PROCEDIMIENTO PARA SINTETIZAR TIMOSINAS

CAMPO DE LA INVENCIóN:

Esta invención está dentro del campo de Ia química biomédica. En particular, Ia invención se refiere a un nuevo procedimiento de síntesis química de timosinas mediante síntesis de péptidos en fase sólida con un rendimiento y pureza elevados. El procedimiento se basa en Ia incorporación de derivados de pseudoprolina en posiciones clave de las secuencias de las timosinas. El ciclo oxazolidina de Ia pseudoprolina impide Ia estructuración de Ia cadena peptídica creciente anclada a Ia resina, evitando Ia agregación de la peptidil resina y el colapso de Ia síntesis durante

Ia elongación de Ia secuencia peptídica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIóN:

Las timosinas son uña familia de polípéptidos bioquímica y funcionalmente diferentes con importantes funciones fisiológicas. Descritas por primera vez en 1966 y originariamente aisladas en el timo, han sido identificadas posteriormente en diversos tejidos y células [Goldstein, A.L, Slatβr, F.D., White, A, Preparation and partial purification of a thymic lymphocytopoietic factor, Proa Nati. Acad. ScL USA 1966, 56 (3), 1010-1017]. Existen diferentes familias de timosinas que desempeñan funciones distintas, por ejemplo las oc-timosinas, que tienen localización nuclear y están implicadas en replicación y/o transcripción de DNA y las β-timosinas, que se localizan en el citoplasma y muestran una gran afinidad por G-actina en procesos implicados en motilidad celular. Las α- y β-timosinas juegan un importante papel en Ia regulación de Ia respuesta inmune, biología vascular y patogénesis del cáncer, presentando un gran potencial terapéutico además de su aplicación en diagnóstico como marcadores moleculares [Goldstein A.L.; Badamchian M., Thymosins: chemistry and biológica! properties in health and disease, Expert Opin. Biol. Therapy, 4 (4), 559-573]. La subfamilia de las α-timosinas está compuesta por oc-paratimosina, α-protimosina, α1-timosina y α11-timosina. La más importante es Ia α1-timosina o timalfasina, originariamente aislada de tejido tímico, es un péptido de 28 aminoácidos, acilado en posición N-terminal y con un grupo ácido en su extremo C-terminal, derivado del

precursor α1-protimosina con 111 aminoácidos. Debido a sus propiedades inmunoreguladoras, α1-timosina ha sido utilizada para el tratamiento de enfermedades en ias que el sistema inmunitario está afectado; principalmente en hepatitis B, C y carcinoma hepático. La hepatitis B crónica es una enfermedad relacionada con una disfunción del sistema inmune, conlleva un alto riesgo de padecer cirrosis y carcinoma hepatocelular. La α1-timosina actúa como modulador del sistema inmunitario activando Ia producción de células NK en varios modelos animales y humanos e incrementado Ia producción de células CD3, CD4 y CD8 en enfermos con hepatitis crónica B y cáncer. Activa también Ia producción de citoquinas Th1, relacionadas con una fuerte respuesta inmune antiviral.

Numerosos modelos celulares in vitro avalan el potencial terapéutico de Ia α1- timosina. El tratamiento con ort-timosina reduce Ia replicación del VIH-1 y del virus parainfluenza en cultivos celulares primarios [Collθdge, D., Wang, Y. Tuthill C; Locarnini-S. Antivaral effects βf thymosin alpha 1 versüs ^* lettkoeytie interferon in primaiγ cultures of duck hepatocytes persistently infected with duck HBV in vitro, Second international conference on therapies for viral hepatitis, 1997; Kona, Hawai; Palamara, A. Bue M., Savini, P., Thymosin alpha 1 inhibits Sendai virus replication: involvement of infrácelϊülar redox state, 6 ^t hnternational Expert Forum of Immunotherapy and Gene Therapy; May 1998, Florence, Italy]. Además reduce el estrés oxidativo aumentando los niveles de glutación intracelular cuya baja concentración en pacientes con el VIH está relacionada con un bajo índice de supervivencia [Giuliani, C, Napolitano, G., Mastino, A., Thymosin alpha-1 regulates MHC class I expression in FRTL-5 cells at transcriptional level, Eur. J. Immunol. 2000, 30, 778-786] . La α1-timosina aumenta los niveles de expresión de MHC clase 1 en cultivos celulares, manteniendo Ia capacidad del sistema inmune para responder a agentes infecciosos [Herzenberg, LA.; De Rosa, S.C.; Dubs, J.G., Glutathione deficiency is associated with impaired sun/ival in HIV disease, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 1967-1972]

En modelos animales de infección, el potencial terapéutico de α1-timosina ha sido puesto de manifiesto en ratones infectados con varios patógenos (Listeria monocitogenes, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcescens) y en ratones inmunodeprimidos con 5-fluorouracilo [Ishitsuka, H; Umeda, Y. Nakamura,J. Yagi, Y. Protective activity of thymosin against opportunistíc infections in animal models. Cancer Immunol. Immunother. 1983, 14, 145-150]. Así, en estudios

con modelos animales de hepatitis B crónica (woodchuck hepatitis virus) en los que los animales siguieron un tratamiento con α1-timosina, Ia concentración del virus en suero fue reducida en un 99% [Gerin, J.L, Korba, B.E., Cote P.J., Tennant, B.C., A preliminary report of a controlled study of thymosin alpha 1 in the woodchuck model of hepanavirus infection. In: Block T., ed. Innovations in antiviral development and the detection of virus infection. Philadelphia, Pa: Jefferson Medical; 1992,121-123; Tennant, B.V., Korba, B.E., Baldwin B.H., Goddard, LA, Hornbuckle W.E., Cote, PJ., Treatment of chronic woodchuck hepatitis virus infection with thymosin alpha-1 (TA1). Antiviral Res. 1993; 20 (suppl 1), 1634], disminuyendo dicho tratamiento el riesgo de muerte por carcinoma hepatocelular. Asimismo oc1-timosina aumenta Ia supervivencia de animales adultos o inmunodeprimidos infectados con el virus herpes simple, el virus influenza o Candida albicans [Effros, R.B., Casillas, A., Wadlford, R.L., The effect of thymosin alpha 1 on immunity to influenza in aged mice. Aging: immunology and infectious . disease. Yol 1.,NewYork, N.Y,: Mary Ann Liebert,INC; 1988; 31-40; Bistoni _, F., Marconi, P., Frati, L, Bonmassar, E, Garaci, E. Increase of mouse resistance to candida albicans infection by thymosin alphai. Infect Immun. 1982, 36, 609-614].

El efecto sinérgico de oc1-timosina con otras citoquinas en el tratamiento de Ia hepatitis C ha sido puesto de manifiesto en ensayos con ratones infectados con el virus influenza A tratados con una combinación de α1-timosina, interferón IFNα/β y el antiviral amantadina. La combinación de los tres compuestos mejora sustancialmente el porcentaje de supervivencia [D'Agostini C, Palamara, A.T., Favalli, C. Efficacy of combination therapy with amantadme, thymosin alpha 1 and alpha/beta interferón in mice infected with influenza A virus. Int. J. Immunopharmacol. 1996, 16, 95-102]. Un estudio en el que se estudió comparativamente el efecto del tratamiento con ort- timosina o interferón IFN α-2b en pacientes difíciles de tratar con un muíante del virus de Ia hepatitis B muestra casi el doble de eficacia en eliminación del virus con α1- timosina. En contraposición al IFNα-2b, Ia oc1 -timosina es mejor tolerada y además no presenta efectos secundarios significativos en personas inmunodeprimidas [Andreone, P., Cursaro, C, Gramenzi, A., A randomized controlled trial of thymosin alpha 1 versus interferón alpha treatment in patients with hepatitis B antigen antibody and hepatitis B virus DNA, positíve chronic hepatitis B ₁ Hepatology, 1996, 24, 774-777]. Mientras interferón produce una rápida respuesta durante el tratamiento, cepas resistentes del virus provocan Ia recaída del paciente, Ia α1 -timosina tiene un efecto más retardado,

relacionado con una mejora del sistema inmunitario a largo plazo [Garad, E., Milanθse, G., VeIIa, S., A randomized controlled study for the evaluation of the actMty of a triple combination of zidovudine, thymosin alpha 1 and interferon alpha In HIV- infected individuáis with CD4 counts between 200 and 500 cells/mm ³ , Antiviral Therapy, 1998, 3, 103-11 J.

En modelos animales de cáncer, la oc-timosina ha demostrado su eficacia en Ia prevención de cáncer intestinal [Moody, T.W., Leyton, J., Zia, F, Tuthill, C, Badamchian, M. Goldstβin, A.L., Thymosin alphai is chemopreventive for lung adenoma formation in A/J mice, Cáncer Lett. 2000, 155, 121-127], cáncer de mama, reduciendo Ia incidencia de desarrollo del cáncer como resultado de Ia estimulación del sistema immunitario en ratas [Moody, T.W., Tuthill, C, Badamchian, M., Goldstein, A. L, Thymosin alphai inhibits mammary carcinogenesis in Fisherrats, Peptides, 2002, 23 (5), 1011-1014Jy glioblastoma [Patente WO03049697, Thymosin-alphai is used as an -adjuvant in combination with carmustine (BCNU) as an effective treatment- for malignant glioblastoma, Wands, J.R. De Ia Monte S., Rhode Island Hospital (US), 30- 06-2005]. La terapia combinada de interferon IFN α-2b, α1-timosina y ciclofosf amida ha dado buenos resultados, reduciendo el tamaño del melanoma en ratones [Pica, F., Frascñetti, M., Matteuccí, C, Tuthill, C, Rasí, G., High doses of thymosin alpha 1 enhance the anti-tumor efficacy of combination chemo-immunotherapy for murine B16 melanoma, Anticancer Res. 1998, 18, 3571-3578].

Otros dos péptidos relacionados con α1-timosina y tan potentes como ella en infecciones de Candida albicans han sido aislados de preparaciones de fracción 5 de timosina: des-(25-28)- α1 -timosina y α11 -timosina [Thymosin α11: a peptide related to thymosin al isolated from calf thymosin fraction 5, Calderella, J., Goodall, GJ. , Félix, A.M., Heimer, E.P., SaMn, S.B., Horecker, B.L, Proc. Nati. Acad. Sd. USA, 80, 7424- 742].

La segunda subfamilia de timosinas son las β-timosinas que constituyen una familia de proteínas (β-4, β-8, β-9, β-10, β-11, β-12, β-15 timosinas) con una alta homología en su secuencia peptídica (ver Tabla 1). La tabla 1 muestra las secuencias de las timosinas.

La β4-t¡mosina contiene 43 aminoácidos y se expresa en fases del desarrollo embrionario correspondientes con el desarrollo del corazón. Este descubrimiento, llevado a cabo en estudios preclínicos con animales, ha puesto en relieve el potencial de β4-timosina para el tratamiento de pacientes que hayan sufrido un infarto de miocardio. En estudios preclínicos con ratones a los que se inducían ataques cardiacos, el tratamiento con Ia proteína β4-timosina promovía Ia diferenciación de las células endoteliales y estimulaba Ia migración de las células cardiacas, mejorando Ia capacidad de supervivencia de dichas células [Bock-Marquette, /., Saxena, A., White, M.D., DiMaio, JM. , Srivastava, D., Thymosin β4 activates integrín-linked kinase and promotes cardiac cell migratíon, survival and cardiac repair, Nature, 2004, 432, 466- 472]

La β4-timosina regula además una serie de citoquinas y quimioquínas inflamatorias, controla Ia función de Ia proteína actina, uniéndose a ella, e induce Ia producción de Iáminma-5, una proteína necesaria para Ia correcta adhesión de algunos tipos de células de mamíferos y un importante componente del proceso de reparación de heridas, facilitando así Ia reepitelización e induciendo Ia deposición de colágeno [Bubb, M.R., Thymosin beta 4 interactions, Vitam. Horm. 2003, 66, 297-316].

Otras posibles aplicaciones terapéuticas de la β4-timosina incluyen el aumento del crecimiento del cabello activando células madre de folículos pilosos, denominadas "hair follicle stem cells" [Patente WO/063775 A2, Methods and compositions for the promotion of hairgrowth υtilizing actin binding peptides]. También para el tratamiento diversos tipos de indicaciones dermatológicas crónicas como úlceras venosas crónicas "chronic venous stasis ulcers", úlceras por presión crónicas "chronic pressure ulcers", epidermolisis bullosa, un grupo de desórdenes hereditarios caracterizados por Ia formación de ampollas en respuesta a un trauma mecánico y tratamiento de heridas de córnea. El fragmento LKKTETQ de Ia β4-timosina, el dominio de unión a actina, facilita Ia curación de heridas dérmicas en animales adultos [Philp D., Huff, D., Song Gho, Y.; Hannappel, E, Kleinman, T., The actin binding site on thymosin β4 promotes angiogenesis, FASEBJ., 17, 2103-2105]. La β15-timosina es un péptido de 44 aminoácidos sobreexpresado en cáncer de próstata, donde favorece Ia diseminación del tumor fuera de Ia glándula prostática. Este péptido está siendo desarrollado como biomarcador para el diagnóstico de dicho cáncer, para la discriminación entre los tumores benignos y malignos prostáticos y

para su adecuado tratamiento [Hutchinson, LM., Chang, E.L, Becker, CM., Ushiyama, N., Behonick, D., Shih, M.C., DeWoIf, W.C., Gastón, SM, Zetter, B.R., Development of a sensitive and specific enzyme-linked immunoassay for thymosin beta 15, a urinary blomarker of human prostate cáncer, Clin. Biochem. 2005, 38 (6), 558-571]. La β15-timosina también ha sido patentada para su utilización en regeneración y cicatrización de heridas pudiendo ser aplicada para esta indicación en un futuro próximo [Patente CN1579539, Thymic hormone beta 15 to promote wound healing and generation ofblood, , Gan Chunyu (CN)J.

La β10- imosina está constituida por 43 aminoácidos y se sobreexpresa en células embrionarias y tumorales como adenocarcinomas de colon /Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L.F., Kocher, O., Dvorak, H.F., Differential expression of thymosin β-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis, FASéB J., 2θθ1, 15,458-466] La β10-tímosina presenta una gran homología eon Ia β4-tímosína ya que ambas se unen a Ia actina e inhiben su polimerización [Yu, F.X., Lin, S.C., Morrison-Bogorad, M., Atkinson, M.A., Yin, H.L., Thymosin beta 10 and thymosin beta 4 are both actin monomer sequestering proteins, J. Biol. Chem., 1993, 268 (1), 502- 509]. Recientes resülfados relacionados con Ia unión de Ia βiό-tímosina a Ia actina y activación del proceso apoptótico en células de cáncer de ovario están demostrando el potencial de Ia β10-timosina y sus derivados en una nueva terapia para el tratamiento del cáncer de ovarios [Rho, S.B., Lee, K.W., Chun, T ₁ Lee, S-H., Park, K., Lee, J-H., The Identification of apoptosis-related residues in human thymosin β-10 by mutational analysis and computational modelling, J. Biol. Chem., 280 (40), 34003-34007] Ninguna de las β-timosinas con potencial terapéutico ha llegado por el momento a fases clínicas, aunque Ia utilización de Ia β4-timosina y Ia β15-timosina para el tratamiento de pacientes que hayan sufrido un infarto de miocardio en Ia regeneración del tejido dañado será próximamente presentada a Ia FDA para su aplicación en fase clínica 1. Entre las distintas β-timosinas (ver Tabla 1) Ia β4-timosina, Ia β9-timosina y Ia β10- timosina se encuentran en mamíferos y en cambio Ia β4 ^Xeπ -timosina ha sido identificada en anfibios (Xenopus) [Voelter, W., Kaiser, T., Hannappel, E., Echner, H, Synthesis of thymosin β4 ^Xeπ and its comparison with the natural trítetraconpeptide, J. Prakt. Chem., 1999, 341(1), 47-51] y Ia β11- y Ia β12- en trucha (Salmo gairdnerí)

[Yialouiris, P.P., Coles, B., Tsitsiloni, O., Schmid, B., Howell, S., Aitken, A, Voelter, W., Harítos, AA, The complete sequences of troυt (Salmo gairdneri) thymosin β11 and its homologue thymosin β12, Biochem.J., 1992, 283, 385-389].

La β8-timos¡na contiene 39 aminoácidos y un alto grado de homología (79%) con Ia β4-timosina. La βθ-timosina tiene 41 aminoácidos y se diferencia de Ia β9-timosina en un dipéptido adicional en Ia región C-terminal, presentando un 82% de homología con Ia β4-timosina. La β11-timosina con 42 aminoácidos, presenta un 78% de homología respecto a Ia β4-timosina. La β12-timosina con 43 aminoácidos es 79% homologa a Ia β4-timosina y 84% a Ia β11 -timosina (ver Tabla 1). EI primer procedimiento sintético patentado de timosina fue para Ia obtención de Ia α1- timosina. Este procedimiento proponía Ia síntesis convergente en solución de dos fragmentos de quince (15) y trece aminoácidos (13), que previamente habían sido sintetizados en fase sólida con Ia estrategia Boc/Bzl [Patente US4148788, Synthesis of thymosin alpha 1, Hoffmann La Roche, 1979]. Este procedimiento fue posteriormente implementado en una estrategia realizada en solución en la que se utilizaban siete (7) fragmentos [Patente US4504415, Intermediates for thymosin alpha 1 and desacetyl thymosin alpha 1, Hoffmann La Roche, 1985],

En estos procedimientos anteriormente descritos, Ia estrategia utilizada para Ia síntesis de fragmentos en fase sólida fue Boc/Bzl. Otra opción también utilizada fue el empleo de un grupo protector temporal de Ia posición N-terminal, el denominado Ddz [Nguyen, T.H., Heinzel, W., Biπ, C ₁ Ddz, a highly efficient protecting group in large scale syntheses of thymosin-α1 related peptides, Pept, Proc. Eur. Pept Symp., 19 ^th , 1987].

Otro procedimiento que también ha sido descrito es el de Ia síntesis total de Ia α1- timosina según una estrategia lineal Boc/Bzl en fase sólida sobre una resina MBHA ₁ con Ia utilización de HBr y posteriormente bromotrimetilsilano para escindir el péptido de Ia resina [Wang, S., Wang, B.S.H., Hughes, J.L., Leopold, EJ., Wu, C.R., Tam, P., Cleavage and deprotection of peptides on MBHA-resin with hydrogen bromide, IntJ.Pept Prot. Res., 1992, 40(3-4), 344-349; Hughes, J.L, Leopold, E.J., Cleavage and deprotection of peptides from MBHA-resin with bromotrimethylsilane, Tetrahedron Lett, 1993, 34(48), 7713-7716]

Por otro lado, también existe otro procedimiento patentado de síntesis convergente en solución de fragmentos previamente obtenidos en fase sólida que utiliza Ia protección temporal Moz en lugar de Boc mejorando los rendimientos y Ia pureza del producto

final [Patente US5856440, Solid phase process for synthesizing thymosin alphai, Alpha 1 Biomedicals Inc., 1999].

Sin embargo, el procedimiento que emplea Ia estrategia ortogonal Fmoc/tBu es actualmente Ia más popularmente aceptada debido a Ia eliminación de las etapas de trabajo con TFA para eliminar el grupo protector temporal N-terminal y HF para escindir el péptido de la resina. Con la estrategia Fmoc/tBu un método propuesto de síntesis de la α1-timosina incluye el uso de cadenas laterales protegidas y acoplamiento en solución de dos fragmentos (1-10) y (11-28) con DCC/HOBT con un rendimiento para las 4 últimas etapas del 30%. [Félix, AM. , Heimer, E.P., Wang, CT, Lambros, TJ., Swistok, J., Roszkowski, M., Ahmad, M., Confalone, D., Scott, J.W., Synthesis of thymosin α1 by fragment condensation υsing tert-butyl side chain protection, Int. J. Pept. Prot Res., 1985, 26 (2), 130-148]. La etapa de acoplamiento anteriormente descrita ha sido optimizada hasta obtener un rendimiento del 44% en TFE. Aunque el rendimiento de acoplamiento en CHCI ₃ es del 49%, Ia pureza del crudo obtenido en este último es peor [Félix, AM., Wang, CT. , Lambros, TJ., Coupling of large protected peptide fragments in trifluoroethanol: synthesis of thymosin α1 Pept: Struct. Fυnct, Proc. Am. Pept. Symp., 9" ¹ , 1985]. La estrategia lineal paso a paso en fase sólida con protectores Fmoc/tBu también ha sido descrita utilizando una resina p-benzíloxicarbonilo [Echner, H., Voelter, W., A new synthesis of thymosin oc1, Liebigs Annalen der Chimie, 1988, 11, 1095-1097].

Para Ia obtención de β4-timosina en fase sólida se han descrito dos estrategias lineales: una estrategia Boc/Bzl [Low, T.L.K., Wang, S.S., Goldstein, A.L., Solid-phase synthesis of thymosin β4: chemical and biológica! characterization of the synthetic peptide, Biochemistry, 1983, 22, 733-740] y una estrategia Fmoc/tBu /Zikos, C, Livaniou, E., Leondiadis, L., Ferderigos, N., Ithakissios, D.S., Evangelatos, G.P., Comparative evaluation of four trityl-.type amidomethyl polystyrene resins in Fmoc solid phase peptide synthesis, J. Pept. Sci, 2003, 9(7), 419-429/. En esta última, utilizando resinas lábiles tipo cloro-tritilo, se obtiene Ia β4-timosina con un rendimiento del 30%, mejor que el obtenido con Ia estrategia Boc/Bzl (5-12%) pero que puede ser mejorable desde el punto de vista industrial (ver Tabla 2, en Ia que se muestra Ia comparativa de rendimientos obtenidos en Ia síntesis de beta-timosinas).

Tabla 2

Una variante de Ia β4-timosina en Ia cual las posiciones Ser15, Ala40 y Ser41 de Ia β4- timosina están reemplazadas por Ala, Thr y Ser respectivamente, es Ia β4 ^Xen -timosina que ya ha sido sintetizada según una estrategia lineal Fmoc/tBu, y de Ia que se ha obtenido una pureza del crudo del 48-53% [Voelter, W., Kaiser, T., Hannapel, E., Echner, H, Synthesis of thymosin β4 ^Xen and its comparíson with the natural trítetraconpeptide, J.Prakt.Chem., 1999, 341, 1, 47-51].

La síntesis de Ia β10-timosina en fase sólida ya ha sido descrita siguiendo una estrategia de síntesis lineal, con una resina bromo-4-cianotritilo. El procedimiento de síntesis incluye acoplamientos prolongados durante Ia noche, reacoplamientos y acetilaciones en varias posiciones [Leondiadis, L, Vassiliadou, /., Zikos, C ₁ Ferderígos, N., Livaniou, E., Ithakissios, D.S., Evangelatos, G.P., Solid-phase synthesis of thymosin. β10 using a p-cyanotrítyl resin. Chemical characterízation and immunochemical control of the synthetic peptide, J. Chem. Soc, Perkin Trans. 1, 1996, 971-975]. La síntesis también descrita dé Ia β15-timosina se obtiene mediante una estrategia similar, es decir, una síntesis lineal basada en Ia estrategia Fmoc/tBu. Esta síntesis conduce al producto β15-timosina , pero también supone acoplamientos largos e incompletos, que incluyen un paso de acetilación, disminuyendo Ia pureza del crudo obtenido [Koutrafourí, V., Leondiadis, L ₁ Ferderígos, N., Avgoustakis, K., Livaniou, E., Evangelatos, G.P., Ithakissios, D.S. Synthesis and angiogenetic activity in the chick choríoallantoic membrane model of thymosin beta-15, Peptides, 2003, 24, 107-115]. Los rendimientos globales obtenidos no son bajos (40% de Ia β10-timosina) y (45% de Ia β15-timosina) aunque el procedimiento de síntesis en previsión de una producción a gran escala necesita ser optimizado. En Ia síntesis de péptidos en fase sólida, las interacciones hidrofóbicas de Ia creciente cadena peptídica protegida dan lugar a bajos rendimientos de acoplamiento, desprotecciones incompletas y a Ia obtención de productos secundarios. El uso de pseudoprolinas introducido recientemente en síntesis de péptidos largos es una mejora substancial para el estado de Ia técnica en péptidos con una gran tendencia a estructurarse durante Ia elongación de Ia cadena. Las pseudoproiinas son derivados cíclicos de Ser, Thr o Cys que sirven como grupos protectores de estos aminoácidos (Formula I) y facilitan Ia síntesis de secuencias difíciles, interrumpiendo Ia estructuración de Ia cadena peptídica creciente aún anclada a Ia resina e impidiendo Ia agregación de Ia peptidil-resina y el colapso de Ia síntesis

La tabla 3 muestra las secuencias de las timosinas; las Ser y Thr que podrían ser sustituidas por pseudoprolinas aparecen subrayadas.

Como se ha visto en líneas anteriores, aunque ya se han descrito en el estado de Ia técnica síntesis de péptidos largos con pseudoprolinas en el ámbito académico, las pseudoprolinas no han sido aplicadas ni a escala industrial ni para sintetizar timosinas, Io cual avala Ia novedad y Ia capacidad y nivel inventivos de Ia presente invención.

TABLA 3

DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN:

La presente invención describe un procedimiento sintético nuevo para Ia preparación y obtención industrial de timosinas (α y β) usando dipéptidos pseudoprolina protegidos en posiciones estratégicas (Ver Tabla 4). Concretamente, el método de síntesis de timosinas propuesto en ia presente invención describe un procedimiento que consta de las siguientes etapas: a) Síntesis lineal de los péptidos en fase sólida sobre resina aplicando la metodología Fmoc/tBu, b) Utilización de X-Thr o X-Ser, donde X es cualquier aminoácido, en forma de dipéptidos pseudoprolina en posiciones estratégicas de Ia secuencia según las siguientes pautas: b.1) La inserción de dipéptidos pseudoprolina no es necesaria en Ia posición C-terminal ni en Ia N-terminal, b.2) Incorporación de al menos un dipéptido pseudoprolina en Ia secuencia, b.3) El efecto desestabilizador de estructura de las pseudoprolinas mantiene su influencia en los siguientes 5-6 aminoácidos, b.4) La separación óptima entre dipéptidos pseudoprolina es de 5-6 aminoácidos. b.5) La separación mínima entre dos dipéptidos pseudoprolina o una pseudoprolina y una prolina es preferentemente de dos residuos, b.6) El resultado sintético es óptimo si el dipéptido pseudoprolina se encuentra en una región de residuos hidrofóbicos.

c) Rotura del enlace péptido-resina, desprotección de las cadenas laterales, apertura del ciclo de pseudoprolina y obtención de timosinas mediante el tratamiento de Ia peptidil-resina con ácido trifluoroacético, d) En caso de existencia del aminoácido Met en Ia secuencia, tratamiento de destec-butilación del crudo con AcOH previo a Ia purificación por RP- HPLC.

La diferencia básica con respecto a otros procedimientos sintéticos ya existentes es Ia incorporación adicional en Ia secuencia de X-Thr y/o X-Ser en forma de dipéptidos pseudoprolina protegidos que conduce a Ia obtención del producto final con muy buenos rendimientos y elevada pureza (ver Tabla 2), siendo Ia pureza del crudo superior al 80%, pureza del producto puro superior al 99% y rendimiento global superior al 50%.

En Ia tabla 3 se muestran aquellas secuencias de las timosinas con todas las posibles posiciones para Ia incorporación de dipéptidos pseudoprolina. El objeto de Ia presente invención se desarrolló porque Ia síntesis de péptidos largos supone un reto debido fundamentalmente a acoplamientos y desprotecciones poco eficientes, derivadas de los efectos de agregación también encontrados en secuencias no muy largas pero especialmente hidrofóbicas o repetitivas.

La presente invención pretende solucionar este problema técnico y para ello propone un procedimiento sintética para la obtenciórr industr-iaϊ de timosinas ^" basado eo Ia síntesis de péptidos en fase sólida, que aplican Ia metodología Fmoc/tBu sobre una resina tipo 2-clorotritiio, incorporando X-Ser y X-Thr en posiciones clave como dipéptidos pseudoprolina.

Lá síntesis en ^" fase sólida dé fas ^" tlrriósiήas con una función C-termiñar ácido, se lleva cabo a partir de una resina de cloruro de 2-clorotritiIo [Barios K., Chatzi, O., Gatos, D., Stavropoulos, G, 2-Chlorotrítyl chloríde resin, Int. J. Peptide Protein Res., 1991 (37), 513-520]. Esta resina facilita Ia incorporación del primer aminoácido y minimiza Ia reacción secundaria de racemización. Esta resina además reduce el riesgo de formación de dicetopiperacina en el tratamiento básico con 20% piperidina en DMF posterior a Ia incorporación del segundo aminoácido sobre la resina. Basándose en una estrategia de síntesis lineal Fmoc/tBu, tal y como se ha comentado en líneas anteriores, la presente invención se caracteriza porque incorpora aminoácidos Thr o Ser, según Ia secuencia peptídica, a través o mediante Ia adición de dipéptidos pseudoprolina en posiciones estratégicas de Ia secuencia peptídica.

Tabla 4

La presente invención por tanto, se caracteriza porque incorpora aminoácidos Thr o Ser, según Ia secuencia peptídica, mediante Ia adición de dipéptidos pseudoprolina en posiciones estratégicas de Ia secuencia peptídica, siguiendo las siguientes pautas:

a) La inserción de dipéptidos pseudoprolina no es necesaria en Ia posición C-terminal ni en Ia N-terminal, b) La incorporación de al menos un dipéptido pseudoprolina en Ia secuencia, c) El efecto desestabilizador de estructura de las pseudoprolinas mantiene su influencia en los siguientes 5-6 aminoácidos, d) La separación óptima entre dipéptidos pseudoprolina es de 5-6 aminoácidos. e) La separación mínima entre dos dipéptidos pseudoprolinas o una pseudoprolina y una prolina es preferentemente de dos residuos, f) El resultado sintético es óptimo si el dipéptido pseudoprolina se encuentra, en una región de residuos hidrofóbicos. La obtención y optimización de un proceso sintético para la producción de timosinas a nivel industrial ha supuesto un gran esfuerzo. Nuestro laboratorio ha abordado otras estrategias sintéticas para- Ia obtención de timosinas sin éxito.- Para obtener un proceso productivo rentable para Ia producción de β4-timosina, se han estudiado tres estrategias diferentes:

Primera estrategia mediante síntesis convergente en fase sólida:

La síntesis de β4-timosina ha sido abordada en una primera estrategia de síntesis convergente en fase sólida utilizando dos fragmentos (1-27) y (28-43)-resina. La etapa de activación y acoplamiento en fase sólida del fragmento 1-27 protegido sobre Ia peptidil- resina 28-43-resina protegida daba lugar a geles que bloqueaban la reacción. Con esta primera aproximación el producto final no pudo ser identificado.

Segunda estrategia mediante síntesis lineal en fase sólida:

Una segunda aproximación, Ia síntesis lineal en fase sólida paso a paso de β4-timosina daba lugar a un crudo de síntesis de baja pureza, inviable para un proceso industrial de producción de β4-timosina dada Ia dificultad de Ia etapa de purificación y el bajo rendimiento global obtenido.

Tercera estrategia mediante síntesis lineal en fase sólida con Ia estrategia Fmoc/íBu, y utilización de pseudoprolinas:

La tercera estrategia ha supuesto Ia resolución de un problema, Ia obtención de timosinas según un proceso competitivo a escala industrial. En Ia presente invención, para obtener un proceso sintético más rentable y competitivo, se ha incorporado Ia utilización de pseudoprolinas en Ia síntesis lineal en fase sólida con Ia estrategia Fmoc/tBu. Los resultados obtenidos en Ia síntesis comparativa entre Ia estrategia de síntesis lineal de Ia β4-timosina y

Ia misma estrategia incorporando pseudoprolinas pone de manifiesto Ia gran ventaja que supone la incorporación de las pseudoprolinas, ya que las pseudoprolinas son aminoácidos no naturales derivados de Cys, Ser o Thr con una estructura análoga a Ia prolina. El anillo cíclico de oxazolidina impide Ia estructuración de Ia cadena peptídica creciente aún anclada a Ia resina y bloquea Ia agregación de Ia peptidil-resina y el colapso de Ia síntesis. El tratamiento ácido, final, de la peptidil-resina regeneraJa Ser o. Thr de. la secuencia nativa. . .

La comparación entre Ia segunda y Ia tercera estrategia en términos de pureza del producto final se presenta en la Figura 1, en Ia que se observa el cromatograma de RP-HPLC del crudo de β4-timosina obtenido siguiendo una estrategia SPPS lineal (Figura 1A) y siguiendo Ia misma estrategia Fmoc/tBu pero con Ia utilización de pseudoprolinas (Figura 1 B). Como se aprecia en Ia comparativa de ambos gráficos en Ia Figura 1A el rendimiento es mucho menor que en Ia síntesis objeto de Ia presente invención cuyo resultado se muestra en Ia Figura 1 B. Debemos considerar que para Ia síntesis lineal convencional (Figura 1A) fue necesaria Ia reactivación en las posiciones Ne (34), Thr (33), Lys (31), Ser (30), Pro (29), Leu (28), Pro (27), Asn (26), Lys (16) Ser (15), Lys (14), Asp (13), Phe (12), Lys (11), GIu (10), He (9), GIu (8), Ala (7), Met (6), Asp (5), Pro (4), Ser (1), siendo necesario en algunos casos reacoplar: He (34), Thr (33), Leu (28), Asn (26), Lys (16), Ser (15), Asp (13), GIu (10), He (9), GIu (8), Met (6), Asp (5).

Por el contrario en Ia síntesis lineal con pseudoprolinas (Figura 1 B) sólo fue necesario reactivar en He (34) y Asn (26) y reacoplar en este último, Io que indica que Ia adición de

pseudoprolinas en el procedimiento de síntesis mejora de forma sustancial y sorprendente el rendimiento del procedimiento, haciéndolo más sencillo, más ventajoso y con un rendimiento muy superior a los procedimientos ya conocidos de síntesis de timosinas. Una vez completada Ia síntesis objeto de Ia presente invención, con acetilación o no del extremo N-terminal, según el producto, Ia peptidil-resina se somete a un tratamiento final con ácido trifluoroacético y capturadores de carbocationes para escindir el péptido de Ia resina y eliminar los grupos protectores de las cadenas laterales y Ia protección pseudoprolina. Finalmente el crudo resultante se purifica por RP-HPLC y el conjunto de fracciones puras se juntan y liofilizan, obteniéndose los productos finales con una pureza de más del 99%, con un rendimiento global superior al 50%.

La Figura 1 muestra el crudo de β4-t¡mosina aislado según Ia estrategia 2 y la estrategia 3. En Ia Tabla 2 (expuesta en líneas anteriores) podemos observar Ia diferencia en rendimientos en estas estrategias y otras anteriomente publicadas para Ia síntesis de β- timβsinas. - La aproximación de síntesis lineal en fase sólida siguiend© una estrategia Fmoc/tBu sin Ia utilización de las pseudoprolinas da lugar a un crudo difícil de purificar (Figura 1A), obteniéndose el producto con un rendimiento muy bajo (Tabla 2). Sin embargo, Ia utilización de dipéptidos pseudoprolina en una estrategia lineal Fmoc/tBu mejora notablemente el rendimiento y Ia pureza del producto ^" final. Para finalizar ^' y corrió conclusión de Io anteriormente expuesto, el punto clave e inventivo del procedimiento sintético reivindicado en Ia presente invención se fundamenta en Ia utilización de dipéptidos pseudoprolina en posiciones clave de Ia síntesis, siguiendo las pautas anteriormente mencionadas, evitando secuencias que provocan Ia agregación de Ia cadena creciente sobre Ia resina y eliminando así problemas de acoplamientos y desprotecciones incompletas que conducen a un crudo peptídico de baja calidad y por tanto a un bajo rendimiento de síntesis, con Ia consecuente dificultad en el proceso de purificación.

El éxito del proceso sintético se desarrolla para Ia presente invención como un proceso competitivo para Ia síntesis de las timosinas a gran escala, ya que resulta ser un procedimiento poco costoso, rápido y con un rendimiento y pureza superiores a los descritos en el estado de Ia técnica. Las abreviaturas empleadas en Ia presente descripción tienen los siguientes significados: Ac ₂ O: Anhídrido acético. AcOH: ácido acético. Boc: Terc-butoxicarbonilo.

DCM: Diclorometano.

DIEA: NjN'-diisopropiletüamina.

DlPCDl: Diisopropilcarbodiimida.

DMF: N,N-dimetilformamida. Fmoc: 9-FIuoroenümetoxicarbonilo.

HF: ácido fluorhídrico.

HOBT: N-hidroxibenzotriazol.

HPLC: Cromatografía Líquida de Alta Presión. μL: microlitros. μmol: micromoles. tBu: Tere-butilo.

TFA: ácido trifluoroacético.

-TrI ¹ WtHo. - - . .. . .

Aminoácidos: Ala (A): L-Alanina

Arg (R): L-Arginina

Asn (N): L-Asparagina

Asp (D): L-Aspártico

GIn(Q): L-Glutamina GIu (E): L-Glutámico

GIy (G): L-Glicina

Ue (I): L-lsoleucina

Leu (L): L-Leucina

Lys (K): L-Lisina Met (M): L-Metionina

Phe (F): L-Feniialanina

Pro (P): L-Prolina

Ser (S): L-Serina

Thr (T): L-Treonina Tyr (Y): L-Tirosina

Val (V): L-Valina

Según un primer aspecto importante, Ia presente invención se refiere a un procedimiento para Ia obtención de timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables mediante síntesis en fase sólida sobre soportes poliméricos que comprende las siguientes etapas:

a. Sintetizar ünealmente los péptidos derivados de timus en fase sólida sobre una resina aplicando Ia metodología Fmoc/tBu,

b. Incorporar al menos una X-Thr y/o X-Ser en forma de dipéptidos pseudoprolina en Ia secuencia,

c. Adicionar de forma intercalada los dipéptidos pseudoprolina con una distancia de al menos 5 aminoácidos,

d. Obtener las timosinas mediante el tratamiento de peptidil-resina con ácido trifluoroacético que provoca de forma simultánea ruptura del enlace péptido- resina, desprotección de las cadenas laterales y apertura del ciclo de pseudoprolina,

e. Purificar las timosinas por RP-HPLC.

La presente invención se refiere a un procedimiento para Ia obtención de timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables en el que se obtienen α-timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables.

La presente invención se refiere a un procedimiento para Ia obtención de timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables en el que se obtienen β-timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables.

La presente invención se refiere a un procedimiento para Ia obtención de timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables en el que Ia síntesis se realiza sobre soportes poliméricos.

La presente invención se refiere a un procedimiento para Ia obtención de timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables donde en Ia etapa a) se utiliza una resina de tipo cloro- tritilo.

La presente invención se refiere a un procedimiento para ia obtención de timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables donde en Ia etapa a) se utiliza una resina de tipo pMBHA.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables donde en Ia etapa b) Ia incorporación de Ser o Thr se lleva a cabo de forma adicional como dipéptidos pseudoprolina y/o Ser o Thr modificadas en forma de pseudoprolina en Ia peptidil-resina.

La presente invención se refiere a un procedimiento para Ia obtención de timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables donde preferentemente Ia separación mínima entre dos dipéptidos pseudoprolina o una pseudoprolina y una prolina es de dos aminoácidos.

La presente invención se refiere a un procedimiento para Ia obtención de timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables donde preferentemente el dipéptido pseudoprolina se adiciona en una región de aminoácidos hidrofóbicos.

La presente invención se refiere a un procedimiento para Ia obtención de timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables en el que si tras Ia etapa d) aparece el aminoácido Met en Ia secuencia se realiza adicionalmente un tratamiento de destercbutilación del crudo con AcOH.

Según un segundo aspecto importante, Ia presente invención se refiere a un compuesto aislado y/o purificado obtenido por el procedimiento anterior que comprende una secuencia de aminoácidos Ia cual tiene al menos un 80% de identidad con las secuencias SEQ.ID.N.1 a SEQ.ID.N.11 sobre toda su longitud.

La presente invención se refiere a un compuesto aislado y/o purificado obtenido por el procedimiento anterior que consiste en una secuencia aminoacídica escogida del grupo formado por las secuencias SEQ.iD.N.1 a SEQ.ID.N.11, por sus secuencias

complementarias y/o por sus secuencias homologas y/o por sus secuencias equivalentes funcionales.

La presente invención se refiere a un compuesto aislado y/o purificado obtenido por el procedimiento anterior que incluye fragmentos de al menos una secuencia de aminoácidos escogida del grupo formado por las secuencias SEQ.ID.N.1 a SEQ.ID.N.11, por sus secuencias complementarias, por sus secuencias homologas y por sus secuencias equivalentes funcionales.

La presente invención se refiere a un compuesto aislado y/o purificado obtenido por el procedimiento anterior en el que alguno de los aminoácidos comprendidos en las secuencias SEQ.ID.N.1 a SEQ. ID. N.11 se selecciona del grupo formado por L-aminoácidos, D-aminoácidos, N-metil aminoácidos, aminoácidos no naturales, Met-tBu o Met-oxidada.

La presente invención se refiere a un compuesto aislado y/o purificado obtenido por el procedimiento anterior que incluye modificaciones en el aminoácido N-terminal seleccionadas de acilaciones y/o pegilaciones.

Según un tercer aspecto importante Ia presente invención se refiere al uso del compuesto obtenido por el procedimiento anteriormente mencionado en Ia preparación de un medicamento.

La presente invención se refiere al uso del compuesto obtenido por el procedimiento anteriormente mencionado en Ia preparación de un medicamento para Ia regulación de Ia respuesta inmune, biología vascular y patogénesis del cáncer.

Ejemplos de realización:

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar Ia naturaleza de Ia presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a Ia invención que se reivindica en Ia presente memoria.

Ejemplo 1: Síntesis de Ia α1-timosina

La incorporación del residuo C-terminal Fmoc-Asn-OH sobre Ia resina 2 clorotritilo se realiza con un defecto de aminoácido, con Ia finalidad de obtener una funcionalización de 0,85 mmol/g después de Ia incorporación del primer aminoácido. Sobre 2,5 g de resina (f = 1 ,6 mmol/g de resina, 4 mmol) se incorporan 0,8 g de aminoácido (2,13 mmol, 0,5 eq.). Se pesan en recipientes separados Ia resina y el aminoácido y se dejan secar a vacío un mínimo de 4 horas. Se disuelve el aminoácido en 25 mL de DCM seco (sobre tamiz de 4 á). Se añade DIEA (0,7 mL, 1,6 mmol, 1 eq.) y se agita durante 5 min. Se prepara un disolución 1 :1 (2,8 mi) de DIEA:DCM (1,4 mL, 3,2 mmol, 2 eq.) y se añade a Ia mezcla de reacción. Se deja bajo agitación durante 40 min más y seguidamente se añaden 4 mL de MeOH seco y se deja reaccionar 10 min, después de los cuales se filtra Ia resina en un reactor de síntesis equipado con una placa filtrante y una llave y se procede a los siguientes lavados:

Paso - -- Reactivo Repeticiones Tiempo

1 DCM 3 1 min

2 DMF 5 1 min

3 5% piperidina en DMF 1 10 min

4 20% piperidina en DMF 1 15 min

5 DMF 5 1 min

La incorporación de los siguientes aminoácidos se realiza en todos los casos con un exceso de 2,5 eq de aminoácido, HOBT y DIPCDl respecto a Ia funcionalización de Ia resina después de Ia incorporación del primer aminoácido (0,85 mmol/g). Se deja reaccionar durante 40-60 min y posteriormente se realiza Ia desprotección del grupo Fmoc con 20% de piperidina en DMF durante 5 min 2 veces y durante 10 min otras 2 veces.

El dipéptido Fmoc-Ile-Thr(ψ ^Me - ^Me pro)-OH (correspondiente a los aminoácidos 11-12 de Ia secuencia de Ia α1-timosina) fue incorporado utilizando 2,5 eq. de dipéptido, HOBT y DIPCDI, dejándolo reaccionar durante 1 h. La eficacia del acoplamiento se controla mediante el test de ninhidrina. Si es positivo, se reactiva utilizando 1/3 eq. HOBT y DIPCDI y si después de Ia reactivación aún es positivo, se reacopla utilizando Vz eq. de Fmoc-AA-OH, HOBT y DIPCDI respecto a los equivalentes utilizados en el primer acoplamiento. Si después de reactivar, reacoplar y reactivar de nuevo

el test de Ia ninhidrina sigue siendo positivo, se procede a Ia acetilación utilizando 2,5 eq. Ac ₂ O, y DIEA durante 15 min.

Las posiciones en que fue necesario reactivar y/o reacoplar se detallan a continuación: Ser (1), Ser(2), Thr(7), dipéptido pseudoprolina (11-12), Lys(14), Leu(16), Lys(17), GIu(18), Lys(19).

El rendimiento al final de Ia síntesis es cuantitativo en Ia obtención de Ac-Ser(tBu)- Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-G lu(OtBu)-lle-Thr(ψ ^Me - ^Me pro)- Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)- Lys(Boc)-QIu(OtBu)-Val- Val-Glu(OtBu)-G!u(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn-resina. 7 g de peptidil-resina se tratan durante 1h 30 min con 80 mL de Ia mezcla TFA: H ₂ O 95:5 bajo agitación. Una vez acabada Ia reacción, Ia resina se separa del producto por filtración y se lava con TFA. Se añade éter dietílico (560 mL) sobre la solución de TFA y el precipitado blanco se filtra en una placa P3 y se lava con MeOH y éter dietílico. Rendimiento de síntesis: 40%. ^• - - ^• . ^• . ^• . . . . . . .. : . .

Caracterización del producto:

ESI-MS: M teórica = 3108 g/mol, M experimental: (m/z): [M+2H]72=1555; [M+3H] ⁺ /3=1037,

[M+4H]74=778, [M+5H]7δ=623.

RP-HPLC analítico: Gradiente: 5-85% B en 20 min, tr =11.7 min; (socrático: 19% B en 30 min, tr =16,5 min (B= 0.07% TFA en acetonitrilo).

Ejemplo 2: Síntesis de Ia β4-ϋmosina

La β4-timosina se sintetizó siguiendo una estrategia de síntesis peptídica en fase sólida utilizando los protectores Fmoc/tBu. Para Ia incorporación del primer aminoácido sobre Ia resina 2-clorotritilo (1 g, 1 ,6 mmol/g) se utilizaron el aminoácido Nα-Fmoc-protegido (0,5 eq) y DIEA (3 eq.) en DCM, para conseguir una funcionalización de 0,85 mmol/g después de Ia incorporación del primer aminoácido. Se deja bajo agitación magnética durante 40 min y seguidamente se añaden 4 mL de MeOH seco y se deja reaccionar 10 min. Se filtra Ia resina en un reactor de síntesis equipado con una placa filtrante y una llave y se procede a los siguientes lavados con DCM y DMF. La resina se trata con 5% piperidina en DMF 1 x 10 min y 20% piperidina en DMF 1 x 15 min y se aclara con DMF. El resto de aminoácidos fueron incorporados utilizando Nα-Fmoc-protegidos (3 eq.), HOBT (3 eq.) y DIPCDI (3 eq.) en DMF,

equivalentes calculados respecto a Ia funcionalización de Ia resina una vez incorporado el primer aminoácido. Como grupos protectores para las cadenas laterales se eligieron los siguientes: para Arg, 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-suifonil (Pbf), el tert- butiioxicarbonilo (Boc) para las cadenas laterales de Lys, GIu y Asp y el tert-butilo para las cadenas laterales de Thr y Ser. La escisión del grupo protector temporal Fmoc se llevó a cabo por tratamiento con una solución de 20% piperidina en DMF (2 veces durante 5 min y 2 veces más durante 10 min). Los dipéptidos pseudoprolina se incorporaron en Ia síntesis como Fmoc-Lys(Boc)-Ser(ψMe,Me pro)-OH en lugar de los aminoácidos 14-15 y Fmoc- Glu(OtBu)-Thr(ψMe,Me pro)-OH en las posiciones de los aminoácidos 21-22 y 32-33. Dichas posiciones se eligieron entre las posibles por su disposición en Ia secuencia peptídica, proximidad óptima a Ia posición C-terminal, proximidad óptima a residuos Pro y distancia óptima entre pseudoprolinas.

La eficacia del acoplamiento se controla con el test de ninhidrina. Si es positivo, se reactiva utilizando V& eq. KQBT y DIPCDl y si después -de Ia reactivación aún es positivo^ se reacopla utilizando Vz eq. De Fmoc-AA-OH, HOBTy DIPCDI respecto al primer acoplamiento. Si después de reactivar, reacoplar y reactivar de nuevo, el test de ninhidrina sigue siendo positivo, se procede a Ia acetilación utilizando 2,5 eq. Ac ₂ O, y DIEA durante 15 min; - - -- - - -

Las posiciones en que fue necesario reactivar fueron lle(34) y Asn(26) y en este último también se reacopló.

El rendimiento al final de Ia síntesis de Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-Met- Ala-Glu(OtBu)-IIe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Asp(OtBu)-Lys(Boc)- Ser(ψ ^Me - ^Me pro)-Lys(Boc)- Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(ψ ^Me - ^Mθ pro)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn-Pro- Leu-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Thr(ψ ^Me - ^Me pro)-IIe-Glu(OtBu)-GIn-Glu(OtBu)-Lys(Boc)- Gln-Ala-Gly-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-resina es cuantitativo.

4,8 g de peptidil-resina se tratan con 24 mL de Ia mezcla TFA: H ₂ O 95:5 durante 2 h bajo agitación. Se filtra Ia suspensión y el filtrado se precipita con éter (168 mL). El crudo se filtra en una placa P3, se lava con MeOH y éter dietílico y se seca a vacío. El péptido se trató con una disolución de 4% AcOH en H ₂ O durante 1h 30 min a 37°C y posteriormente se purificó por RP-HPLC preparativo. El producto final se caracterizó por espectrometría de masas en un equipo ESl-MS y se analizó según especificaciones. Pureza: 99%, Rendimiento: 50%.

Caracterización del producto:

ESI-MS: M teórica = 4962 g/mol, M experimental: (m/z): [M+4H] ⁺ /4 = 1242; [M+ 5Hf /5 = 994; [M+ 6H] ⁺ /6 = 828; [M+ 7H] ⁺ /7 = 710. RP-HPLC analítico: Gradiente: 5-85% B en 20 min, tr =11 ,6 min; Isocrático: 20% B en 30 min, tr =19 min (B= 0.07% TFA en acetonitπlo).

Ejemplo 3: Síntesis de Ia β15-timosina

El procedimiento sintético fue similar al utilizado para Ia β4-timosina. El dipéptido Fmoc- Lys(Boc)-Ser(ψ ^{Me> Mθ} pro)-OH se utilizó en sustitución de los aminoácidos 14-15, Fmoc- Asn(Trt)-Thr(ψ ^Me ' ^Me pro)-OH en las posiciones de los aminoácidos 21-22 y Fmoc-Glu(OtBu)- Thr(ψ ^Me ' ^Me pro)-OH en las posiciones 32-33. Sólo fue necesario un reacoplamiento en Ia Lys(3). . . . . . _{. .} . . . . _{. .} .. . . . _. -. _{. .} . .

La peptidil-resina Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Glu(O tBu)-Val- Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Phe-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ser(ψ ^Me - ^Me pro)-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-

Lys(Boc)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(ψ ^Me - ^Me pro)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn-Thr(tBu)-Leu-

Pro-Sór(tBu)'Lys(Bóc)^GIu(OtBu)-Thr(ψ ^Me>Me pro)-íle-Gln-GIn-Glu(OtBυ)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-

Tyr(tBu)-Asn-Gln-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-resina se obtuvo con un rendimiento cuantitativo.

El péptido se escindió de Ia resina haciéndola reaccionar con una mezcla de TFA:H ₂ O 95:5 durante 1h 30 min, se precipitó con éter dietílico y se liofilizó. El crudo se purificó en un RP- HPLC semipreparativo y el producto final se caracterizó por espectrometría de masas en un equipo ESI-MS. Pureza:98%. Rendimiento:50%

Caracterización del producto: ESI-MS: M teórica = 5173 g/mol, M experimental: (m/z): [M+6H] ⁺ /6 = 863, [M+7Hf/7 = 740, [M+8H]78 = 648, [M+9H] ⁺ /9 = 576.

RP-HPLC analítico: Gradiente: 5-85% B en 20 min, tr =11 ,5 min; Isocrático: 20% B en 30 min, tr =11.5 min (B= 0.07% TFA en acetonitrilo).

Aunque Ia presente invención ha sido descrita en relación con estos casos particulares, muchas otras variaciones y modificaciones y otros usos están relacionados con aquellos

especificados en Ia técnica. La presente invención de este modo no está limitada por Ia revelación específica en ella misma, sino solamente por las reivindicaciones.