La presente invención se encuadra dentro del campo de Ia biomedicina. Específicamente, Ia presente invención se refiere a una célula del Sistema

Mononuclear Fagocítico o SMF, preferiblemente un monocito o un macrófago, modificada genéticamente para sobreexpresar Ia lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL, en sus siglas en inglés), a un método para su obtención y a su uso para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia, isquemia seguida de reperfusión o toxinas, fallo agudo o rechazo al transplante de un órgano.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La patología de origen isquémico es Ia principal causa de muerte en los países desarrollados. En el caso del riñon, el fallo renal agudo (FRA) es una enfermedad que conlleva una mortalidad de más del 50%, cifra que no ha experimentado cambios significativos en las 4 últimas décadas. Normalmente los pacientes con síntomas clínicos de fallo renal, son tratados después de que el daño se haya desarrollado, excepto en el caso de pacientes a los que se les va practicar un trasplante renal. Puesto que Ia enfermedad está desarrollada cuando el paciente llega al hospital, se requiere urgentemente disponer de vías de curación mediante Ia estimulación del proceso regenerativo y curativo en general.

Una aproximación terapéutica dirigida a disminuir Ia inflamación y el daño renal ha sido Ia terapia celular con macrófagos modificados genéticamente. En este sentido, Ia alteración genética de los macrófagos hacia un fenotipo antiinflamatorio, mediante el tratamiento con adenovirus recombinante para expresar IL-1 ra y su posterior inyección en modelos inflamatorios de enfermedad renal puede reducir Ia infiltración, Ia inflamación glomerular e incluso Ia proteinuria (Holdsworth et al. Lab Invest. 1984, 51 :172-180; Kitamura et al. Kidney Int. 2000, 57:709-716; Kluth et al. Gene Ther. 2000, 7:263-270).

En cuanto a Ia regeneración del riñon dañado, las medidas terapéuticas empleadas hasta ahora, han sido: Ia aplicación de factores de crecimiento (Hirschberg et al. Kidney Int. 1999, 55:2423-2432; Miller y Padanilam. Chapter 17: Molecular responses and growth factors, in : Atlas if diseases of the kidney, Robert W Schrier, p. 17.1-17.16, Blackwell Science Press, Philadelphia, USA. 1999) o ensayos con células madre (Brodsky et al. Am J Physiol Renal Physiol. 2002, 282: F1140-F1149; KaIe et al. J Clin Invest. 2003, 112:42-49; Lin F et al. J Am Soc Nephrol. 2003, 14:1188-1199; Gupta et al. Kidney Int. 2002, 62: 1285-1290; Oliver et al. Clin Invest. 2004, 114: 795-803), pero no se ha conseguido el resultado regenerativo deseado. Estudios previos han demostrado Ia capacidad de Ia terapia con macrófagos para inducir Ia regeneración en modelos animales de isquemia/reperfusión (I/R), si éstos eran administrados en Ia fase no inflamatoria (Vinuesa et al. Journal of Pathology; 2007, 213: 2008 Jan; 214(1 ):104-13).

NGAL es una proteína de 25 kDa de Ia superfamilia de las lipocalinas (Flower. FEBS Lett. 1994, 354: 7-11 ) que actúa sobre Ia proliferación en múltiples tipos celulares (Cowland et al. J Immunol. 2003, 171 : 6630-6639; Gwira et al. J Biol Chem. 2005, 280: 7875-7882). Se trata de una proteína expresada en células tubulares, que aumenta notablemente en respuesta a estímulos dañinos como Ia isquemia o toxicidad. También se ha descrito que mejora Ia apoptosis de Ia célula tubular (Mishra et al. J Am Soc Nephrol. 2004, 15: 3073-3082). Estudios previos han demostrado Ia capacidad de NGAL para inducir Ia regeneración en modelos animales de isquemia/reperfusión (I/R) en Ia fase no inflamatoria del daño renal, pero el efecto es el contrario en Ia fase inflamatoria (Vinuesa E et al. Am J Physiol Renal Physiol. 2008 Nov; 295(5):F1554-62.).

Por tanto, existen estudios que indican Ia capacidad del macrófago para modular y resolver Ia inflamación renal, dependiendo de su fenotipo, y también existen estudios que indican que se puede regenerar el riñon dañado, pero no se conocen terapias que posean Ia doble función antiinflamatoria por una parte y potenciadora de Ia regeneración por otra. Existe por tanto Ia necesidad de disponer de terapias que permitan reducir Ia inflamación y el daño renal, potenciando Ia regeneración renal durante Ia fase inflamatoria del daño renal.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una célula del SMF, preferiblemente un monocito o un macrófago, modificada genéticamente para sobreexpresar NGAL, a un método para su obtención y a su uso para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia, isquemia seguida de reperfusión o toxinas, de un fallo agudo o del rechazo al transplante de un órgano.

En Ia presente invención se demuestra que macrófagos modificados genéticamente para que sobreexpresen NGAL, son capaces de disminuir Ia inflamación y el daño renal, además de inducir Ia regeneración en un modelo animal de isquemia-reperfusión renal, cuando son administrados en Ia fase inflamatoria del daño renal. La invención, por tanto, provee una terapia que reduce Ia inflamación y el daño renal, potenciando Ia regeneración renal durante Ia fase inflamatoria del daño renal. Esta terapia asimismo puede emplearse en Ia prevención o el tratamiento del daño por isquemia, isquemia seguida de reperfusión o causada por toxinas, de un fallo agudo o del rechazo al transplante de otros órganos.

El macrófago tiene su origen en las células progenitoras pluripotenciales granulo-monocíticas (CGp-GM) de Ia médula ósea. Por acción de los factores de estimulación colonial (CSF), Ia CGp-GM se diferencia en célula progenitora monopotencial monocítica (CGm-M), Ia cual, se diferencia en monoblasto, y éste, a su vez, en promonocito, Ia primera célula morfológicamente identificable como precursora del macrófago y que ya posee algunas de sus características, como adherencia al vidrio y capacidad fagocítica. Por división del promonocito y posterior diferenciación aparecen los monocitos, que abandonan Ia médula ósea pasando a Ia sangre. Los monocitos circulantes pasan por diapédesis a través del endotelio vascular, emigrando hacia los tejidos en los que se diferenciarán en macrófagos, que, a su vez, pueden presentarse en diferentes estados funcionales: residentes, inflamatorios y activados. El conjunto formado por los precursores medulares, los monocitos y los macrófagos tisulares, se engloba actualmente bajo Ia denominación de Sistema Mononuclear Fagocítico (SMF).

Un primer aspecto de Ia invención se refiere a una célula del Sistema Mononuclear Fagocítico (SMF) aislada modificada genéticamente caracterizada porque comprende un polinucleótido exógeno (en adelante, el polinucleótido de Ia invención) que presenta una identidad con Ia SEQ ID NO: 1 seleccionada de Ia lista que consiste en:

a. al menos, un 50 %, b. al menos, un 60 %, c. al menos, un 70 %, d. al menos, un 80 %, y e. al menos, un 90 %,

donde dicha célula del SMF es capaz de inducir Ia regeneración renal durante Ia fase inflamatoria del daño renal. Dicha capacidad se puede determinar mediante métodos convencionales tales como los ensayos descritos en el Ejemplo que acompaña esta descripción.

La expresión "fase inflamatoria" tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a una primera fase del daño renal caracterizada por un aumento de mediadores inflamatorios, típicamente durante las primeras 24 horas después de un insulto isquémico. A su vez, este ambiente promueve el daño del tejido renal por apoptosis y necrosis. La fase regenerativa se inicia con un cambio del ambiente inflamatorio. El macrófago juega un papel importante en eliminar células muertas que a su vez, estimulan su cambio de fenotipo hacía antiinflamatorio y pro-proliferativo, permitiendo asimismo Ia inducción de Ia regeneración renal.

La expresión "modificada genéticamente" tal y como se utiliza en Ia presente descripción, incluye aquí cualquier célula del SMF en Ia cual el genotipo ha sido alterado de manera que comprende un polinucleótido exógeno, introducido experimentalmente, que presenta una identidad con Ia SEQ ID NO: 1 seleccionada de Ia lista que consiste en:

a. al menos, un 50 %, b. al menos, un 60 %, c. al menos, un 70 %, d. al menos, un 80 %, y e. al menos, un 90 %,

donde dicha célula del SMF es capaz de inducir Ia regeneración renal durante Ia fase inflamatoria del daño renal.

Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxiribonucleótidos (ADN ó DNA).

En una primera realización preferida de este primer aspecto de Ia invención, Ia célula del SMF modificada genéticamente está caracterizada porque comprende el polinucleótido exógeno con Ia SEQ ID NO: 1 , que corresponde a Ia secuencia nucleótidica del cDNA de Ia proteína NGAL humana (Número de referencia del Genbank: NM_005564).

En una segunda realización preferida de este primer aspecto de Ia invención, Ia célula del SMF modificada genéticamente está caracterizada porque comprende el polinucleótido exógeno con Ia SEQ ID NO: 2, del cDNA de Ia proteína NGAL de ratón (Número de referencia del Genbank: NM_008491 ).

En una tercera realización preferida de este primer aspecto de Ia invención, Ia célula del SMF modificada genéticamente está caracterizada porque comprende el polinucleótido de Ia invención unido operativamente a, al menos, una secuencia de control de Ia lista que comprende:

a. un promotor que dirija Ia transcripción de dicho polinucleótido, b. una señal de inicio de Ia transcripción, c. una señal de terminación de Ia transcripción, d. una señal de poliadenilación, o e. un activador transcripcional.

"Secuencia de control" se refiere a secuencias de polinucleótidos que afectan Ia expresión de las secuencias a las que están ligadas. En células eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores, señales de terminación, intensificadores o silenciadores. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para Ia expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa.

"Unidos operativamente" se refiere a una yuxtaposición en Ia que los componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar en Ia manera intencionada. Una secuencia de control "unida de forma operativa" al polinucleótido, está ligada al mismo de tal manera que se consigue Ia expresión de Ia secuencia codificadora del polinucleótido.

Como se usa aquí, el término "promotor" hace referencia a una región del DNA situada en posición 5' con respecto al punto de inicio de Ia transcripción y que resulta necesaria o facilita dicha transcripción en una célula animal. Este término incluye, por ejemplo, pero sin limitarse, promotores constitutivos, promotores específicos de tipo celular o de tejido o promotores inducibles o reprimibles.

En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia célula del SMF modificada genéticamente está caracterizada porque comprende un polinucleótido exógeno que codifica Ia proteína NGAL.

En una cuarta realización preferida de este primer aspecto de Ia invención, Ia célula del SMF modificada genéticamente está caracterizada porque comprende un polinucleótido exógeno que codifica una secuencia aminoacídica que presenta una identidad con Ia SEQ ID NO: 3 seleccionada de Ia lista que consiste en:

a. al menos, un 50 %, b. al menos, un 60 %, c. al menos, un 70 %, d. al menos, un 80 %, y e. al menos, un 90 %,

donde dicha célula del SMF es capaz de inducir Ia regeneración renal durante Ia fase inflamatoria del daño renal. Dicha capacidad se puede determinar mediante métodos convencionales tales como los ensayos descritos en el Ejemplo que acompaña a esta descripción.

Los términos "secuencia aminoacídica", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden estar, o no, química o bioquímicamente modificados.

En una quinta realización preferida de este primer aspecto de Ia invención, Ia célula del SMF modificada genéticamente está caracterizada porque comprende un polinucleótido exógeno que codifica Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3, que corresponde a Ia secuencia aminoacídica de Ia proteína NGAL humana (Número de referencia del Genbank: NP_005555).

En una sexta realización preferida de este primer aspecto de Ia invención, Ia célula del SMF modificada genéticamente está caracterizada porque comprende un polinucleótido exógeno que codifica Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 4, que corresponde a Ia secuencia aminoacídica de Ia proteína NGAL de ratón (Número de referencia del Genbank: NP_032517).

Los términos "NGAL", "lipocalina asociada a Ia gelatinasa de neutrófilos" o "lipocalina-2" se refieren a una proteína de 25 kDa de Ia superfamilia de las lipocalinas.

El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a Ia proporción de nucleótidos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias nucleotídicas o aminoacídicas que se comparan. El tanto por ciento de identidad existente entre dos secuencias puede ser verificado fácilmente por un experto en Ia materia, por ejemplo, con Ia ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias.

Preferiblemente, Ia célula del SMF es una célula de mamífero, y más, preferiblemente, de un humano. Aún más preferiblemente, Ia célula del SMF es un monocito o un macrófago.

Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de Ia célula del SFM, preferiblemente, un monocito o un macrófago, modificada genéticamente según se ha descrito anteriormente en este documento (de ahora en adelante, célula de Ia invención) para Ia elaboración de un medicamento.

Otro aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia célula de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento de terapia génica. En general, se entiende por medicamento de terapia génica cualquier producto obtenido mediante un conjunto de procesos de fabricación destinados a transferir, bien in vivo bien ex vivo, un ácido nucleico profiláctico, de diagnóstico o terapéutico a células animales, preferiblemente humanas, y su posterior expresión in vivo. Entre los medicamentos de terapia génica se encuentran, pero sin limitarse los siguientes, ácido nucleico desnudo, vectores no virales, vectores virales o células modificadas genéticamente. Tal y como se utiliza en Ia presente descripción, el término "medicamento de terapia génica", se refiere a cualquier medicamento que comprende una célula del SMF modificada caracterizada porque comprende el polinucleótido de Ia invención. Puede tratarse de medicamentos de terapia génica basados en células autólogas (procedentes del propio paciente), como alogénicas (de otro ser humano) o xenogénicas (de animales).

Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de Ia célula de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento de terapia génica para Ia prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia, isquemia- reperfusión o toxinas en un tejido o un órgano. Preferiblemente, el tejido o el órgano es de Ia lista que comprende: riñon, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, colon, páncreas, vejiga, útero o piel. Más preferiblemente, el órgano es el riñon.

El término "isquemia" se refiere a una disminución transitoria o permanente del riego sanguíneo en un tejido o un órgano, con Ia consecuente disminución del aporte de oxígeno. El conjunto de los daños que sufre el tejido o el órgano debido a Ia isquemia se conoce como "daño causado por isquemia".

El término "reperfusión" se refiere a Ia restauración del suministro de sangre a un tejido o un órgano que está isquémico como consecuencia de una disminución del riego normal de sangre. La recuperación del riego sanguíneo restaura el aporte de oxígeno y nutrientes al tejido, permitiendo Ia recuperación del tejido o del órgano isquémico. Sin embargo, Ia reperfusión en sí misma puede lesionar el tejido o el órgano isquémico, ocasionando Io que se conoce como "daño causado por reperfusión".

La expresión "daño por isquemia-reperfusión" se refiere al conjunto de los daños que sufre un tejido o un órgano debido a una disminución del riego sanguíneo (isquemia) seguida de una restauración del riego sanguíneo (reperfusión).

La expresión "daño causado por toxinas" se refiere al conjunto de los daños que sufre un tejido o un órgano como consecuencia de su exposición a toxinas como, por ejemplo, pero sin limitarse, antibióticos, anestésicos, quimioterapéuticos, contrastes radiológicos, metales pesados, fungicidas, pesticidas, solventes orgánicos, venenos animales, tóxicos fúngicos o tóxicos de origen endógeno.

Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia célula de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia en el riñon o isquemia renal. La isquemia renal consiste en una disminución transitoria o permanente del riego sanguíneo, con Ia consecuente disminución del aporte de oxígeno al riñon, como consecuencia, por ejemplo, pero sin limitarse de una disminución del volumen sanguíneo total, una redistribución de Ia sangre o una obstrucción. La disminución del riego sanguíneo puede ser unilateral, cuando afecta únicamente a un riñon, o bilateral, cuando afecta a los dos ríñones. El conjunto de los daños que sufre el tejido o el órgano debido a Ia isquemia se conoce como "daño causado por isquemia renal".

Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia célula de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia-reperfusión en el riñon o isquemia-reperfusión renal. La expresión "daño por isquemia- reperfusión renal" se refiere al conjunto de los daños que sufre el riñon debido a una disminución del riego sanguíneo (isquemia renal) seguida de una restauración del riego sanguíneo (reperfusión).

Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia célula de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento del daño que sufre el tejido renal o el riñon como consecuencia de su exposición a toxinas como, por ejemplo, pero sin limitarse, antibióticos, anestésicos, quimioterapéuticos, contrastes radiológicos, metales pesados, fungicidas, pesticidas, solventes orgánicos, venenos animales, tóxicos fúngicos o tóxicos de origen endógeno.

Como consecuencia de los daños causados por isquemia, isquemia- reperfusión o toxinas en un órgano puede producirse un fallo agudo orgánico. Los términos "fallo agudo", "fallo orgánico agudo" o "fracaso orgánico agudo", se refieren a un síndrome clínico que se caracteriza por un deterioro brusco de Ia función de un determinado órgano.

Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de Ia célula de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento de un fallo agudo de un órgano. Preferiblemente, el tejido o el órgano es de Ia lista que comprende: riñon, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, colon, páncreas, vejiga, útero o piel. Más preferiblemente, el órgano es el riñon.

Como consecuencia de los daños causados por isquemia, isquemia- reperfusión o toxinas en el riñon puede producirse un fallo renal agudo (FRA). Los términos "fallo renal agudo", "fracaso renal agudo" o "insuficiencia renal aguda (IRA)" se refieren a un síndrome clínico que se caracteriza por un deterioro brusco de Ia función renal que tiene como consecuencia una disminución del filtrado glomerular y una acumulación de productos nitrogenados séricos (como, por ejemplo, urea o creatinina), pudiendo también producirse alteraciones del equilibrio hidroelectrolítico y del equilibrio ácido base. El FRA puede clasificarse en tres grandes grupos: FRA funcional, FRA parenq u ¡matoso o FRA obstructivo. En el FRA funcional existe una inadecuada perfusión renal que compromete el filtrado glomerular, pero el parénquima glomerular está íntegro. La insuficiencia renal que se produce durante el FRA funcional es reversible tras restaurar el flujo plasmático, pero si persiste Ia situación que Io ha desencadenado evolucionará hacia un FRA parenquimatoso. En el FRA parenquimatoso Ia causa del deterioro de Ia función renal es un daño en las diferentes estructuras anatómicas renales, que da lugar a diferentes síndromes clínicos: el túbulo (necrosis tubular aguda), el glomérulo (necrosis glomerular), el intersticio tubular (necrosis tubular intersticial) o los vasos sanguíneos. En el FRA obstructivo se produce un aumento de Ia presión en Ia vía urinaria, que se transmite retrógradamente, comprometiendo el filtrado glomerular normal, como consecuencia de Ia obstrucción de alguno de los conductos del riñon.

Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia célula de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento de un FRA.

Una de las situaciones más frecuentes de daño causado por isquemia- reperfusión tiene lugar en el transplante de órganos. De hecho, el fallo orgánico agudo es una de las primeras causas por las que se produce el rechazo de órganos transplantados.

Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de Ia célula de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento del rechazo de un órgano transplantado. Preferiblemente, el tejido o el órgano es de Ia lista que comprende: riñon, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, colon, páncreas, vejiga, útero o piel. Más preferiblemente, el órgano es el riñon. El FRA asociado al daño causado por isquemia-reperfusión es una de las principales causas por las que se produce el retraso inicial en Ia función o el rechazo de un riñon transplantado.

Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia célula de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento del rechazo de un riñon transplantado.

Otro aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia célula de Ia invención.

Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia célula de Ia invención para Ia prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia, isquemia-reperfusión o toxinas en un tejido o un órgano. Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia célula de Ia invención para Ia prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia, isquemia-reperfusión o toxinas en un órgano de Ia lista que comprende: riñon, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, colon, páncreas, vejiga, útero o piel. Una realización más preferida de este aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia célula de Ia invención para Ia prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia, isquemia-reperfusión o toxinas en el riñon.

Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia célula de Ia invención para Ia prevención o el tratamiento de un fallo agudo de un órgano. Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia célula de Ia invención para Ia prevención o el tratamiento de un fallo agudo de un órgano de Ia lista que comprende: riñon, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, colon, páncreas, vejiga, útero o piel. Una realización más preferida de este aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia célula de Ia invención para Ia prevención o el tratamiento de un FRA.

Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia célula de Ia invención para Ia prevención o el tratamiento del rechazo de un órgano transplantado. Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia célula de Ia invención para Ia prevención o el tratamiento del rechazo de un órgano transplantado de Ia lista que comprende riñon, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, colon, páncreas, vejiga, útero o piel. Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia célula de Ia invención para Ia prevención o el tratamiento del rechazo de un riñon transplantado.

En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia composición farmacéutica según se ha descrito anteriormente en este documento, comprende, además, un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización más preferida de Ia presente invención, Ia composición farmacéutica comprende además otro principio activo. En una realización más preferida de Ia presente invención, Ia composición farmacéutica comprende junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, además, otro principio activo.

Como se emplea aquí, los términos "principio activo", "sustancia activa", sustancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" o "ingrediente farmacéuticamente activo" se refiere a cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de una enfermedad, o que afecte a Ia estructura o función del cuerpo del ser humano u otros animales. Las composiciones pueden formularse para su administración en una variedad de formas conocidas en el estado de Ia técnica. Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal y, más preferiblemente, a un mamífero, incluyendo a un humano, por una variedad de vías, incluyendo, pero sin limitarse a parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, epidural, intraespinal, intraestromal, intraaricular, intrasinovial, intratecal, intralesional, intraarterial, intracapsular, intracardiaca, intramuscular, intranasal, intracraneal, subcutánea, intraorbital, intracapsular o tópica.

La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como, por ejemplo, edad, peso, sexo o tolerancia del animal. En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a Ia cantidad de Ia composición farmacéuticamente efectiva que produzca el efecto deseado y, en general, vendrá determinada entre otras causas, por las características propias de dicha composición farmacéutica y del efecto terapéutico a conseguir. Los "adyuvantes" o "vehículos" farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos en el estado de Ia técnica.

Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a un método para obtener Ia célula de Ia invención que comprende:

a. obtener una célula del SFM aislada, y b. transfectar Ia célula del paso (a) con un ácido nucleico que comprende un polinucleótido, donde dicho polinucleótido presenta una identidad con Ia SEQ ID NO: 1 seleccionada de Ia lista consiste en:

i) al menos, un 50 %, ii) al menos, un 60 %, iii) al menos, un 70 %, iv) al menos, un 80 %, y v) al menos, un 90 %.

En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, el polinucleótido comprendido en el ácido nucleico transfectado en el paso (b) del método de Ia invención es Ia SEQ ID NO: 1.

En otra realización preferida de este aspecto de Ia invención, el polinucleótido comprendido en el ácido nucleico transfectado en el paso (b) del método de Ia invención es Ia SEQ ID NO: 2.

En una realización más preferida de este aspecto de Ia invención, el polinucleótido comprendido en el ácido nucleico transfectado en el paso (b) está unido operativamente a, al menos, una secuencia de control de Ia lista que comprende:

a. un promotor que dirija Ia transcripción de dicho polinucleótido, b. una señal de inicio de Ia transcripción, c. una señal de terminación de Ia transcripción, d. una señal de poliadenilación, o e. un activador transcripcional.

El término "transfectar", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a introducir un ácido nucleico exógeno al interior de una célula eucariota.

El ácido nucleico del paso (b) del método de Ia presente invención puede ser introducido al interior de Ia célula del SFM aislada obtenida en el paso (a), por ejemplo, pero sin limitarse, como ácido nucleico desnudo o mediante un vector.

Tal como se utiliza en Ia presente invención los términos "vector" o "vector de transferencia géncica", se refieren a sistemas utilizados en el proceso de transfección de un ácido nucleico exógeno al interior de una célula, permitiendo de este modo Ia vehiculación del ácido nucleico al interior de Ia célula.

En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia célula del SFM se pone en contacto con un vector de transferencia génica, el cual comprende el ácido nucleico que comprende el polinucleótido del paso (b), de tal manera que el ácido nucleico es introducido en Ia célula bajo las condiciones apropiadas para que dicho polinucleótido sea expresado en el interior de Ia célula. El vector puede ser viral o no viral. Existen numerosos vectores virales y no virales para introducir DNA exógeno dentro de las células madre que son bien conocidos para aquellos expertos en Ia materia. Vectores virales apropiados para poner en práctica esta realización de Ia invención incluyen, pero no están limitados a los siguientes: vectores adenovirales, vectores adenoasociados, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores alfavirales, vectores herpesvirales y vectores derivados de coronavirus. Vectores de tipo no viral apropiados para poner en práctica esta realización de Ia invención incluyen, pero no están limitados a los siguientes: gene gun, liposomas, poliaminas, péptidos, dendrímeros, glicopolímeros catiónicos, complejos liposoma-policatión, proteínas y sistemas de transferencia génica mediados por receptor.

En una realización aún más preferida de este aspecto de Ia invención, Ia transfección del ácido nucleico del paso (b) se realiza empleando un vector adenoviral.

Preferiblemente, Ia célula del SMF obtenida en el paso (a) es una célula de mamífero, y más, preferiblemente, de un humano. Aún más preferiblemente, Ia célula del SMF es un monocito o un macrófago.

A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Muestra el efecto de Ia administración de los macrófagos modificados genéticamente para sobreexpresar NGAL sobre el daño renal. A. Efecto sobre Ia expresión del marcador de daño funcional del riñon BUN. B. Efecto sobre Ia expresión del marcador de daño funcional del riñon creatina. A y B. Datos representados como Ia media +/- SEM; p<0,05; n=5. C. Efecto sobre el daño histológico analizado en secciones de tejido teñidas con hematoxilina-eosina. Magnificación original x 400.

Figura 2. Muestra el efecto de Ia administración de los macrófagos modificados genéticamente para sobreexpresar NGAL sobre Ia proliferación y Ia regeneración renal. A. Efecto sobre Ia expresión del marcador de proliferación y regeneración renal Ki67. B. Efecto sobre Ia expresión del marcador de proliferación y regeneración renal creatina. A y B. Datos representados como Ia media +/- SEM; p<0,05; n=5. C. Efecto sobre Ia expresión de los marcadores regenerativos PCNA y Statmina analizada mediante inmunofluorescencia. El PCNA se caracteriza por una tinción nuclear de las células durante Ia fase G1 tardía y fase S. La Statmina sin embargo es una proteína citosólica que actúa en Ia transición de Ia fase G2 a M (ver flechas). Magnificación original x 400.

Figura 3. Muestra el efecto de Ia administración de los macrófagos modificados genéticamente para sobreexpresar NGAL sobre Ia inflamación. Efecto sobre Ia expresión de las citoquinas pro-inflamatorias TNF-α (A) e IL-1 (B). Efecto sobre Ia expresión de las citoquinas anti-inflamatorias IL-10 (C) e IL-4 (D). A-C. Datos representados como Ia media +/- SEM; p<0,05; n=5. EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar Ia naturaleza de Ia presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a Ia invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran Ia invención sin limitar el campo de aplicación de Ia misma.

EJEMPLO 1. Macrófagos modificados genéticamente para Ia sobreexpresión de NGAL para inducir Ia regeneración en un modelo animal de isquemia-reperfusión renal.

MATERIAL Y MÉTODOS EMPLEADOS

Modelo de isquemia-reperfusión renal

Se utilizaron ratas de Ia cepa Sprague Dawley, machos de un peso aproximadamente de 225-25Og (Charles River, Francia). Todas las intervenciones se realizaron bajo Ia supervisión del comité ético de nuestra institución y siguieron las pautas de Ia Unión Europea. Las condiciones ambientales se mantuvieron constantes, Ia temperatura fue de 21-22°C, Ia humedad relativa del 70% y los ciclos alternativos de luz/oscuridad de 12h. Los animales fueron alimentados con una dieta estándar de pienso AO4 (Panlab, Barcelona) y agua de Ia red de Barcelona ad libitum.

Los animales fueron anestesiados con Isoflurane, se colocaron en posición supina y se mantuvo Ia temperatura corporal entre 36 y 37°C. Después de realizar una laparotomía media para acceder al riñon apartando cuidadosamente el paquete intestinal, se indujo Ia isquemia bilateral mediante el clampaje de ambos pedículos arteriovenosos renales durante 45 minutos con un clamp microvascular no-traumático. Posteriormente se inició el período de reperfusión, con Ia retirada del clamp y se verificó visualmente con Ia observación del regreso del flujo sanguíneo al riñon. A continuación se suturó el animal y se administró Buprex subcutáneo (4,16μg/100g de peso). Animales sujetos a una operación sham fueron utilizados como controles. Durante todo el proceso de operación, los animales fueron bien hidratados y Ia temperatura corporal se mantuvo alrededor de 37°C. Durante el tiempo de reperfusión, los animales se estabularon bajo el control de un veterinario. Pasadas 24h de reperfusión, el animal se sacrificó para Ia extracción de los ríñones y de sangre. El tejido fue conservado inmediatamente en formol para las pruebas histológicas o congelado en nieve carbónica y posteriormente almacenado a - 80 ⁰ C.

Grupos de estudio.

I/R.- Animales sometidos a 45 minutos de isquemia y 24 horas de reperfusión.

I/R NGAL.- Animales sometidos a I/R pero con inyección de 10x10 ⁶ macrófagos genéticamente modificados para expresar NGAL por animal, mediante punción directa de Ia vena cava inferior, 1 hora después del inicio del tiempo de reperfusión. I/R bgal.- Animales sometidos a I/R pero con inyección de 10x10 ⁶ macrófagos con el virus control para expresar Ia β-Galactosidasa por animal, mediante punción directa de Ia vena cava inferior, 1 hora después del inicio del tiempo de reperfusión.

Sham NGAL.- Animales control, no sometidos a isquemia/reperfusión y con administración de 10x10 ⁶ macrófagos modificados genéticamente para expresar NGAL por animal.

Sham bgal.- ídem que SHAM NGAL, pero con inyección de macrófagos con el virus control para expresar Ia β-Galactosidasa. Cultivo celular de macrófagos primarios derivados de Ia medula ósea, transfección viral y posterior infusión al animal.

Células derivadas de Ia medula ósea de ratas Sprague Dawley fueron recogidas mediante Ia aspiración de los fémures y se cultivaron en Dulbecco's

Modified Eagle Médium (DMEM):F-12 1 :1 (volumen/volumen) con concentración alta de glucosa, 15mM Hepes y glutamina estable, suplementado con 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml estreptomicina, 10%

(volumen final) suero bovino fetal inactivado, y 10ng/ml del factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF) (Invitrogen, Barcelona).

Las células se mantuvieron en flascones de teflón, no adherentes, durante 7 días para Ia maduración a macrófagos.

Posteriormente, los macrófagos fueron separados mediante adherencia diferencial. Las células se mantuvieron en una atmósfera con 5% CO2 en aire, a 37°C.

Para Ia transfección viral, 10x10 ⁶ células fueron transfectadas con un adenovirus para sobreexpresar el NGAL (Ad-NGAL; producido y purificado por Viraquest, USA). Como virus control utilizamos un vector similar para Ia expresión de β-Galactosidasa (Ad-bgal), que fue producido en células HEK 293 y purificado por gradiente de cloruro de cesio. El título de cada virus fue determinado mediante análisis en placa en células HeLa. La eficiencia de cada transfección fue medida mediante Ia determinación de proteína por ELISA en el sobrenadante del cultivo celular. La transfección viral se estableció con una multiplicidad de infección (MOI) de 50. A las 48 horas post-transfección, los macrófagos fueron recogidos en un tubo y se mantuvieron en PBS hasta su posterior infusión en el animal. Marcadores de daño funcional del riñon.

Nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina en plasma fueron analizados como marcadores de función renal utilizando un ADVIA 2400 (Siemens Medical Diagnostics) del Hospital Clínico de Barcelona.

Análisis histológico.

Las muestras fueron incluidas en parafina, cortadas en secciones de 4μm, y teñido con hematoxilina y eosina (H&E). Evaluación del daño histológico fue determinado mediante microscopía convencional.

Inmunofluorescencia de los marcadores regenerativos PCNA y Statmina.

Todas las muestras se fijaron en formaldehído al 4% y posteriormente se incluyeron en parafina. Se realizaron cortes de 4μm que fueron lavados en xilol, y deshidratados mediante alcoholes de graduación decreciente, con lavado en PBS y posterior bloqueo de uniones inespecíficas con suero de cabra durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente se incubaron las muestras con PCNA (Santa Cruz Biotechnology) y Statmina (Calbiochem) para detectar Ia regeneración en el tejido renal. Las muestras se incubaron con anticuerpos fluorescentes secundarios para revelar Ia tinción con PCNA y Statmina en el tejido (rabbit anti-goat IgG conjugado con Alexa Fluor 488 para Statmina y goat anti-mouse IgG conjugado con Alexa Fluor 568 para PCNA; Molecular Probes) durante dos horas a temperatura ambiente en oscuridad. Los cortes fueron montados con mowiol (Calbiochem) y las imágenes se obtenían mediante un microscopio confocal láser Leica TCS NT (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) a una magnificación original de x400. RT-PCR a tiempo real.

El RNA de las muestras de riñon fue extraído mediante el reactivo TRIzol de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Barcelona). Se extrajo el RNA total de las células con el RNeasy mini Kit de Qiagen (Madrid) acorde a las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de RNA fueron calculadas por determinación de absorbancia a 260 nm. La integridad del RNA así obtenido se examinó mediante análisis de las bandas de RNA ribosomal 18S y

28S detectado y analizado en el Bioanalyzer del Hospital Clínico Barcelona (Agilent).

La expresión de los genes analizados se midió mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real normalizada con el gen constitutivo (o houskeeping, en inglés) de gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Las RT-PCRs a tiempo real se llevaron a cabo en un Termociclador Bio-Rad (iCycler iQ Real-Time PCR detection System, Bio-Rad, Barcelona) y las amplificaiones se hicieron en reacciones de 20 μl con el RT-PCR Kit con SYBR-Green en dos pasos (Bio- Rad) según las instrucciones del fabricante. Los primers fueron los siguientes: Ki-67: directo, SEQ ID NO: 5; inverso, SEQ ID NO: 6; PCNA: directo, SEQ ID NO: 7; inverso, SEQ ID NO: 8; NGAL: directo, SEQ ID NO: 9; inverso, SEQ ID NO: 10; TNF-a: directo, SEQ ID NO: 11 ; inverso, SEQ ID NO: 12; GAPDH: directo, SEQ ID NO: 13; inverso, SEQ ID NO: 14. Los datos de las demás citoquinas (IL-1, IL-10, ÍL-4) fueron obtenidas usando primers pre-validados de Qiagen (Barcelona, España) con los números de referencia QT00181657, QT00106169 y QT00160678, respectivamente.

ELISA de NGAL.

El sobrenadante de las células fue recogido, centrifugado y guardado a -80 ⁰ C hasta su uso. La placa de ELISA de 96 pocilios se preincubó con Anti-mouse

Lipocalin-2/NGAL (R&D Systems, Madrid), mediante Ia adición de 1 μl de Ia solución madre del anticuerpo, diluido en 99μl de tampón carbonato 1 :100 durante 18 horas a 4 ⁰ C. Tras lavado de Ia placa, se bloquearon las uniones inespecíficas durante 1 h a temperatura ambiente.

Se añadieron 50μl_ de cada muestra a Ia placa de ELISA y se mantuvieron 1 hora a temperatura ambiente., Tras otro lavado, se añadieron 100 μl de un anticuerpo de detección biotiniliado, Anti-Mouse Lipocalin-2/NGAL (R&D Systems, Madrid), obtenido tras dilución de 1 μl de Ia solución madre en 99 μl de tampón de dilución 1 :100. El anticuerpo biotinilado se incubó durante 1 h a temperatura ambiente.

Posteriormente se añadieron 100 μl de avidina HRP-conjugada (Zymed, Invitrogen, Barcelona), obtenida tras dilución de 1 μl de Ia solución madre en 1999 μl de tampón de dilución 1 :2000. Se incubó durante 1 h a temperatura ambiente, para reconocer Ia unión del anticuerpo biotiniliado.

Finalmente se aplicó el agente colorante (OPD tablets, Dako, Barcelona) para medir Ia absorbancia a 492 nm.

Análisis estadístico.

Los datos se muestran como media +/- el error estándar de Ia media (SEM), y los valores de p>0,05 se consideraron significativos. Las diferencias estadísticas entre grupos se analizaron con un análisis de varianza (ANOVA), y en caso de significancia se aplicó Ia t-Student.

RESULTADOS OBTENIDOS.

Efecto de Ia administración de los macrófaqos modificados genéticamente para sobreexpresar NGAL sobre el daño renal.

Como se observa en Ia figura 1A, el nitrógeno ureico en sangre (BUN), marcador de daño renal funcional, se incrementa significativamente en el grupo de isquemia-reperfusión. Sin embargo, al administrar macrófagos genéticamente modificados para sobreexpresar NGAL se observa un descenso significativo de este parámetro de daño. En ninguno de los grupos a los que se administró macrófagos transfectados con el virus control (Sham bgal; I/R bgal) se pudo detectar ningún efecto protector respecto a sus respectivos controles (Sham; I/R). Los datos se muestran como media +/- SEM, y los valores de p>0,05 se consideraron significativos. Las diferencias estadísticas entre grupos se analizaron con un análisis ANOVA, y en caso de significancia se aplicó Ia t-Student.

Como se observa en Ia figura 1 B, Ia creatinina en sangre, marcador de daño renal funcional, se incrementa significativamente en el grupo de isquemia- reperfusión. Sin embargo, al administrar macrófagos genéticamente modificados para sobreexpresar NGAL se observa un descenso significativo de este parámetro de daño. En ninguno de los grupos a los que se les administró macrófagos transfectados con el virus control (Sham bgal; I/R bgal) se pudo detectar ningún efecto protector respecto a sus respectivos controles (Sham; I/R). Los datos se muestran como media +/- SEM, y los valores de p>0,05 se consideraron significativos. Las diferencias estadísticas entre grupos se analizaron con un análisis ANOVA, y en caso de significancia se aplicó Ia t- Student.

El análisis histológico de cortes del tejido renal (figura 1C) revela que el área más afectada se encuentra en Ia médula del riñon. A las 24 horas de reperfusión se observa edema intersticial grave, infiltración de células, necrosis, y Ia deposición de material proteico en el lumen tubular. Sin embargo, el tratamiento con macrófagos previamente modificados para sobreexpresar el NGAL preserva Ia integridad del tejido renal. Los macrófagos tratados con el virus control no tienen este efecto protector y se observa un grado de daño parecido a las 24 horas de reperfusión. En Ia figura 1C se muestran fotos representativas de los tres grupos principales (Sham; I/R; I/R NGAL). Efecto de Ia administración de los macrófagos modificados genéticamente para sobreexpresar NGAL sobre Ia proliferación y Ia regeneración.

En Ia figura 2A se muestra Ia expresión de Ki-67, marcador de proliferación celular y regeneración que se expresa durante todas las fases del ciclo celular, excepto GO. Los resultados de Ia RT-PCR a tiempo real muestran que a las 24 horas de reperfusión no se expresa Ki-67 en las células epiteliales tubulares del riñon y por Io tanto no hay regeneración en este tiempo en que las células probablemente están muriendo por apoptosis inducida por Ia isquemia- reperfusión. Al contrario, al administrar macrófagos sobreexpresando el NGAL detectamos un aumento significativo de Ia proliferación celular en el tejido y por Io tanto una avanzada regeneración al tiempo de 24 horas de reperfusión. Los macrófagos tratados con el virus control no tuvieron Ia capacidad de inducir Ia proliferación en el tejido renal Io que nos indica que es el NGAL el responsable de promover Ia regeneración renal. Los datos se muestran como media +/- SEM, y los valores de p>0,05 se consideraron significativos. Las diferencias estadísticas entre grupos se analizaron con un análisis ANOVA, y en caso de significancia se aplicó Ia t-Student.

En Ia figura 2B se muestra Ia expresión de PCNA (proliferating cell nuclear antigen), marcador de proliferación celular y regeneración que tiene un pico de expresión en Ia fase S del ciclo celular, y por Io tanto en células mitóticamente activas. Los resultados de Ia RT-PCR a tiempo real muestran que solo se encuentra sobreexpresado en el grupo de macrófagos sobreexpresando NGAL. Los datos se muestran como media +/- SEM, y los valores de p>0,05 se consideraron significativos. Las diferencias estadísticas entre grupos se analizaron con un análisis ANOVA, y en caso de significancia se aplicó Ia t- Student.

La figura 2C muestra el perfil de regeneración mediante inmunofluorescencia de PCNA y Statmina. Recientemente, Ia Statmina se ha descubierto como nuevo marcador de proliferación en Ia reparación tras un insulto agudo por isquemia renal. Es una fosfoproteína citosólica y está asociada a Ia inducción de proliferación y Ia reentrada de células en el ciclo celular. El PCNA sin embargo interactúa con diversas moléculas, y afecta al metabolismo celular, a los mecanismos de reparación del DNA y a su síntesis. Detectamos mediante miscroscopía confocal que el tratamiento con macrófagos sobreexpresando Ia NGAL efectivamente inducen tanto las expresión de PCNA como de Statmina a un nivel muy alto. Estas observaciones confirman el papel clave de Ia NGAL en Ia inducción de Ia regeneración renal. Al contrario, cuando administramos macrófagos transfectados con el virus control, no se detecta ningún efecto sobre Ia proliferación celular y los niveles de expresión de PCNA y Statmina se parecen al grupo de 24 horas de reperfusión.

Efecto de Ia administración de los macrófagos modificados genéticamente para sobreexpresar NGAL sobre Ia inflamación.

La figura 3 muestra los resultados de RT-PCR que indican Ia expresión de citoquinas tanto pro- como antiinflamatorias tras el tratamiento con macrófagos genéticamente modificadas con Ad-NGAL. Los resultados muestran una disminución de citoquinas proinflamatorias, representadas por TNF-α e IL-1 , cuando administramos macrófagos tratados con el virus portador de NGAL (en los animales del grupo I/R NGAL) comparado con los niveles de inflamación a las 24 horas de reperfusión en los animales no tratados (I/R) o tratados con el virus control (I/R bgal). Al contrario, las citoquinas antiinflamatorias, representadas por IL-10 e IL-4, muestran un aumento tras el tratamiento con macrófagos que sobreexpresan NGAL. Por Io tanto podemos deducir un efecto protector y antiinflamatorio con el tratamiento de macrófagos genéticamente modificados y el papel clave de NGAL en estos procesos. Los datos se muestran como media +/- SEM, y los valores de p>0,05 se consideraron significativos. Las diferencias estadísticas entre grupos se analizaron con un análisis ANOVA, y en caso de significancia se aplicó Ia t-Student.