TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG

[001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung einer auf mindestens einem Antikörper-Medikament basierten Krebs-Therapie. Die Erfindung umfasst ferner ein System zur Ermittlung einer auf mindestens einem Antikörper-Medikament basierten Krebs- Therapie.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

[002] Laut WHO gilt Krebs als Todesursache Nummer 1 in den Industrieländern, bzw. steht in allen anderen Ländern an zweiter Stelle. Viele der modernen Anti-Krebs-Medikamente sind Biologika, d.h. sie bestehen hauptsächlich aus Antikörpern, die gezielt an die Krebszellen binden und somit die Krankheit beeinflussen. Bei einer großen Mehrheit der Patienten ist es aber so, dass die Krebszellen, entweder direkt von Anfang an (primär), oder im Verlauf der Therapie (erworben) eine Resistenz gegen diese Medikamente entwickeln, d.h. diese wirken dann nicht mehr. Nach dem Erkennen einer Resistenz beim Patienten werden andere Therapien/ Medikamente eingesetzt. Meist haben diese aber deutlich stärkere Nebenwirkungen. Die Krebserkrankung hatte zudem bis dahin Zeit sich weiter auszubreiten und die Patienten sind daher oft zu Beginn der nächsten Therapie in einem fortgeschrittenen Stadium.

[003] Ein bislang ungelöstes Problem in der Krebstherapie mit modernen Biologika (Antikörper-basierten Medikamenten) ist daher die Medikamenten-Resistenz, die bei den meisten der behandelten Krebspatienten, entweder direkt schon zu Beginn der Therapie besteht oder sich in ihrem Verlauf einstellt [1 , 2] Generell wird das Problem der Resistenz mit der Heterogenität der Tumorzellen erklärt, wobei die genauen Gründe bislang nur unzureichend verstanden werden [3, 4] Nach dem Erkennen einer Resistenz und dem Ausweichen auf andere Medikamente in den nachfolgenden Therapie-Runden, kann die zwischenzeitlich fortgeschrittene Krebserkrankung, oft nicht mehr effektiv genug bekämpft werden. Daher sind sowohl die sofortige Wirkung bei Beginn der ersten Antikörper- Medikament-/ Biologika-Therapie, wie auch die Aufrechterhaltung dieser Wirkung bis zum Ende anzustreben und von entscheidender Bedeutung für den weiteren Krankheitsverlauf.

[004] Es ist davon auszugehen, dass es für den individuellen Patienten nicht ausreicht, eine standardmäßig vorgegebene, minimale Blutspiegel-Konzentration des Biologika- Medikamentes zu erreichen, um die bestmögliche Wirkung zu erzielen, sondern, dass es einen für jeden Patienten eigens festzulegenden, optimalen Blutspiegel- Konzentrationsbereich gibt. Bei in Kultur gehaltenen Krebszellen sind glockenförmige Dosis- Wirkungskurven von Biologika bereits nachgewiesen worden [5] Bei Patienten sind solche Dosis- Wirkungskurven Verläufe auch für eine Reihe von Medikamenten bekannt [6] Eine Biologika-Therapie mit suboptimaler Dosis hat für die Patienten negative Konsequenzen. Diese beinhalten vor allem eine Erhöhung des Resistenz-Risikos und eine mangelhafte Effizienz in der Anti-Krebs- Wirkung. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung begegnen der Anforderung, diese negativen Konsequenzen zu minimieren bzw. zu beheben.

[005] Seit Jahrzehnten werden Patienten anhand einer visuellen Abschätzung der Rezeptordichte auf immun-histochemisch (d.h. mit Antikörper-Färbung) behandelten Biopsie- Proben, grob in 3 Kategorien eingeteilt, die von „sehr wenig“ bis „sehr viel“ Rezeptoren reichen. Hierbei stellen vor allem Biopsien der Patienten der mittleren Kategorie (2+) eine Herausforderung dar und werden nicht selten falsch klassifiziert [7] Noch wichtiger ist jedoch die Tatsache, dass es bislang nicht möglich ist, die absoluten Rezeptormengen des Tumors zu messen. Die vorliegende Erfindung berücksichtigt auch diese im Stand der Technik bestehenden Nachteile. Zur Behebung von diesen bestand bisher eine große Notwendigkeit, denn in der Literatur publizierte Schätzungen der Rezeptormenge pro Zelle für die höchste Kategorie (3+) beruhen nicht auf quantitativen Messungen, die zudem an Krebs-Zelllinien, die unter 2-D Kulturbedingungen gehalten wurden, durchgeführt wurden. Nachgewiesenermaßen führen aber diese Kultur-Bedingungen zu deutlich niedrigeren Rezeptordichten als in Zellen, die 3-dimensional wachsen [8]

[006] Bislang ist es ferner nicht möglich, das im Patienten tatsächlich herrschende Verhältnis von vorhandener Rezeptordichte und -menge zur Konzentration und Menge der vorhandenen Biologika festzustellen. Selbst bei Einhaltung der empfohlenen Standard- Blutspiegelwerte kann es daher dazu kommen, dass im individuellen Patienten, besonders bei solchen mit Tumoren mit sehr hoher Rezeptor-Dichte (also der Kategorie 3+), die totale Rezeptormenge die Menge der verfügbaren Antikörper um ein Vielfaches übersteigt und diese Patienten somit unterdosiert werden. Hinzu kommt, dass die Blutspiegelwerte von Biologika keineswegs identisch sind mit den Konzentrationen die in der Umgebung der Tumorzellen herrschen, dort sind nämlich deutlich niedrigere Werte anzunehmen als im Blut [9] Die vorliegende Erfindung berücksichtigt auch diesen im Stand der Technik bestehenden Nachteil.

[007] Ein Beispiel einer Krebsart bei dem Medikamenten-Resistenz in der Mehrheit der Patienten auftritt, ist der HER2 überexprimierende Brustkrebs, wobei anzumerken ist, dass eine HER2- Überexpression auch bei vielen anderen Krebserkrankungen gefunden wird. Bei diesem Typ Krebserkrankung wird das Antikörper-Medikament Trastuzumab eingesetzt, um das durch den HER2 Rezeptor verursachte Zellwachstum zu stoppen. Da eine genaue Justierung der Medikamentendosis an die Rezeptor-Dichte bislang nicht möglich ist, ist davon auszugehen, dass es bei bestimmten Patienten, bei denen der Antikörper zu niedrig oder zu hoch dosiert ist, zu einem Wirkungsverlust kommt, was bei Krebszellen in Kultur bereits gemessen werden konnte [5] Wenn das Zell-Wachstum nicht bei allen Krebszellen effektiv gehemmt wird und sich dadurch resistente Krebszell-Subpopulationen durchsetzen, sind die Folgen für den Patienten überaus schädlich. Bei Brustkrebspatienten mit HER2- Überexpression ist bekannt, dass nach einer kombinierten Trastuzumab- und Chemotherapie 25 % der Patienten innerhalb von 5 Jahren einem Rückfall erleiden [11] Die zur Zeit praktizierte zusätzliche Gabe von Pertuzumab verbessert die Langzeitprognosen der Patienten statistisch nur, wenn sie sich bereits im fortgeschrittenen Stadium befinden, d.h. beim Vorliegen von Metastasen [12, 13] Neuere Studien weisen zudem auf Patientengruppen hin, deren Langzeitprognosen mit einer Trastuzumab-Monotherapie wahrscheinlich besser wären [14, 15]

[008] Verlässliche Methoden zur Errechnung der Rezeptordichten auf Patientenzellen sind bislang nicht vorhanden, bzw. zu ungenau. Lichtmikroskopie-basierte Verfahren wie die des Förster Resonanz Energie Transfers (FRET) und des „Proximity ligation assay“ (PLA), sind hierfür ungeeignet, weil sie beide ab bestimmten Rezeptor-Dichten in einen Sättigungsbereich kommen [16, 17] Ab diesen Wertebereichen besteht keine lineare Korrelation mit den Kalibrierungswerten mehr. Zudem können auch inhomogene Rezeptorverteilungen auf den Zellen die Messwerte verfälschen. Generell sind quantitative Rezeptordichte-Messungen mit Fluoreszenz-markierten Antikörpern bei hohen Rezeptordichten unzuverlässig [18], da es hierbei zu einer gegenseitigen Abschwächung der Fluoreszenzsignale („seif quenching“) kommt [19] Grundsätzlich sind daher Messverfahren mit Fluoreszenz-markierten Antikörpern bei HER-Protein überexprimierenden Tumoren nicht für eine absolute Quantifizierung geeignet [20] Bestehende Messverfahren zur Quantifizierung von beispielsweise HER1-3 in Patientengewebeproben können daher nur semi-quantitative, d.h. relative Ergebnisse liefern [21, 22], jedoch können hiermit keine absoluten Angaben über die Dichte und die Menge der vorhandenen HER-Proteine gemacht werden.

[009] Trotz ihrer Bedeutung für die Prognose des Patienten werden auch die Bestimmung der Heterogenität in lokalen Rezeptordichten, d.h. unterschiedliche Dichtebereiche auf den einzelnen Tumorzellen, sowie zwischen verschiedenen Zellsubpopulationen im Tumor, bisher nur grob ansatzweise, und zudem nur auf zweidimensionalen Schnitten, also ohne quantitative Aussagekraft, durchgeführt.

[0010] Ein weiteres, sehr wichtiges Tumor-Kennzeichen, dem im Zusammenhang mit dem Problem der Heterogenität eine zentrale Rolle zukommt, sind die sogenannten Krebsstammzellen. Diese sind inzwischen zwar als eine der Hauptursachen der Resistenzentwicklung erkannt [23], werden aber bislang diagnostisch noch kaum (mit)bestimmt, geschweige denn ihre Rezeptordichte untersucht. Daher wird bislang diese wichtige Subpopulation der Krebszellen bei Diagnose und Therapieauswahl nicht berücksichtigt. Krebsstammzellen machen meist nur einen kleinen Teil der Gesamt- Krebszellpopulation aus, sie besitzen aber die besondere Fähigkeit zur Selbsterneuerung und zur Differenzierung. Zudem können sowohl ihr Anteil an der Gesamt- Krebszellpopulation, sowie ihre speziellen Stammzell-Eigenschaften durch den Kontakt mit den eingesetzten Therapeutika verändert werden [24], was wiederum den Erfolg der Therapie stark beeinflussen kann.

[0011] Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung die obig aufgeführten Nachteile und bestehenden Herausforderungen sowie Bedürfnisse aus dem Stand der Technik zu verbessern bzw. zu beheben. Es ist beispielsweise eine Aufgabe der Erfindung das Auftreten der Medikamenten-Resistenz zu verringern oder ganz aufzuheben. Dazu muss die Dosis des Medikaments genau auf den individuellen Patienten eingestellt werden. Die vorliegende Erfindung trägt zu einer stark erhöhten Passgenauigkeit der letztendlich auszuwählenden Krebs-Therapie für den individuellen Patienten bei, womit die Chancen für eine wirksame Krebsbekämpfung steigen. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

[0012] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung einer auf mindestens einem Antikörper-Medikament basierten Krebs-Therapie umfassend: a) Ermitteln mindestens eines Parameters ausgewählt aus der absoluten Anzahl mindestens eines Rezeptors pro Zelle, der mittleren Rezeptordichte mindestens eines Rezeptors pro Zelle, der kumulativen Häufigkeit von mittleren Rezeptordichten mindestens eines Rezeptors pro Zelle, der durchschnittlichen Rezeptordichte mindestens eines Rezeptors von Zellen eines Subjektes und kumulative oder statistische Verteilungen davon, b) Ermitteln des mindestens einen Antikörper-Medikaments und/ oder einer personalisierten Dosis des mindestens einen Antikörper-Medikaments für das Subjekt aufgrund des/ der in a) ermittelten Parameters/ Parameter.

[0013] Eine weitere Ausführungsform betrifft das Verfahren, wobei in a) die durchschnittliche Rezeptordichte eines Rezeptors in einer repräsentativen Anzahl von Krebszellen des Subjektes ermittelt wird.

[0014] Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren, wobei in a) die statistische Verteilung des mindestens einen Parameters als Standardabweichung oder Abweichung von einer Normalverteilung ermittelt wird.

[0015] Eine zusätzliche Ausführungsform betrifft ferner das Verfahren, wobei der in a) bestimmte mindestens eine Parameter auf zirkulierenden Krebszellen, die von Blut des Subjektes gewonnen wurden, ermittelt wird.

[0016] Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren, wobei der Schritt b) ferner das Gewicht des Subjektes und das vorhandene Tumorvolumen einbezieht.

[0017] Eine zusätzliche Ausführungsform betrifft das Verfahren, wobei in Schritt a) die mittlere Rezeptordichte pro Zelle und/ oder die betreffende statistische Verteilung des HER2 Rezeptors ermittelt werden.

[0018] Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren, wobei in Schritt b) das mindestens eine Antikörper-Medikament ausgewählt wird aus Trastuzumab, Trastuzumab- Emtansin, Pertuzumab und einer Kombination davon.

[0019] Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft das Verfahren, wobei in Schritt a) die mittlere Rezeptordichte pro Zelle und/ oder die statistische Verteilung des HER2 Rezeptors, des HER1 Rezeptors und/ oder des HER3 Rezeptors ermittelt werden.

[0020] Eine Ausführungsform betrifft das Verfahren, wobei in Schritt b) die personalisierte Dosis des mindestens einen Antikörper-Medikaments auf der Basis einer drei-dimensionalen Dosis- Wirkungs-Kurve berechnet wird, bevorzugt wobei die Dosis-Wrkungs-Kurve die Stärke der Wirkung des mindestens einen Antikörper-Medikaments in Abhängigkeit von der mittleren Rezeptordichte des mindestens einen Rezeptors pro Zelle, der betreffenden statistischen Verteilung und der Konzentration des mindestens einen Antikörper- Medikaments ermittelt.

[0021] Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft das Verfahren, wobei in b) zusätzlich eine Voraussage über das Auftreten oder Bestehen mindestens einer Medikamenten-Resistenz ermittelt wird.

[0022] Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft das Verfahren, ferner umfassend die Detektion von Krebsstammzellen in einer Probe, die von dem Subjekt entnommen wurde, mit fluoreszenz-markierten Antikörpern.

[0023] Die Erfindung umfasst ferner ein System zur Ermittlung einer auf mindestens einem Antikörper-Medikament basierten Krebs-Therapie umfassend: a) Vorrichtung zum Ermitteln mindestens eines Parameters ausgewählt aus der absoluten Anzahl mindestens eines Rezeptors pro Zelle, der mittleren Rezeptordichte mindestens eines Rezeptors pro Zelle, der kumulativen Häufigkeit von mittleren Rezeptordichten mindestens eines Rezeptors pro Zelle, der durchschnittlichen Rezeptordichte mindestens eines Rezeptors von Zellen eines Subjektes und kumulative oder statistische Verteilungen davon, b) Vorrichtung zum Ermitteln des mindestens einen Antikörper-Medikaments und/ oder einer personalisierten Dosis des mindestens einen Antikörper-Medikaments für das Subjekt aufgrund des/ der in a) ermittelten Parameters/ Parameter.

[0024] In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße System eine Vorrichtung nach a), welche eine Probenaufbereitungs- Vorrichtung und eine Vorrichtung zur Fluoreszenzmikroskopie umfasst.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

[0025] Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung der schrittweisen Probenvorbereitungsmethode. I. Ein Schnitt aus einem FFPE-Tumorblock wird entparaffinisiert und durch Kollagenase- und Dispase-Verdauung dissoziiert, anschließend wird eine hitzeinduzierte Epitopdemaskierung durchgeführt. II. Aus der entstehenden Zellsuspension werden alle nicht-Tumorzellen, z.B. durch ein magnetisches Separationsverfahren, entfernt, hierdurch bleiben hauptsächlich Tumorzellen in der Suspension übrig. III. Die Tumorzellen mit HER2-Membranproteinen werden mit Biotin konjugierten, spezifisch und monovalent an HER2-bindenden Proteinen inkubiert, z.B. mit Anti-HER2 Affibodies. IV. Die Tumorzellen werden danach auf einem Substrat, z.B. in einem Well einer Mikrotiterplatte, immobilisiert und mit Streptavidin-konjugierten fluoreszierenden Markern, z.B. Quantum Dots inkubiert. Optional (nicht dargestellt) kann anschließend eine Färbung zur parallelen Identifizierung von Krebsstammzellen durchgeführt werden (mit Fluoreszenz-Markern für CD44 ⁺ /CD24 ).

[0026] Figur 2 zeigt lichtmikroskopische Aufnahmen (links jeweils die Differential-Interferenz- Kontrast- und rechts die zugehörigen Fluoreszenzbilder) von Tumorproben, welche die in Figur 1 dargestellte Markierung des HER2 Rezeptors erhielten. Figur 2A und 2B zeigen Tumorzellen, die (in B) deutliche Fluoreszenzsignale von mit Quantum Dot markiertem HER2 emittieren. Figur 2C und 2D zeigen ein Beispiel eines negativen Kontrollexperiments welches die Spezifität der HER2-Markierung zeigt. Tumorzellen, wie in Figur 2A und 2B gezeigt, wurden mit demselben Markierungsverfahren behandelt, allerdings ohne den Affibody einzusetzen. Es zeigt sich keine nennenswerte, unspezifische Fluoreszenz in D. Figur 2E und 2F zeigen ein weiteres negatives Kontrollexperiment für die Spezifität des Markierungsverfahrens. Die hier gezeigten Tumorzellen wurden demselben Makierungs- verfahren unterzogen wie die Zellen in Figur 2A und 2B, stammten allerdings von einer Tumorprobe, die von Pathologen als HER2 negativ klassifiziert wurde. Auch hier zeigen sich (in 2F) nur sehr schwache Fluoreszenzsignale, die das niedrige, normale Niveau der HER2- Dichte im Brustgewebe widerspiegelt. Maßstabsbalken: 50 pm.

[0027] Figur 3 zeigt lichtmikroskopische Aufnahmen (Fluoreszenzbilder) von Brustkrebszellen in Kultur (SKBR3 Zelllinie) mit Doppelmarkierung von HER1, in Figur 3A, und HER2, in Figur 3B. HER1 und HER2 wurden mit dem in Figur 1 beschrieben Verfahren markiert, wobei jeder Rezeptor mit einem anderen, jeweils spezifischen Bindungsprotein, und einem anderen Typ von Quantum Dot Nanopartikel markiert wurde. Es ist zu erkennen, dass die Verhältnisse der beiden Rezeptoren zueinander auf den einzelnen Zellen unterschiedlich sind, da manche Zellen mehr Fluoreszenz von markiertem HER1 abstrahlen (siehe mit Pfeilen markierte Zellen), als von markiertem HER2. Dies weist auf unterschiedliche Rezeptordichteverhältnisse von HER1 und HER2 in den einzelnen Krebszellen hin. Figur 3C veranschaulicht diese unterschiedlichen Rezeptordichten durch eine Bildbearbeitung beider Aufnahmen. Hierbei wurde für jeden Bildpunkt (Pixel) die HER2- Intensität von der HER1 -Intensität subtrahiert, die hellen Zellen (mit Pfeilen markiert) weisen dementsprechend eine relativ höhere HER1-Dichte auf, als die meisten anderen der abgebildeten Zellen. Die Fluoreszenzaufnahmen in Figur 3D, 3E und 3F zeigen eine andere Gruppe von Brustkrebszellen derselben Zelllinie, die mit fluoreszierenden Antikörpern gegen die Brustkrebsstammzellmarker CD44 (in 3D) und CD24 (in 3E), inkubiert wurden. Als Brustkrebsstammzellen gelten Zellen die CD44 positiv und CD24 negativ sind. Zwei dieser Zellen sind mit Pfeilen markiert. Figur 3F zeigt dieselben Zellen nach der beschriebenen HER2-Markierung. Man sieht, dass eine dieser Zellen eine sehr hohe Dichte an HER2 aufweist. Maßstabsbalken: 50 pm.

[0028] Figur 4 zeigt die Darstellung einer hypothetischen 3 D-Dosis- Wirkungskurve zur Bestimmung der optimalen Dosis eines auszuwählenden Krebstherapeutikums (z.B. Biologika). Unter Zugrundelegung der Dichte der gemessenen Rezeptoren, der Heterogenität der Rezeptordichte innerhalb der Einzelzellen und der Krebszellpopulation, vorab bestimmten Wrksamkeitsprofilen der zur Auswahl anstehenden Therapeutika, und dem Patientengewicht kann die individuelle, personalisierte Dosis für ein Subjekt bestimmt werden.

[0029] Figur 5 zeigt die schematische Darstellung der Vorrichtung zur individuellen Bestimmung der personalisierten Dosis und Zusammenstellung einer auf Antikörper- Medikamenten basierten Krebs-Therapie. Die Biopsiegewebeprobe (oben links) wird in der Vorrichtung erst zu einer Einzelzell-Suspension verarbeitet, die Zellen in Wells einer vorpräparierten Mikrotiterplatte immobilisiert und die Rezeptoren mit spezifischen Markern markiert (wie in Figur 1 dargestellt). Ein angeschlossenes, vollautomatisches Lichtmikroskopie-System bildet die Krebszellen ab und bestimmt für alle abgebildeten Zellen die Werte für mittlere Fluoreszenzintensität und Größe bzw. Oberfläche, sowie die statistische Verteilung innerhalb der Einzelzellen, wie auch in der Gesamtzellpopulation. Mittels einer Eichkurve werden Fluoreszenzintensitäts- Werte in absolute Rezeptordichte- Werte umgerechnet und eine Häufigkeitsverteilung der Zellpopulation erstellt. Optional können nach der Rezeptormarkierung in den Wells noch zusätzliche Marker für Krebsstammzellen eingesetzt werden. Krebszell-Subpopulationen können anschließend separat analysiert und getrennt von der Gesamtpopulation dargestellt werden (im Schema Messdaten B benannt). Die Ergebnisse der Hauptanalyse (im Schema Messdaten A benannt) werden, zusammen mit Informationen zur Gesamt-Tumorzellanzahl (aus der Größe des Tumors und der Größenhäufigkeitsverteilung der Einzelzellen errechnet) und des Patientengewichtes, sowie der 3D-Dosis-Wirkungskurve verarbeitet. Die Information der Messdaten A, kann mit oder ohne Messdaten B-Information, in eine Empfehlung zur personalisierten Therapie und Dosis jedes einzelnen Patienten umgesetzt werden. Von dieser Empfehlung ist zu erwarten, dass sie das Risiko einer Resistenzentwicklung minimiert, bzw. eine bereits bestehende, primäre Resistenz mit hoher Wahrscheinlichkeit Vorhersagen kann, und zudem die Wirksamkeit einer Krebstherapie steigert.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

[0030] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung einer auf mindestens einem Antikörper-Medikament basierten Krebs-Therapie umfassend: a) Ermitteln mindestens eines Parameters ausgewählt aus der absoluten Anzahl mindestens eines Rezeptors pro Zelle, der mittleren Rezeptordichte mindestens eines Rezeptors pro Zelle, der kumulativen Häufigkeit von mittleren Rezeptordichten mindestens eines Rezeptors pro Zelle, der durchschnittlichen Rezeptordichte mindestens eines Rezeptors von Zellen eines Subjektes und kumulative oder statistische Verteilungen davon, b) Ermitteln des mindestens einen Antikörper-Medikaments und/ oder einer personalisierten Dosis des mindestens einen Antikörper-Medikaments für das Subjekt aufgrund des/ der in a) ermittelten Parameters/ Parameter.

[0031] Der Begriff „Ermittlung einer auf mindestens einem Antikörper-Medikament basierten Krebs-Therapie“ kann dabei die Ermittlung einer personalisierten Dosis oder eines personalisierten Dosisbereichs mindestens eines Antikörper-Medikamentes umfassen. Dies ist eine auf die jeweiligen Bedürfnisse des Subjektes zugeschnittene Dosis oder Dosisbereich für das jeweilige Subjekt. Der Begriff „Ermittlung einer auf mindestens einem Antikörper-Medikament basierten Krebs-Therapie“ kann dabei aber auch die Ermittlung des mindestens einen Antikörper-Medikamentes oder die Ermittlung einer Kombination an Antikörper-Medikamenten umfassen. Besonders bevorzugt ist dabei, dass der Begriff „Ermittlung einer auf mindestens einem Antikörper-Medikament basierten Krebs-Therapie“ sowohl die Ermittlung des mindestens einen Antikörper-Medikamentes oder die Ermittlung einer Kombination an Antikörper-Medikamenten und die Ermittlung einer personalisierten Dosis oder eines personalisierten Dosisbereichs des mindestens einen Antikörper- Medikamentes umfasst. Der Begriff „Antikörper-Medikament“, wie verwendet in der vorliegenden Anmeldung, umfasst jegliche Form von Medikamenten, die beispielsweise in der Krebs-Therapie eingesetzt werden können, wobei es sich um Antikörper für diesen Zweck, aber auch Biologika, handeln kann. Biologika bzw. Biopharmazeutika sind pharmazeutische Arzneimittel, die biotechnologisch hergestellt werden. Biotechnologische Verfahren zur Herstellung von Biologika bedienen sich in der Regel lebender Zellen, die meist genetisch verändert wurden, um daraus Biomoleküle zu gewinnen. Als Arzneimittel verabreicht, können diese Wirkstoffe entgleiste krankhafte Vorgänge des menschlichen Körpers korrigieren oder das Immunsystem gegen eine bestimmte Erkrankung aktivieren. [0032] Die absolute Anzahl mindestens eines Rezeptors pro Zelle bedeutet den absoluten Wert, wie oft ein bestimmter Rezeptor oder Rezeptortyp auf einer Zelle vorhanden ist. Dieser Wert kann durch quantitative Messungen, wie hierin beschrieben, ermittelt werden.

[0033] Der Begriff „Rezeptordichte“ nach der vorliegenden Anmeldung kann synonym zu dem Begriff „Rezeptoroberflächendichte“ verwendet werden. Die Rezeptordichte wird dabei nach der vorliegenden Anmeldung bevorzugt in der Einheit „Anzahl Rezeptoren/ pm ² “ angegeben.

[0034] Der Begriff „mittlere Rezeptordichte“, wie verwendet in der vorliegenden Anmeldung, kann synonym zu dem Begriff „absolute Rezeptordichte“ verwendet werden. Diese Rezeptordichte bedeutet den absoluten Wert (d. h. eine genaue, spezifische Zahl), welche spezifiziert/ angibt, wie viele Rezeptoren sich pro Flächeneinheit (z.B. pro Quadratmikrometer) im Mittel auf einer gemessenen Zelle befinden. Sie gibt also auch die “mittlere Rezeptordichte”, wie hierin verwendet, an. Die Einheit der Rezeptordichte ist „Anzahl Rezeptoren/ pm ² “. Dieser genannte Wert spezifiziert also beides zugleich, eine absolute Rezeptordichte und eine mittlere Rezeptordichte, wobei letztere so zu verstehen ist, das sie einen Mittelwert für jede einzelne Zelle angibt. Dieser Wert kann aus der Fluoreszenzmessung einer Zelle ermittelt werden und besteht dann aus der „Summe aller Fluoreszenzintensitätswerte einer Zelle“ geteilt durch die „Oberfläche der gemessenen Zelle [in pm ² ]“. Mittels einer Eichkurve kann dieser Wert dann in einen Dichtewert, nämlich in „Anzahl Rezeptoren/ pm ² “ umgerechnet werden. Eine einzelne Zelle weist in der Regel immer verschiedene Rezeptordichten lokal auf ihrer Oberfläche auf, d.h. die Rezeptoren sind meist inhomogen verteilt. Diese innerhalb der einzelnen Zelle bestehenden Inhomogenitäten der Rezeptordichte können ebenso für die Ermittlung des mindestens einen Antikörper- Medikaments und/ oder der personalisierten Dosis des mindestens einen Antikörper- Medikaments für das Subjekt berücksichtigt werden. Wenn ein statistisches Verteilungsprofil davon, bezogen auf eine Gesamtzellpopulation, eine Zellteilpopulation oder Zellsubpopulation erstellt wird, ist dies als kumulative Häufigkeit davon zu verstehen.

[0035] Der Begriff „durchschnittliche Rezeptordichte eines Rezeptors von Zellen“ bezeichnet den Durchschnittswert der absoluten/ mittleren Rezeptordichten bezogen auf einen ganz bestimmten Rezeptor oder Rezeptortyp für mehreren Zellen, also eine bestimmte, limitierte Menge an Zellen, eine Zellpopulation oder eine Zellsubpopulation. Bei diesen Zellen handelt es sich bevorzugt um Krebszellen, die dem Subjekt entnommen worden sind, also um eine bestimmte Krebszellpopulation. Besonders bevorzugt kann es sich dabei auch um eine Krebsstammzellpopulation handeln. Die Erfindung bezieht sich daher auch in besonderer Weise auf die Berücksichtigung der Inhomogenitäten der Rezeptordichte auf dem Niveau der Zellpopulation, also der (absoluten/ mittleren) Rezeptordichten verschiedener Zellen untereinander, angegeben in Form der durchschnittlichen Rezeptordichte. [0036] Der Begriff „personalisierte Dosis“, wie verwendet in der vorliegenden Erfindung, bedeutet, dass anhand des/ der in Schritt a) ermittelten Parameters/ Parameter, eine Dosis für das jeweilige Subjekt bestimmt wird, die Grundlage einer Krebstherapie bildet. Eine solche Dosis, welche auch ein Dosisbereich sein kann, berücksichtigt dabei die individuellen und besonderen Bedürfnisse des jeweiligen Subjektes. Die Dosis wird beispielsweise in mg Antikörper-Medikament/ kg Körpergewicht (des Subjektes) angegeben.

[0037] Bei dem Subjekt, wie hierin genannt, handelt es sich bevorzugt um ein Säugetier und besonders bevorzugt um einen Menschen.

[0038] Eine weitere Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Ermittlung einer auf mindestens einem Antikörper-Medikament basierten Krebs-Therapie umfassend: a) Ermitteln der absoluten Anzahl mindestens eines Rezeptors pro Zelle eines Subjektes, und b) Ermitteln des mindestens einen Antikörper-Medikaments und/ oder einer personalisierten Dosis des mindestens einen Antikörper-Medikaments für das Subjekt aufgrund des in a) ermittelten Parameters.

[0039] Eine weitere Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Ermittlung einer auf mindestens einem Antikörper-Medikament basierten Krebs-Therapie umfassend: a) Ermitteln der absoluten Rezeptordichte mindestens eines Rezeptors pro Zelle eines Subjektes, und b) Ermitteln des mindestens einen Antikörper-Medikaments und/ oder einer personalisierten Dosis des mindestens einen Antikörper-Medikaments für das Subjekt aufgrund des in a) ermittelten Parameters.

[0040] Eine weitere Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Ermittlung einer auf mindestens einem Antikörper-Medikament basierten Krebs-Therapie umfassend: a) Ermitteln der mittleren Rezeptordichte mindestens eines Rezeptors pro Zelle eines Subjektes, und b) Ermitteln des mindestens einen Antikörper-Medikaments und/ oder einer personalisierten Dosis des mindestens einen Antikörper-Medikaments für das Subjekt aufgrund des in a) ermittelten Parameters.

[0041] Eine weitere Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Ermittlung einer auf mindestens einem Antikörper-Medikament basierten Krebs-Therapie umfassend: a) Ermitteln der kumulativen Häufigkeit von mittleren Rezeptordichten mindestens eines Rezeptors pro Zelle eines Subjektes, und b) Ermitteln des mindestens einen Antikörper-Medikaments und/ oder einer personalisierten Dosis des mindestens einen Antikörper-Medikaments für das Subjekt aufgrund des in a) ermittelten Parameters.

[0042] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung einer auf mindestens einem Antikörper-Medikament basierten Krebs-Therapie umfassend: a) Ermitteln der durchschnittlichen Rezeptordichte eines Rezeptors von Zellen eines Subjektes, b) Ermitteln des mindestens einen Antikörper-Medikaments und/ oder einer personalisierten Dosis des mindestens einen Antikörper-Medikaments für das Subjekt aufgrund des in a) ermittelten Parameters.

[0043] Eine weitere Ausführungsform betrifft das Verfahren, wobei in a) die durchschnittliche Rezeptordichte eines Rezeptors in einer repräsentativen Anzahl von Krebszellen des Subjektes ermittelt wird. Eine repräsentative Anzahl an Krebszellen, d.h. die nötige Stichprobengröße, ist abhängig von der Gesamtmenge an verfügbaren, intakten Krebszellen, die beispielsweise aus mindestens 2 Biopsieproben des Subjektes gewonnen wurden. Der Zahlenwert der Stichprobengröße kann individuell berechnet werden, z. B. ergibt sich bei einer Gesamtmenge von ~ 2000 verfügbaren, intakten Krebszellen, einem Konfidenzniveau von 99 % und einer Fehlermarge von 5 % eine Stichprobengröße von mind. 500 zu messenden Subjektzellen.

[0044] Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren, wobei in a) die statistische Verteilung des mindestens einen Parameters als Standardabweichung oder Abweichung von einer Normalverteilung ermittelt wird. Die statistische Verteilung kann als Maß für die Zellheterogenität dienen. Die Erfindung umfasst daher in einer Ausführungsform das Verfahren, wobei in a) die Heterogenität der mittleren Rezeptordichte mindestens eines Rezeptors pro Zelle ermittelt wird. Die „Heterogenität“ bedeutet hier, man betrachtet die Verteilung der Rezeptordichten, also die unterschiedlichen Dichtebereiche auf einer Zelle oder einzelnen Zellen oder auch zwischen verschiedenen Zellpopulationen oder Zellsubpopulationen.

[0045] Eine zusätzliche Ausführungsform betrifft ferner das Verfahren, wobei in a) zusätzlich der Anteil an Krebsstammzellen in einer Probe, die von dem Subjekt entnommen wurde, ermittelt wird. [0046] Eine zusätzliche Ausführungsform betrifft ferner das Verfahren, wobei in a) zusätzlich die Größe der Zelle oder die Größe der Zellen in einer Probe, die von dem Subjekt entnommen wurde, ermittelt wird. Diese Daten können ebenso für den Schritt b) eingesetzt werden.

[0047] Eine zusätzliche Ausführungsform betrifft ferner das Verfahren, wobei der in a) ermittelte mindestens eine Parameter auf zirkulierenden Krebszellen, die aus dem Blut des Subjektes gewonnen wurden, ermittelt wird. Zirkulierende Krebszellen liegen in der Regel vor, wenn Krebszellen sich vom Primärtumorzellverband oder Metastasen gelöst haben und sich systemisch über das Blut- oder Lymphsystem im Körper eines Subjektes, bevorzugt eines Patienten, ausbreiten können. Ein alternativer Begriff in der Krebsforschung lautet zirkulierende Tumorzellen („circulating tumor cells“, CTCs).

[0048] Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren, wobei der Schritt b) ferner das Gewicht des Subjektes und das im Subjekt vorhandene Tumorvolumen einbezieht. Bei dem Gewicht des Subjektes handelt es sich in der Regel um das Körpergewicht angegeben in kg. Das vorhandene Tumorvolumen des Subjektes wird über etablierte Verfahren der Tumorvolumetrie bestimmt [25]

[0049] Eine zusätzliche Ausführungsform betrifft das Verfahren, wobei in Schritt a) die mittlere Rezeptordichte pro Zelle und/ oder die betreffende statistische Verteilung des HER2 Rezeptors ermittelt werden. Aus diesen beiden bestimmten Parametern und optional mit Hilfe weiterer Parameter, wie z.B. dem Gewicht des Subjektes und dem Tumorvolumen, wird die personalisierte Dosis berechnet. Der HER2-Rezeptor (auch genannt: “human epidermal growth factor receptor 2”, offizieller Name: ERBB2, “erb-b2 receptor tyrosine kinase 2”) gehört zur Familie der epidermalen Wachstumsfaktorrezeptoren (EGF-Rezeptor). Er stimuliert die Zellproliferation über den RAS-MAP-Kinase-Weg und hemmt den programmierten Zelltod (Apoptose) über den mTOR-Signalweg.

[0050] Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren, wobei in Schritt b) das mindestens eine Antikörper-Medikament ausgewählt wird aus Trastuzumab, Trastuzumab- Emtansin, Pertuzumab und einer Kombination davon. Trastuzumab ist ein humanisierter monoklonaler Antikörper, der als Arzneistoff bei bestimmten Formen des Brustkrebses und des Magenkrebses verwendet wird. Trastuzumab bindet an den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor HER2 auf der Zelloberfläche von Krebszellen, wodurch deren Wachstum gehemmt wird. Trastuzumab-Emtansin dient zur Behandlung des HER2-positiven, inoperablen lokal fortgeschrittenen oder metastasierten Brustkrebs nach einer vorangegangenen Therapie mit Trastuzumab und einem Taxan. Bei Pertuzumab (auch bekannt als 2C4 oder Omnitarg) handelt es sich ebenso um einen monoklonalen Antikörper, der in der Behandlung von HER2-positivem Brustkrebs zusammen mit Trastuzumab und Docetaxel eingesetzt wird. Bei der Auswahl des Antikörper-Medikamentes können auch folgende Kriterien einen Einfluss haben: Das gegen Heterodimere wirksamere Pertuzumab ist zu empfehlen, wenn die Rezeptordichte von HER1 der von HER2 gleicht, bzw. sollte das nur gegen HER2 wirksamere Trastuzumab empfohlen werden, wenn die Rezeptordichte von HER2 die von HER1 um ein Vielfaches übertrifft. Das Medikament Trastuzumab-Emtansin kann z.B. empfohlen werden, wenn die Krebsstammzellpopulation einen bestimmten Mindestanteil überschritten hat, wobei dieser Mindestanteil unter Berücksichtigung weiterer Parameter wie Tumorgröße, Lymphknotenbefall oder das Vorliegen von Metastasen, ermittelt werden kann.

[0051] Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft das Verfahren, wobei in Schritt a) die mittlere Rezeptordichte pro Zelle und/ oder die statistische Verteilung des HER2 Rezeptors, des HER1 Rezeptors und/ oder des HER3 Rezeptors ermittelt werden. Der HER1-Rezeptor, auch genannt EGF-Rezeptor, (Abkürzung für englisch “Epidermal Growth Factor Receptor”, EGFR) ist ein Protein in Zellmembranen von Wirbeltieren. Es ist der Rezeptor für den Epidermal-Growth-Factor (EGF) und ist ein Mitglied der ErbB-Familie, einer Unterfamilie von vier eng verwandten Rezeptor-Tyrosinkinasen: EGFR1/HER1 (ErbB-1), HER2/c-neu (ErbB-2), HER3 (ErbB-3) und HER4 (ErbB-4). Der HER3-Rezeptor (abgekürzt für “human epidermal growth factor receptor 3”) wird auch genannt “Receptor tyrosine- protein kinase erbB-3” und ist ein membrangebundenes Protein, welches vom ERBB3-Gen kodiert wird. Bezüglich des HER2-Rezeptors verweisen wir auf die obigen Ausführungen.

[0052] Bisher war die Abschätzung der Rezeptordichte auf den Krebszellen nur sehr grob möglich und es wurde die Dosis der Medikamente bislang nur mit Hilfe des Gewichts des Subjektes eingestellt. Auch die parallele Detektion und Dichtebestimmung anderer, mit HER2 interagierender, Rezeptoren wurden bislang kaum durchgeführt. Hierdurch konnte es zur mangelhaften Ausschaltung wichtiger Umgehungswege der Tumorzellen gegen das Medikament kommen, was letztendlich in der Resistenz der Tumorzellen endet. Die vorliegende Erfindung beinhaltet dagegen die genaue Quantifizierung der Rezeptordichte auf einer Anzahl repräsentativer Zellen eines Subjektes. Die Werte für die absoluten Rezeptordichten, d.h. wie viele Rezeptoren es pro Zellmembranoberfläche auf jeder untersuchten Zelle gibt, werden bevorzugt mittels Lichtmikroskopie bestimmt. Daraus können dann die, wie obig definiert, mittleren Rezeptordichten mindestens eines Rezeptors pro Zelle bestimmt werden. Aus der mittleren Rezeptordichte des mindestens einen Rezeptors pro Zelle beispielsweise für die untersuchten Zellen, und der zugehörigen Standardabweichung, die für jeden gemessenen Rezeptor bestimmt werden kann, wird in Kombination mit einer Abschätzung der Tumorzell-Größe und -Gesamtzahl, den relativen Dichte- Verhältnissen der gemessenen Rezeptoren, angegeben in Form der Heterogenität, die auch Angaben über Homo- und Heterodimerisierung erlauben, sowie dem Gewicht des Subjektes, die optimierte und personalisierte Dosis, welche auch ein Dosisbereich des mindestens einen Antikörper- Medikaments sein kann, und/ oder das aussichtsreichste Antikörper-Medikament oder eine Kombination von Antikörper-Medikamenten für das jeweilige Subjekt ermittelt.

[0053] Eine Ausführungsform bildet das Verfahren, wobei in Schritt b) die personalisierte Dosis des mindestens einen Antikörper-Medikaments auf der Basis einer drei-dimensionalen Dosis-Wirkungs-Kurve berechnet wird, bevorzugt wobei die Dosis-Wirkungs-Kurve die Stärke der Wirkung des mindestens einen Antikörper-Medikaments in Abhängigkeit von der mittleren Rezeptordichte des mindestens einen Rezeptors pro Zelle, der betreffenden statistischen Verteilung und der Konzentration des mindestens einen Antikörper- Medikaments ermittelt. Die Dosis-Wirkungs-Kurve wird z.B. zuerst in Zellkulturen, dann in Tumor-Organoiden und dann in Tiermodellen bestimmt. Für ein bestimmtes Subjekt wird bevorzugt die mittlere Rezeptordichte mindestens eines Rezeptors pro Zelle und ihre betreffende statistische Verteilung ermittelt. Dann kann anhand dieser Werte und weiterer optionaler Parameter, wie z.B. dem Gewicht des Subjektes, die personalisierte Dosis mittels der 3D-Dosis- Wirkungs-Kurve bestimmt werden, wie sie auch Figur 4 zu entnehmen ist.

[0054] Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft das Verfahren, wobei in b) zusätzlich eine Voraussage über das Auftreten oder Bestehen von mindestens einer Medikamenten-Resistenz ermittelt wird. Die Voraussage über das Risiko des Auftretens bzw. das Auftreten von einer oder mehrerer Medikamenten-Resistenz(en) kann beispielsweise über die jeweilige Rezeptordichte eines oder mehrerer Rezeptoren, deren statistische Verteilung und deren relative Dichte-Verhältnisse oder Heterogenität, innerhalb von einzelnen Zellen oder innerhalb einer Zellpopulation berechnet werden. Diese Werte können beispielsweise von den Krebszellen des Subjektes, die dem Subjekt entnommen worden sind, bestimmt werden. Andere Kombinationen und Medikamente sind dadurch allerdings ebenso möglich und keineswegs ausgeschlossen.

[0055] Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft das Verfahren, ferner umfassend die Detektion von Krebsstammzellen in einer Probe, die von dem Subjekt entnommen wurde, mit fluoreszenz-markierten Antikörpern. Dabei können mit Hilfe von spezifischen, fluoreszenz-markierten Antikörpern gegen Krebsstammzell-Marker (CD44+/ CD24-, CD133, oder ALDH1) [26, 27], Krebszellen in einer Probe, die von dem Subjekt entnommen wurden, auf eventuell anwesende Krebsstammzellen untersucht werden. Detektierte Krebsstammzellen können dann gesondert von den restlichen Tumorzellen auf ihre mittleren Rezeptordichten mindestens eines Rezeptors pro Zelle und deren statistischen Verteilungen untersucht werden. Diese Ausführungsform ist auch bevorzugt für zirkulierende Krebszellen. Aus den Parametern, die in dieser Ausführungsform ermittelt werden, können dann optional weitere Parameter, wie z.B. das Gewicht des Subjektes und das Tumorvolumen in die Ermittlung des mindestens einen Antikörper-Medikamentes und/ oder der personalisierten Dosis des mindestens einen Antikörper-Medikaments für das Subjekt einbezogen werden.

[0056] Die Erfindung umfasst ferner ein System zur Ermittlung einer auf mindestens einem Antikörper-Medikament basierten Krebs-Therapie umfassend: a) Vorrichtung zum Ermitteln mindestens eines Parameters ausgewählt aus der absoluten Anzahl mindestens eines Rezeptors pro Zelle, der mittleren Rezeptordichte mindestens eines Rezeptors pro Zelle, der kumulativen Häufigkeit von mittleren Rezeptordichten mindestens eines Rezeptors pro Zelle, der durchschnittlichen Rezeptordichte mindestens eines Rezeptors von Zellen eines Subjektes und kumulative oder statistische Verteilungen davon, b) Vorrichtung zum Ermitteln des mindestens einen Antikörper-Medikamentes und/ oder einer personalisierten Dosis des mindestens einen Antikörper-Medikaments für das Subjekt aufgrund des/ der in a) ermittelten Parameters/ Parameter.

[0057] Eine weitere Ausführungsform betrifft das System, wobei die Vorrichtung nach a) dazu dient, die durchschnittliche Rezeptordichte eines Rezeptors in einer repräsentativen Anzahl von Krebszellen des Subjektes zu ermitteln.

[0058] Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist das System, wobei die Vorrichtung nach a) dazu dient, die statistische Verteilung des mindestens einen Parameters als Standardabweichung oder Abweichung von einer Normalverteilung zu ermitteln.

[0059] Die Erfindung umfasst in einer weiteren Ausführungsform das System, wobei die Vorrichtung nach a) dazu dient, die Heterogenität der mittleren Rezeptordichte mindestens eines Rezeptors pro Zelle zu ermitteln.

[0060] Eine zusätzliche Ausführungsform betrifft ferner das System, wobei die Vorrichtung nach a) dazu dient, den mindestens einen Parameter auf zirkulierenden Krebszellen, die von Blut des Subjektes gewonnen wurden, zu ermitteln.

[0061] Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist das System, wobei die Vorrichtung nach b) dazu dient, ferner das Gewicht des Subjektes und das vorhandene Tumorvolumen einzubeziehen. [0062] Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ferner das System, wobei die Vorrichtung nach a) dazu dient, zusätzlich die Größe der Zelle oder die Größe der Zellen in einer Probe, die von dem Subjekt entnommen wurde, zu ermitteln.

[0063] Eine zusätzliche Ausführungsform betrifft das System, wobei die Vorrichtung nach a) dazu dient, die mittlere Rezeptordichte pro Zelle und/ oder die betreffende statistische Verteilung des HER2 Rezeptors zu ermitteln.

[0064] Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft das System, wobei die

Vorrichtung nach b) dazu dient, das mindestens eine Antikörper-Medikament aus Trastuzumab, Trastuzumab-Emtansin, Pertuzumab und einer Kombination davon auszuwählen.

[0065] Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft das System, wobei die

Vorrichtung nach a) dazu dient, die mittlere Rezeptordichte pro Zelle und/ oder die statistische Verteilung des HER2 Rezeptors, des HER1 Rezeptors und/ oder des HER3 Rezeptors zu ermitteln.

[0066] Eine Ausführungsform betrifft das System, wobei die Vorrichtung nach b) dazu dient, die personalisierte Dosis des mindestens einen Antikörper-Medikaments auf der Basis einer drei-dimensionalen Dosis- Wirkungs-Kurve zu berechnen, bevorzugt dazu dient, für die Dosis-Wrkungs-Kurve die Stärke der Wrkung des mindestens einen Antikörper- Medikaments in Abhängigkeit von der mittleren Rezeptordichte des mindestens einen Rezeptors pro Zelle, der betreffenden statistischen Verteilung und der Konzentration des mindestens einen Antikörper-Medikaments zu ermitteln.

[0067] Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft das System, wobei die

Vorrichtung nach b) dazu dient, zusätzlich eine Voraussage über das Auftreten oder Bestehen mindestens einer Medikamenten-Resistenz zu ermitteln.

[0068] Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft das System, wobei das System zusätzlich eine Vorrichtung zur Detektion von Krebsstammzellen in einer Probe, die von dem Subjekt entnommen wurde, mit fluoreszenz-markierten Antikörpern umfasst.

[0069] Das erfindungsgemäße System umfasst in einer Ausführungsform als Vorrichtung zum Ermitteln mindestens eines Parameters ausgewählt aus der absoluten Anzahl mindestens eines Rezeptors pro Zelle, der mittleren Rezeptordichte mindestens eines Rezeptors pro Zelle, der kumulativen Häufigkeit von mittleren Rezeptordichten mindestens eines Rezeptors pro Zelle, der durchschnittlichen Rezeptordichte mindestens eines Rezeptors von Zellen eines Subjektes und kumulative oder statistische Verteilungen davon, eine Probenaufbereitungs-Vorrichtung und eine Vorrichtung zur Fluoreszenzmikroskopie. Letzteres kann auch eine automatische Probenbeladung umfassen. Die Vorrichtung zur Fluoreszenzmikroskopie kann über automatische Abbildungs- und Bildverarbeitungsmodule verfügen. Beispielsweise werden zunächst, je nach Probenart, entweder frische oder fixierte Gewebe-Biopsien in Einzelzellen aufgebrochen, d.h. die Zellen werden vereinzelt, Tumorzellen selektiert, chemisch aufbereitet (bei fixierten Geweben), in Wells einer Mikrotiterplatte mit Glasboden für die Mikroskopie immobilisiert und vorhandene Rezeptoren in einem definierten (maximal 1:1) Verhältnis mit den fluoreszierenden Proben markiert. Ein weiterer Markierungsschritt mit Markern für Krebsstammzellen kann sich optional anschließen. Der gesamte Aufbereitungsprozess dauert wenige Stunden und kann für viele Proben gleichzeitig erfolgen. Pro Subjekt können hierbei 3 - 5 Proben parallel verarbeitet werden.

[0070] Die markierten und immobilisierten Zellen können dann automatisch in der Vorrichtung zur Fluoreszenzmikroskopie abgebildet werden. Es können beispielsweise zunächst mittels eines Rechners die absoluten oder mittleren Rezeptordichten mindestens eines Rezeptors pro Zelle für die einzelnen Zellen ermittelt werden und hiervon ein statistisches Verteilungsprofil für eine Gesamtzellpopulation (kumulative Häufigkeit) ermittelt werden. Dies gibt Aufschluss über die Heterogenität innerhalb der Probe. Auch die Heterogenität der Rezeptorverteilung (also wie ist die absolute Anzahl mindestens eines Rezeptors pro Zelle über eine Zelle verteilt) oder Rezeptordichteverteilung (also wie ist die mittlere Rezeptordichte mindestens eines Rezeptors pro Zelle über eine Zelle verteilt) innerhalb der einzelnen Zellen kann gemessen und bei der Ermittlung der Krebs-Therapie berücksichtigt werden. Bei einer Ausführungsform, in der in a) die Krebsstammzellen markiert werden, kann jede Zellsubpopulation separat analysiert werden und die Daten entsprechend gesondert widergegeben werden. Die Rezeptordichten der gemessenen Rezeptoren auf den Krebszellen des Subjektes können ferner der Errechnung der HER2- Homo- und -Hetero-Dimer-Dichten und der entsprechenden Gesamtmengen dienen, die mittels Standard-Daten aus der Pathologie, unter Einbeziehung einer 3D-Dosis- Wirkungskurve (siehe Figur 4), sowie des Körpergewichtes des Subjektes und des Tumorvolumens, in einen optimalen Dosis-Wert für das optimale Antikörper-Medikament, oder eine Kombination mehrerer Antikörper-Medikamente, umgerechnet werden. Bei dem Antikörper-Medikament im Sinne der vorliegenden Erfindung kann es sich auch um ein Biologika handeln.

[0071] Diese Beschreibung der Vorrichtungen, enthalten in dem erfindungsgemäßen System, ist ein Beispiel einer möglichen Ausführungsform. Jedoch können die Vorrichtungen des Systems auch anders gebaut werden, zum Beispiel können auch Gewebeschnitte markiert und analysiert werden. Hierfür können die Ergebnisse in einem zusätzlichen Schritt auf die extrapolierte 3-Dimensionalität im Gewebe umgerechnet werden. [0072] Das erfindungsgemäße System kann ferner beispielsweise auch die Ermittlung der auf mindestens einem Antikörper-Medikament basierten Krebs-Therapie auf folgende Weise ermöglichen: Krebszellen aus Biopsieproben werden zunächst zur Verfügung gestellt. Sind Krebszellen vorhanden, so können die Rezeptoren auf den Krebszellen mittels eines Pipettiergerätes spezifisch markiert und für die Lichtmikroskopie präpariert werden. Das System kann ferner eine Vorrichtung umfassen, die lichtmikroskopische Bilder davon aufnimmt. Bei einer solchen Vorrichtung kann es sich beispielsweise um ein Lichtmikroskopie-Gerät handeln. Diese Vorrichtung kann dann mit entsprechender Software, anhand von zuvor erstellten Eichkurven, beispielsweise die mittleren Rezeptordichten mindestens eines Rezeptors pro Zelle und deren statistische Verteilung innerhalb der analysierten Zellen, Zellpopulation oder Zellsubpopulation, bevorzugt Krebszellen oder eine Krebszellpopulation, von dem Subjekt bestimmen. Die Vorrichtung berechnet dann mittels einer vorher für das jeweilige Medikament bestimmten drei-dimensionalen Dosis- Wirkungs- Kurve die personalisierte Dosis des mindestens einen Antikörper-Medikaments.

[0073] Alle Ausführungsformen für das Verfahren sind in gleicher Weise für das System hierin offenbart. Alle obig aufgeführten Definitionen für das erfindungsgemäße Verfahren gelten in gleicher weise für das hierin beschriebene erfindungsgemäße System.

[0074] Zusammenfassend stellt die vorliegende Erfindung ein System und ein Verfahren bereit, das die optimierte und personalisierte Dosis, sowie die Art eines einzusetzenden Antikörper- oder Biologika-Medikamentes, oder eine Kombination mehrerer Antikörper- Medikamente oder Biologika-Medikamente oder anderer Medikamente, bestimmt, mit dem Ziel eine Resistenzentwicklung zu verhindern, bzw. bei einer zu erwartenden primären Resistenz direkt eine Therapie-Empfehlung für ein alternatives Medikament bereit zu stellen. Hierbei kann auch das Verhältnis der absoluten Anzahl pro Zelle, der mittleren Rezeptordichte pro Zelle, der kumulativen Häufigkeit der mittleren Rezeptordichten pro Zelle, der durchschnittlichen Rezeptordichte von Zellen eines Subjektes oder kumulative oder statistische Verteilungen davon von HER2 mit dem entsprechenden Wert von einem anderen interagierenden und somit aktivierenden Rezeptor, zum Beispiel HER1 oder HER3, bestimmt und entsprechend bei der Ermittlung der auf mindestens einem Antikörper-Medikament basierten Krebs-Therapie berücksichtigt werden. Als weitere Parameter können der Anteil an Krebsstammzellen, sowie deren Rezeptordichten bestimmt werden. Diese Erfindung ist jedoch nicht begrenzt auf Rezeptoren der HER Familie, welche hier als Beispiel angeführt werden, sondern kann auch bei anderen Rezeptoren eingesetzt werden. [0075] Mittels des erfindungsgemäßen Systems und Verfahrens können ferner die Rezeptordichten und die Heterogenität in den jeweiligen Krebszellpopulationen eines Subjektes bestimmt werden. Optional kann auch die absolute Gesamtmenge an anzugreifenden Rezeptoren, unter Berücksichtigung der geschätzten Tumorgesamtzellzahl, ermittelt werden. Auf der Basis dieser Werte wird dann, optional unter Einbeziehung von zusätzlichen Messungen an Krebsstammzellen, sowie des Körpergewichtes des Subjektes, die optimierte und personalisierte Dosis des mindestens einen Antikörper-Medikaments für das Subjekt bestimmt. Ferner stellen sich durch die vorliegende Erfindung geringere Nebenwirkungen, durch Vermeidung unnötig überhöhter Medikamenten-Konzentrationen, ein.

BEISPIELE DER ERFINDUNG

[0076] Material und Methoden:

Histochoice Clearing Reagenz, Epitopdemaskierungsreagenz (pH 6), Kollagenase, Dispase, biotin-konjugierter anti-HER2 Affibody, Ziegenserum, streptavidin-konjugierte Quantum Dots (Qdot® 655 oder 565 nm), ultra-reines, deionisiertes Wasser, Aceton und Ethanol, Phosphor-gepufferte Kochsalzlösung (“PBS”), Formaldehyd, Kochsalz, Glyzin, biotinfreies Rinderserumalbumin Fraction V, Histochoice Reinigungsagenz, Kollagenase IA, Tween, poly-L-Lysin (mol wt 70,000-150,000), MAPTrix™ Reagenz (high MW) Natriumbicarbonat, Natriumhydroxid, Natriumtetraborat und Borsäure.

[0077] Beispiel: Das erfindungsgemäße Verfahren und System zur Ermittlung einer auf mindestens einem Antikörper-Medikament basierten Krebs-Therapie kann wie folgt durchgeführt werden:

[0078] Standardbiopsiegewebeproben werden zuerst zu einer Einzelzell-Suspension verarbeitet. Hierfür werden die formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitte einer integrierten Entparaffinierung und Rehydrierung, einer enzymatischen Verdauung, gefolgt von hitzeinduzierter Epitopdemaskierung mit einem Demaskierungsreagenz unterzogen. [0079] Die so vereinzelten Krebszellen werden auf dem Glasboden von Wells einer vorpräparierten Mikrotiterplatte immobilisiert und die Rezeptoren mit spezifischen Markern und den fluoreszierenden Nanopartikeln (Qdots) markiert.

[0080] Ein angeschlossenes, vollautomatisches Lichtmikroskopie-System bildet die Zellen ab, erkennt die einzelnen räumlichen Areale die durch Zellen eingenommen werden, und bestimmt für diese Areale jeweils die Werte für mittlere Fluoreszenzintensität, Standardabweichung und Oberflächengröße, sowie die statistische Verteilung innerhalb der Gesamtzellpopulation.

[0081] Mittels einer Eichkurve werden Fluoreszenzintensitäts-Werte in mittlere Rezeptordichte-Werte und, mittels der Oberflächengröße, in absolute Mengen an Rezeptoren pro Zelle umgerechnet und eine Häufigkeitsverteilung dafür in der Zellpopulation erstellt. Optional können nach der Rezeptormarkierung in den Wells noch zusätzliche Marker für Krebsstammzellen eingesetzt werden. Krebszell-Subpopulationen können anschließend separat analysiert und getrennt von der Gesamtpopulation dargestellt werden (im Folgenden Messdaten B benannt).

[0082] Die Ergebnisse der Hauptanalyse (im Folgenden Messdaten A benannt) werden, zusammen mit Informationen zur Gesamt-Tumorzellanzahl (aus der Größe des Tumors und der Größenhäufigkeitsverteilung der Einzelzellen errechnet) und des Patientengewichtes, sowie der 3D- Dosis-Wirkungskurve verarbeitet. [0083] Die Information der Messdaten A, kann mit oder ohne Messdaten B-Information, in eine Empfehlung zur personalisierten Therapie jedes einzelnen Patienten umgesetzt werden. Von dieser Empfehlung ist zu erwarten, dass sie das Risiko einer Resistenzentwicklung minimiert, bzw. eine bereits bestehende, primäre Resistenz mit hoher Wahrscheinlichkeit Vorhersagen kann, und zudem die Wirksamkeit der Krebstherapie steigert.

[0084] Die vorliegende Erfindung ermöglicht ferner auch die Verwendung anderer Rezeptorbindungsproteine, z.B. Fab’s (Antikörperfragmente), oder Darpins (Designed Ankyrin Repeat Proteins, künstliche Proteine, die zur Erkennung und Bindung von Antigenen befähigt sind, und strukturell von Ankyrin-Proteinen abgeleitet sind), oder Nanobodies (Einzeldomänenantikörper). Anstatt QDs ist auch die Verwendung anderer fluoreszierender Farbstoffe oder -Nanopartikel möglich.

REFERENZEN

1. Lavaud P, Andre F: Strategies to overcome trastuzumab resistance in HER2-overexpressing breast cancers: focus on new data from clinical trials. BMC Medicine 2014, 12(1):132.

2. Lubner SJ, Uboha NV, Deming DA: Primary and acquired resistance to biologic therapies in gastrointestinal cancers. Journal of Gastrointestinal Oncology 2017, 8(3):499-512.

3. Janiszewska M, Liu L, Almendro V, Kuang Y, Paweletz C, Sakr RA, Weigelt B, Hanker AB, Chandarlapaty S, King TA et ah In situ single-cell analysis identifies heterogeneity for PIK3CA mutation and HER2 amplification in HER2-positive breast cancer. Nature Genet 2015, 47(10):1212-+.

4. Wu DJ, Wang DC, Cheng YF, Qian MJ, Zhang MM, Shen Q, Wang XD: Roles of tumor heterogeneity in the development of drug resistance: A call for precision therapy. Semin Cancer Biol 2017, 42:13-19.

5. Riedl T, Boxtel Ev, Bosch M, Parren PWFII, Gerritsen AF: High-Throughput Screening for Internalizing Antibodies by Homogeneous Fluorescence Imaging of a pH-Activated Probe. Journal of Biomolecular Screening 2016, 21(l):12-23.

6. Reynolds AR: Potential relevance of bell-shaped and u-shaped dose-responses for the therapeutic targeting of angiogenesis in cancer. Dose Response 2010, 8(3):253-284.

7. Qaiser T, Mukherjee A, Reddy PBC, Munugoti SD, Tallam V, Pitkaaho T, Lehtimaki T, Naughton T, Berseth M, Pedraza A et ah. HER2 challenge contest: a detailed assessment of automated HER2 scoring algorithms in whole slide images of breast cancer tissues. Histopathology 2018, 72(2):227-238.

8. Breslin S, O'Driscoll L: The relevance of using 3D cell cultures, in addition to 2D monolayer cultures, when evaluating breast cancer drug sensitivity and resistance. Oncotarget 2016, 7(29):45745- 45756.

9. Thurber GM, Schmidt MM, Wittrup KD: Antibody tumor penetration: transport opposed by systemic and antigen-mediated clearance. Adv Drug Deliv Rev 2008, 60(12):1421-1434.

10. Romond EH, Perez EA, Bryant J, Suman VJ, Geyer CE, Davidson NE, Tan-Chiu E, Martino S, Paik S, Kaufman PA et ah Trastuzumab plus Adjuvant Chemotherapy for Operable HER2-Positive Breast Cancer. New England Journal of Medicine 2005, 353(16):1673-1684.

11. Cameron D, Piccart-Gebhart MJ, Gelber RD, Procter M, Goldhirsch A, de Azambuja E, Castro G, Untch M, Smith I, Gianni L et ah. 11 years' follow-up of trastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2-positive early breast cancer: final analysis of the HERceptin Adjuvant (HERA) trial. The Lancet 2017, 389(10075): 1195-1205.

12. (IQWiG) IfQuWiG: [A18-41] Pertuzumab (breast cancer) - Benefit assessment according to §35a Social Code Book V. In. https://www.iqwig.de/en/projects-results/projects/drug-asses sment/al8-41- pertuzumab-breast-cancer-benefit-assessment-according-to-35a -social-code-book-v.l0102.html:

Institut für Qualität und Wirtschaftlichkeit im Gesundheitswesen (IQWiG) 2018.

13. Von Minckwitz G, Procter M, De Azambuja E, Zardavas D, Benyunes M, Viale G, Suter T,

Arahmani A, Rouchet N, Clark E: Adjuvant pertuzumab and trastuzumab in early HER2-positive breast cancer. New England Journal of Medicine 2017, 377(2):122-131.

14. Schmid S, Klingbiel D, Aebi S, Goldhirsch A, Mamot C, Munzone E, Nole F, Oehlschlegel C, Pagani O, Pestalozzi B et ah Long-term responders to trastuzumab monotherapy in first-line HER-2+ advanced breast cancer: characteristics and survival data. BMC Cancer 2019, 19(l):902-902.

15. Dali P, Koch T, Göhler T, Selbach J, Ammon A, Eggert J, Gazawi N, Rezek D, Wischnik A, Hielscher C et ah. Trastuzumab without chemotherapy in the adjuvant treatment of breast cancer: subgroup results from a large observational study. BMC Cancer 2018, 18(1):51.

16. Mocanu M-M, Väradi T, Szöllösi J, Nagy P: Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA). PROTEOMICS 2011, ll(10):2063-2070.

17. Szendi-Szatmäri T, Szabo A, Szollosi J, Nagy P: Reducing the Detrimental Effects of Saturation Phenomena in FRET Microscopy. Analytical Chemistry 2019, 91.

18. Bondza S, Björkelund H, Nestor M, Andersson K, Buijs J: Novel Real-Time Proximity Assay for Characterizing Multiple Receptor Interactions on Living Cells. Analytical Chemistry 2017, 89(24):13212- 13218.

19. Swiecicki J-M, Thiebaut F, Di Pisa M, Gourdin -Bertin S, Tailhades J, Mansuy C, Burlina F, Chwetzoff S, Trugnan G, Chassaing G et ah. How to unveil self-quenched fluorophores and subsequently map the subcellular distribution of exogenous peptides. Scientific Reports 2016, 6:20237.

20. Sapino A, Goia M, Recupero D, Marchio C: Current Challenges for HER2 Testing in Diagnostic Pathology: State of the Art and Controversial Issues. Frontiers in Oncology 2013, 3(129).

21. McCabe A, Dolled-Filhart M, Camp RL, Rimm DL: Automated Quantitative Analysis (AQUA) of In Situ Protein Expression, Antibody Concentration, and Prognosis. JNCI: Journal of the National Cancer Institute 2005, 97(24):1808-1815.

22. Kashyap A, Khartchenko AF, Pati P, Gabrani M, Schraml P, Kaigala GV: Quantitative microimmunohistochemistry for the grading of immunostains on tumour tissues. Nature biomedical engineering 2019, 3(6):478-490.

23. Korkaya Fl, Paulson A, lovino F, Wicha MS: FIER2 regulates the mammary stem/progenitor cell Population driving tumorigenesis and invasion. Oncogene 2008, 27(47):6120-6130.

24. Rodriguez CE, Berardi DE, Abrigo M, Todaro LB, Joffe E, Fiszman GL: Breast cancer stem cells are involved in Trastuzumab resistance through the FIER2 modulation in 3D culture. J Cell Biochem 2018, 119(2):1381-1391. 25. Dicken V: Tumor-Volumetrie. In: RöFo-Fortschritte auf dem Gebiet der Röntgenstrahlen und der bildgebenden Verfahren: 2006. RK_208_202.

26. Brugnoli F, Grassilli S, Al-Qassab Y, Capitani S, Bertagnolo V: CD133 in Breast Cancer Cells: More than a Stern Cell Marker. Journal ofoncology 2019, 2019.

27. Ricardo S, Vieira AF, Gerhard R, Leitäo D, Pinto R, Cameselle-Teijeiro JF, Milanezi F, Schmitt F, Paredes J: Breast cancer stem cell markers CD44, CD24 and ALDH1: expression distribution within intrinsic molecular subtype. Journal of clinical pathology 2011, 64(ll):937-946.