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Title:
MULTIFUNCTIONAL LIPOSOMES, COMPOSITIONS, USES AND METHODS FOR PREPARING SAME
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2020/215136
Kind Code:
A1
Abstract:
The present patent application relates to multifunctional liposomes comprising ingredients with antimicrobial, anti-inflammatory and antioxidant activity. The aforementioned liposomes are active against Cutibacterium acnes, for example. Compositions comprising such liposomes, such as gel, cream, gel-cream and lotion, the method for producing the liposomes and the medical, cosmetic and veterinary uses thereof also form part of the scope of this application.

Inventors:
HENNIES PAULO DE TARSO (BR)
Application Number:
BR2020/050049
Publication Date:
October 29, 2020
Filing Date:
February 19, 2020
Export Citation:
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Assignee:
FUND DE AMPARO A PESQUISA DO ESTADO DE SAO PAULO FAPESP (BR)
International Classes:
A61K9/127; A61K31/20; A61P17/10
Domestic Patent References:
WO2007142548A22007-12-13
WO2011112883A12011-09-15
Foreign References:
CA2120511A11994-02-17
Other References:
FARKUH, LAURA: "Estudo e desenvolvimento de lipossomas com potencial para aplicação em base cosmetica", DISSERTAÇÃO (MESTRADO, 2015, Sao Paulo, pages 88p
DARREN YANG ET AL.: "The antimicrobial activity of liposomal lauric acids against Propionibacterium acnes", BIOMATERIALS, vol. 30, 2009, pages 6035 - 6040, XP026524669, DOI: 10.1016/j.biomaterials.2009.07.033
ESHTIAGJI M. N. ET AL.: "Formulation of anti acne cream containing natural antimicrobials", INT. RES. J. PHARM., vol. 4, no. 11, 2013, pages 20 - 25, XP002764227, DOI: 10.7897/2230-8407.041105
CHUN-MING HUANG ET AL.: "Eradication of drug resistant Staphylococcus aureus by liposomal oleic acids", BIOMATERIALS, vol. 32, 2011, pages 214 - 221, XP027493706, DOI: 10.1016/j.biomaterials.2010.08.076
WEN-CHENG HUANG ET AL.: "Anti-bacterial and anti- inflammatory properties of capric acid against Propionibacterium acnes: A comparative study with lauric acid", JOURNAL OF DERMATOLOGICAL SCIENCE, vol. 73, 2014, pages 232 - 240
CHI-HSIEN LIU ET AL.: "In Vitro Anti- Propionibacterium Activity by Curcumin Containing Vesicle System", CHEM. PHARM. BULL., vol. 61, no. 4, 2013, pages 419 - 425, XP055107402, DOI: 10.1248/cpb.c12-01043
Attorney, Agent or Firm:
GALVÃO, Leonor Magalhães Peres (BR)
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Claims:
REIVINDICAC ES

1. Lipossoma unilamelar caracterizado pelo fato de compreender um ácido graxo com ação antimicrobiana e/ou anti- inflamatória em uma concentração entre 0,08% e 0,75% e possuir diâmetro médio entre 90nm e 300nm.

2. Lipossoma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de apresentar polidispersidade na faixa de 0,01 a 0,30.

3. Lipossoma, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é o ácido láurico .

4. Liposssoma, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que também pode compreender acetato de tocoferol e Biosaccharide Õum-2.

5. Processo de produção de lipossomas, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(a) solubilização do ácido graxo e demais componentes lipidicos, ou oleosos, em um ou mais solventes lipofílicos;

(b) alcalinização da fase lipidica com uma solução de um agente alcalinizante; e

(c) adição da mistura da fase lipidica e agente alcalinizante a uma fase aquosa.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é o ácido láurico .

7. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a solução de agente alcalinizante compreende uma solução aquosa de hidróxido de sódio .

8. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a fase aquosa compreende água desmineralizada ou uma solução tampão com pH 6,0 a 7,5.

9. Composição caracterizada pelo fato de que compreende lipossoma conforme definido nas reivindicações de 1 a 3 e um veiculo cosmético, farmacêutico e/ou veterinário aceitável.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de ser na forma de um gel, creme, gel-creme ou uma loção.

11. Uso de ácido láurico caracterizado pelo fato de ser para preparação de um lipossoma conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

12. Uso de um lipossoma conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 caracterizado pelo fato de ser no preparo de uma composição para tratar e/ou prevenir problemas dermatológicos.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de o problema dermatológico ser acne, psoriase, dermatite atópica, envelhecimento da pele, seborreia (caspa) , alopecia, mau odor corporal ou bucal, infecção microbiana, ou desbalanço da microbiota cutânea .

14. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o problema dermatológico é causado por bactérias, fungos, bolores e/ou leveduras, como p. ex. Cutibacterium acnes (Propionibacterium acne) , Staphylococcus aureus, Malassezía furfur, Corineumbacterium spp. , Trichophyton spp., entre outros.

Description:
"LIPOSSOMAS MULTIFUNCIONAIS, COMPOSIÇÕES, USOS E PROCESSOS PARA A PREPARAÇÃO DOS MESMOS"

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] O presente pedido de patente se refere a lipossomas multifuncionais compreendendo ácidos graxos com atividades antimicrobiana, anti-inflamatória e antioxidante . Tais lipossomas são adequados para o tratamento dermatológico, seja médico, cosmético ou veterinário e são veiculados em composições cosméticas e/ou farmacêuticas. O uso de ácidos graxos para preparação dos lipossomas e respectivo processo de preparação são também descritos.

ESTADO DA TÉCNICA

[002] Ácidos graxos fazem parte de uma classe de agentes antimicrobianos de amplo espectro capazes de atuar na membrana microbiana, sendo por isso considerados como compostos com baixo potencial de desenvolvimento de cepas resistentes, ao contrário do que acontece com os antibióticos convencionalmente utilizados no tratamento de infecções bacterianas e fúngicas. Eles representam uma parcela significativa dos lipídios antimicrobianos reconhecidos como componentes naturais do sistema imune do corpo humano.

[003] Entretanto, a aplicação dos ácidos graxos em produtos para o tratamento cosméticos ou farmacêutico da pele e de mucosas corporais é limitada pela característica hidrofóbica destes compostos, a qual dificulta sua veiculação e disponibilização no sítio biológico alvo.

[004] Para a sua incorporação em produtos dermatológicos tópicos, é necessário o uso de agentes tensoativos, e/ou de solventes orgânicos ou oleosos. Neste aspecto, a incorporação de ácidos graxos em formulações nanotecnológicas , como lipossomas, representa uma alternativa para aproveitar sua potente ação antimicrobiana e melhorar suas propriedades farmacológicas, viabilizando e otimizando a sua veiculação e entrega, conforme apresentado por JACKMAN et al . (JACKMAN, J.A. et al . , "Nanotechnology formulations for antibacterial free fatty acids and monoglycerides", Molecules, v.21, n.305, p.1-9, 2016). Também nesse sentido, o desenvolvimento de sistemas nanoparticulados para a encapsulação, direcionamento preferencial ao sitio biológico na pele e a liberação modificada de substâncias capazes de atuar contra um ou mais fatores causadores da acne representa uma abordagem inovadora e muito promissora para o tratamento da pele acneica .

[005] Atualmente são relativamente poucos os relatos de lipossomas com ação antimicrobiana para aplicações terapêuticas e/ou cosméticas, não existindo nenhum produto envolvendo lipossomas na qual o ingrediente ativo antimicrobiano seja o ácido láurico. As únicas referências bibliográficas identificadas em que há a descrição da preparação e da avaliação de eficácia de lipossomas contendo ácido láurico como agente antimicrobiano contra a bactéria Cutibacterium acnes (até recentemente denominada como Propionibacterium acnes), são os artigos científicos publicados por um grupo de pesquisas dos Estados Unidos (YANG, D. et al . , "The antimicrobial activity of liposomal lauric acid against Propionibacterium acnes." Biomaterials, v .30 , p. 6035-6040, 2009; PORNPATTANANANGKUL, D. et al . , "In vivo treatment of Propionibacterium acnes infection with liposomal lauric acids." Advanced Healthcare Materials, v. 2, n. 10, p. 1322-1328, 2013) . Paralelamente, um outro grupo de pesquisas de Taiwan, associado a este grupo americano, relatou estudo de lipossomas de ácido oleico para o controle da bactéria Staphylococcus aureus (HUANG, W.-C., et al . , "Eradication of drug resistant Staphylococcus aureus by liposomal oleie acids." Biomaterials, v. 32, p. 214-221, 2011) . O processo utilizado nos trabalhos relatados por YANG et al. (2009); e PORNPATTANANANGKUL et al . (2013) envolveu a formação do filme lipidico seco, seguido pela sonicação de dispersão lipidica em um banho ultrassónico para a produção de vesículas muitilamelares (MLVs) . Posteriormente, a suspensão de MLVs foi sonicada através de um probe de titânio para produzir vesículas unilamelares pequenas (SUVs) . E, finalmente, a suspensão de vesículas unilamelares pequenas (SUVs) foi submetida a 11 ciclos de extrusão através de membrana com diâmetro de poro definido (lOOnm) para gerar lipossomas unilamelares grandes (LUVs) . Em comparação com o processo acima descrito, cujo escalonamento é praticamente inviável, o processo de produção de lipossomas unilamelares grandes (LUVs) descrito no presente pedido de patente representa uma inovação tecnológica substancial, por ser muito mais simples, rápido e, principalmente, facilmente escalonável para a produção piloto ou industrial dos lipossomas .

[006] Em um outro estudo, é relatada a atividade anti- inflamatória dos ácidos cáprico e láurico na pele (HUANG, W.-C., et al . , "Anti-bacterial and anti-inflammatory properties of capric acid against Propionibacterium acnes : a comparative study with lauric acid." Journal of Dermatological Science, v. 73, p. 232-240, 2014) . Os autores descrevem preliminarmente as bases moleculares para a ação anti-inflamatória destes dois ácidos graxos em células monocíticas THP-1 estimuladas pela C. acnes. De uma forma mais ampla, é relatado que os ácidos graxos livres exercem um papel relevante no sistema imune humano, particularmente na defesa das superfícies da pele e das mucosas corporais, sendo que existem de 10 mg a 15mg de ácidos graxos livres por centímetro quadrado da pele humana, entre os quais encontram-se os ácidos láurico, mirístico, palmítico, sapienico e cis-8-octadecanóico (DESBOIS, A.P., SMITH, V.J., "Antibacterial free fatty acids : activities, mechanisms of action and biotechnological potential." Appl . Microbiol. Biotechnol . , v. 85, p. 1629-42, 2010) .

[007] No pedido de patente WO2007142548 (CONSTANTINO, L.F.P., et al . "Vesicular formulations containing organic acid prodrugs, process for their preparation, new prodrugs, pharmaceutical compositions and method for the treatment of tuberculosis and other mycobacteriosis" . Universidade de Lisboa, Portugal. PCT - WO 2007/142548, 13/12/2007.) é descrita a preparação de formulações lipossomais para a aplicação farmacêutica no tratamento da tuberculose e de outras infecções micóticas ou bacterianas, caracterizada pela presença de um ou mais ácidos orgânicos fracos, incluindo ácidos graxos e seus ésteres derivados. Ela reivindica formulações vesiculares contendo pró-drogas de ácidos orgânicos, o processo de sua preparação, novas pró- drogas, composições farmacêuticas e método para o tratamento de tuberculose e de outras micobacterioses . Porém não se refere a qualquer aplicação tópica para o tratamento cosmético ou farmacêutico da pele ou de mucosas oral ou vaginal. O processo reivindicado da preparação dessas formulações envolve a esterificação dos ácidos orgânicos, a solubilização dos componentes lipidicos em um solvente apropriado, a remoção do referido solvente por evaporação ou liofilização, seguida pela hidratação do produto obtido, não havendo qualquer indicação sobre o tamanho e a lamelaridade dos lipossomas obtidos, que são aspectos críticos para a sua aplicação cosmética e farmacêutica, e que, portanto, fica sem ser esclarecido.

[008] O pedido de patente CA2120511 (MIKLOS, G. et al . , "Pharmaceutical and/or cosmetic composition and the use thereof." Rhône-Poulenc Rorer Gmbh, Alemanha. CIPO - CA 2120511, 17/02/1994) descreve uma composição farmacêutica e/ou cosmética para uso tópico contendo ácido graxo, composta de ao menos um ingrediente ativo e um carreador lipossomal para a penetração do ingrediente ativo na pele, onde o referido ingrediente ativo é o ácido linoleico e/ou ao menos um composto dele derivado. A esta composição podem ser associados outros ingredientes ativos, como ácido azeláico, eritromicina e ácido retinóico. E reivindica o uso da supracitada composição para a prevenção e/ou tratamento da acne e/ou de alterações a ela relacionadas.

[009] O pedido de patente BRPI0805754-0 (MARTINS, M.H., PESSINE, F.B.T., "Composição farmacêutica compreendendo isotretinoina lipossomal e processo para a preparação da mesma." UNICAMP, Brasil. INPI - BR PI 0805754 (A2), 14/09/2010) descreve uma composição farmacêutica para uso dermatológico que compreende isotretinoina encapsulada em lipossomas destinada ao tratamento tópico de desordens da pele, como acne, psoriase e fotoenvelhecimento, mas não referencia o uso de ácidos graxos como ingrediente ativo antimicrobiano na formulação lipossomal.

[010] No caso do tratamento da acne vulgar, atualmente o agente antimicrobiano de referência é o peróxido de benzoila, cujo uso no Brasil é restrito a formulações farmacêuticas (seu uso não é permitido em produtos cosméticos) . Assim como os ácidos graxos, o peróxido de benzoila é considerado de baixo potencial de desenvolvimento de cepas bacterianas resistentes. Porém, devido à elevada capacidade alvejante deste ingrediente ativo, o seu uso pode provocar manchas na roupa dos usuários, o que é considerado um problema tecnológico ainda não solucionado. Antibióticos clássicos, como clindamicina e eritromicina, também são utilizados no tratamento da acne, apesar da sua propensão em gerar resistência bacteriana a médio e longo prazo. [011] Lipossomas podem ser produzidos através de diversos métodos de preparação. Em função do método utilizado, as vesículas lipossomais geradas podem apresentar tamanho médio variando desde algumas poucas dezenas de nanômetros até alguns micrômetros. Em termos do número de bicamadas lipídicas, ou lamelas, os lipossomas podem apresentar-se como vesículas unilamelares , quando há apenas uma única bicamada lipídica lipossomal encapsulando o cerne aquoso, ou então apresentar-se como vesículas multilamelares, quando duas ou mais lamelas estão presentes. Lipossomas com tamanho médio na faixa de 25 nm até lOOnm são classificados como pequenos, enquanto aqueles com tamanho médio superior a lOOnm são classificados como lipossomas grandes.

[012] Os métodos mais amplamente utilizados para a preparação de lipossomas, como o da hidratação do filme lipídico seco ou o da injeção da fase lipídica em uma fase aquosa, normalmente resultam na obtenção de lipossomas multilamelares grandes. Tais características de lamelaridade e de tamanho podem ser, posteriormente, modificadas através do emprego de outros processos, como a homogeneização sob alta pressão, a extrusão da suspensão lipossomal através de membrana com diâmetro de poro definido e uniforme, ou pela sua sonicação, possibilitando a obtenção de lipossomas unilamelares com redução de seus tamanhos médios.

[013] Um processo para a preparação de lipossomas unilamelares, baseado na injeção através de um bocal (nozzle de 0,1 mm a 10,0 mm de diâmetro), sob pressão, de uma solução etanólica dos componentes lipídicos e ingrediente ativo lipofílico (vazão de 1 mL a 1.000 mL por minuto), em uma fase aquosa sob agitação intensa (1.500 rpm a 20.000 rpm), em homogeneizador, é descrito na patente EP0253619 BI (BOLLER, F.H., "Method of preparing single bilayered liposomes." CILAG LTD . , Suíça. EPO - EP 0253619, 15/01/1992) . O referido agente hidrofilico é um ativo antifúngico (econazol, terconazol ou miconazol), e/ou um anti-inflamatório não esteroidal (prostaglandina) . Porém persiste aqui o problema tecnológico de uso de etanol em concentrações significativas (em torno de 5% a 10%), que é indesejável no caso de produtos para uso tópico na pele oleosa com tendência à acne, ou de peles ressecadas, especialmente aquelas cuja barreira cutânea está comprometida, como no caso da dermatite atópica e psoriase, que foi devidamente considerado no processo ora revelado, na qual os lipossomas concentrados (até 50mM de lipídios) são produzidos com até 5% de concentração de etanol, o que permite se obter concentração de etanol no produto cosmético final igual ou inferior a 1,25%. Além disso, o processo descrito na patente EP0253619 BI (BOLLER, F.H., "Method of preparing single bilayered liposomes." CILAG LTD., Suíça. EPO - EP 0253619, 15/01/1992) utiliza um homogeneizador, equipamento imprescindível para a execução da produção dos lipossomas neste caso, enquanto na preparação dos lipossomas multifuncionais objeto do presente pedido de patente não se faz necessário o uso deste equipamento para a geração de lipossomas unilamelares .

[014] O pedido de patente W02003077861 A2 (SKÕLD, T. "Water-based delivery systems." Collagenex Pharmaceuticals, Inc. , Estados Unidos. PCT - WO 2003/077861, 13/03/2002) descreve um sistema vesicular para a entrega modificada de ingredientes ativos capaz de proporcionar a restauração da barreira no estrato córneo, no qual ácidos graxos estão presentes na composição lipídica da bicamada, juntamente com fosfolipídios, ceramidas e colesterol. Neste caso, entretanto, a função do ácido graxo na composição e na aplicação final reivindicada não envolve a sua atividade antimicrobiana ou anti-inflamatória cutânea, sendo descrita a utilização de outros compostos ativos para as diferentes finalidades terapêuticas tópicas reivindicadas, inclusive para o tratamento da acne.

[015] O invento aqui descrito envolve o uso de um ácido graxo, especificamente o ácido láurico, veiculado em lipossomas para aplicações dermatológicas tópicas, cosméticas e/ou farmacêuticas e/ou veterinárias, associado a ingredientes ativos complementares com ação anti- inflamatória e antioxidante . O uso de ácido láurico como agente antimicrobiano e anti-inflamatório cutâneo apresenta a vantagem de não indução de resistência bacteriana, como os relatados para os antibióticos convencionais, como p. ex . clindamicina e eritromicina . Por outro lado, o ácido láurico pode ser utilizado em substituição ao peróxido de benzoila, com a vantagem de não apresentar ação alvejante (não mancha as roupas ou o cabelo) , não expor a pele humana ou animal a radicais livres, e de poder ser usado em menores concentrações. Além disso, os lipossomas com ácido láurico podem ser usados sobre toda a superfície da pele visando a prevenção e o tratamento da acne vulgar, sendo esta uma outra vantagem sobre o uso do peróxido de benzoila.

[016] Um problema amplamente conhecido no estado da técnica, e ao menos parcialmente superado pelas invenções ora reveladas, trata-se da irritação cutânea causada por ácidos graxos em geral, especialmente o ácido láurico, classificado na categoria 3 de irritação cutânea de acordo com a Classificação GHS . Tal problema é minimizado pela diluição suficiente do ácido láurico conforme descrição detalhada a seguir. Tal diluição permite a manutenção das atividades e propriedades desejadas, por exemplo antimicrobianas , sem a ocorrência de irritação cutânea significativa. [017] Comparado a outros agentes antimicrobianos vegetais, como alguns óleos essenciais, p. ex . óleo essencial de melaleuca, a vantagem de se usar o ácido graxo reside no fato dele ser um composto único (uma substância apenas), sem potencial alergênico, ao contrário dos óleos essenciais, compostos por inúmeras substâncias, algumas das quais reconhecidamente envolvidas em processos alérgicos quando aplicadas topicamente em humanos. A veiculação de ácidos graxos, especialmente do ácido láurico em lipossomas representa uma alternativa muito promissora, pois minimiza o teor de compostos lipidicos na formulação galênica, especialmente importante no caso de sua aplicação para o tratamento cosmético da pele oleosa com tendência à acne. Ainda, o ácido láurico comprovadamente apresenta atividade anti-inflamatória na pele, como descrito por HUANG e colaboradores (HUANG, W.-C., et al . , "Anti-bacterial and anti-inflammatory properties of capric acid against Propionibacterium acnes : a comparative study with lauric acid." Journal of Dermatological Science, v. 73, p. 232-240, 2014) .

[018] Além disso, a forma de veiculação via lipossomal permite associar outros ingredientes ativos complementares, necessários para o adequado tratamento de diferentes problemas da pele e/ou de mucosas corporais. E também, dada a interação dos lipossomas com o cimento intercelular do estrato córneo, é possível o acúmulo parcial dos ingredientes ativos nesta estrutura (efeito reservatório) , possibilitando a ação de tais ingredientes na pele ao longo de um maior período de tempo, além de favorecer a recuperação e/ou melhoria da função de barreira da pele. O agente antimicrobiano e anti-inflamatório ácido láurico isoladamente, ou associado com compostos que apresentam atividades anti-inflamatória e/ou antioxidante complementares, veiculado em uma formulação lipossomal, permite que esta composição seja utilizada para a prevenção e/ou o tratamento de acne vulgar, de psoriase, de dermatite atópica, do envelhecimento da pele, da seborreia (caspa) , da alopecia, do mau-odor corporal ou bucal, e de infecções microbianas oportunistas, dado que o espectro da ação antimicrobiana do ácido láurico é amplo, apresentando atividade antimicrobiana também contra a bactéria patogênica Staphílococcus aureus (NAKATSUJI, T. et al., "Antimicrobial property of lauric acid against Propionibacterium acnes : its therapeutic potential for inflammatory acne vulgaris." J. Invest. Dermatol . , v.129, p. 2480-2488, 2009) e, portanto, não se restringindo apenas à C. acnes. Desta forma, a formulação lipossomal desenvolvida pode ter uma gama maior de aplicações, contribuindo na manutenção da microbiota cutânea normal como forma de prevenção e/ou de tratamento de diferentes problemas dermatológicos associados ao desbalanço da microflora cutânea. Outra vantagem dos lipossomas ora escritos é o processo mais simples de produção dos mesmos, que envolve a injeção de uma fase oleosa, - na qual o solvente principal pode ser um álcool, especificamente o etanol, e/ou um poliol, um poli-éster de poliol ou um poli-éter de poliol, como p. ex . polietileno-glicol ou glicerol, mais especificamente o propilenoglicol , em uma fase aquosa sob agitação em agitador convencional. E a sua composição pode apresentar um teor de álcool etílico na suspensão lipossomal que pode variar desde 4,5% até 21% (m:m) , possibilitando a obtenção de formulações cosméticas e/ou farmacêuticas e/ou veterinárias finais com teores de etanol variando desde 0, 1% (ou inferior) até 20% (m:m) .

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[019] Foram desenvolvidos lipossomas unilamelares grandes ("Large Unilamellar Vesicles" - LUV) compreendendo ingredientes com atividades antimicrobiana, aplicáveis na prevenção e no tratamento cosmético tópico da acne leve a moderada. Tais lipossomas são estáveis em pelo menos uma base cosmética, como gel, creme, gel-creme e loção.

[020] A produção dos lipossomas foi realizada pelo processo de injeção da fase lipidica em uma fase aquosa, com adequado controle do fluxo da fase lipidica e uso de agitação mecânica convencional (haste centrífuga) , obtendo-se uma suspensão lipossomal estável, de elevada concentração lipidica e baixa concentração de etanol.

[021] Os referidos LUV são úteis, por exemplo, contra Cutibacterium acnes, e têm ação anti-inflamatória e antioxidante . Seus usos médicos, cosméticos e veterinários, bem como métodos relacionados são também parte da invenção.

DE CR ÇÃO DAS FIGURAS

[022] FIGURA 1: Dados de SAXS para a amostra de lipossomas preparados com fos fatidilcolina de soja não hidrogenada (Lipoid S75 ® ) , diluída a 20mM de lipídios totais. Os pontos experimentais estão representados pelos círculos abertos enquanto a linha contínua corresponde ao ajuste.

[023] FIGURA 2: Perfil de densidade eletrónica obtido a partir do ajuste da curva experimental mostrada na Figura 1.

[024] FIGURA 3: Comparação entre as curvas de SAXS de · lipossomas preparados com fosfatidilcolina de soja (Lipoid S75®) e A lipossomas preparados com fosfatidilcolina de soja hidrogenada Phospholipon 80H®.

[025] FIGURA 4: Comparação entre as curvas de SAXS de lipossomas multifuncionais de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (Phospholipon 80H®) , obtidas sob concentrações lipídicas totais de 50mM, 25mM e 12,5mM.

[026] FIGURA 5: Comparação do efeito inibitório sobre o crescimento da C. acnes pela ação dos lipossomas multifuncionais, do ácido láurico isoladamente e do ingrediente antimicrobiano de referência peróxido de benzoila .

[027] FIGURA 6: Comparação do efeito inibitório contra a C. acnes do gel lipossomal, do gel-placebo e dos lipossomas multifuncionais de ácido láurico. (OBS. 1: O gel lipossomal refere-se ao gel cosmético contendo 25% de suspensão de lipossomas multifuncionais com elevada concentração relativa de ácido láurico, preparados com lecitina de soja hidrogenada, conforme descrito na Tabela 8; OBS .2 : O gel placebo, sem ácido láurico, foi empregado nas mesmas quantidades do gel lipossomal; para fins de comparação, sua concentração foi referenciada no gráfico como a correspondente à concentração de ácido láurico presente em igual volume do gel lipossomal) .

[028] FIGURA 7: Avaliação da atividade antioxidante dos lipossomas (LF) através da porcentagem de inibição da peroxidação lipidica de ácido araquidônico devido à presença de lipossomas (com ou sem sacarideos) .

[029] FIGURA 8: Avaliação da ação anti-inflamatória " in vítro" - Níveis de IL-1a dosados em sobrenadantes de cultura de células NHK pré-incubadas com biosaccharide gum-2 (RH 0,05 mM) ou com lipossomas contendo biosaccharide gum-2 (Lip. + RH, colchete preto) em 4 concentrações diferentes, ou com lipossomas sem biosaccharide gum-2 (Lip. - RH, colchete vermelho) em 4 concentrações diferentes, e incubados posteriormente com extrato de parede de C. acnes inativada pelo calor.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[030] O presente pedido de patente se refere, em uma modalidade, a lipossomas compreendendo lipídios com ação antimicrobiana contra microrganismos envolvidos em problemas dermatológicos, como p. ex . as bactérias Cutibacterium acne e Staphílococcus aureus, bem como ação anti-inflamatória . [031] Os lipídios em questão são ácidos graxos, entre eles o ácido cáprico, caprílico, mirístico, láurico, oleico, palmítico, esteárico, araquídico e/ou linoleico, ou misturas dos mesmos, mas preferencialmente o ácido láurico, associado ou não a outros agentes antimicrobianos , lipídicos ou não, ou a compostos que apresentem atividades biológicas relevantes para a prevenção e/ou tratamento de problemas dermatológicos, como ingredientes ativos com ação anti- inflamatória, antioxidante, sebo-reguladora, hidratante, restauradora da barreira cutânea, promotora de proliferação celular, anti-envelhecimento, anti-queda capilar, promotora do equilíbrio da microbiota cutânea, entre outras.

[032] De acordo com uma modalidade alternativa, a veiculação do lipídio antimicrobiano e/ou anti -inflamatório supracitado é realizada através da sua incorporação em bicamadas lipídicas, especificamente em vesículas lipossomais, de forma a minimizar o uso de outros agentes usualmente empregados para viabilizar a incorporação de compostos lipofílicos em formulações de base aquosa, como p. ex . agentes tensoativos, emulsionantes e/ou emulsificantes . As vesículas lipossomais, ou lipossomas, podem ser incorporadas em formulações cosméticas e/ou farmacêuticas de uso tópico para a aplicação na pele, no couro cabeludo e/ou nas mucosas corporais (boca ou genitais) .

[033] Em uma modalidade preferida, o presente pedido de patente se refere aos lipossomas descritos acima. Tais lipossomas apresentam, em sua composição lipídica, uma concentração de ácido graxo suficientemente alta para que a sua ação antimicrobiana seja relevante, sendo significativamente mais alta em relação à concentração de ácido graxo na maioria dos lipossomas relatados previamente na literatura. Uma das vantagens trazidas pelos lipossomas ora descritos e reivindicados é que tal concentração, embora alta e suficiente para alcançar a atividade necessária, não causa irritação cutânea. Isso é surpreendente dado o potencial de ácidos graxos, como o ácido láurico de causar irritação cutânea.

[034] A elevada concentração relativa de ácido graxo, perante os demais componentes lipofilicos constituintes da bicamada lipossomal, também pode ser considerado um fator determinante para a obtenção de lipossomas com as caracteristicas especificas de tamanho e de lamelaridade descritas no presente pedido patente.

[035] Em uma modalidade preferida especifica, lipossomas descritos no presente pedido de patente são obtidos quando o ácido graxo com ação antimicrobiana e/ou anti- inflamatória, como por exemplo, o ácido láurico, é usado em concentração suficientemente elevada e, simultaneamente, quando uma parcela significativa deste ácido graxo está na forma do seu sal, isto é, na forma de laurato. De acordo com tal modalidade, a concentração final de ácido láurico na suspensão de lipossomas deve ficar acima da concentração mínima inibitória para que os lipossomas apresentem ação antimicrobiana contra a C. acnes, determinada como sendo 0,02% (m:m) . Desta forma, a concentração de ácido láurico na suspensão lipossomal descrita no presente relatório descritivo deve estar entre 0,08% e 0,75%, preferencialmente na faixa de 0,20% a 0,60%, mais especificamente na faixa de 0,40% a 0,50% (m:m) . A formação do referido sal é melhor descrita abaixo.

[036] Alternativamente, além do ácido láurico, os lipossomas aqui descritos e reivindicados podem compreender outros compostos nanoencapsulados , como antioxidantes , anti- inflamatórios e outros agentes cosméticos, por exemplo, mas não limitados a acetato de tocoferol e Biosaccharide Gum-2. [037] Outra modalidade da invenção se refere a um processo de produção dos lipossomas multifuncionais aqui descritos e reivindicados. O referido processo compreende, de maneira geral, a solubilização do ácido graxo e demais componentes lipidicos, ou oleosos, em um ou mais solventes lipofilicos, seguida da alcalinização da fase lipidica com uma solução de um agente alcalinizante e posterior adição da mistura da fase lipidica e agente alcalinizante a uma fase aquosa.

[038] Os tamanhos médios dos lipossomas mostraram-se dependentes da composição lipidica e do(s) solvente (s) lipofilico ( s ) utilizado ( s ) , conforme descrito na Tabela 4.

[039] Os componentes lipidicos, ou oleosos, podem ser, por exemplo, selecionados do grupo compreendendo, mas não limitados a lecitina hidrogenada de soja desengordurada e com 70% de fosfatidilcolina, ácido láurico, acetato de tocoferila, colesterol e o polissorbato 80.

[040] Solventes lipofilicos adequados podem ser, por exemplo, um álcool e um poliol selecionados do grupo compreendendo, mas não limitado a etanol e propilenoglicol, onde a concentração em massa de etanol pode variar de 0% até 99,9%, e a concentração em massa de propilenoglicol pode variar entre 0% e 95%. As concentrações de tais componentes são exemplificadas na Tabela 4.

[041] A solubilização dos componentes oleosos em um ou mais solventes lipofilicos adequados, que podem ser um álcool e um poliol, especificamente etanol e propilenoglicol, onde a concentração em massa de etanol na suspensão lipossomal pode variar de 1% a 25%, preferencialmente na faixa de 2% a 7%, especialmente na faixa de 4% a 5% , e a concentração em massa de propilenoglicol na suspensão lipossomal pode variar entre 0% e 30%, preferencialmente na faixa de 20% a 30%, mais especificamente na faixa de 24% a 28%. [042] A solução de um agente alcalinizante pode ser, por exemplo, selecionada do grupo compreendendo, mas não limitado a uma solução aquosa de hidróxido de sódio , hidróxido de potássio, hidróxido de amónio, hidróxido de cálcio ou trietanolamina, entre outros equivalentes. A solução de agente alcalinizante deve ter concentração final na suspensão lipossomal na faixa de 0,009% até 0,040%, preferencialmente na faixa de 0,020% até 0,030%, mais especificamente na faixa de 0,024% até 0,026% (m:m) .

[043] A adição da fase lipidica à fase aquosa pode ser efetuada vertendo-se diretamente a fase lipidica sobre tal fase aquosa, com constante agitação mecânica desta, em que a fase lipidica é obtida, por exemplo, através da solubilização de ingredientes lipossolúveis em solvente orgânico. Preferencialmente, a adição da mistura da fase lipidica e agente alcalinizante a uma fase aquosa pode ser efetuada, por exemplo, pela injeção da solução lipidica, sob um fluxo controlado (por exemplo, via bomba peristáltica) , no seio da fase aquosa, ou vertendo-se direta e lentamente a fase lipidica sobre a fase aquosa, sob aquecimento e sob agitação mecânica moderada (por exemplo, agitador com hélice centrífuga ou agitação magnética) .

[044] Em uma modalidade preferida, a temperatura de aquecimento das fases aquosa e oleosa para a preparação dos lipossomas está na faixa de 40°C a 80°C, preferencialmente na faixa de 65°C a 75°C. É essencial que ambas as fases, aquosa e oleosa, estejam, simultaneamente, dentro das referidas faixas de temperatura para o processo de preparação ser bem sucedido.

[045] Em outra modalidade preferida, o tipo de agitador usado para agitar a fase aquosa durante a preparação dos lipossomas é, por exemplo, um agitador mecânico, com hélice, do tipo centrífuga. Ao longo da etapa de adição da fase oleosa na fase aquosa, a velocidade de agitação deste agitador mecânico com hélice centrífuga deve ser ajustada, por exemplo, na faixa de 850rpm a 1.800rpm, preferencialmente na faixa de 1.200rpm a 1.600rpm.

[046] Em mais uma modalidade preferida, o fluxo de adição da fase oleosa na fase aquosa, quando transferida pela bomba peristáltica, deve estar, por exemplo, na faixa de 5mL/minuto a 20mL/minuto, preferencialmente na faixa de lOmL/minuto a llmL/minuto .

[047] A fase aquosa pode ser composta, por exemplo, por água desmineralizada ou por uma solução tampão com pH 6,0 a

7.5, por exemplo. Especificamente, mas não se limitando a uma possibilidade específica, uma solução tampão fosfato de potássio pode ter 30mM e pH 6,6.

[048] O uso de uma solução tampão é desejável para evitar variações no pH da suspensão lipossomal, uma vez que os lipossomas não são completamente estáveis quando preparados e/ou mantidos sob pH menor que pH 6,0 ou sob pH maior que pH

7.5.

[049] É importante ressaltar que a alcalinização da fase lipídica demonstrou ser uma etapa crítica do processo para a obtenção de lipossomas físico-quimicamente estáveis. A relevância da alcalinização da fase lipídica, que teoricamente proporcionaria a desprotonação do ácido láurico, mostrou ser, surpreendentemente, um fator importante para a estabilização da bicamada lipídica do lipossoma, indicada por testes complementares realizados nos quais a etapa de alcalinização foi suprimida. É importante se considerar que os ácidos graxos apresentam pKa tipicamente na faixa de 4,5 a 5,5, sendo que o pKa do ácido láurico é 5, 3.

[050] Portanto, a incorporação da solução alcalinizante na fase lipídica durante a preparação da suspensão de lipossomas, é essencial para viabilizar a obtenção dos lipossomas unilamelares e com as caracteristicas adequadas de tamanho e estabilidade fisico-quimica .

[051] Outro aspecto importante é que a relação molar entre o hidróxido de sódio e o ácido láurico presentes na suspensão lipossomal deve estar na faixa de 10% a 70%, preferencialmente na faixa de 20% a 35%, mais especificamente na faixa de 26% a 30% (mol:mol - percentual relativo ao quociente das quantidades molares de hidróxido de sódio e ácido láurico) . Desta forma, garante-se que uma parcela significativa de ácido láurico seja saponificado pelo hidróxido de sódio, condição fundamental para a obtenção de lipossomas unilamelares e com as caracteristicas adequadas de tamanho e estabilidade fisico-quimica descritas neste pedido de patente. Os lipossomas descritos no presente pedido de patente são obtidos quando o ácido láurico é usado em concentração suficientemente elevada e, simultaneamente, quando uma parcela significativa deste ácido graxo está na forma do seu sal, isto é, na forma de laurato, por exemplo laurato de sódio ou potássio.

[052] O processo descrito acima, e aqui reivindicado, permite a obtenção lipossomas unilamelares, com tamanho médio na faixa de 90nm a 300nm, por exemplo de 140nm a 250nm. O referido processo é simples o suficiente para ser implementado em escala industrial, não necessitando de equipamentos especiais de custo mais elevado, e/ou que envolveriam maior tempo de processo, tais como homogeneização a alta pressão, agitação com elevado cisalhamento em agitador tipo rotor-estator, ou mesmo como a extrusão da suspensão lipossomal através de membranas de diâmetro de poros definido ou como a sonicação. Além disso, o tamanho médio dos lipossomas pode ser ajustado ou modulado, dentro de uma faixa de tamanhos entre 90nm a 300nm, em função da composição lipidica, especialmente da lecitina ou do fosfolipidio usado, assim como em função do sistema solvente lipofilico empregado.

[053] Considerando os resultados experimentais descritos nos Exemplos, a seguir, lipossomas com caracteristica consideradas ideais foram preparados com fosfatidilcolina de soja hidrogenada e quando o sistema solvente da fase lipidica é composto por propilenoglicol e etanol. A faixa de tamanho médio das nanoparticulas obtidas para os referidos lipossomas é de 90nm a 300nm, mais preferencialmente entre 140nm e 260nm, com índice de polidispersidade (PDI) na faixa de 0,01 a 0,30, preferencialmente índice de polidispersidade (PDI) na faixa de 0,05 a 0,20. O parâmetro índice de polidispersidade (PDI - "polydispersity index") representa uma medida da distribuição de tamanho das nanopartículas lipossomais, considerando a técnica de espectroscopia de correlação fotônica (PCS - "photon correlation spectroscopy" ) empregada para a determinação do tamanho das nanopartículas . Entretanto, é evidente, a partir da presente descrição, que outros lipossomas com características adequadas podem ser obtidos por variações dos processos ora descritos e reivindicados.

[054] Alternativamente, além do ácido láurico, os lipossomas aqui descritos e reivindicados podem ser obtidos de modo a compreender outros compostos encapsulados, como antioxidantes , anti-inflamatórios e outros agentes cosméticos, por exemplo, mas não limitados a acetato de tocoferol e Biosaccharide Gum-2.

[055] Os lipossomas obtidos como acima descritos foram caracterízados em termos de pH da suspensão (pH entre pH6,6 e pH 7,5, preferencialmente pH 6,8 a pH 7,0), tamanho médio (90nm a 300nm) e distribuição de tamanhos das nanopartículas (PDI < 0,3), potencial zeta (-41mV a -32mV) , lamelaridade (unilamelar) , eficiência de encapsulação (EE = 28,8% ± 0,3% ref. ao ingrediente ativo hidrofilico encapsulado, biosaccharide gum-2), sendo estáveis do ponto de vista fisico-quimico e microbiológico .

[056] Em uma modalidade preferida, o presente pedido de patente se refere a lipossomas unilamelares de diâmetro médio entre 90nm e 300nm. Particularmente, os processos ora reivindicados permitem a obtenção de lipossomas unilamelares de diâmetro médio inferior a 90 nm a lOOnm, isto quando o solvente lipofilico é composto apenas por etanol. Quando o propilenoglicol é adicionado ao sistema, diâmetros maiores podem ser obtidos, conforme demonstrado na Tabela 4. Tais lipossomas compreendem um lipídio antimicrobiano e/ou anti- inflamatório, preferencialmente um ácido graxo, como p. ex. ácido láurico. Os lipossomas aqui revelados possuem ainda característica de baixa polidispersidade .

[057] Em outra modalidade preferida, o presente pedido de patente se refere a composições que compreendem lipossomas conforme descritos acima e um veículo cosmético, farmacêutico e/ou veterinário aceitável. Tais composições podem ser na forma de, por exemplo, gel, creme, gel-creme ou uma loção. Em algumas modalidades alternativas, o teor de álcool etílico de tais composições é igual ou inferior a 20,5% (quando o álcool etílico é o único solvente lipofilico utilizado na preparação dos lipossomas), ou igual ou inferior a 1,25% (quando outro solvente lipofilico é usado juntamente com o álcool etílico) .

[058] Em outra modalidade preferida, o presente pedido de patente se refere a usos de ácido láurico para preparação de um lipossoma conforme definido acima. Alternativamente, tais usos são no preparo de uma composição para tratar e/ou prevenir problemas dermatológicos. Tal problema dermatológico pode ser causado, por exemplo, por bactérias, fungos, bolores e/ou leveduras, como p. ex . Cutibacterium acnes (Propionibacterium acne) , Staphylococcus aureus , Malassezia furfur, Corineumbacterium spp. , Trichophyton spp., entre outros. Alternativamente, o problema dermatológico pode ser acne, psoriase, dermatite atópica, envelhecimento da pele, seborreia (caspa) , alopecia, mau odor corporal ou bucal, infecção microbiana, ou desbalanço da microbiota cutânea.

[059] A seguir, são apresentadas concretizações especificas da presente invenção. No entanto, deve ser entendido que tais exemplos são providos somente para finalidade ilustrativa e que várias modificações ou mudanças, à luz das concretizações aqui reveladas, serão sugestivas a um técnico no assunto e devem estar incluídas dentro do espírito e alcance desta descrição e escopo das reivindicações que a acompanham.

EXEMPLOS

Exe pl o 1 : Preparação de Lipossomas

[060] Em um exemplo da preparação de lipossomas multifuncionais com elevada concentração relativa de ácido graxo perante os demais componentes da bicamada lipossomal, lecitina de soja enriquecida em fosfatidilcolina (Emulmetik ® 900/Lucas Meyer) , ácido láurico, acetato de tocoferila e ésteres de aminopropanodiol de óleo de cártamo/azeite de dendê (ômega-6-Ceramide ® /Solabiá) foram inicialmente solubilizados em etanol sob agitação magnética e à temperatura ambiente (25°C) . Em seguida, a esta solução etanólica de lipídios, sob agitação e à temperatura ambiente, adicionou-se uma solução aquosa de hidróxido de sódio 0,1M (0,1 mol/L) . A solução lipídica alcalinizada foi então injetada no seio de uma fase aquosa através de uma cânula de aço-inox de 18 biseis (gauge 18), com a saída imersa nesta fase aquosa, composta por uma solução de Biosaccharide Gum- 2 em água desmineralizada, e mantida sob agitação por 20 minutos e à temperatura de 45°C, obtendo-se lipossomas com tamanho médio de 93nm (PDI = 0,252) . A suspensão lipossomal assim obtida, cuja composição é apresentada na Tabela 1, apresentou pH igual a 7,0. Em relação aos componentes lipidicos, o ácido láurico representa 58,5% (proporção molar) em relação ao total de lipídios presentes nos lipossomas. Portanto, a bicamada lipídica é constituída maj oritariamente por moléculas deste ácido graxo.

[061] Tabela 1: Composição da suspensão de lipossomas multifuncionais descrita no Exemplo 1.

Exemplo 2: Preparação de Li possoma s

[062] Em um outro exemplo da preparação de lipossomas multifuncionais com elevada concentração relativa de ácido graxo perante os demais componentes da bicamada lipossomal, os componentes lipidicos Lipoid S75 ® /Lipoid (lecitina de soja desengordurada com 70% de fosfatidilcolina de soja), ácido láurico, acetato de tocoferila, colesterol e o polissorbato 80 foram solubilizados em uma mistura de propilenoglicol e etanol, sob agitação magnética (marca IKA, mod. C-Mag HS-7, velocidade: nível 6) e a 70°C. Após a completa solubilização destes ingredientes, e ainda mantendo-se a agitação e o aquecimento, adicionou-se a esta solução lipídica uma solução de hidróxido de sódio 2,0 M (2,0 mol/L) em água. Posteriormente, fez-se a injeção da solução lipídica alcalinizada no seio de uma fase aquosa, composta por sacarose, Malt Secrets ® /Gattefossé (Propanediol (and) Water (and) Hordeum vulgare seed extract) e Biosaccharide Gum-2, previamente solubilizados em solução Tampão Fosfato de Potássio 30mM pH 6,6. A referida injeção da fase lipídica alcalinizada foi realizada usando-se uma bomba peristáltica (marca Watson-Marlow, mod. 120S/DV) com mangueira de silicone de diâmetro interno de 0, 8mm, sob velocidade de 200rpm e vazão de 6,75 mL/minuto. Durante o processo de injeção da fase lipídica, a fase aquosa foi mantida sob agitação mecânica (marca IKA, modelo RW20, com haste centrífuga) , sob velocidade de 850rpm e sob a temperatura de 70°C. Ao final deste processo, a suspensão lipossomal obtida, cuja composição é apresentada na Tabela 2, apresentou pH igual a 7,0 e tamanho médio dos lipossomas de 270 nm (PDI = 0,198), observando-se uma única população de nanopartículas . Os lipossomas obtidos foram caracteri zados como sendo unilamelares através da técnica de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) . Nesta formulação, o ácido láurico representa 51% (proporção molar) em relação ao total de lipídios presentes nos lipossomas.

[063] Tabela 2: Composição da suspensão de lipossomas multifuncionais descrita no Exemplo 2.

Exemplo 3: Preparação de Lipossomas

[064] Em um mais um exemplo da preparação de lipossomas multifuncionais com elevada concentração relativa de ácido graxo perante os demais componentes da bicamada lipossomal, os componentes lipidicos Phospholipon 80H®/Lipoid (lecitina hidrogenada de soja, desengordurada e com 70% de fosfatidilcolina) , ácido láurico, acetato de tocoferila, colesterol e o polissorbato 80 foram solubilizados em uma mistura de propilenoglicol e etanol, sob agitação magnética (marca IKA, mod. C-Mag HS-7, velocidade: nivel 6) e a 70°C durante 30 minutos. Após a completa solubilização destes ingredientes, e ainda mantendo-se a agitação e o aquecimento, adicionou-se a esta solução lipidica uma solução aquosa de hidróxido de sódio 2,0 M (2,0 mol/L) . Posteriormente, fez- se a injeção da solução lipidica alcalinizada no seio de uma fase aquosa, composta por sacarose e Biosaccharide Gum-2, previamente solubilizados em solução Tampão Fosfato de Potássio 30mM pH 6,6. A referida injeção da fase lipidica alcalinizada foi realizada usando-se uma bomba peristáltica (marca Watson-Marlow, mod. 120S/DV) com mangueira de silicone de diâmetro interno de 1,6 mm, sob velocidade de 80 rpm e vazão de 10,5 mL/minuto. Durante o processo de injeção da fase lipidica, a fase aquosa foi mantida sob agitação mecânica (marca IKA, modelo RW20, com haste centrífuga), sob velocidade de 1.200 rpm e sob a temperatura de 70°C. Ao final deste processo, a suspensão lipossomal obtida, cuja composição é apresentada na Tabela 3, apresentou pH igual a 6, 9 e tamanho médio dos lipossomas de 190 nm (PDI = 0,176) . Os lipossomas obtidos foram caracterizados como sendo unilamelares através da técnica de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) . Nesta formulação, o ácido láurico representa 51% (proporção molar) em relação ao total de lipídios presentes nos lipossomas.

[065] Tabela 3: Composição da suspensão de lipossomas multifuncionais, descritos no Exemplo 3.

[066] Um resultado interessante e inesperado é relativo aos tamanhos médios das nanoparticulas obtidas ao se alterar um ingrediente (fosfolipidio) e/ou o sistema solvente utilizado na preparação da fase lipidica ( Tabela 4 ) . Os lipossomas preparados com Phospholipon 80H® (lecitina de soja hidrogenada) , como descrito no terceiro exemplo, apresentaram tamanho médio inicial de 190nm, que é 80nm menor do que aquele obtido para os lipossomas preparados com Lipoid S75® (270nm) . Comparando-se com o tamanho médio dos lipossomas obtidos no primeiro exemplo, preparado apenas com etanol como solvente da fase lipidica, percebe-se que as nanoparticulas lipossomais geradas neste caso apresentavam o menor tamanho médio (93nm), sendo cerca de lOOnm menores que aquelas do terceiro exemplo (tamanho médio de 190nm) , onde se utilizou lecitina hidrogenada, e 180nm menores que o tamanho médio dos lipossomas obtidos no segundo exemplo, a partir de lecitina não-hidrogenada (tamanho médio de 270nm) . Desta forma, evidencia-se que o tamanho médio dos lipossomas obtidos com o processo descrito nesta patente é dependente tanto do tipo de lecitina utilizada (hidrogenada ou não-hidrogenada) , quanto do sistema solvente utilizado para a solubilização dos componentes lipofilicos na preparação da fase oleosa.

[067] Tabela 4: Variação do diâmetro médio dos lipossomas em função do fosfolipidio e do sistema solvente da fase lipidica utilizados.

Exemplo 4: Lamel ar i dade dos lipossomas

[068] A lamelaridade dos lipossomas multifuncionais foi determinada utilizando-se a técnica de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS ; equipamento Nanostar Bruker, com ótica otimizada pela empresa Xenocs) . Nestes experimentos foram utilizados capilares de vidro de l,5mm de diâmetro onde foram colocadas a suspensão lipossomal e suas diluições em tampão fosfato de potássio a 30mM e pH 7. A análise foi realizada através do programa SUPERSAXS . A Figura 1 apresenta o dado experimental (em escala absoluta, e para o qual já foram feitas as correções e calibrações necessárias) obtido durante a medição da amostra lipossomal preparada com fosfatidilcolina de soja não hidrogenada (Lipoid S75 ® ) . O dado foi ajustado desconsiderando-se o fator de estrutura de camadas estacadas, ou seja, foi assumido que as vesículas são unilamelares (N = 1) . Nota-se que o ajuste é satisfatório, conseguindo descrever bem o comportamento da curva experimental.

[069] A Figura 2 mostra o perfil de densidade eletrónica usado para modelar o fator de forma P(q) das bicamadas. A partir do mesmo, conclui-se que a espessura da bicamada é dm = (42 ± 1) Å. Como se tratam de vesículas unilamelares, não é possível obter os parâmetros periodicidade lamelar (D) e parâmetro de Caillé (h) (flexibilidade das bicamadas), pois ambos descrevem o fator de estrutura de camadas estacadas, o qual não é aplicável a este sistema.

[070] Com isso, demonstrou-se que os lipossomas multifuncionais preparados com fosfatidilcolina de soja não hidrogenada (Lipoid S75®) eram unilamelares. Esse mesmo ensaio foi repetido para a formulação de lipossomas preparada com fosfatidilcolina de soja hidrogenada ( Phospholipon 80H®) . A comparação entre os resultados está indicada na Figura 3. Um fator de escala e "background" foi ajustado de maneira a tornar mais fácil a comparação dos dados. As curvas aproximadamente se sobrepõem para valores de "q" maiores que 0, 10Å-1, indicando que ambas são unilamelares. A principal diferença entre as curvas está na região de q < 0, 10Å-1, na qual é possível notar uma oscilação em ambas as curvas, atribuída à interação entre as vesículas. Como as oscilações possuem características diferentes, é possível dizer que a mudança entre as formulações lipossomais alterou principalmente a interação entre as vesículas, mas a forma unilamelar foi preservada. A fim de verificar se as oscilações estão correlacionadas com as interações entre as vesículas, foram feitas diluições na amostra de lipossomas de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (12,5mM e 25mM) em tampão fosfato de potássio 30mM e pH 7, e os resultados são mostrados na Figura 4.

[071] Um fator de escala e "background" foi ajustado de maneira a tornar mais fácil a comparação dos dados. Como é possível perceber, as curvas se sobrepõem perfeitamente na região de q > 0,10Å-1, indicando novamente que a forma das vesículas é a mesma para as três concentrações. Ao mesmo tempo, as oscilações observadas para a amostra a 50mM tornam- se menos pronunciadas no caso da amostra a 25mM e praticamente inexistes para a amostra a 12,5mM. Portanto, o começo da curva (região de q < 0,10Å-1), pode ser associado à interação entre as vesículas.

[072] Os lipossomas multifuncionais obtidos com fosfatidilcolina de soja hidrogenada, descritos no terceiro exemplo, foram caracterizados quanto à eficiência de encapsulação do ingrediente biosaccharide gum-2, determinada como sendo (28,8% ± 0,3%), através da separação da fase aquosa externa aos lipossomas por meio da técnica de cromatografia de permeação em gel (gel Sephadex® G100/Sigma- Aldrich; fase móvel = tampão fosfato de potássio 30mM e pH 7,0), com a subsequente quantificação dos resíduos de ramnose provenientes da biosaccharide gum-2 nas amostras contendo lipossomas e nas amostras contendo o ingrediente livre (fase aquosa externa aos lipossomas) . O ingrediente biosaccharide gum-2 foi caracterizado em função do teor do monossacarídeo ramnose através de método colorimétrico (GIBBONS, M. N., "The determination of methylpentoses . " Analyst, v. 80, p. 268 276, 1955) .

F.xempl o 5: Ati vi dade ant i mi crobi ana dos lipossomas

[073] Os lipossomas multifuncionais aqui descritos e reivindicados apresentaram atividade antimicrobiana contra a Cutibacterium acnes ATCC 6919 (Propionibacterium acnes ATCC 6919) sob concentração igual ou superior a 0, 63mM de lipídios lipossomais, determinada através do Teste de Concentração Inibitória Mínima (Teste MIC) contra esta bactéria, utilizando-se o método descrito por NAKATSUJI et al . (NAKATSUJI, T. et al., "Antimicrobial property of lauric acid against Propionibacterium acnes : its therapeutic potential for inflammatory acne vulgaris." J. Invest. Dermatol., v.129, p. 2480-2488, 2009), com adaptações. Inicialmente as bactérias foram cultivadas em ágar de meio reforçado de Clostridium (RCM - "Reinforced Clostridium Médium") a 37 °C durante 3 dias, sob condições anaeróbias. Depois, 3 ou 4 colónias de C. acnes foram coletadas, inoculadas em caldo RCM e cultivadas anaerobicamente a 37 °C por 24h, período necessário para a bactéria atingir a fase de crescimento logarítmico. Ao término da incubação, foi feita a leitura de absorbância a 595nm ( espectrofotômetro Genesys 105 Vis), usando o caldo RCM estéril como branco. O caldo RCM com C. acnes foi posteriormente diluído com o meio RCM estéril até se obter o valor de 0,150 para absorbância a 595nm. Conforme a curva de crescimento bacteriano em função da absorbância previamente obtida para a C. acnes, este valor de absorbância corresponde a uma carga de 4,0 x 107 UFC/mL (UFC: Unidades Formadoras de Colónia) . A partir deste inoculo foram feitas as diluições necessárias com caldo RCM estéril para se obter 1,0 x 10 5 UFC em cada poço da microplaca de Elisa contendo a amostra a ser testada, considerando -se o volume de meio com inoculo que se adicionaria em cada poço. A solução-mãe dos agentes hidrofóbicos foi preparada usando- se dimetilsul fóxido (DMSO) como solvente. Alíquotas desta solução foram dispensadas nos poços de uma microplaca (96 poços) e diluídas sequencialmente com DMSO. No caso dos ingredientes hidrofí licos, bem como das suspensões e géis lipossomais, água destilada foi utilizada em substituição ao DMSO. Alíquotas de cada uma das diluições das amostras foram acrescidas de meio de cultura (caldo RCM) contendo inoculo, e o material foi incubado a 37 °C, sob anaerobiose, durante 48h. No caso das amostras com lipossomas, tanto dispersos em suspensão aquosa quanto em gel cosmético, uma segunda microplaca foi preparada, com a diferença única de se empregar o caldo RCM estéril (não inoculado) . Após a incubação das microplacas foi efetuada a leitura de absorbância a 595nm em leitor de Elisa (marca Biotek, Sinergy Hl Multi-Mode Reader) para estimar o crescimento microbiano. Visando a confirmação qualitativa dos resultados obtidos para preparações contendo lipossomas pelo método acima descrito, o teste de redução da resazurina (0'BRIEN, J. et al . , " Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity" . Eur. J. Biochem. , v. 267, p. 5421-5426, 2000) foi também empregado nas mesmas placas, após as leituras de absorbância a 595nm terem sido efetuadas. Para tanto, 70mL de uma solução 0,01% de resazurina foi adicionada a cada poço e o desenvolvimento da cor foi registrado através de imagem fotográfica.

[074] Os resultados, quando expressos em termos de absorbância relativa, referem-se ao quociente entre a absorbância absoluta da amostra em relação à absorbância do seu branco, no caso dos ingredientes isolados ou em uma mistura de ingredientes em fase aquosa, sem a presença de lipossomas. No caso das amostras com lipossomas (suspensão ou gel aquoso) , a absorbância relativa refere-se ao quociente entre as absorbâncias absolutas da amostra inoculada com C. acnes e da mesma amostra não-inoculada (estéril) .

[075] Foram comparadas as atividades antimicrobianas contra C. acnes de lipossomas multifuncionais de ácido láurico com relação aos ingredientes ácido láurico e peróxido de benzoila (agente antimicrobiano de referência) , assim como em relação ao gel lipossomal e ao gel placebo (sem lipossomas) . Os resultados obtidos nestes estudos são apresentados nas Figuras 5 e 6, tendo sido confirmados qualitativamente através do teste de redução da resazurina.

[076] Com relação aos ingredientes antimicrobianos , a inibição do crescimento bacteriano foi mais pronunciada para o ácido láurico, considerando-se que um efeito inibitório significativo foi obtido a uma concentração inferior (22 pg/mL) relativamente ao efeito inibitório verificado para o peróxido de benzoila (336 pg/mL) . A concentração inibitória do ácido láurico foi 15 vezes inferior à do peróxido de benzoila, considerando-se uma diminuição de absorbância relativa similar em relação à absorbância relativa inicial (relativa à amostra sem qualquer ingrediente, ou seja, com concentração de 0,0 pg/mL) , obtida para cada composto nas concentrações indicadas.

[077] A inibição da C. acnes pela ação dos lipossomas ocorreu sob concentrações de ácido láurico superiores à deste ingrediente isoladamente, porém ainda sob concentrações inferiores às do peróxido de benzoila. Uma significativa ação inibitória dos lipossomas foi observada a partir de concentração de 56 pg/mL de ácido láurico lipossomal. Tais resultados demonstram que o ácido láurico isoladamente seria mais eficiente que os lipossomas multifuncionais contendo ácido láurico. Porém, deve-se considerar a possível interferência causada pela ação antibacteriana do solvente DMSO (dimetil sulfóxido) . Neste estudo, o ácido láurico não- lipossomal foi veiculado após sua prévia solubili zação em DMSO para torná-lo miscível com a fase aquosa do meio de cultura e, consequentemente, possibilitar a sua interação com as bactérias. Da mesma forma, o peróxido de benzoila foi igualmente solubilizado em DMSO.

Eempl o 5: Ati vidade antioxidante dos lipossomas

[078] A atividade antioxidante dos lipossomas multifuncionais preparados com fosfatidilcolina de soja hidrogenada ( Phospholipon 80H®) foi determinada pela avaliação dos níveis de malondialdeído (MDA) , através do método de TBARS ( "Thiobarbituric Acid Reactive Substances") , com a intenção de verificar a ação antioxidante dos lipossomas no que diz respeito à proteção da peroxidação lipídica [MIYAMOTO, S. et al . , "Evaluation of Malondialdehyde Leveis", In: Zenteno-Savin, T. et al . , "Oxidative Stress in Aquatic Ecosystems", John Wiley & Sons Ltd., p. 440-447, 2011]. A primeira etapa deste ensaio envolve a indução da peroxidação do ácido araquidônico (AA) , lipídio presente naturalmente na pele humana. Para isso, foram colocados em tubos de ensaio 10mL da solução 125mg/mL de AA em etanol, 20mL de solução lOmM de ácido ascórbico em tampão fosfato de potássio a 30mM pH 7,0 e 20mL da solução 50mM de FeC13 em água deionizada. Para o controle positivo, o volume foi completado para lmL com metanol e nenhum agente antioxidante foi adicionado. Para os tubos contendo as amostras-teste, foram adicionados volumes distintos de soluções (suspensão lipossomal e demais controles) e o volume foi igualmente completado para lmL com metanol. Um segundo controle, no qual foi suprimida a adição da solução de FeC13, foi preparado visando a avaliação da extensão da oxidação lipídica gerada pelos agentes oxidantes. Os tubos foram fechados, homogeneizados em vórtex e incubados a 37°C por lh. Para se quantificar os níveis de MDA gerados, 50mL de cada amostra exposta aos agentes oxidantes foram transferidos para tubos contendo 1,5mL da solução 1% (v/v) de ácido fosfórico e 500mL de solução 0,67% (m/v) de ácido tiobarbitúrico em água. Para interromper a reação de formação de MDA, foram adicionados em cada tubo 150mL de solução 1,0% (m/v) de EDTA dissódico em água. Os tubos foram fechados, agitados em vortex, e submetidos a banho-maria de água fervente por 30min. Após resfriadas até temperatura ambiente, as amostras foram transferidas para um tubo contendo lmL de n-butanol. Os tubos foram agitados em vórtex e centrifugados a l000g por 5min. Foram realizadas leituras das amostras em espectrofotômetro a 535nm. Os resultados obtidos foram analisados de forma relativa, considerando que o ensaio de controle positivo (ausência de qualquer agente antioxidante) sofreu 100% de oxidação.

[079] Os sacarideos interferem no método, exercendo um forte efeito sinérgico na formação de TBARS, superestimando desta forma a extensão da oxidação (SILVA, F. A. M. et al . , "Métodos para avaliação do grau de oxidação lipidica e da capacidade antioxidante". Química Nova, v. 22, n.l, p. 94- 103, 1999) . Por esta razão, foram analisados os lipossomas multifuncionais preparados na ausência e na presença dos sacarideos (sacarose e biosaccharide gum-2) . A Figura 7 mostra os resultados obtidos para estes ensaios, na qual o controle positivo representa 100% de oxidação de AA, ou seja, 0% de inibição de peroxidação lipidica.

[080] O ensaio com o controle sem Fe(III), conduzido na ausência deste íon, apresentou 33, 6% de oxidação (equivalente a 66,4% de inibição), que pode ser interpretado como a oxidação basal do sistema. Isso indica que a reação de oxidação ocorre em uma extensão significativa mesmo sem a ação do Fe (III) como promotor da oxidação.

[081] A presença dos lipossomas junto ao ácido araquidônico no meio reacional proporcionou uma inibição de 44,5% da oxidação deste lipídio. Efeito antioxidante similar foi observado com os lipossomas preparados sem qualquer sacarideo, com 37,9% de inibição da peroxidação lipidica. Estes resultados indicam que a interferência na quantificação dos produtos da reação com o TBA, decorrente da presença de sacarideos na suspensão lipossomal, foi pouco relevante. Portanto, a suspensão lipossomal é capaz de proporcionar um razoável efeito antioxidante . Por outro lado, os resultados obtidos indicam que o ingrediente biosaccharide gum-2 também apresenta atividade antioxidante, estando de acordo com a indicação prévia de ISARD e colaboradores (ISARD, O. et al, "Anti-inflammatory properties of a new undecyl-rhamnoside (APRC11) against P. acnes." Arch. Dermatol. Res., v.303, n.10, p. 707-13, 2011) .

[082] A comparação dos resultados observados com o controle positivo e com o controle sem Fe (III) evidencia que o método utilizado está adequado, sendo capaz de gerar níveis significativos e detectáveis de complexo formado entre MDA e TBA. Desta forma, é possível afirmar que os resultados obtidos para os lipossomas indicam de fato uma significativa capacidade antioxidante destes.

Exemplo 7: Ati vi dade ant i - i n f l ama tória dos lipossomas

[083] A Atividade anti-inflamatória foi determinada pela quantificação da citocina pró-inflamatórias IL-1a produzida por queratinócitos de pele humana (células NHK - Primary Epidermal Keratinocytes ; Normal, Human, Neonatal Foreskin ATCC® PCS-200-010™) , induzidas por extrato de membrana de C. acnes morta pelo calor, com base na metodologia descrita por ISARD e colaboradores (ISARD, O. et al, "Anti -inflammatory properties of a new undecyl-rhamnoside (APRC11) against P. acnes." Arch. Dermatol. Res., v.303, n.10, p. 707-13, 2011) .

[084] Para o preparo do extrato de membrana de bactéria morta pelo calor, inicialmente realizou-se a cultura da C. acnes (ATCC 6919) em caldo RCM, sob anaerobiose e a 37°C, por 4 dias (período necessário para a bactéria atingir a fase de crescimento estacionário) . Ao final do período de incubação, quantificou-se a carga microbiana através da medida de absorbância a 595nm utilizando se o caldo RCM estéril como branco. Conforme a curva de crescimento bacteriano em função da absorbância previamente obtida para a C. acnes, uma leitura de absorbância de 0,150 (a 595nm) corresponde a uma carga de 4,0 x 107 UFC/mL. Em seguida procedeu se à inativação térmica das bactérias em banho maria a 60°C durante 30 minutos. Centrifugou-se a suspensão bacteriana inativa sob 4.000 rpm por 15 minutos removendo-se cuidadosamente o sobrenadante com pipeta Pasteur. A massa bacteriana foi lavada por 5 vezes com soro fisiológico e centrifugada a 4.000rpm por 15 minutos. Para se efetuar o rompimento das membranas celulares, ressuspendeu-se a massa bacteriana em soro fisiológico, procedendo-se a 15 ciclos de congelamento (-80°C) e aquecimento (37°C) desta suspensão, seguida por 5 ciclos de sonicação. O extrato bacteriano assim obtido foi congelado. No momento de sua utilização, o extrato de membrana de C. acnes morta pelo calor foi descongelado sob temperatura ambiente, centrifugado sob 4.000rpm por 15 minutos removeu-se o sobrenadante com pipeta Pasteur e ressuspendeu-se o pellet no meio de cultura de queratinócitos .

[085] As células NHK foram cultivadas no meio Dermal Cell Basal Médium (ATCC, Manassas, VA) suplementado com o kit Keratinocyte Growth (ATCC, Manassas, VA) e antibióticos (10 U/mL de penicilina, 10 mg/mL de estreptomicina e 25 ng/mL de amfotericina B; ATCC, Manassas, VA) de acordo com as instruções do fabricante e mantidas a 37 °C em incubadora com atmosfera úmida contendo 5% CO2. Ao atingirem 70%-80% de confluência, as monocamadas de células foram tripsinizadas para obtenção de subculturas.

[086] Suspensões lipossomais contendo ou não biosaccharide gum-2 foram pré-incubadas com as células NHK antes do estimulo do extrato de parede de C. acnes inativada ser adicionado ao meio. Conforme os resultados apresentados na Figura 8, há indicativos de efeito preventivo contra a inflamação induzida pela bactéria sem, no entanto, mostrarem um comportamento concentração-dependente. Nota-se que os lipossomas contendo biosaccharide gum-2 apresentaram uma maior redução nos níveis da citocina IL-1a do que os lipossomas que não continham este ingrediente. Entretanto, quando comparamos os valores obtidos para as amostras lipossomais com aquele obtido para o controle positivo, biosaccharide gum-2 isoladamente (RH) , os dois tipos de lipossomas apresentam ainda concentrações mais elevadas. Por outro lado, o fato dos lipossomas sem biosaccharide gum-2 proporcionarem uma redução dos níveis de IL-1a é uma evidência de que os próprios lipossomas de ácido láurico apresentaram efeito preventivo contra a inflamação.

Exemplo 8: Formulações compreendendo os lipossomas

[087] Formulações cosméticas de uso tópico, na forma galênica de um gel, foram preparadas utilizando-se algumas das suspensões de lipossomas multifuncionais anteriormente descritas. Para tanto, à uma fase aquosa, ou à própria suspensão lipossomal, adicionou-se um ou mais agentes formadores de gel e/ou espessantes, que podem ser goma xantana, goma carragenana, goma guar, goma acácia, goma tragacanto, pectina, dextrina, gelatina, derivados de celulose, como carbocimetilcelulose, hidroxietilcelulose, hidroxipropilcelulose ou celulose microcristalina, polímeros carboxivinílicos ou carbômeros, como o carbopol, álcool polivinílico, polivinilpirrolidonas, poloxamer, alginatos de propilenoglicol ou de sódio, ou outros polímeros sintéticos ou naturais. Um ou mais dos seguintes ingredientes foram utilizados para a composição do sistema conservante do produto, parabenos (metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno, butilparabeno, heptilparabeno, isobutilparabeno , isopropilparabeno, benzil -parabeno e/ou seus sais de sódio) , fenoxietanol, DMDM hidantoína, metilcloroisotiazolinona, iodo propinilbutilcarbamato, imidazolidinil uréia, diazolidinil uréia, Quaterniumló, hidroximetilglicinato de sódio, entre outros ingredientes conservantes e/ou adjuvantes não considerados como ingredientes conservantes, mas que contribuem para a conservação microbiológica de produtos cosméticos, tais como o caprililglicol .

[088] Um primeiro exemplo de formulação cosmética de uso tópico, na forma de gel, foi obtida pela incorporação do conservante microbiológico DMDM hidantoína à suspensão de lipossomas preparada com lecitina de soja (Emulmetik 900/Lucas Meyer) anteriormente descrita no primeiro exemplo da preparação de lipossomas multifuncionais (Tabela 1), sob agitação magnética (marca IKA, mod. C-Mag HS-7, velocidade: nível 6) e à temperatura ambiente. Seguidamente, a suspensão resultante, ainda sob agitação, foi aquecida até 40°C-45°C e o agente gelificante goma xantana foi a ela adicionado (vide Tabela 5) . Para a completa hidratação da goma xantana e obtenção de um gel homogéneo, o sistema foi mantido sob agitação e aquecido (40°C-45°C) por mais 40 minutos. Ao final deste período, o sistema foi resfriado até atingir a temperatura ambiente (25°C), obtendo-se um gel cosmético com baixa viscosidade, translúcido, levemente amarelado e com pH final igual a pH 6,9.

[089] Tabela 5: Fórmula do primeiro exemplo de gel cosmético contendo lipossomas multifuncionais com elevada concentração relativa de ácido láurico.

[090] Tabela 6: Fórmula do gel cosmético contendo 2,5% da suspensão de lipossomas multifuncionais com elevada concentração relativa de ácido láurico, preparados com lecitina de soja hidrogenada.

[091] Tabela 7: Fórmula do gel cosmético contendo 10% de suspensão de lipossomas multifuncionais com elevada concentração relativa de ácido láurico, preparados com lecitina de soja hidrogenada.

[092] Tabela 8: Fórmula do gel cosmético contendo 25% de suspensão de lipossomas multifuncionais com elevada concentração relativa de ácido láurico, preparados com lecitina de soja hidrogenada.

[093] Outros três exemplos de formulação cosmética de uso tópico, na forma de gel, foram obtidas pelo uso dos agentes gelificantes e/ou espessantes goma carragenana (Viscarin ® PC-389/EMC - Chondrus Crispus ( carrageenan) , (and) Glucose) e hidroxietilcelulose (CELLOSIZE ® QP IOOMH/Dow - Hydroxyethylcellulose ) , conforme apresentado nas Tabelas 6,

7 e 8, acima. Estes dois ingredientes foram primeiramente dispersos em glicerina e incorporados em solução tampão fosfato de potássio 30mM pH 7,0 , sob agitação mecânica vigorosa (marca IKA, modelo RW20, com haste centrífuga), sob velocidade de 1.600rpm e sob aquecimento (70°C), mantendo- se estas condições durante 15 minutos para a completa dispersão. Após este intervalo, a suspensão de lipossomas multifuncionais preparada com lecitina de soja hidrogenada (Phospholipon 80H ® /Lipoid) , descrita no exemplo 3 anteriormente relatado (Tabela 3), foi adicionada lentamente, sob as mesmas condições de agitação e temperatura. Posteriormente, o sistema conservante microbiológico composto por fenoxietanol e caprililglicol (Microcare ® PHG/Thor - Phenoxyethanol (and) Caprylyl Glycol) foi incorporado à formulação, e o sistema foi resfriado até a temperatura ambiente (25°C) , mantendo-se a agitação. Ao atingir esta temperatura, e ainda mantendo a mesma condição de agitação, adicionou-se a fragrância como etapa final do preparo do referido produto.

[094] O gel cosmético obtido ao se utilizar a menor concentração da suspensão lipossomal (2,5%) apresentou concentrações finais de propilenoglicol e de etanol iguais a, respectivamente, 0,6% e 0,1% (m:m) . Ao se utilizar a concentração intermediária da suspensão lipossomal (10%), o gel cosmético apresentou concentrações finais de propilenoglicol e de etanol iguais a, respectivamente, 2,5% e 0,5% (m:m) E ao se utilizar a maior concentração da suspensão lipossomal (25%), o gel cosmético foi obtido com concentrações de propilenoglicol e de etanol iguais a, respectivamente, 6,3% e 1,1% (m:m) . Estes dois componentes, propilenoglicol e etanol, são oriundos exclusivamente da suspensão lipossomal utilizada na formulação dos referidos géis cosméticos.

[095] Apesar de certas concretizações terem sido descritas, elas foram apresentadas como um modo exemplificativo somente, e não há intenção de limitar o escopo da presente invenção. De fato, as novas concretizações aqui descritas podem ser concretizadas em uma variedade de outras formas; mais que isso, várias omissões, substituições e mudanças na forma das concretizações aqui descritas podem ser feitas sem se afastar do espirito da presente invenção. As reivindicações que acompanham esta descrição e suas equivalentes são consideradas como cobrindo tais formas ou modificações a medida em que elas podem estar dentro do escopo e espirito da presente invenção.