Mobile photometrische Messvorrichtung und Verfahren zur mobilen photometrischen Messung an Mikrotitierplatten

Die Erfindung betrifft eine mobile photometrische Messvorrichtung, die einen einfachen, kompakten Aufbau als Messeinrichtung bereitstellt, der frei an mindestens eine Probe heranführbar ist.

Die erfinderische mobile photometrische Messvorrichtung wird insbesondere flächig nebeneinander angeordnet und stellt damit einen beliebig geometrisch konfigurierbaren Messplatz bzw. eine Messeinrichtung für parallele

photometrische Messungen an mehreren Proben z.B. einer Mikrotitierplatte bereit.

Dabei ist für jede einzelne Probe einer Mikrotitierplatte ein eigenes, kompaktes Detektionsmodul, bestehend aus einer Lichtquelle, insbesondere einer

Leuchtdiode (LED), einem Detektor, z.B. einer Photodiode (PD), und einer Optik mit integrierten Filtereigenschaften oder einer Optik und mindestens einem Filter, nach den unabhängigen Ansprüchen, vorgesehen.

Die Mikrotitierplatte verfügt über einen transparenten Boden vorzugsweise mit einem Gittersensor und kann damit einfach auf die Optik mit integrierten

Filtereigenschaften oder den Filter der Optik der erfinderischen mobilen photometrische Messvorrichtung gelegt werden.

Damit kann die mobile photometrische Messvorrichtung an den Ort der Probe, z.B. bei Feldmessungen oder unter Abzugshauben, bewegt werden, womit sich die Gefahr, dass die Parameter der Probe sich verändern, z.B. durch eine Bewegung der Probe, Druckänderung, Feuchteänderung und/oder

Temperaturänderung der Umgebung o.ä., minimieren oder ausschließen lässt. Auch ist eine Erstellung der Probe in einem Napf oder einer Mikrotitierplatte möglich, die sich bereits auf der mobilen Vorrichtung in einer frei wählbaren Umgebung befindet. Dies ist z.B. für Messungen unter Quarantänebedingungen, in denen in der Regel kein Labor vor Ort zur Verfügung steht, einrichtbar. Weiter betrifft die Erfindung ein mobiles photometrisches Messverfahren zur photometrischen, insbesondere markerfreien, Messung mittels Gittersensoren, die mit einer derartigen mobilen photometrische Messvorrichtung einfach durchgeführt werden können, die lediglich eine Lichtquelle und einen Detektor pro Probe aufweist und mit dem Verfahren auf eine spektrale Analyse des Gitter- Sensors verzichten kann.

Die klassischen Geräte, die auch als Reader für Mikrotitierplatten bezeichnet werden, arbeiten auf der Grundlage einer Durchlichtmessstrecke in die die zu bestimmende organische/biologische Substanz, als einzelne Probe, zwischen eine Lichtquelle und einen Photodetektor gebracht wird und untersucht wird. Die EP 1 027 591 B1 zeigt einen Reader für Mikrotitierplatten oder

Substanzchips mit einem Detektorarray, einem Linsenarray und mit einer Teleskop- und Feldlinse und einer Beleuchtungseinheit. Damit sind parallele Messungen aller Proben einer Mikrotitierplatte möglich.

Zum Nachweis von Substanzen wird die jeweilige Probe chemisch mit Hilfe von Fluoreszenzmarkern detektiert oder mit elektrischen Sensoren, wie zum Beispiel mit elektrochemischen Sensoren, Quarzkristall-Mikrobalance-Sensoren, Oberflächenresonanz-Sensoren, mittels optischer Spektrometerverfahren oder durch Vorrichtungen, die die spezifische optische Absorption von zu

analysierenden Komponenten ausnutzen, analysiert. Der bekannte Stand der Technik der Messverfahren, die auch auf die

erfinderische mobile photometrische Messvorrichtung anwendbar sind, ist in der DE 10 2010 005 859 B3 der Anmelderin umfassend ausgeführt. Dabei ist in der Vorrichtung eine Filterbank, ein photonischer Kristall sowie ein optischer Empfänger zur Auswertung des transmittieren Signals eingebracht. Es ist selbstverständlich, dass derartige bekannte Messmethoden auch Anwendung auf die erfinderische mobile photometrische Messvorrichtung finden können.

Eine gängige Methode der markerfreien Messtechnik mittels Gitter-Sensoren ist das Aufzeichnen der Resonanzverschiebung. Hierfür wird üblicherweise ein Spektrometer eingesetzt, um ein Spektrum der Transmission oder Reflektion des Sensors zu erhalten. Um dann die zentrale Wellenlänge der Resonanz zu bestimmen, wird mathematisch ein„fit" über die Messung gelegt.

Eine weitere Methode besteht darin, die Resonanzverschiebung in eine

Intensitätsänderung umzuwandeln. Hierfür wird die Resonanz an die spektrale Flanke der Lichtquelle gebracht und eine Resonanzverschiebung wird in eine Intensitätsänderung umgewandelt.

Der Nachweis biologischer Substanzen wie zum Beispiel DNS, Antigenen, Enzymen oder Bakterien gewinnt in der täglichen Laborarbeit und auf einigen wissenschaftlichen Gebieten durch derartige Messverfahren zunehmend an Bedeutung. Dabei kommen überwiegend Mikrotitierplatten zum Einsatz, die damit weit verbreitet sind und in verschiedenen mikrobiologischen Arbeitsprozessen, z.B. für zelluläre oder biochemische Experimente, eingesetzt werden. Typische Einsatzbereiche sind die Zellzüchtung oder das Screening technischer

Bioreaktionen. Durch die große Anzahl der Kavitäten und der Verwendung gleicher Typen eignen sich Mikrotiterplatten für die Kultivierung und Testung großer

Probenmengen.

Die Befüllung der Mikrotitierplatten geschieht manuell üblicherweise mit

Mehrkanalpipetten, im Hochdurchsatz meistens mit Pipettier-Robotern. Die überwiegend flächigen, rechteckig geformten Mikrotiterplatten bestehen meist aus Kunststoffen, z.B. Polystyrol, Polyvinylchlorid) oder aus Glas. Sie enthalten viele jeweils voneinander isolierte in der Höhe variierende Näpfe, die in Reihen und Spalten zur Fläche senkrecht ausgerichtet, nebeneinander angeordnet sind.

Die genauen Abmessungen (Länge* Breitex Höhe) betragen gemäß ANSI- Standard 127,76 mmx85,48 mmx 14,35 mm. Dabei weist die gleiche Grundfläche derzeit Formate folgenden Typs auf, die in variabler Höhe bezogen werden können:

Sechs Näpfe in zwei Reihen und drei Spalten mit Füllvolumen zwischen 2-5 ml; Zwölf Näpfe in drei Reihen und vier Spalten mit Füllvolumen zwischen 2-4 ml; 24 Näpfe in vier Reihen und sechs Spalten mit Füllvolumen zwischen 0,5-3 ml; 48 Näpfe in sechs Reihen und acht Spalten mit Füllvolumen zwischen 0,5-1 ,5 ml; 96 Näpfe in acht Reihen und zwölf Spalten mit Füllvolumen zwischen 0,1-0,3 ml; 384 Näpfe in 16 Reihen und 24 Spalten mit Füllvolumen zwischen 0,03-0,1 ml; 1536 Näpfe in 32 Reihen und 48 Spalten mit Füllvolumen von 0,01 ml. Die Näpfe sind in verschiedenen Formen verfügbar: als F-Boden oder

Flachboden, als C-Boden oder Flachboden mit minimal abgerundeten Ecken, als V-Boden mit konisch zulaufendem Boden und als U-Boden mit U-förmigen Vertiefungen.

Viele Anwendungen mit diesen Mikrotiterplatten basieren auf dem

photometrischen Messprinzip, wie z.B. markerfreie Technologien mit

Gittersensoren oder Dünnschichtsensoren, Fluoreszenzmessungen oder Absorptionsmessungen.

Gitter-Sensoren, auch photonische Kristalle genannt, bestehen aus einer planaren Wellenleiterstruktur mit einer periodischen Nanostruktur. Diese

Nanostruktur kann sowohl in einer Dimension periodisch sein, ein sogenanntes lineares Gitter oder in mehreren Dimensionen als sogenanntes

quadratisches/trianguläres Gitter. Das Besondere an Gitter-Sensoren ist, dass ihre Wellenleitermoden durch das Gitter an Fernfeldmoden koppeln können und durch Transmissions- oder Reflektionsmessungen analysiert werden können. Die Moden erscheinen in der Messung als eine scharfe Resonanz im Spektrum. Drei Kenngrößen definieren hierbei die Mode, die zentrale Wellenlänge, die spektrale Breite und die Intensität der Mode.

Diese Kenngrößen stehen in starker Abhängigkeit zu den geometrischen und materiellen Eigenschaften des Wellenleiters, wie z.B. dem Brechungsindex des Wellenleiters und seiner Umgebung.

Dieses Phänomen wird genutzt um mit dem erfinderischen Verfahren markerfreie Bioanalysen durchzuführen. Dabei wird eine Brechungsindexänderung an der Oberfläche des Gitter-Sensors, hervorgerufen z.B. durch zelluläre Reaktionen auf Substanzen oder durch Anbinden von Molekülen an die Oberfläche, detektiert.

Der Stand der Technik zielt auf die Resonanzverschiebung ab und zeichnet diese entweder direkt mittels Spektrometer auf oder wandeln sie an der spektralen Flanke der Lichtquelle in eine Intensitätsänderung um.

Das erfinderische Verfahren nutzt die intrinsische Intensitätsänderung der Resonanz für die Bestimmung der Brechungsindexänderung an der

Sensoroberfläche. Dabei wird ausgenutzt, dass jede Probe per se eine individuelle Eigenart aufweist, vergleichbar mit der eines menschlichen

Fingerabdrucks, die es durch die photometrische Messung zu untersuchen und zu analysieren gilt. Dafür ist eine genaue Kenntnis der Resonanz notwendig, die als Verfahrensschritt abbildbar ist.

Nachteilig an den bekannten Vorrichtungen ist der komplexe technische Aufbau der Messmimik und der Optik.

Weiter ist im Einzelfall für jeden Messvorgang eine neue Justierung oder Kalibrierung der bekannten Vorrichtungen erforderlich, die bei der erfinderischen Vorrichtung entfallen kann.

Ein weiterer Mangel wird darin gesehen, dass die bekannten Geräte nur in Laboren stationär einsetzbar sind und damit die Probe immer zur Vorrichtung bewegt werden muss, was bei der erfinderischen Vorrichtung entfallen kann. Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung und ein Verfahren bereitzustellen, das mit einem einfachen Messaufbau auskommt, keine Zusatzgeräte benötigt, ein sicher auswertbares Signal liefert, einen stabilen Messaufbau gewährleistet, eine vor-Ort Messung an der Probe ermöglicht, eine einfache schnelle

Kalibrierung und Justierung ermöglicht und sehr kostengünstig ist.

Weiter ist es Aufgabe eine parallele Messung der Proben, auch

Mehrfachmessung zu ermöglichen. Dabei können im Raster auch gezielt, frei definierbare Probengruppen gemessen und ausgewertet werden, womit neben statistischen Messungen auch Validierungen schnell und einfach durchführbar sind.

Die Aufgabe wird durch die Vorrichtungen und ein Verfahren mit den in den unabhängigen Ansprüchen genannten Merkmalen gelöst. Die Unteransprüche geben vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung an.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung gemäß Hauptanspruch ist eine mobile photometrische Messvorrichtung mit mindestens einem Messmodul, bestehend aus einer Lichtquelle, einem Detektor und einem Optikgerüst mit einer Optik mit integrierten Filtereigenschaften oder einer Optik und mindestens einem Filter, wobei diese Komponenten auf einer Platine, in einem Gehäuse und/oder einem Baustein verschaltet angeordnet sind. Das erfindungsgemäße Verfahren nach Anspruch 7 ist ein mobiles

photometrisches Messverfahren an Mikrotitierplatten mit Gittersensoren, insbesondere mit einer mobilen photometrischen Messvorrichtung, mit den Schritten:

Auswahl eines Gitter-Sensors in Abhängigkeit von einem

Resonanzverhalten von Wellenmoden,

Auswertung der intrinsischen Intensitätsänderung des Resonanzverhaltens, Bestimmung einer Brechungsindexänderung am Gitter-Sensor.

Zur Erläuterung und Veranschaulichung wird die Erfindung im Folgenden anhand von Figuren dargestellt, die keine Einschränkung auf die Ausführungen und Gestaltungen darstellen. Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung in Zusammenhang mit den Figuren.

Es zeigen:

Fig. 1 ein Schnittbild eines Ausschnitts der erfinderische mobilen

photometrische Messvorrichtung mit einer aufgelegten Mikrotitierplatte mit Gitter-Sensor im transparenten Boden der Mikrotitierplatte; die Wellenlängenverschiebung und Intensitätsänderung der Resonanz bei Brechungsindexänderungen. Linke und rechte Abbildung zeigen beide Szenarien für vollständig und unvollständig ausgeprägte

Moden;

Fig. 3 die Modendispersionsrelation am Beispiel eines Gitter-Sensors. Im kreisförmig gekennzeichneten Bereich ist eine nicht vollständig ausgeprägte Mode zu sehen und

Fig. 4 zwei Beispiele für einen Messaufbau für das erfinderische Verfahren einer photometrischen markerfreien Messung.

In Fig. 1 ist ein Schnittbild eines Ausschnitts der erfinderischen mobilen photometrische Messvorrichtung mit aufgelegter Probe, hier einer Mikrotitierplatte 8 gezeigt. Im unteren Teil der Figur ist die erfinderische mobile Vorrichtung, mit einem Messmodul 1 , bestehend aus einer Lichtquelle 2, hier eine Leuchtdiode (LED), einem Detektor 3, hier einer Photodiode (PD), und einem Optikgerüst 4 mit einer Optik 5, hier einer Kugellinse mit einem Filter 6, hier einem

Polarisationsfilter gezeigt.

Damit der Zugang zu der Mikrotiterplatte 8 von oben nicht blockiert ist, befindet sich sämtliche Bauteile des Messmoduls 1 unterhalb der Mikrotiterplatte 8.

Die bekannte Mikrotitierplatte 8 weist am transparenten Boden einen Sensor, hier einen Gitter-Sensor 9 auf. Das punktförmige Licht der Lichtquelle 2 wird zunächst durch die Optik 5 parallelisiert und auf den Sensor, hier den Gitter-Sensor 9 unterhalb Mikrotitierplatte 8, oder die Flüssigkeit innerhalb des Napfes gelenkt. Das durch den Sensor reflektierte oder durch die fluoreszierende Flüssigkeit emittierte Licht wird dann ebenfalls durch eine Optik 5 auf den Detektor 3 fokussiert. Um das direkte Licht der Lichtquelle 2, welches nicht mit dem Sensor oder der Flüssigkeit interagiert hat, zu unterdrücken, wird ein Filter 6, hier Polarisationsfilter oder Färb- oder Interferenzfilter verwendet, der im

Strahlengang platziert ist.

Aus produktionstechnischer Sicht ist es vorteilhaft die mobile Vorrichtung kompakt in höchstens zwei oder drei Bauteilebenen aufzubauen. In einer ersten Ebene sind alle elektrischen/elektronischen Bauteile, wie die jeweiligen Lichtquellen 2 (LED) und die Detektoren 3 (PD, CCD, Kamerasensor) paarweise, sowie erforderliche Auswerteeinheiten, insbesondere zur

Signalverarbeitung, Schnittstelleneinheiten, Datenspeichereinheit und/oder Kommunikationseinheiten miteinander verbunden oder auf einer Platine 7 aufgebaut und in einem Gehäuse oder in einem Baustein oder einer Platine 7 integriert.

Dabei ist eine Programmierung von Messungen, Messgruppen, sowie

Messserien über die Schnittstelleneinheiten, sowie ein Datenaustausch mit Speicherung vor Ort und/oder in externen Auswerteeinheiten frei wählbar. Die Weiterverarbeitung und Messwertanalyse sowohl direkt vor Ort als auch zeitlich oder räumlich versetzt ist frei wählbar. Über die Auswerteeinheiten sind sowohl vollständige Automatismen in der Auswertung möglich als auch nur die

Programmierung von selektiven Teilschritten in der Auswertung, die zudem zeitlich steuerbar sind. Auf einer weiteren Ebene wird das Optiksystem realisiert. Hierbei werden die

Optik 5, hier Linsen, z.B. Kugellinsen in ein Optikgerüst 4 eingesetzt. Kugellinsen eigen sich dabei besonders, da sie mit ihrer sehr kurzen Brennweite und ihrer Kugelsymmetrie besonders gut für eine selbstjustierende Bauweise geeignet sind. Für die jeweilige Lichtquelle 2 und den korrespondierenden Detektor 3 kann eine gleiche Optik 5 verwendet werden. Als dritte Ebene bzw. zweite Ebene wird der Filter 6 im Strahlengang platziert.

Dabei kann das Optikgerüst 4 aber auch bereits als Teil der Platine 7 oder eine Bausteins ausgeführt werden, der alle elektrischen/elektronischen Bauteile bereits integriert aufweist , so dass auch die Optik 5 als Teil der ersten Ebene ausgeführt werden kann. Dies gilt dann auch für den oder die Filter 6, wenn dieser/diese bereits in die Optik 5 integrierbar ist/sind bzw. auf das hoch integrierte Bauteil aufgetragen wird/werden.

Die Anzahl der Messmodule 1 kann beliebig an das Format bzw. die Geometrie der Mikrotiterplatte 8 angepasst werden, da durch die kompakte Bauweise pro Napf jeweils ein separates Messmodul 1 z.B. auf einer Platine 7 oder in einem Baustein oder Gehäuse, im gewünschten Raster realisierbar ist.

Eine Übertragung von Funktionalitäten der mobilen photometrische

Messvorrichtung auf smartphone-artige Vorrichtungen wird durch eine

Anpassung der Gehäuse und Sensorik ermöglicht. Wie in Fig. 2 gezeigt, kann das Resonanzverhalten in zwei Kategorien unterteilt werden. Ist der Wellenleiter und somit der Gitter-Sensor 9 so beschaffen, dass die Mode vollständig ausgeprägt ist, gilt der im linken Teil der Fig. 2 dargestellte Fall. Dabei führt eine Brechungsindexerhöhung zu einer Rotverschiebung und einer Intensitätsverringerung der Resonanz. Ist die Mode durch die Geometrie und die Materialien des Wellenleiters nicht vollständig ausgeprägt, führt eine Brechungsindexerhöhung ebenfalls zu einer Rotverschiebung, aber zusätzlich auch zu einer Intensitätserhöhung der Resonanz, wie in Fig. 2 in der rechten Abbildung gezeigt.

In Fig. 3 ist in einem Beispiel die Modendispersionsrelation eines Gitter-Sensors 9 gezeigt. Im gesamten Diagramm sind Resonanzen zu beobachten, welche vollständig ausgeprägt sind. Nur im durch einen weißen Kreis gekennzeichneten Bereich ist eine Resonanz zu beobachten, welcher erst bei höherem Wnkel vollständig ausgeprägt ist. Um diese Eigenart für das erfinderische Verfahren nutzbar zu machen, bedarf es nur einer Lichtquelle 2 und eines Detektors 3, wie beispielsweise durch die erfinderische mobile Vorrichtung bereitgestellt. Beide Bauteile müssen dafür so ausgewählt werden, dass das emittierte Licht der Lichtquelle 2 respektive die spektrale Empfindlichkeit mit der zentralen Wellenlänge der Resonanz übereinstimmen. Wird z.B. eine einfarbige und somit spektral eingeschränkte LED genutzt, kann hierbei nur eine Resonanz angeregt und somit untersucht werden.

In Fig. 4 wird beispielsweise eine derartige Vorrichtung mit Lichtquelle 2 und Photodetektor gezeigt, die für das Verfahren eingesetzt werden kann, um die Vorgehensweise zu verdeutlichen. In der linken Abbildung ist eine Vorrichtung mit Strahlteiler 10 in einem Reflektionsaufbau gezeigt. In der rechten Abbildung ist eine Vorrichtung ohne Strahlteiler 10 in einem Reflektionsaufbau gezeigt.

Um das Licht der Lichtquelle 2, das nicht mit dem Gitter-Sensor 9 interagiert und nicht zum Signal beiträgt, zu filtern, kann zusätzlich ein Polarisationsfilter im Strahlengang platziert werden. Hierfür können entweder zwei gekreuzte

Polarisationsfilter oder ein zirkularer Polarisationsfilter eingesetzt werden.

Um eine Signalverstärkung zu erreichen kann die hier beschriebene Methode mit anderen Methoden kombiniert werden. So kann z.B. die spektrale Flanke einer Lichtquelle 2 genutzt werden, um die Resonanzverschiebung zusätzlich in eine Intensitätsänderung, die mit der intrinsischen Intensitätsänderung übereinstimmt, zu wandeln und die Signaländerung zu verstärken.

Als Detektor 3 kann hierbei alternativ auch ein bildgebendes Element wie z.B. ein Kamerasensor benutzt werden. So kann die Gitter-Sensor-Oberfläche abgebildet werden und z.B. die Brechungsindexänderung einzelner Zellen beobachtet werden. B E Z U G S Z E I C H E N L I S T E

Messmodul

Lichtquelle

Detektor

Optikgerüst

Optik

Filter

Platine

Mikroti tierplatte

Gitter-Sensor

Strahlteiler

Napf

geführte Mode