Titre de l'invention : Puce microfluidique pour attirer et piéger un élément biologique spécifique

Domaine Technique

La présente demande concerne le domaine des dispositifs microfluidiques aptes à attirer et à piéger un élément biologique spécifique. Plus précisément, la présente demande concerne une puce microfluidique apte à attirer et à piéger in vivo un élément biologique spécifique, tel qu'une cellule procaryote ou eucaryote.

Technique antérieure

Chaque année en France environ 400 000 nouveaux cas de cancers sont identifiés avec environ 150 000 décès.

Il existe différents types de cancers en fonction du tissu dans lequel ils se développent. On peut ainsi distinguer les tumeurs solides qui se caractérisent par un amas localisé de cellules cancéreuses et les tumeurs des cellules sanguines, qui sont diffuses et dont les cellules cancéreuses circulent dans la moelle osseuse ou le sang. Les tumeurs des cellules sanguines aussi appelées cancers hématopoïétiques sont des cancers affectant le sang ou les organes lymphoïdes, tels que les leucémies et les lymphomes.

Pour ce qui est des tumeurs solides on distingue les carcinomes et les adénocarcinomes, cancers issus d'un tissu épithélial. On distingue également les sarcomes qui correspondent à des cellules cancéreuses apparaissant dans un tissu dit de support on parle alors d'ostéosarcome pour les os, de liposarcome pour la graisse ou encore de myosarcome pour les muscles.

Chez les hommes comme chez les femmes, les cancers solides représentent 90 % des cancers, avec les cancers de la prostate, du poumon et du colon-rectum représentant les trois cancers les plus fréquents chez les hommes et les cancers du sein, du colon-rectum et du poumon représentant les trois cancers les plus fréquents chez les femmes. Bien que la mortalité par cancer ait diminué de 1,5 % par an chez les hommes et de 1 % par an chez les femmes entre 1980 et 2012 (taux standardisés), il reste nécessaire de disposer de solutions efficaces pour traiter et prévenir ces tumeurs solides ainsi que leurs complications.

A ce jour, la chirurgie est l'un des traitements principaux d'une tumeur solide et correspond à la résection de la totalité de la tumeur lorsque cela est possible et éventuellement des tissus situés autour de la tumeur dite marge de résection. La chirurgie peut être utilisée en traitement unique lorsque la tumeur est très localisée, notamment lorsque la tumeur est à un stade précoce mais elle est souvent associée à d'autres traitements tels que la radiothérapie qui est aussi un traitement local et / ou à des traitements médicaux comme la chimiothérapie qui est un traitement systémique agissant potentiellement sur toutes les cellules cancéreuses du corps.

L'avantage de la chirurgie locale pour le traitement d'une tumeur solide est la possibilité de retirer la totalité de la tumeur lorsque cela est possible et de préserver les organes et les structures anatomiques non atteints par les cellules cancéreuses. Elle permet également de limiter les effets secondaires attribués au traitement par radiothérapie tels que les brûlures, ou la génération de cancers radio-induits, et à la chimiothérapie tels que les réactions cutanées, les nausées, vomissements, diarrhées, douleurs musculaires, fatigue, chute des cheveux ainsi que les cancers chimio-induits.

Afin de diminuer le taux de rechute la zone de résection inclut une zone de tissus sains présents autour de la tumeur, qui correspond à la marge de résection. A ce stade, plusieurs cas de figures doivent être considérés. Dans un premier cas de figure, les cellules tumorales de la tumeur primaire sont inclues dans la zone de résection et il n'y aura pas de récidive. Dans un second cas de figure, certaines cellules tumorales sont localisées au-delà de la zone de résection soit au niveau local soit à distance et alors une récidive est envisageable soit localement ou à distance pour former des métastases, c'est-à-dire des colonies secondaires de cellules cancéreuses qui se propagent à distance de l'organe atteint par la tumeur initiale et qui sont à l'origine d'un cancer dit « métastatique» dans un organe autre que celui dans lequel se trouvait la tumeur solide.

Il est donc nécessaire de prévenir au mieux les risques de récidive locale et de cancer métastatique après la résection d'une tumeur solide.

La chimiothérapie peut être utilisée après la chirurgie locale visant la résection de la tumeur, on parle de « chimiothérapie adjuvante » afin de prévenir la récidive et / ou la formation d'un cancer métastatique. Cependant, tel qu'indiqué précédemment, de très nombreux effets secondaires sont engendrés par ce traitement médicamenteux. Parmi les effets secondaires les plus considérables liés à l'utilisation de la chimiothérapie on peut en particulier faire référence aux cancers chimio-induits qui par définition correspondent aux nouvelles tumeurs survenant chez des patients traités par des drogues cytotoxiques pour une première tumeur maligne et causées par celles-ci, on peut également faire référence au risque de générer une résistance des cellules cancéreuses au traitement chimiothérapeutique limitant ainsi fortement les possibilités d'éliminer lesdites cellules.

Il existe un besoin de disposer d'une solution permettant d'éliminer efficacement les cellules cancéreuses restantes après la résection d'une tumeur solide afin de prévenir et / ou diminuer les risques de récidive locale et / ou de développement de cancer métastatique, qui soit efficace et ne présente pas d'effets secondaires médicamenteux à court et moyen terme.

Des dispositifs microfluidiques ont été décrits dans l'art antérieur pour leur utilisation dans le domaine du traitement du cancer. On peut notamment faire référence au document WO2018/089989 Al qui décrit un dispositif ex vivo pour le traitement du cancer en soumettant un fluide biologique tel que le sang à rayonnement électromagnétique spécifique du type de cellule cancéreuse ciblée et apte à la détruire.

On peut également faire référence au document US2018111124 Al qui décrit un dispositif microfluidique comprenant un ou plusieurs canaux microfluidiques et un ou plusieurs réseaux d'électrodes bipolaires sans fil permettant une capture à haut débit des cellules tumorales circulantes dans une solution ionique conductrice, en appliquant un champ électrique alternatif de 40 kHz à un échantillon biologique. Les cellules ainsi capturées peuvent être utilisées pour diagnostiquer un cancer ou évaluer l'effet d'un traitement anticancéreux. Aucun document de l'art antérieur ne décrit ou ne suggère une puce microfluidique pour attirer et détruire, de préférence in vivo, un élément biologique et en particulier une cellule cancéreuse après la résection d'une tumeur solide et ainsi prévenir et / ou diminuer les risques de récidive locale et / ou de développement de cancer métastatique, dont la fabrication est simple et peu coûteuse, qui est efficace et qui est facile à mettre en oeuvre in vivo pour une application clinique.

Pour répondre à ce besoin, la présente invention propose une puce microfluidique apte à attirer, piéger et in fine détruire un élément biologique spécifique comprenant un réservoir constitué d'une matrice comprenant un composé chimioattractant capable d'attirer l'élément biologique, au moins un réseau de microcanaux disposé entre le réservoir et le milieu extérieur de la puce et permettant de laisser passer le composé chimioattractant vers ledit milieu et de laisser passer l'élément biologique présent dans ledit milieu en direction du réservoir, caractérisée en ce que chaque microcanal se présente sous une forme de harpon comprenant au moins deux flèches espacées longitudinalement l'une de l'autre et dirigées vers le réservoir, dans laquelle chaque flèche comprend deux branches ayant chacune une extrémité libre formant un angle aigu compris entre 10° et 80°, et dans laquelle chaque flèche comprend deux ouvertures communiquant avec une partie longitudinale du microcanal et présentant une largeur comprise entre 5 pm et 30 pm.

Exposé de l'invention

La présente invention concerne une puce microfluidique apte à attirer et piéger un élément biologique spécifique, ladite puce comprenant :

- un réservoir (1) constitué d'une matrice comprenant un composé chimioattractant capable d'attirer l'élément biologique

- au moins un réseau de microcanaux (2) disposé entre le réservoir (1) et le milieu extérieur (3) de la puce et permettant de laisser passer le composé chimioattractant vers ledit milieu et de laisser passer l'élément biologique présent dans ledit milieu en direction du réservoir (1), caractérisée en ce que chaque microcanal se présente sous une forme de harpon comprenant au moins deux flèches espacées longitudinalement l'une de l'autre et dirigées vers le réservoir, dans laquelle chaque flèche comprend deux branches ayant chacune une extrémité libre formant un angle aigu compris entre 10° et 80°, et dans laquelle chaque flèche comprend deux ouvertures communiquant avec une partie longitudinale du microcanal et présentant une largeur comprise entre 5 pm et 30 pm.

Brève description des dessins

[Fig. 1] La figure 1 représente un réseau de microcanaux (2) faisant partie de la puce selon l'invention.

[Fig. 2] La figure 2 représente une vue au microscope électronique (grossissement X414) d'un réseau de microcanaux (2) faisant partie de la puce selon l'invention. On distingue les cellules (15) piégées au sein de la puce et les cellules (16) présentes au sein du milieu extérieur.

[Fig. 3] La figure 3 est une vue en coupe de la puce selon l'invention.

[Fig. 4] La figure 4 représente la partie supérieure (9) de la puce vue du dessus.

[Fig. 5] La figure 5 représente la partie inférieure (8) de la puce vue du dessus.

[Fig. 6] La figure 6 représente une vue éclatée du dessous de la puce selon l'invention.

[Fig. 7] La figure 7 représente une vue éclatée du dessus de la puce selon l'invention.

[Fig. 8] La figure 8 représente une vue en coupe de la puce selon l'invention à l'échelle 5 :0,5 cm.

[Fig. 9] La figure 9 représente une vue en coupe de la puce à l'échelle 5 :1 cm.

Description détaillée

Les Demandeurs ont mis au point une puce microfluidique pour attirer et piéger un élément biologique, tel qu'une cellule procaryote ou eucaryote. Cette puce microfluidique est particulièrement intéressante pour attirer et piéger une cellule cancéreuse in vivo après la résection d'une tumeur solide afin de prévenir et / ou diminuer les risques de récidive locale et / ou de développement de cancer métastatique. La puce microfluidique mise au point par les Demandeurs est particulièrement avantageuse car elle permet d'attirer, de piéger et in fine de détruire un élément biologique sans nécessiter la mise en oeuvre d'une ou plusieurs électrodes. L'absence d'électrode permet notamment de fabriquer plus facilement la puce microfluidique, de limiter les coûts de production mais aussi de faciliter la mise en oeuvre de la puce microfluidique in vivo. En effet, la structure particulière des microcanaux mis en oeuvre dans la puce selon l'invention, permet le passage d'un élément biologique au sein de ladite puce, depuis le milieu extérieur en direction du réservoir constitué d'une matrice comprenant un composé chimioattractant capable d'attirer l'élément biologique, tout en empêchant ledit élément biologique de ressortir de la puce en direction du milieu extérieur. Ainsi, la puce selon la présente invention permet non seulement d'attirer un élément biologique présent dans le milieu extérieur de la puce mais aussi de le piéger au sein de ladite puce et in fine de le détruire puisque l'élément biologique privé des ressources nécessaires à sa survie finit par être détruit.

Définitions

Une « puce microfluidique » est un dispositif comprenant un réseau de microcanaux, c'est-à dire des canaux de taille micrométrique, gravés ou moulés dans un matériau, connectés entre eux et reliant l'intérieur de la puce à l'extérieur de la puce par des entrées et des sorties percées à travers la puce, pour réaliser une fonction voulue. La puce microfluidique peut être obtenue par des procédés spécifiques tels que par déposition et électrodéposition, gravure, collage, moulage par injection, embossage, lithographie douce, soudure anodique, ou toutes autres technologies. Ces procédés de fabrication sont connus de l'Homme du métier. Dans le cadre de la présente invention, la fonction voulue de la puce microfluidique est de pouvoir attirer in vivo un élément biologique spécifique, de préférence une cellule eucaryote en particulier une cellule cancéreuse, et de le détruire in vivo.

Le « réseau de microcanaux» correspond à une multitude de canaux, reliés à l'extérieur de la puce par des entrées et des sorties percées à travers la puce. Les microcanaux peuvent par exemple être fabriqués à partir d'un moule, ou directement dans le matériau de la puce microfluidique. Le nombre de microcanaux varie en fonction du diamètre de la puce, de la largeur des microcanaux ou encore de l'espacement entre lesdits microcanaux.

Chaque microcanal composant le réseau de microcanaux correspond à un passage dont la hauteur peut être de quelques micromètres à quelques centaines de micromètres avec une longueur de quelques centaines de micromètres jusqu'à quelques millimètres. La largeur d'un microcanal correspond à la distance horizontale des deux points qui sont sur les bords opposés de la section transversale et qui sont les plus éloignés l'un de l'autre. La hauteur d'un microcanal correspond à la distance verticale des points situés sur les bords opposés de la section transversale et les plus éloignés les uns des autres. La longueur d'un microcanal est la distance entre les deux extrémités dudit canal, la longueur d'un microcanal correspond à la plus grande dimension. Les deux dimensions les plus courtes définissent généralement la section transversale susmentionnée. Par « microcanal sous la forme de harpon » au sens de la présente invention, on fait référence au fait que chaque microcanal faisant partie du réseau de microcanaux présente une forme longitudinale de type lance.

La puce microfluidique est de préférence « destinée à être implantée in vivo » c'est à dire que la puce microfluidique est destinée et apte à être implantée au sein d'un être vivant, de préférence un mammifère et en particulier un être humain. Plus particulièrement, cela signifie que la puce peut être implantée dans un être vivant sans interférer, ni dégrader les tissus avec lesquels elle est en contact et que ladite puce est apte à fonctionner in vivo c'est-à-dire attirer, piéger et détruire un élément biologique spécifique in vivo, de préférence une cellule eucaryote telle qu'une cellule cancéreuse, et de le détruire in vivo. Par « élément biologique » au sens de la présente invention on fait référence à tout élément comprenant de l'information génétique sous forme d'ARN ou d'ADN et susceptible de se trouver au sein d'un organisme vivant c'est-à-dire in vivo, tels que les cellules procaryotes, les cellules eucaryotes et les microorganismes. Parmi les éléments biologiques envisageables on peut notamment faire référence à une cellule procaryote telle qu'une bactérie, à une cellule eucaryote telle qu'une cellule animale.

Par « élément biologique spécifique » ou « élément biologique cible » on fait référence à l'élément biologique d'intérêt dans le cadre de l'utilisation de la puce c'est-à-dire l'élément biologique que l'on souhaite attirer et détruire in vivo. Le composé chimioattractant présent dans le réservoir étant choisi pour attirer l'élément biologique d'intérêt dans le cadre de l'utilisation de la puce microfluidique.

De préférence dans le cadre de l'invention, l'élément biologique d'intérêt est une cellule procaryote ou eucaryote, de préférence encore l'élément biologique d'intérêt est une cellule eucaryote. De façon encore plus préférée, la cellule eucaryote est une cellule cancéreuse, de préférence une cellule cancéreuse métastatique.

Une « cellule cancéreuse » est une cellule dans laquelle une ou plusieurs lésions majeures de l'ADN se sont produites, transformant ainsi la cellule normale en cellule cancéreuse apte à proliférer pour former un groupe de cellules transformées identiques c'est-à-dire une tumeur. On fait notamment référence à une cellule cancéreuse lorsque la cellule considérée présente un certain nombre de caractéristiques telles qu'une indépendance vis-à-vis des signaux de régulation de la croissance cellulaire, une capacité à échapper au processus de mort cellulaire programmée ainsi qu'une capacité à se diviser indéfiniment.

Plus particulièrement dans le cadre de la présente invention, on fait référence par « cellule cancéreuse » à une cellule issue d'une tumeur solide dite initiale ou d'origine ou primaire, présente au niveau ou à proximité de la zone de résection de la tumeur solide.

De préférence dans le cadre de la présente invention, on fait également référence par « cellule cancéreuse » à une « cellule cancéreuse métastatique » c'est à dire une cellule cancéreuse, capable de ou ayant migré à travers le corps par la voie des vaisseaux sanguins ou lymphatiques à partir de la tumeur d'origine et capable de ou ayant colonisé un ou plusieurs autres tissus à proximité ou à distance de ladite tumeur formant ainsi des métastases, à l'origine de « cancers métastatiques » ou encore « tumeurs métastatiques ». Dans ce cadre, la cellule cancéreuse est une cellule issue d'une tumeur solide dite secondaire ou tertiaire qui correspondent à des tumeurs métastatiques dans un second ou troisième tissu ou organe autre que celui de la tumeur initiale.

Il est fait référence à « élément biologique spécifique », « une cellule procaryote », « une cellule eucaryote », « une cellule cancéreuse », « une cellule métastatique» au singulier pour des raisons de clarté, étant entendu que la puce microfluidique selon la présente invention est apte à attirer et détruire in vivo plusieurs desdits éléments et cellules. Il est également bon de noter que la puce microfluidique selon la présente invention est apte à attirer et détruire in vivo plusieurs éléments biologiques spécifiques qui peuvent être de nature différente, lesdits éléments étant attirés au sein de la puce par le choix spécifique du ou des composés chimioattractants présents dans le réservoir.

Dans le cadre de la présente invention, le terme « prévenir » désigne une réduction du risque d'acquisition d'une maladie ou d'un trouble spécifié, la réduction ou le ralentissement de l'apparition des symptômes de cette maladie. Par exemple dans le cadre de la présente invention, le terme « prévenir » peut correspondre à la réduction du risque de propagation d'une infection lorsque l'élément biologique est une cellule procaryote ou à la réduction du risque de récidive locale du cancer et / ou du risque d'apparition de métastases, plus précisément de cancers métastatiques lorsque l'élément biologique est une cellule eucaryote de type cancéreuse.

Dans le cadre de la présente invention, le terme « traiter » désigne une amélioration ou l'inversion d'une maladie ou d'un trouble spécifié ou d'au moins un symptôme discernable. Le terme « traiter » peut aussi désigner la réduction ou le ralentissement de la progression de la maladie ou du trouble, ou de l'apparition des symptômes de cette maladie ou trouble. Par exemple dans le cadre de la présente invention, le terme « traiter» peut correspondre à la réduction ou au ralentissement de la progression d'une infection lorsque l'élément biologique est une cellule procaryote ou à la réduction ou le ralentissement d'apparition de métastases, plus précisément de cancers métastatiques lorsque l'élément biologique est une cellule eucaryote de type cancéreuse.

Au sens de la présente invention, la puce microfluidique est de préférence destinée à être implantée in vivo chez un sujet.

Le sujet dans le cadre de la présente invention est un être vivant, de préférence un mammifère et plus particulièrement les êtres humains, enfants, hommes ou femmes.

Par « cancer solide », ou « tumeur solide » on fait référence à une masse individualisée de cellules cancéreuses dans n'importe quel tissu tel que la peau, les muqueuses, les os, ou tout autre tissu présent dans les organes, c'est-à-dire aux carcinomes ou aux endocarcinomes issus de cellules épithéliales comme la peau, les muqueuses, les glandes et aux sarcomes issus de cellules des tissus conjonctifs et de soutien tels que l'os, le cartilage.

De préférence dans le cadre de la présente invention on fait référence par « cancer solide » ou « tumeur solide », à un carcinome tel que le cancer du sein, des poumons, de la prostate, de la vessie, des glandes salivaires, de la peau, de l'intestin, du côlon-rectum, de la thyroïde, du col de l'utérus, de l'endomètre et des ovaires, du cancer lèvre-bouche-larynx, du rein, du foie, du cerveau, des testicules, du pancréas, préférentiellement le cancer du sein. Ces exemples de tumeurs solides n'étant pas limitatifs.

Par « composé chimioattractant » on fait référence à tout composé apte à attirer par chimiotactisme un élément biologique, de préférence une cellule exprimant des récepteurs membranaires spécifiques de ce composé à sa surface, ledit élément biologique se déplaçant en fonction du gradient de concentration en composé chimioattractant. Dans le cadre de la présente invention, le composé chimioattractant est apte à induire le déplacement d'un ou plusieurs éléments biologiques spécifiques en fonction du gradient de concentration dudit composé par chimiotactisme positif, l'élément biologique se déplaçant vers la région où la concentration en composé chimioattractant est la plus élevée.

En particulier dans le cadre de la présente invention, le composé chimioattractant est dit « apte à attirer » un élément biologique spécifique lorsqu'il permet le déplacement dudit élément à l'intérieur de la puce microfluidique et en particulier vers le réservoir de composé chimioattractant dans lequel se trouve la concentration la plus élevée en composé chimioattractant. L'Homme du métier saura caractériser l'élément biologique spécifique d'intérêt afin de choisir le composé chimioattractant apte à attirer ledit élément au sein de la puce.

Dans le cadre de la présente invention, le composé chimioattractant est choisi en fonction de l'élément biologique spécifique d'intérêt.

Lorsque l'élément biologique est une cellule eucaryote, le composé chimioattractant est choisi en fonction du type de récepteurs membranaires que cette cellule exprime.

Plus précisément, lorsque l'élément biologique est une cellule eucaryote le composé chimioattractant peut être une cytokine c'est-à-dire un polypeptide ou une protéine soluble synthétisée par une cellule et agissant à distance sur d'autres cellules pour en réguler l'activité et la fonction par l'intermédiaire de récepteurs membranaires, choisie parmi les chimiokines, les facteurs stimulant les colonies de granulocytes et de macrophages tels que M-CSF, G-CSF, CSF-1, les facteurs de croissance et facteurs de croissance transformant tels que TGF alpha, TGF beta, EGF, bétacelluline, amphiréguline, héréguline, HBEGF, FGF, VEGF, les facteurs de nécrose tumorale tels que NGF, TNF alpha, TNF beta, les interférons tels que IFN alpha, IFN beta, IFN gamma, IFN lambda et les interleukines telles que IL-1 à IL-38.

De préférence lorsque l'élément biologique est une cellule eucaryote telle qu'une cellule cancéreuse, le composé chimioattractant est choisi parmi les chimiokines, les facteurs de croissance et les facteurs de croissance de transformation.

Une chimiokine est une petite protéine de 8 à 14 kilo daltons caractérisée par la présence de quatre résidus cystéine en des positions conservées permettant la formation de leur structure tridimensionnelle. Les chimiokines peuvent être classées en quatre sous-familles en fonction de l'espacement entre deux de leurs cystéines en position N-terminale, on peut notamment faire référence à la famille CXC ou alpha c'est à dire dont les deux premières cystéines sont séparées par un acide aminé quelconque, la famille CC ou beta, la famille CX3C ou delta, la famille C ou gamma. La chimiokine dans le cadre de la présente invention peut par exemple être choisie parmi les chimiokines suivantes : CXCL12, appelée également stromal cell-derived factor 1 (SDF-1), CCL5, CCL2, CCL3, CCL7, CCL19, CCL21, CCL22, CCL25, CXCL1, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CX3CL1. Un facteur de croissance est une protéine de faible poids moléculaire (inférieur à 30 kilo daltons) qui stimule la multiplication cellulaire et est reconnu par des récepteurs membranaires spécifiques qui sont le plus souvent des tyrosines kinases. Le facteur de croissance dans le cadre de la présente invention peut par exemple être choisi parmi TGF alpha ou beta (facteur de croissance transformant alpha ou beta), FGF (facteur de croissance du fibroblaste alpha), EGF (facteur de croissance épidermique), la bétacelluline l'amphiréguline, l'héréguline, HBEGF, VEGF (facteur de croissance de l'endothélium vasculaire), PDGF (facteur de croissance plaquette-dérivé).

Lorsque l'élément biologique est une cellule procaryote, telle qu'une bactérie, le composé chimioattractant peut être un peptide portant un groupe N formylé tel que le N-formylméthionyl- leucyl-phénylalanine (FMLP) ou encore des molécules glucidiques telles que le glucose.

Dans le cadre de la présente invention, le composé chimioattractant est compris dans une matrice qui est composée d'un matériau biocompatible tel que défini dans la présente invention. Le matériau biocompatible de la matrice étant choisi spécifiquement en fonction du composé chimioattractant, du profil de libération souhaité ainsi que du contexte d'utilisation de la puce microfluidique.

Par « milieu extérieur» dans le cadre de la présente invention on fait référence aux tissus situés autour de la puce microfluidique lorsque celle-ci est implantée in vivo, plus précisément aux tissus situés directement au contact de la puce, jusqu'à 300 mm, de préférence jusqu'à 150 mm, de préférence encore jusqu'à 100 mm autour de la puce.

Par « résection d'une tumeur solide » on entend le retrait, l'ablation ou encore l'exérèse d'une tumeur solide par exemple par chirurgie.

Ainsi, la présente invention concerne une puce microfluidique apte à attirer et à piéger in vivo un élément biologique spécifique. De façon avantageuse, la puce selon l'invention permet une destruction passive de l'élément biologique piégé au sein de la puce qui dépourvu des conditions nécessaires à sa survie fini par être détruit.

Les références numériques utilisées dans le cadre de la présente description détaillée de l'invention font référence aux figures de la présente demande ayant pour objectif d'illustrer l'invention sans pour autant s'y limiter.

Un premier objet de l'invention concerne une puce microfluidique apte à attirer et piéger un élément biologique spécifique, ladite puce comprenant :

- un réservoir (1) constitué d'une matrice comprenant un composé chimioattractant capable d'attirer l'élément biologique

- au moins un réseau de microcanaux (2) disposé entre le réservoir (1) et le milieu extérieur (3) de la puce et permettant de laisser passer le composé chimioattractant vers ledit milieu et de laisser passer l'élément biologique présent dans ledit milieu en direction du réservoir (1), caractérisée en ce que chaque microcanal se présente sous une forme de harpon comprenant au moins deux flèches (4) espacées longitudinalement l'une de l'autre et dirigées vers le réservoir, dans laquelle chaque flèche comprend deux branches (5) ayant chacune une extrémité libre (6) formant un angle aigu compris entre 10° et 80°, et dans laquelle chaque flèche comprend deux ouvertures (7) communiquant avec une partie longitudinale du microcanal et présentant une largeur comprise entre 5 pm et 30 pm.

De préférence, la présente invention concerne une puce microfluidique destinée à être implantée in vivo pour attirer et piéger pour in fine détruire un élément biologique spécifique, de préférence une cellule eucaryote, et de préférence encore une cellule cancéreuse

La matrice du réservoir comprenant le composé chimioattractant est formée d'un matériau biocompatible.

Le composé chimioattractant compris dans la matrice du réservoir permet d'attirer in vivo l'élément biologique spécifique au sein de la puce par chimiotactisme positif, l'élément biologique migrant en direction du réservoir où la concentration en composé chimioattractant est la plus élevée. Le réseau de microcanaux quant à lui, permet le passage par diffusion du composé chimioattractant depuis le réservoir vers le milieu extérieur de la puce ainsi que le passage de l'élément biologique spécifique depuis le milieu extérieur de la puce vers l'intérieur de la puce, en direction du réservoir. De façon avantageuse, la forme particulière de chaque microcanal composant le réseau de microcanaux, c'est- à-dire sous forme d'un harpon comprenant au moins deux flèches espacées longitudinalement l'une de l'autre et dirigées vers le réservoir, avec chaque flèche comprenant deux branches ayant chacune une extrémité libre formant un angle aigu compris entre 10° et 80°, et avec chaque flèche comprenant deux ouvertures communiquant avec une partie longitudinale du microcanal et présentant une largeur comprise entre 5 pm et 30 pm, permet le passage de l'élément biologique depuis le milieu extérieur au sein de la puce microfluidique en direction du réservoir tout en empêchant le passage de l'élément biologique présent dans ladite puce en direction du milieu extérieur. Ainsi, le réseau de microcanaux mis en oeuvre dans la puce selon l'invention permet avantageusement de piéger l'élément biologique présent dans la puce mais aussi de le détruire de façon passive puisque ledit élément piégé au sein de la puce est dépourvu des conditions nécessaires à sa survie.

En particulier, lorsque l'élément biologique attiré et piégé dans la puce microfluidique est une cellule procaryote ou eucaryote, en l'absence des conditions nécessaire à sa survie, la cellule va être détruite, notamment par apoptose au bout de quelques heures à quelques jours. Les débris cellulaires ou corps apoptotiques ressortent de la puce via le réseau de microcanaux et sont rejetés dans le milieu extérieur. Ainsi la puce microfluidique permet une destruction passive de l'élément biologique ne nécessitant pas la mise en oeuvre d'une ou plusieurs électrodes et ne nécessitant aucune consommation d'énergie. La capacité de fonctionnement de la puce est renouvelée en continu grâce à la destruction passive de l'élément biologique piégé au sein de la puce et grâce également à son rejet passif vers le milieu extérieur. Les dimensions et la géométrie des microcanaux mis en oeuvre dans la puce selon l'invention sont particulièrement adaptés pour permettre le déplacement de cellules eucaryotes qui ont besoin d'un support pour migrer notamment en projetant leurs membranes vers l'avant et en formant une structure riche en actine nommée lamellipode. De plus, les dimensions et la géométrie des microcanaux mis en oeuvre dans la puce selon l'invention participent avantageusement au profil de libération du composé chimioattractant vers le milieu extérieur notamment en créant une résistance hydrodynamique qui limite la diffusion du composé chimioattractant vers l'extérieur et contribue à la création et au maintien d'un gradient de composé chimioattractant. Enfin, les dimensions et la géométrie des microcanaux mis en oeuvre dans la puce selon l'invention permettent d'assurer le passage unidirectionnel d'un élément biologique spécifique au sein de la puce depuis le milieu extérieur en direction du réservoir de composé chimioattractant, permettant ainsi de piéger l'élément au sein de la puce.

Selon un aspect préféré chaque microcanal comprend entre 2 et 6 flèches, de préférence entre 3 et 5 flèches et de façon encore préférée 3 flèches.

Selon un autre aspect préféré, chaque extrémité libre d'une flèche forme un angle compris entre 10° et 60°, de préférence entre 10° et 45°, de préférence encore entre 10° et 30°, de façon encore préférée un angle de 20°.

Selon un autre aspect préféré, les deux ouvertures présentes sur chaque flèche et communiquant avec la partie longitudinale du microcanal, présentent une largeur comprise entre 10 pm et 20 pm, de préférence entre 10 pm et 15 pm, de façon encore préférée 10 pm.

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les deux ouvertures présentes sur chaque flèche et communiquant avec la partie longitudinale du microcanal, présentent une largeur inférieure à 10 pm. Ce mode de réalisation permet avantageusement d'améliorer la capacité de la puce à cibler et à attirer spécifiquement les cellules cancéreuses qui sont les seules cellules eucaryotes à pouvoir s'invaginer de sorte à pouvoir passer lesdites ouvertures.

En particulier, dans la puce selon l'invention, les deux ouvertures présentes sur chaque flèche se trouvent sur l'axe longitudinal du microcanal et communiquent avec la partie longitudinale dudit microcanal.

Dans la puce microfluidique selon l'invention, chaque flèche comprend une première ouverture dite « d'entrée » disposée à l'entrée de la flèche et par laquelle l'élément biologique entre et une deuxième ouverture dite de « sortie » par laquelle l'élément biologique sort en direction du réservoir comprenant le composé chimioattractant. En d'autres termes la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle chaque flèche (4) comprend une première ouverture par laquelle l'élément biologique entre et une deuxième ouverture par laquelle l'élément biologique sort en direction du réservoir comprenant le composé chimioattractant. Dans la puce microfluidique selon l'invention, chacune des branches d'une même flèche est symétrique à l'autre branche selon l'axe longitudinal du microcanal.

Selon un aspect particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique selon le premier objet, dans laquelle l'extrémité libre (6) de chaque branche (5) est séparée de l'autre par une distance comprise entre 30 et 200 pm. De préférence, l'extrémité libre (6) de chaque branche (5) est séparée de l'autre par une distance comprise entre 50 et 100 pm, de préférence encore d'une distance comprise entre 50 et 70 pm.

Selon un autre aspect particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle chaque flèche (4) est espacée longitudinalement de la suivante par une distance comprise entre 10 et 100 pm, de préférence entre 10 et 30 pm.

Plus particulièrement, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle chaque flèche (4) comprend une première ouverture par laquelle l'élément biologique entre et une deuxième ouverture par laquelle l'élément biologique sort en direction du réservoir (1) et dans laquelle la deuxième ouverture d'une flèche est espacée longitudinalement de la première ouverture de la flèche suivante par une distance comprise entre 10 et 100 pm, de préférence entre 10 et 30 pm.

De préférence, la longueur formée par l'ensemble des flèches comprises sur un même microcanal et l'espace longitudinal entre chacune d'elles, est comprise entre 100 pm et 500 pm, de préférence entre 200 pm et 250 pm.

Selon un aspect encore particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle chaque flèche (4) présente une longueur comprise entre 50 et 200 pm, de préférence 50 pm, une hauteur comprise entre 10 et 50 pm, de préférence 10 pm et une distance entre chaque extrémité libre (6) de chaque branche (5) comprise entre 30 et 200 pm, de préférence 50 pm.

Selon un aspect préféré de l'invention, chaque flèche (4) présente une longueur de 50 pm, une hauteur de 10 pm et une distance entre chaque extrémité libre (6) de chaque branche (5) de 50 pm. De préférence, toutes les flèches présentent sur un même microcanal, présentent les mêmes dimensions.

Selon un aspect encore particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle chaque microcanal présente une longueur comprise entre 100 et 500 pm, de préférence entre 200 et 300pm, une largeur comprise entre 30 et 200 pm, de préférence entre 50 et 100 pm, une hauteur comprise entre 5 et 50 pm, de préférence entre 20 et 30 pm De préférence, chaque microcanal compris dans un réseau de microcanaux est séparé du microcanal directement adjacent par une distance comprise entre 50 et 400pm, de préférence entre 100 et 200 pm.

Les microcanaux composant le réseau de microcanaux de la puce microfluidique selon la présente invention peuvent être de forme parallélépipédique, cylindrique, pavimenteuse, tronconique ou un mélange de ses formes.

De préférence, dans le cadre de la présente invention l'ensemble des microcanaux compris dans un réseau de microcanaux a la même forme et les mêmes dimensions.

Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, chaque microcanal comprend 3 flèches, dont chaque extrémité libre (6) d'une flèche (4) forme un angle de 20° et dont les deux ouvertures (7) présentes sur chaque flèche présentent une largeur comprise entre 10 pm et 20 pm. De préférence selon ce mode de réalisation, l'extrémité libre (6) de chaque branche (5) est séparée de l'autre par une distance comprise entre 50 et 100 pm. De préférence encore selon ce mode de réalisation, chaque flèche (4) présente une longueur de 50 pm, une hauteur de 10 pm et une distance entre chaque extrémité libre (6) de chaque branche (5) de 50 pm.

De façon encore préférée selon ce mode de réalisation chaque flèche est séparée longitudinalement de la suivante par une distance comprise 10 et 30 pm.

De façon encore plus préférée selon ce mode de réalisation, chaque microcanal présente une longueur comprise entre 100 et 500 pm, une largeur comprise entre 30 et 200 pm, une hauteur de 10 pm.

En particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle ladite puce est dépourvue d'électrode entre le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2).

De façon avantageuse, l'absence d'électrode permet une fabrication et une mise en oeuvre plus facile de la puce et permet également de disposer d'une puce permettant d'attirer, de piéger et in fine de détruire de façon passive un élément biologique spécifique.

Dans le cadre de la présente invention, l'élément biologique est de préférence une cellule cancéreuse et en particulier une cellule cancéreuse provenant d'un cancer ou d'une tumeur solide. La migration de cette cellule à l'intérieur de la puce s'effectue par adhérence au support sur lequel se trouvent le réseau de microcanaux.

De préférence, le réseau de microcanaux de la puce microfluidique selon la présente invention se situe sur la bordure externe de ladite puce c'est-à-dire au contact du milieu extérieur, assurant ainsi la communication entre ledit milieu et l'espace intérieur de la puce. La puce selon la présente invention peut comprendre plusieurs réseaux de microcanaux, par exemple deux réseaux de microcanaux.

La puce microfluidique selon le premier objet de l'invention comprend une partie inférieure (8) et une partie supérieure (9), le réservoir (1) comprenant la matrice de composé chimioattractant et le réseau de microcanaux (2) pouvant être compris indépendamment l'un de l'autre dans la partie supérieure (9) et / ou la partie inférieure (8) de ladite puce.

Selon un mode de réalisation particulier, la puce microfluidique selon le premier objet de l'invention comprend une partie inférieure (8) comprenant une partie du réservoir (1), le réseau de microcanaux (2) et une partie supérieure (9) comprenant une partie du réservoir (1) et apte à être disposée sur la partie inférieure (8), lesdites parties étant fixées entre elles.

Selon un autre mode de réalisation particulier, la puce microfluidique selon la présente invention comprend une partie inférieure (8) comprenant une partie du réservoir (1), et une partie supérieure (9) comprenant une partie du réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2), ladite partie supérieure étant apte à être disposée sur la partie inférieure (8), lesdites parties étant fixées entre elles.

La partie supérieure de la puce microfluidique est apte à être disposée sur la partie inférieure pour former un couvercle, lesdites parties étant fixées entre elles. Le réservoir compris dans la partie inférieure et dans la partie supérieure correspond à un seul et même réservoir dont une partie se trouve dans la partie supérieure de la puce et l'autre partie se trouve dans la partie inférieure de la puce.

Dans le cadre de la présente invention, on entend par partie supérieure « apte à être disposée sur la partie inférieure pour former un couvercle » le fait que la forme de la partie supérieure est telle qu'elle s'adapte à celle de la partie inférieure sur laquelle elle repose sans entraver la fonctionnalité de chaque élément composant la partie inférieure et permet de former un couvercle fermant la puce.

De façon avantageuse et préférée, la partie supérieure et inférieure de la puce microfluidique sont arrondies de manière à ce que la puce soit implantée in vivo sans endommager les tissus.

De préférence la puce est de forme arrondie, avec par exemple la partie supérieure et inférieure ayant une forme de demi-ovale ou de demi-sphère de sorte que lorsque la partie supérieure est disposée sur la partie inférieure, la puce microfluidique est respectivement de forme ovale ou sphérique.

La taille de la puce microfluidique selon le premier objet est adaptée à une implantation in vivo et est de l'ordre de quelques centimètres, de préférence entre 0,5 et 5 cm, de préférence encore entre 1 et 3 cm, de façon encore préférée de 1 cm. Plus particulièrement, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2) sont de forme annulaire et dans laquelle le réservoir est situé au centre de la puce.

Comme son nom l'indique, la forme annulaire correspond à une forme d'anneau. Cette configuration particulière permet notamment d'assurer une diffusion radiale du composé chimioattractant compris dans le réservoir en direction du milieu extérieur et une attraction homogène de l'élément biologique à partir dudit milieu en direction du réservoir, grâce à la situation centrale du réservoir ainsi qu'à la forme annulaire du réseau de microcanaux. La partie inférieure et la partie supérieure de la puce microfluidique peuvent être fixées l'une à l'autre par n'importe quel moyen physique ou chimique, adapté à une utilisation in vivo. A titre d'exemple de moyen de fixation physique ou chimique on peut faire référence respectivement à une vis ou à une colle adaptées à une utilisation in vivo àe la puce ou encore à un élément proéminent venant au regard d'un élément creux présents dans la partie inférieure et supérieure pour les assembler.

De préférence dans le cadre de la présente invention, la partie supérieure comprend une ou plusieurs ouvertures par lesquelles une ou plusieurs vis peuvent être insérées et la partie inférieure comprend un ou plusieurs écrous aptes à recevoir ladite ou lesdites vis.

De façon encore préférée, la partie supérieure de la puce microfluidique selon l'invention comprend une ouverture centrale par laquelle une vis (17) est apte à être insérée et la partie inférieure comprend un écrou central apte à recevoir ladite vis. Dans ce mode de réalisation préféré, le réservoir annulaire est disposé autour de l'ouverture centrale présente sur la partie supérieure et de l'écrou central présent sur la partie inférieure de la puce.

En particulier, la puce microfluidique comprend un ou plusieurs joints (10) aptes à rendre la puce étanche, lesdits joints étant disposés entre la partie inférieure et la partie supérieure au-dessus du réseau de microcanaux.

On entend ici par « joint apte à rendre la puce étanche », la propriété du joint à ne pas laisser entrer au sein de ladite puce les fluides pouvant être présents dans le milieu extérieur tel que le sang et à ne pas laisser sortir dans le milieu extérieur les liquides et matériaux présents à l'intérieur de ladite puce par un autre endroit que par le réseau de microcanaux. La position du ou desdits joints au- dessus du réseau de microcanaux permettant de ne pas entraver la diffusion du composé chimioattractant vers le milieu extérieur ni le passage de la cellule spécifique présente dans ledit milieu au sein de la puce, en direction du réservoir. De façon avantageuse, les joints permettent de créer une zone d'appui entre la partie supérieure et inférieure de la puce.

En particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle la partie supérieure (9) et / ou la partie inférieure (8) comprennent une cavité annulaire i) (8) apte à recevoir la matrice comprenant le composé chimioattractant, et une cavité annulaire ii) (10) disposée entre le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2), apte à recevoir un liquide dans lequel le composé chimioattractant est apte à diffuser.

Plus particulièrement, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle la partie supérieure (6) et / ou la partie inférieure (5) comprennent une cavité annulaire i) (11) apte à recevoir la matrice comprenant le composé chimioattractant par l'intermédiaire d'une ou plusieurs ouvertures (12) communiquant avec le milieu extérieur (3) et débouchant dans ladite cavité, et une cavité annulaire ii) (13) disposée entre le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2), apte à recevoir un liquide dans lequel le composé chimioattractant est apte à diffuser, par l'intermédiaire d'une ou plusieurs ouvertures (14) communiquant avec le milieu extérieur (3) et débouchant dans ladite cavité.

Plus particulièrement encore, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle la partie supérieure (9) et la partie inférieure (8) comprennent une cavité annulaire i) (11) apte à recevoir la matrice comprenant le composé chimioattractant par l'intermédiaire d'une ou plusieurs ouvertures (12) communiquant avec le milieu extérieur (3) et débouchant dans ladite cavité, et une cavité annulaire ii) (13) disposée entre le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2), apte à recevoir un liquide dans lequel le composé chimioattractant est apte à diffuser, par l'intermédiaire d'une ou plusieurs ouvertures (14) communiquant avec le milieu extérieur (3) et débouchant dans ladite cavité.

De préférence le composé chimioattractant est ajouté à la matrice du réservoir avant son ajout dans la cavité annulaire i). Alternativement, le composé chimioattractant peut être ajouté dans la cavité annulaire i) avant ou après l'ajout dans cette même cavité de la matrice formant le réservoir.

La matrice comprenant le composé chimioattractant et le liquide dans lequel le composé chimioattractant est apte à diffuser, sont ajoutés respectivement dans la cavité annulaire i) et dans la cavité annulaire ii) par l'intermédiaire desdites ouvertures (12, 14) de préférence après que la partie supérieure a été disposée sur la partie inférieure.

Le liquide dans lequel le composé chimioattractant est apte à diffuser est de préférence une solution aqueuse telle que du sérum physiologique ou une solution tampon physiologique telle qu'une solution aqueuse comprenant un tampon phosphate salin (PBS).

L'étanchéité de chacune des cavités après lesdits ajouts est assurée par l'obturation des ouvertures par l'intermédiaire de joints, par exemple en PDMS ou tout autre matériau adapté, lesdits joints étant situés à la sortie de ces ouvertures (12, 14) et communiquant avec le milieu extérieur.

De préférence, la cavité annulaire i) est comprise dans la partie supérieure et la partie inférieure de la puce, la ou les ouvertures débouchant dans cette cavité se trouvant dans la partie inférieure de la puce, et la cavité annulaire ii) ainsi que la ou les ouvertures débouchant dans cette cavité sont comprises dans la partie supérieure de la puce. La puce selon la présente invention est en matériau biocompatible. En particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle la partie supérieure, la partie inférieure et la matrice comprenant le composé chimioattractant sont composées d'un matériau biocompatible.

Plus précisément, la partie supérieure et la partie inférieure en tant que telles ainsi que les éléments qu'elles comprennent sont constitués d'un matériau biocompatible. Plus précisément encore, la partie supérieure, la partie inférieure, le réservoir notamment la matrice comprenant le composé de chimioattractant, le réseau de microcanaux, et les joints sont constitués d'un matériau biocompatible.

Par « matériau biocompatible » ou « biomatériau » on fait référence à un matériau ayant la capacité de ne pas interférer, de ne pas dégrader le milieu biologique dans lequel il est utilisé et ce, même en contact direct ou indirect, bref ou prolongé avec les tissus et fluides internes du corps d'un être humain ou d'un animal. A titre d'exemple de matériau biocompatible utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut faire référence de façon non exhaustive au verre, aux céramiques telles que l'alumine, la zircone, l'hydroxyapatite, aux métaux et alliages métalliques tels que le titane, la platine, aux polymères d'origine naturelle tels que le collagène, l'agarose, le chitosan, le carraghénane, le xanthane et l'alginate ou synthétique dégradables tels que les polyesters et polyanhyd rides ou non dégradables tels que les polyuréthanes, la cellulose et ses dérivés, les polymères vinyliques. De préférence dans le cadre de la présente invention les polymères d'origine synthétiques sont le PEEK (polyétheréthercétone) ou le PDMS (polydiméthylsiloxane).

De préférence, la partie supérieure, la partie inférieure et le réseau de microcanaux sont indépendamment l'un de l'autre, en polymères d'origine synthétique tels que le polydiméthylsiloxane (PDMS) ou le polyétheréthercétone (PEEK). De préférence encore, la partie supérieure et la partie inférieure sont en polyétheréthercétone (PEEK).

De préférence, le réseau de microcanaux est en polyétheréthercétone (PEEK).

De préférence, le réservoir et en particulier la matrice comprenant le composé chimioattractant est en collagène et / ou en alginate, de préférence encore ledit réservoir, en particulier ladite matrice est en alginate.

De façon particulière et préférée, la partie supérieure, la partie inférieure et le réseau de microcanaux de la puce selon l'invention sont en polyétheréthercétone (PEEK), le réservoir de composé chimioattractant est en alginate.

Selon un aspect particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle la matrice comprenant le composé chimioattractant est composée d'un matériau biocompatible, de préférence un polymère réticulé. De préférence, le polymère réticulé composant la matrice est un polymère d'origine naturelle et en particulier le collagène et / ou en alginate, de préférence en alginate. La réticulation d'un polymère correspond à la formation d'un ou de plusieurs réseaux tridimensionnels à partir de polymères linéaires ou ramifiés, par voie chimique et / ou physique. L'Homme du métier sait comment induire une réticulation des polymères selon les polymères considérés, à titre d'exemple la réticulation peut être effectuée par chauffage et/ou par l'utilisation d'agent de réticulation. Un polymère dit « réticulé » est un polymère dont certaines de ses chaînes sont reliées entre elles par des liaisons fortes ou faibles.

A titre d'exemple, le collagène peut être réticulé par l'utilisation d'agents réticulants tels que l'ammoniac gazeux, des sucres oxydés ou des aldéhydes à température ambiante et l'alginate peut être réticulé dans un bain de chlorure de calcium à température ambiante.

De préférence encore, le matériau biocompatible composant la matrice comprenant le composé chimioattractant est en alginate réticulé dans un bain de chlorure de calcium de préférence à température ambiante.

La réticulation du matériau biocompatible composant la matrice comprenant le composé chimioattractant permet avantageusement une libération prolongée de ce composé. Par « libération prolongée » on fait référence à une cinétique de libération du composé chimioattractant contrôlée et continue sur une période de temps. De préférence dans le cadre de la présente invention, la libération du composé chimioattractant s'effectue entre 3 jours et 6 mois, de préférence entre 15 jours et 3 mois.

Selon un aspect particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle le pourcentage massique composé chimioattractant / matrice du réservoir (1) est compris entre 0,1 et 20 %, de préférence entre 0,5 et 10 % et de préférence encore entre 0,5 et 5%.

L'Homme du métier saura déterminer la teneur du réservoir en composé chimioattractant en fonction du contexte de l'utilisation de la puce, de l'élément biologique spécifique d'intérêt, de la durée de libération du composé chimioattractant souhaitée et du biomatériau composant la matrice du réservoir.

Lorsque l'élément biologique spécifique est une cellule eucaryote, de préférence une cellule cancéreuse, le composé chimioattractant compris dans le réservoir de la puce microfluidique et en particulier dans la matrice du réservoir, est de préférence choisi parmi les chimiokines telles que CXCL12, appelée également stromal cell-derived factor 1 (SDF-1), CCL5, CCL2, CCL3, CCL7, CCL19, CCL21, CCL22, CCL25, CXCL1, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CX3CL1, les facteurs de croissance et les facteurs de croissance de transformation tels que TGF alpha ou beta (facteur de croissance transformant alpha ou beta), FGF (facteur de croissance du fibroblaste alpha), EGF (facteur de croissance épidermique alpha), la bétacelluline, l'amphiréguline, l'héréguline, HBEGF, PDGF (facteur de croissance plaquette-dérivé), VEGF (facteur de croissance de l'endothélium vasculaire).

Plus particulièrement, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle le composé chimioattractant compris dans le réservoir de la puce, est choisi parmi au moins un des composés suivants : CXCL12, CCL5, CCL2, CCL3, CCL7, CCL19, CCL21, CCL22, CCL25, CXCL1, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CX3CL1, TGF alpha, TGF beta, FGF, PDGF, EGF, VEGF.

Selon un autre aspect, lorsque l'élément biologique spécifique est une cellule procaryote, de préférence une bactérie, le chimioattractant compris dans le réservoir de la puce microfluidique et en particulier dans la matrice du réservoir, est de préférence choisi parmi les molécules glucidiques.

Le composé chimioattractant peut être utilisé seul ou en combinaison avec un ou plusieurs autres composés chimioattractants susmentionnés et / ou avec d'autres composés aptes à améliorer directement ou indirectement l'aptitude dudit composé chimioattractant à attirer un élément biologique spécifique, tel qu'une cellule eucaryote et en particulier une cellule cancéreuse comme par exemple des molécules glucidiques (glucose) et / ou lipidiques (acides gras) qui permettent d'apporter l'énergie nécessaire (énergie apportées sous forme d'ATP après dégradation du glucose ou des acides gras) à la survie de l'élément biologique, notamment d'une cellule eucaryote et en particulier d'une cellule cancéreuse. D'autres molécules comme l'oxygène peuvent être utilisées en association avec les chimioattractants. L'oxygène peut être transporté par l'hémoglobine ou par des hémoglobines synthétiques. L'oxygène est une molécule indispensable à la survie et prolifération des cellules et notamment des cellules cancéreuses. De préférence le composé chimioattractant est utilisé en combinaison avec une ou plusieurs molécules glucidiques (glucose) et / ou lipidiques (acides gras).

L'Homme du métier veillera à choisir le ou les composés chimioattractants en fonction de l'élément biologique spécifique ciblé.

A cet effet, lorsque l'élément biologique est une cellule eucaryote une analyse des récepteurs membranaires exprimés par la cellule ciblée devra être réalisée en amont afin de s'assurer de la spécificité du ou des composés chimioattractants choisis.

A titre d'exemple, lorsque l'élément biologique spécifique est une cellule cancéreuse exprimant le récepteur transmembranaire CXCR4 comme par exemple une cellule cancéreuse mammaire notamment humaine, le composé chimioattractant choisi est le stromal cell-derived factor 1 (SDF-1).

De même, lorsque l'élément biologique spécifique est une cellule cancéreuse provenant du cancer du poumon, le composé chimioattractant choisi est le facteur de croissance épidermique (EGF) ou le facteur de croissance transformant alpha (TGF alpha).

Un second objet de l'invention concerne l'utilisation de la puce microfluidique selon le premier objet de l'invention pour attirer et piéger un élément biologique spécifique.

Plus particulièrement la présente invention concerne l'utilisation de la puce microfluidique selon le premier objet de l'invention ou une méthode pour attirer et piéger in vivo un élément biologique spécifique, ladite puce étant implantée in vivo. Plus précisément, la présente invention concerne l'utilisation de la puce microfluidique selon le premier objet de l'invention ou une méthode pour traiter ou prévenir la prolifération et la dissémination d'un élément biologique spécifique chez un sujet, tel qu'une cellule procaryote ou eucaryote dans laquelle la puce est implantée in vivo chez un sujet.

Selon un aspect, la présente invention concerne l'utilisation de la puce microfluidique selon le premier objet de l'invention ou une méthode pour traiter ou prévenir une infection causée par une cellule procaryote telle qu'une bactérie dans laquelle la puce est implantée in vivo chez un sujet.

Selon un aspect préféré, la présente invention concerne l'utilisation de la puce microfluidique selon le premier objet de l'invention ou une méthode pour traiter ou pour prévenir la prolifération et la dissémination d'une cellule eucaryote et en particulier d'une cellule cancéreuse, de préférence après la résection d'une tumeur solide chez un sujet, dans laquelle la puce est implantée in vivo chez un sujet.

Plus précisément, la présente invention concerne l'utilisation de la puce microfluidique selon le premier objet de l'invention ou une méthode pour prévenir les risques de récidive locale d'un cancer et / ou de développement d'un cancer métastatique chez un sujet, dans laquelle la puce est implantée in vivo chez un sujet.

Dans le cadre de ces utilisations et méthodes, la puce microfluidique est implantée à une distance de 0,1 à 20 cm, de préférence de 1 à 10 cm, de préférence encore à une distance de 5 cm de la zone de résection d'une tumeur solide ou du foyer d'infection bactérienne chez un sujet. La puce microfluidique est de préférence implantée au niveau de la zone de résection dès le retrait de la tumeur solide, de préférence de suite après la résection de ladite tumeur.

On fait référence ici par « contexte d'utilisation de la puce », au type d'élément biologique spécifique ciblé, c'est-à-dire au type d'infection bactérienne lorsque ledit élément est une bactérie, ou au type de cellule cancéreuse ciblée et en particulier au type de tumeur solide retirée et le stade auquel se trouve ladite tumeur lorsque ledit élément est une cellule cancéreuse.

Dans le contexte des utilisations susmentionnées, la puce microfluidique peut être utilisée seule ou combinée à l'administration simultanée ou séquentielle d'autres composés médicamenteux tels que composés anti-cancéreux, notamment des composés chimiothérapeutiques et/ou d'hormonothérapie et/ou d'immunothérapie et/ou de thérapie ciblées et/ou radiothérapie lorsque l'élément biologique spécifique est une cellule cancéreuse.

Enfin, la présente invention concerne également une puce microfluidique selon le premier objet pour son utilisation pour attirer et détruire in vivo un élément biologique spécifique, ladite puce étant implantée in vivo, conformément aux conditions de mise en oeuvre susmentionnées.

Plus précisément, la présente invention concerne une puce microfluidique selon le premier objet pour son utilisation pour traiter ou prévenir la prolifération et la dissémination d'un élément biologique spécifique chez un sujet, tel qu'une cellule procaryote ou eucaryote, dans laquelle la puce est implantée in vivo chez un sujet conformément aux conditions de mise en oeuvre susmentionnées.

Selon un aspect, la présente invention concerne une puce microfluidique selon le premier objet pour son utilisation pour traiter ou prévenir une infection causée par une cellule procaryote telle qu'une bactérie, dans laquelle la puce est implantée in vivo chez un sujet.

Selon un aspect préféré, la présente invention concerne une puce microfluidique selon le premier objet pour son utilisation pour traiter ou prévenir la prolifération et la dissémination d'une cellule eucaryote et en particulier d'une cellule cancéreuse, de préférence après la résection d'une tumeur solide chez un sujet, dans laquelle la puce est implantée in vivo chez un sujet conformément aux conditions de mise en oeuvre susmentionnées.

De façon encore préférée, la présente invention concerne une puce microfluidique selon le premier objet pour son utilisation pour prévenir les risques de récidive locale d'un cancer et / ou de développement d'un cancer métastatique chez un sujet, dans laquelle la puce est implantée in vivo chez un sujet conformément aux conditions de mise en oeuvre susmentionnées.

La durée d'utilisation de la puce microfluidique in vivo peut être comprise entre 2 et 12 mois. A la suite de cette durée d'utilisation, une nouvelle puce pourra être implantée.

Dans le cadre de ces utilisations et méthodes, lorsque l'élément biologique spécifique est une cellule eucaryote et en particulier une cellule cancéreuse, ladite cellule provient de préférence d'un cancer du sein, des poumons, de la prostate, de la vessie, des glandes salivaires, de la peau, de l'intestin, du côlon-rectum, de la thyroïde, du col de l'utérus, de l'endomètre et des ovaires, du cancer lèvre- bouche-larynx, du rein, du foie, du cerveau, des testicules, du pancréas, préférentiellement le cancer du sein. Ces exemples de tumeurs solides n'étant pas limitatifs.

L'invention sera davantage illustrée par les figures et exemples suivants. Cependant, ces exemples et ces figures ne doivent en aucun cas être interprétés comme limitant la portée de l'invention.

EXEMPLES

Exemple 1 : Fabrication de la puce microfluidiaue pour l'étude de concept in vitro

Pour réaliser la preuve de concept in vitro, une puce microfluidique contenant en son centre un réservoir dans lequel est placé un chimioattractant avec un réseau de microcanaux sous forme de harpons, conforme à la présente invention a été fabriquée. a) Fabrication du moule en résine de type époxy photosensible SU-8 de MicroChemicals Une plaque de silicium (diamètre 76,2 mm) est préparée dans une solution « piranha » suivie d'une déshumidification pendant 15 à 150°C. La résine SU-8 est déposée sur la plaque de silicium par enduction centrifuge (3000 tr/min, 30s) afin d'obtenir l'épaisseur voulue (10pm ou lOOpm en fonction du type utilisé SU-8 2010 ou SU-8 2100). L'évaporation des solvants est obtenue avec des rampes de chauffage et de refroidissement très légères afin de minimiser le stress mécanique dans la résine (5°C/min). L'échantillon est soumis à une exposition UV 365 nm de 125mJ/cm2 pour une épaisseur de 10pm, et de 250mJ/cm2 pour une épaisseur de 100 pm. La plaque est ensuite soumise à un recuit post insolation (« post exposure bake (PEB) ») (4 min à 95°C pour une épaisseur de 10pm et 30 min à 95°C pour une épaisseur de lOOpm). Enfin, le développement permet de diluer les parties non réticulées de la résine SU-8 dans un solvant (« SU-8 developer » composé principalement de PGMEA (propylene glycol monomethyl ether acetate)). A la fin de cette étape, les motifs permettant la structuration des microcanaux sous forme de harpon restent sur la plaque de silicium. b) Structuration des microcanaux et assemblage final de la puce

Suite à la fabrication du moule, un polymère silicone polydiméthylsiloxane (PDMS) est préparé en le mélangeant avec son agent de durcissement (Sylgard ™184 silicone elastomer kit de chez Dow, ratio 1:10). Les bulles formées pendant le mélange sont éliminées grâce à un dessiccateur et une pompe à vide. Une fois le PDMS dégazé, il est versé sur le moule SU-8 posé dans une boîte de Pétri, puis placé dans une étuve à 80°C pendant au moins 2 heures afin de terminer le processus de réticulation.

Après refroidissement, le PDMS est décollé puis découpé à l'aide d'une lame circulaire afin d'obtenir les formes cylindriques des dispositifs. Ceux-ci sont alors percés à l'aide d'un emporte-pièce pour former le puit central qui contiendra les chimioattractants. La dernière étape consiste à coller le PDMS sur un substrat de verre pour encapsuler les canaux. Cela est obtenu en activant la surface pour transformer la fonction Si-CH ₃ du PDMS en Si-OH grâce à un générateur de plasma 0 ₂ ou air. Au contact du verre (Si0 ₂ ), une liaison covalente Si-O-Si permanente sera créée. c) Fabrication de la matrice de libération

Une solution aqueuse d'alginate à 3% (w/v) a été déposée dans un moule poreux ayant la forme du réservoir de la puce. Le moule est immergé dans un bain de réticulation de chlorure de calcium durant 24h. Après 3 lavages à l'eau miliQ, la matrice est congelée à -20°C puis lyophilisée.

Par la suite, la matrice est déposée délicatement dans la puce.

Exemple 2 : Mise en oeuyre de la puce microfluidiaue in vitro

A) Capacité d'attraction des cellules à l'intérieur de la puce

La puce microfluidique a été mise en oeuvre in vitro pour tester sa capacité à attirer les cellules du cancer du sein MDA-MB-231 qui sont des cellules épithéliales de tumeurs mammaires. Le composé SDF-1 « stromal cell-derived factor » correspond au composé chimioattractant apte à attirer les cellules MDA-MB-231.

1) Les cellules MDA-MB-231 stablement transfectées avec la « green fluorescent protein » (GFP) sont trypsinisées à JO. Puis 20 000 cellules sont ensemencées dans une boîte de pétri de 35 mm contenant en son centre la puce microfluidique in vitro. Les cellules sont cultivées dans le milieu Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM F12) 1% sérum de veaux foetal (SVF) + 1% d'antibiotique (streptomycine, pénicilline).

Le réservoir central de la puce microfluidique in vitro est chargé soit avec 50 pL de DMEM F12 + 1% SVF (sérum de veau foetal) + 1% d'antibiotique (streptomycine, pénicilline) (contrôle négatif) soit avec 50 pL de SDF-1 alpha à 100 ng/ml dans 0,1 % BSA dans DMEM F12 + + 1% d'antibiotique (streptomycine, pénicilline). Après 2, 4 et 7 jours de culture dans un incubateur C02 5% et une humidité de 95 % on réalise des photographies à partir d'un microscope inversé à fluorescence et les cellules présentes au sein de la puce sont comptées au bout de 4 jours puis de 7 jours. Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous :

[Table 1] Comptage cellulaire à l'aide d'un microscope inversé à fluorescence

On constate que les cellules se déplacent de l'extérieur vers l'intérieur de la puce et en particulier vers le réservoir central en présence du chimioattractant SDF-1 alpha. Au 7 ^eme jour dans la puce contenant le chimioattractant, on compte 850 cellules dans la puce, réparties dans l'ensemble de la puce et en particulier dans le réservoir central. En revanche, au 7 ^eme jour dans la puce ne contenant pas le chimioattractant c'est-à-dire la puce contrôle négatif, on compte 154 cellules dans la puce, exclusivement localisées à la sortie des microcanaux à l'intérieur de la puce.

Dans une autre expérience, dans les conditions expérimentales identiques à celles citées précédemment une puce microfluidique in vitro équipée de microcanaux harpons, contenant dans son réservoir le chimoattractant SDF-1 alpha à 100 ng/ml est placée dans un incubateur sous un microscope inversé équipé d'un objectif X10 et d'une caméra permettant le suivi des cellules après 5 à 6 jours de culture.

Le nombre de cellules ayant traversé la puce après 5 à 6 jours de culture sur une portion de la puce correspondant à 7 microcanaux a été quantifiées ainsi que le nombre de cellules sorties de la puce après 5 à 6 jours de culture. Ce nombre a par la suite été extrapolé à 200 microcanaux, correspondant au nombre moyen de microcanaux présents dans le réseau de microcanaux d'une puce selon l'invention.

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous.

[Table 2] Comptage cellulaire à l'aide d'un microscope inversé couplé à une caméra doté d'un objectif X10

On observe que les cellules pénètrent dans les microcanaux en forme de harpons et une fois à l'intérieur elles ne peuvent pas faire demi-tour. Les cellules sont donc piégées au sein de la puce et finissent par mourir à l'intérieur soit des microcanaux soit du réservoir central (Voir Figure 2).