Estos procesos implican que, sobre los 50 °C, el polisacáhdo se encuentra con un mayor grado de libertad en la solución, lo cual favorece su reacción en procesos de síntesis y por lo tanto en la formación de un copolímero. En base a estos resultados, los experimentos para obtener el método de síntesis del copolímero HA-g-PLGA se realizaron a una temperatura entre 60 - 70 °C.

Selección de condiciones de síntesis para PLGA y HA

Es importante destacar que los valores indicados en cada uno de los experimentos a continuación son aproximados y pueden tener una variación acorde con la metodología utilizada para medir dichos valores, o por el formato en el cual se adquirieron los reactivos comercialmente. Por ejemplo, los mg de PLGA que se utilizaron en los experimentos variaban ya que el PLGA comercial estaba en un formato de perlas.

Experimento 1

Se solubi lizó 25 mg de PLGA (peso molecular 43.500 Da (g/mol)) en 5 mi de diclorometano (DCM). Luego, para activar el PLGA se agregó a la solución 2 mg de DCC y se dejó reaccionar durante 30 minutos en un baño de hielo. Por otra parte, se disolvió 30 mg de HA en agua ultrapura (5 mi aprox.) junto con una cantidad catalítica de K2CO3 (10% mol respecto la cantidad de HA) equivalente a 1 - 3 mg de K2CO3 para este experimento a temperatura ambiente. No fue necesario agregar un volumen exacto de agua para disolver el HA, solo se requirió que la solución ya no fuese viscosa. El volumen de agua dependerá de la naturaleza del HA utilizado, el lote del producto, fabricante, entre otros.

Posteriormente, se agregó la solución de HA en la solución de PLGA, y se utilizó un reactor de microondas (Microwave Synthesis Reactor Monowave 200, Anton Paar) para llevar a cabo la reacción a 60 °C con 800 watts de potencia, durante 20 minutos.

Se observó que, luego de agregar la solución de HA en la solución de PLGA, el HA no se solubilizó en DCM a pesar de la temperatura o de las posibles interacciones con PLGA en la inferíase de la solución.

Tabla 1. Condiciones del experimento 1

Experimento 2

Se repitió el Experimento 1 , esta vez incorporando di metí Isu Ifóxido (DMSO) para generar una proporción DCM:DMSO 50:50 (v/v) como disolvente para el PLGA.

Se intentó utilizar el DMSO como disolvente para el HA puesto que en la literatura está reportado que el HA es soluble en ese disolvente. Fue inesperado observar que el HA no se solubilizó en el DMSO utilizado, ni siquiera incrementando el volumen de DMSO, o utilizando distintas temperaturas, incluso realizando mezclas con otros disolventes.

Debido a que no se logró solubilizar el HA en DMSO, se agregó la solución de PLGA sobre la solución de HA con el fin de generar la mezcla en el tubo de reacción de microondas. Tampoco se logró solubilizar el HA.

Tabla 2. Condiciones del experimento 2

Experimento 3 Se repitió el Experimento 2, pero en esta ocasión se incorporó 2 mg de DMAP junto con 2 mg de DCC en el paso de activación del PLGA con el fin de favorecer la formación de un enlace éster entre el PLGA y el HA, según se encuentra reportado en la literatura.

No se observó un cambio o avance en la reacción mediante cromatografía de capa fina (TLC), por lo cual, se concluyó que no se generó el copolímero HA-g-PLGA. En base a la apariencia de las mezclas generadas en los experimentos 2 y 3 se estimó que el copolímero no se generó debido a que el HA no se solu bilizó en el DMSO ni en las mezclas generadas con este. Tabla 3. Condiciones del experimento 3

Experimento 4

Se realizó una prueba de solubilidad del HA para evitar el uso de DMSO en la reacción. Para esto, se consideraron disolventes capaces de solubilizar el polímero PLGA y que además fueran miscibles con agua, tales como ACN y THF.

Para el ensayo con ACN, éste se secó durante 48 h con cloruro de calcio, se filtró y se recibió sobre tamices moleculares de 4 ángstrom (4Á) activados (previamente en estufa a 90 °C), y se dejó durante 3 horas en dichos tamices.

Se obtuvo que el HA es soluble en THF, ACN seco, o en una mezcla de ACN y agua en una proporción máxima de ACN:H2O 50:50 (v/v).

Experimento 5

En este experimento se utilizó 5 mi de ACN seco para solubilizar entre 45 - 50 mg de PLGA junto con 1 ,5 mg de DMAP y 2,5 mg de DCC en el paso de activación, durante 8 horas a temperatura ambiente. Luego, la solución de PLGA activado se filtró utilizando tierra de diatomeas (Celite®-545, Merck). Por otra parte, 30 mg de HA se solubilizó en una mezcla de disolventes de ACN:H2O 50:50 (v/v), en el volumen mínimo necesario para generar una disolución. Posteriormente, se agregó gota a gota lentamente los 5 mi de la solución de PLGA activado sobre la solución de HA sin agitación, y se obtuvo una solución de aspecto lechoso. Luego, la reacción se llevó a cabo durante 25 min utilizando microondas a 60 °C y 850 watts, bajo agitación constante con una barra magnética incorporada en la solución de forma previa.

Se observó un precipitado en la reacción adherido completamente al magneto utilizado para homogeneizar la reacción con microondas. Hasta este punto, el progreso de la reacción se monitoreó mediante TLC según lo descrito en literatura para PLGA, lo cual demostró no ser útil debido a que los polímeros HA y PLGA no presentaron movilidad cromatográfica en las condiciones de los disolventes utilizados.

Tabla 4. Condiciones del experimento 5

Experimento 6

Se repitió el Experimento 5, pero esta vez la reacción de activación del PLGA se realizó en 1 ml de ACN seco durante 8 horas a temperatura ambiente. Además, en este experimento se solubilizó 30 mg de HA en 5 mi de agua ultrapura. En este experimento, para mantener la temperatura de la reacción del PLGA activado con HA a aproximadamente 60 °C, se utilizó un baño de silicona con una temperatura entre 60 - 70 °C. Esta reacción se llevó a cabo durante 18 horas, bajo agitación constante con un magneto.

Tras incorporar 2 gotas de la solución de PLGA activado sobre la solución de HA se formó un precipitado que le dio un aspecto lechoso a la solución. Se incorporó gota a gota la totalidad de la solución de PLGA activado y se dejó reaccionar por 18 horas a la temperatura previamente indicada. El producto se caracterizó mediante resonancia magnética nuclear (RMN) utilizando una mezcla de óxido de deuteño y DMSO en una proporción D2O:DMSO-de de 7:1. Como resultado no se obtuvo una mezcla de ambos polímeros, sino que solo las señales del HA.

A partir de este experimento, se determinó que los volúmenes de la solución de PLGA y solución de HA son importantes para la obtención del copolímero.

Tabla 5. Condiciones del experimento 6

Experimento 7

Se siguió lo descrito en la literatura para mejorar la solubilidad del HA. Para ello, se repitió el Experimento 6 pero esta vez se incorporó de 0,6 mol de cloruro de tetrabutilamonio (TBACL) respecto a la masa de HA utilizada, con el fin de favorecer la solubilidad del HA. El extracto crudo de la reacción se analizó mediante RMN utilizando D2O:DMSO-de (7:1 ).

Se obtuvo una solución de aspecto lechoso la cual se volvió más clara tras las 18 horas de reacción a 60 °C. No fue posible determinar la presencia de PLGA en el producto final, solo se presentaron de forma mayohtaria las señales del HA y las asociadas al copolímero HA-g-PLGA.

Se decidió continuar los experimentos sin usar TBACL considerando que no se obtuvo ningún resultado significativo con este compuesto. Tabla 6. Condiciones del experimento 7

Experimento 8

Se repitió el Experimento 6, pero para favorecer la formación del enlace éster se agregó una cantidad catalítica de K2CO3 (10% mol respecto la cantidad de HA) a la solución de HA. Se midió el pH de la solución de PLGA activado y HA posterior a la incubación de 18 h.

En ambas soluciones (PLGA activado en ACN y mezcla de HA con K2CO3 en agua) se obtuvo que el pH de la solución se encuentra en un rango de pH ácido en el rango de 4 - 5. Se observó que este pH no favorece la formación del enlace éster.

Tabla 7. Condiciones del experimento 8 Experimento 9

Se repitió el Experimento 6, pero se reemplazó el disolvente del HA por una solución de tampón fosfato salino (PBS) 80 mM con pH 8. Se decidió usar esta solución con el fin de amortiguar el cambio de pH que se genera por las soluciones ácidas que se utilizan.

Al incorporar la solución de PLGA activado gota a gota en la solución de HA se formó una solución de aspecto lechoso la cual, tras 18 horas de reacción bajo agitación constante con un magneto, se tornó transparente. Junto con el cambio de coloración, se observó la formación de un precipitado amorfo unido al magneto. Por las características mecánicas de dicho precipitado se determinó que era PLGA.

Tabla 8. Condiciones del experimento 9

Mediante espectroscopia FT-IR se pudo analizar los grupos funcionales presentes en el copolímero HA-g-PLGA (FIG. 3). En el espectro de FT-IR obtenido para el copolímero se observaron las siguientes señales: a 3330 cnr ¹ se observó la señal correspondiente al estiramiento de los grupos hidroxilo (OH) y amino (NH), 2843 cnr ¹ se observó la señal correspondiente al estiramiento de los grupos metileno (CH2) y metilo (CH3), a 1786 cm ^-1 se observó la señal correspondiente al estiramiento del grupo carbonilo (C=O) del PLGA, a 1650 cnr ¹ se observó el estiramiento correspondiente al grupo carbonilo del HA, a 1560 cnr ¹ se observó la flexión de la amida del HA, a 1406 cnr ¹ se observó la vibración asimétrica del grupo carbonilo del HA, 1 155 cm ¹ se observó la flexión del grupo metilo y a 1058 cnr ¹ se observó la flexión asociada al sistema hemiacetal (C-O-C) del HA. A partir de las señales observadas se puede determinar que el copolímero HA-g-PLGA presenta grupos funcionales correspondientes a la unión de los precursores HA y PLGA.

Para caracterizar la estructura del copolímero HA-g-PLGA se realizó un análisis de resonancia magnética nuclear (RMN). Se utilizó ¹ H-RMN y se complementó utilizando ¹³ C-RMN y DEPT. Se logró determinar la presencia de un compuesto cuyas características corresponden a la mezcla de ambos polímeros (HA y PLGA) formando el copolímero. En la FIG. 4 se aprecian las señales características del copolímero.

También se realizó una caracterización térmica del copolímero, mediante un análisis termogravimétrico (TGA) y un análisis por calorimetría diferencial de barrido (DSC). El análisis TGA se realizó en una atmósfera de N2. La FIG. 5 muestra el perfil de degradación del copolímero HA-g-PLGA, en el que se observan cuatro procesos de degradación donde el copolímero disminuye en un 32% su masa inicial. El análisis DSC se realizó en un rango de temperatura entre 20 - 80 °C. El resultado de este análisis se muestra en la FIGs. 6A, 6B, 6C. Se observa que el comportamiento térmico del copolímero HA-g-PLGA indica que la unión de PLGA y HA tiene un efecto en la estabilidad térmica de ambos polímeros precursores.

Experimento 10

Con el objetivo de generar una metodología con el menor impacto ambiental se repitió el Experimento 9 pero, para mantener la temperatura de la reacción de la solución de PLGA y HA, se reemplazó el baño de silicona por microondas a una temperatura de 80 °C y 850 W.

Se obtuvo una solución de color amarilla, posiblemente debido a la degradación del polisacáñdo HA, y el PLGA se adhirió completamente al magneto que se utilizó para mantener la agitación constante. En este caso, al utilizar el equipo microondas que se disponía en el laboratorio, no se pudo agregar la solución de PLGA activado gota a gota sobre la solución de HA. Tabla 9. Condiciones del experimento 10

Experimento 11

Con el mismo objetivo del Experimento 10, se repitió el Experimento 9, pero esta vez los procesos de activación e incubación de la reacción se realizaron en un baño con sonicación por 2 horas a 60 °C. La solución resultante se purificó utilizando un tubo Amicon® con tamaño de exclusión de 100 kDa. El polímero resultante se analizó mediante RMN.

Solo se logró identificar el precursor HA en el polímero obtenido desde la fase superior del tubo Amicon®. Por tanto, bajo estas condiciones no se observó el copolímero HA-g-PLGA en la fase superior.

Tabla 10. Condiciones del experimento 11 Experimento 12

Con el objetivo de enriquecer la fracción de copolímero HA-g-PLGA obtenida en el Experimento 9, se repitió dicho experimento con algunas modificaciones. La solución resultante se purificó utilizando un tubo Amicon® con tamaño de exclusión de 100 kDa. En esta oportunidad se analizaron ambas fases generadas por el sistema de filtrado mediante RMN.

Se identificó el copolímero HA-g-PLGA en la porción inferior del tubo, mientras que el precursor HA que no reaccionó quedó en la fase superior.

Tabla 11. Condiciones del experimento 12

Experimento 13

Con el objetivo de evaluar si el orden en el cual se agregan las soluciones de PLGA y HA afecta el resultado de la reacción, se repitió el Experimento 9, pero esta vez la mezcla de HA con K2CO3 en PBS se incorporó sobre la solución de PLGA activado previamente filtrado.

Se obtuvo una solución lechosa, pero el producto deseado (copolímero ramificado HA-g-PLGA) no se logró identificar en el análisis de RMN, por lo que concluyó que la solución de PLGA siempre debe incorporarse sobre la solución de HA y no de forma inversa. Tabla 12. Condiciones del experimento 13

Experimento 14

Considerando las condiciones que se observaron hasta el Experimento 13, se concluyó que el volumen de PBS (5 mi) en el cual se disolvió el HA influye en la solubilidad del PLGA. Se sospechó que la formación de una suspensión coloidal favorecía la interacción del PLGA con el HA.

Para demostrar el punto antes señalado, se repitió el Experimento 12. Los parámetros que se variaron fueron los volúmenes de ACN seco y PBS utilizado. En este caso, se utilizaron 5 mi de ACN y 15 mi de PBS para que la concentración de PLGA incorporada sobre la solución de HA fuera de 4,6 mg/ml aprox. No obstante, se sabe que en una concentración mayor entre 5 - 10 mg/ml el PLGA no precipitará en la mezcla.

En este experimento, no solo se obtuvo el copolímero HA-g-PLGA, sino que bajo estas condiciones se pudo identificar la razón molar entre el HA y el PLGA obteniéndose una razón de 1 :26. El experimento se repitió 3 veces en días distintos a partir de soluciones nuevas obteniendo siempre un resultado reproducible. La cantidad de PLGA que no reacciona (precipitado) disminuyó en comparación a las otras condiciones exploradas.

Se determinó el grado de sustitución del HA mediante análisis de RMN de 1 H. Se integró las señales correspondientes obtenidas a un grupo funcional conocido de HA y de PLGA. En este caso se utilizó la señal correspondiente al grupo CH3 presente en ambos polímeros las cuales tienen un desplazamiento químico de 2,0 y 1 ,5 ppm, respectivamente. En base a la relación HA:PLGA obtenida en el copolímero, se pudo determinar el grado de sustitución del HA el cual fue 1 (SD=1 ) lo cual implica que por cada 100 unidades de monómeros del HA se encuentra una molécula de PLGA injertada.

Tabla 13. Condiciones del experimento 14

Experimento 15

Con el objetivo de mejorar la eficiencia de la reacción del Experimento 14, dicho experimento se repitió, pero se cambió la proporción de los volúmenes utilizados. Por cada mi de solución de PLGA activado se utilizaron 20 ml de PBS, obteniendo una reacción cuyos volúmenes finales fueron 4 mi de PLGA activado y 80 mi de PBS.

Se obtuvo una solución blanco opalescente con escaso PLGA sin reaccionar. El análisis de RMN determino que el grado de sustitución incrementó de SD=1 a SD=5. La solución resultante se concentró utilizando un liofilizador con el fin de obtener un polvo fino y no una película como se obtenía mediante el proceso de rotaevaporación. Se ensayó también con proporciones de los volúmenes de la solución de HA y la solución de PLGA entre 1 :15 a 1 :25. En todo el rango se obtuvo el copolímero HA-g-PLGA, con una razón óptima de 1 :20.

Conclusión del método de síntesis

A partir de los experimentos realizados, se obtuvo que los parámetros esenciales de la presente invención son a) la forma en la que se añade la solución de PLGA sobre el HA (gota a gota), b) la solución de PLGA se debe añadir sobre la solución de HA, c) HA se solubiliza en PBS para obtener un pH básico. Otro parámetro de consideración para mejorar el rendimiento de obtención del HA-g- PLGA respecto a los tres pasos esenciales anteriormente mencionados es la proporción de los volúmenes de la solución de PLGA y HA.

A continuación, se resume uno de los métodos de síntesis del copolímero HA-g-PLGA. No obstante, es importante aclarar que la presente invención no se limita a los reactivos, concentraciones y parámetros que se exponen, puesto que se demuestra claramente en los experimentos anteriores que es posible obtener el copolímero con variaciones a la presente metodología.

Para activar el PLGA, se añadieron 30 mg de PLGA a una solución de 5 mi de ACN seco junto con 1 mg de DCC y 2 mg de DMAP. La reacción de activación se realizó por 8 horas a temperatura ambiente. Luego de este periodo, el PLGA activado se filtró utilizando tierra de diatomeas (Celite®-545, Merck) con un tamaño en diámetro de partícula entre 0,02 - 0,1 mm. La tierra de diatomeas se lavó con ACN seco hasta que se obtuvo una solución de alrededor de 5 mg/ml de PLGA activado filtrado.

Por otra parte, se solubilizaron 30 mg de HA junto con una cantidad catalítica de K2CO3 (10% mol respecto la cantidad de HA) en 80 ml de PBS 80 mM a pH 8. Esta solución se dejó en un baño de silicona a 60 - 70 °C durante 1 hora.

Se incorporó 5 mi de la solución con el PLGA activado sobre la solución de HA gota a gota lentamente (preferentemente a 1 gota cada 30 segundos). Esta mezcla se dejó reaccionar en agitación constante por 18 horas en el baño de silicona a 60 - 70 °C. Luego de este periodo, se obtuvo una solución de aspecto opalescente con el copolímero HA-g-PLGA.

Posteriormente, copolímero HA-g-PLGA se purificó para eliminar el PLGA, DCC y DMAP que no reaccionó mediante centrifugación utilizando un filtro Amicon® a 5000 rpm (3070 g) por 30 minutos a temperatura ambiente.

La solución final obtenida con el copolímero HA-g-PLGA se congeló a -80 °C y se liofilizó hasta obtener un sólido blanco para su almacenamiento.