Proteasen regulieren zahlreiche physiologische Prozesse, die das Wachstum und die Metastasierung von Tumorzellen ermöglichen bzw. stimulieren. Das betrifft insbeson- dere den proteolytischen Abbau der die Tumorzellen umgebenden extrazellulären Mat- rixproteine, durch den die Invasion der von Tumoren abgesiedelten Tumorzellen in an- grenzende Gewebe und in das Lymph-bzw. Blutsystem ermöglicht wird. Proteasen sind auch an der Aktivierung von Wachstumsfaktoren beteiligt, die z. B. die Proliferation von Tumorzellen oder die Angiogenese stimulieren und damit das Tumorwachstum ermög- lichen. Zu diesen proteolytischen Enzymen gehören verschiedene Matrix- Metalloproteasen, membrangebundene Metalloproteasen, lysosomale Cysteinproteasen und eine Vielzahl von Serinproteasen, wie z. B. Urokinase, Plasmin, Elastase, Thrombin oder Cathepsin G, und auch die Type-II-Transmembran-Serinprotease Matriptase oder MT-SP1 (Hopper et al., J. Biol. Chem. 276, 857-860, 2001).

Es gibt zahlreiche Versuche, durch den Einsatz von Proteaseinhibitoren das Wachstum und die Metastasierung von Tumoren zu hemmen, doch zeigten Versuche mit Hemm- stoffen der Matrix-Metalloproteasen bisher kaum Wirkung in klinischen Studien (Cous-

sens et al., Science 295,2387-2392, 2002). Inzwischen wurden auch erste klinische Un- tersuchungen mit Hemmstoffen der Urokinase initiiert, wobei aber noch keine Ergeb- nisse über deren Wirksamkeit bekannt sind.

Matriptase, ist eine trypsinartige Serinprotease, die ursprünglich aus Brustkrebszellen isoliert wurde und bevorzugt C-terminal Peptidbindungen der basischen Aminosäure Arginin spaltet. (Shi et al., Cancer Res. 53,1409-1415, 1993 ; Lin et al., J. Biol. Chem.

272,9147-9152, 1997).

1998 wurde das Gen der Matriptase als putativer Tumorsuppressor durch ein subtrakti- ves Hybridisierungsverfahren, bei dem gesundes und kanzerogenes Darmgewebe ver- wendet wurden, kloniert (Zhang et al. Cytogenet. Cell Genet. 83,56-57, 1998).

Matriptase und MT-SP1 (Abkürzung für"membrane-type serine protease 1) (Takeuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96,11054-11061, 1999 ; Takeuchi et al., J. Biol. Chem. 275,26333-26342, 2000) besitzen die gleiche cDNA. Allerdings ist aufgrund alternativen Splicings die Proteinsequenz der Matriptase im Vergleich zur MT-SP1 um 172 Aminosäuren am N-Terminus verkürzt. Das Gen für MT-SP1 wurde aus einer epi- thelialen Zelllinie eines Prostatatumors isoliert.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff"Matriptase"jedes trypsinartige Protein mit einem Molekulargewicht von 72 bis 92 kDa, das von den Gen- sequenzen mit den Eintragsnummer AF118224, AF133086, BANKIt257050 und NM021978 (GenBank/EBI Data Bank) abgeleitet ist und bereits früher beschrieben wurde (Takeuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96,11054-11061, 1999 ; Lin et al., J.

Biol. Chem. 274, 18231-18236, 1999). Insbesondere bezeichnet der Begriff"Matripta- se"sowohl die Einzel-und Doppelkettenform des Proteins. Die zymogene, inaktive Form der Matriptase ist ein Einzelkettenprotein. Die Doppelkettenform der Matriptase ist ihre aktive Form, die katalytische Aktivität aufweist. Inbesondere bezeichnet daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung der Begriff"Matriptase"die weiter oben be- schriebene ursprüngliche Matriptase als auch MT-SP1.

Das Enzym ist mittels einer Transmembran-Domäne in der Membran von Epithel-oder Krebszellen verankert, wobei die Serinproteasedomäne der Matriptase auf der Zellober- fläche und damit im extrazellulären Raum lokalisiert ist (Hopper et al., J. Biol. Chem. 276,857-860, 2001). Deshalb wurde vermutet, dass Matriptase an der Proliferation und Metastasierung von Brustkrebszellen durch Ab-bzw. Umbau extrazellulärer Matrixpro- teine, der Aktivierung von latenten Wachstumsfaktoren und anderen proteolytischen Kaskaden beteiligt sein könnte (Shi et al., Cancer Res. 53,1409-1415, 1993 ; Lin et al., J. Biol. Chem. 272,9147-9152, 1997).

Matriptase konnte auch aus menschlicher Milch isoliert werden, doch lag sie in diesem Fall fast vollständig als proteolytisch inaktiver Komplex mit dem endogenen Inhibitor HAI-1 vor (Lin et al., J. Biol. Chem. 274, 18237-18242, 1999). Im Gegensatz dazu liegt die Matriptase aus Brustkrebszellen weitestgehend in unkomplexierter und dadurch ka- talytisch wirksamer Form vor, und nur ein geringer Teil ist an HAI-1 gebunden.

Inzwischen wurden erste potentielle Substrate der Matriptase beschrieben. Matriptase ist in der Lage, den Hepatocyten-Wachstumsfaktor (HGF) zu aktivieren, der auch als Scat- tering-Faktor bezeichnet wird (Lee et al., J. Biol. Chem. 275,36720-36725, 2000). Pro- HGF wird von Krebs-oder Stromazellen in inaktiver Form als einkettiges Protein sekre- tiert und wird im extrazellulären Raum durch Spaltung C-terminal des Arg495 in die aktive zweikettige Form (HGF) umgewandelt. Durch die Bindung von HGF wird der Zelloberflächenrezeptor c-Met aktiviert und an bestimmten Tyrosinresten phosphory- liert. Kürzlich wurde eine enge Korrelation zwischen einer hohen Expression von c- Met, Matriptase und HAI-1 und einer schlechten Prognose bei Brustkrebspatienten nachgewiesen (Kang et al., Cancer Res. 63,1101-1105, 2003). Auch bei der Untersu- chung von Ovarialtumoren konnte gezeigt werden, dass Matriptase in verstärktem Maße exprimiert wird. Dabei wurde gefunden, dass im Gegensatz zu Tumoren des Typs 1/11 vor allem in fortgeschrittenen Tumoren des Typs III/IV Matriptase fast ausschließlich ohne HAI-1 exprimiert wird. Dies deutet darauf hin, dass im fortgeschrittenen Stadium ein Ungleichgewicht zwischen Matriptase und dem Inhibitor HAI-1 besteht, wodurch die proteolytische Aktivität der Matriptase und dadurch wahrscheinlich auch das invasi- ve Potential der Tumorzellen verstärkt wird (Oberst et al., Clin. Cancer Res. 8, 1101-

1107,2002).

Neben der Aktivierung von Pro-HGF ist Matriptase möglicherweise auch an der Akti- vierung der Plasminogenaktivator-Kaskade beteiligt. So ist Matriptase in der Lage, Pro- Urokinase zu Urokinase (uPA) zu aktivieren (Lee et al., J. Biol. Chem. 275,36720- 36725,2000 ; Takeuchi et al., J. Biol. Chem. 275,26333-26342, 2000), die Plasminogen in Plasmin umwandelt. Plasmin ist der prinzipielle Aktivator der Matrix- Metalloproteasen, die am Abbau extrazellulärer Matrixproteine beteiligt sind, was als Voraussetzung der Metastasierung angesehen wird.

Von Ihara et al. (J. Biol. Chem. 277,16960-16967, 2002) konnte gezeigt werden, dass Magenkrebszellen verstärkt ßl-6-N-Acetylglucosaminyltransferase (GnT-V) exprimie- ren, die in der Lage ist, Matriptase zu glycosilieren. Durch diese Modifizierung wird die Matriptase abbaustabiler und liegt in erhöhter Konzentration in proteolytisch aktiver Form vor.

Aus diesen Befunden kann abgeleitet werden, dass mit der Entwicklung eines wirksa- men und selektiven Hemmstoffs der Matriptase eine Möglichkeit besteht, die Prolifera- tion von Tumoren und ihre Metastasierung zu hemmen. Obwohl inzwischen auch die Röntgenstruktur der katalytischen Domäne der Matriptase im Komplex mit Benzamidin und dem Rinderpankreas-Trypsininhibitor aufgeklärt werden konnte, sind bisher aller- dings erst wenige Hemmstoffe der Matriptase bekannt (Friedrich et al., J. Biol. Chem.

277,2160-2168, 2002).

Von Enyedy et al. (J. Med. Chem. 44,1349-1355, 2001) wurden Bis-Benzamidine be- schrieben, wobei der wirksamste Inhibitor einen Ksi-vert von 0,19 u. M aufweist.

Die WO 01/97794 beschreibt ein Verfahren zur Hemmung einer Carcinomprogression bei der Matriptase eine Rolle spielt. Dabei werden Verbindungen eingesetzt, die zwei Gruppen enthalten, die in der Lage sind, bei einem physiologischen pH-Wert positiv geladen zu sein. Dabei sind diese Gruppen durch eine chemische Struktureinheit mitein- ander verbunden, die eine Länge von 5 bis 30, bevorzugt 15 bis 24 Angstrom aufweist.

Als positiv geladene Gruppen werden die Amino-, Amidino-, Guanidinogruppe sowie eine aus der Amidino-bzw. Guanidinogruppe abgeleitete cyclische Gruppe offenbart.

Aminosäurederivate sind in der WO 01/97794 nicht erwähnt, insbesondere demgemäß keine sulfonylierten Aminosäurederivate. Vielmehr unterscheiden sich die in der WO 01/97794 explizit offenbarten Verbindungen fundamental von den im Rahmen der vor- liegenden Erfindung beanspruchten Verbindungen.

In WO 02/20475 sind Tripeptidaldeliyde mit C-terminalem Arginal veröffentlicht. Nach Vorinkubation von Matriptase mit diesen Inhibitoren über einen Zeitraum von 30 Minu- ten wurden ICso-Werte kleiner 100 nM für die wirksamsten Verbindungen bestimmt, exakte Hemmkonstanten wurden allerdings nicht angegeben. Diese Inhibitoren binden vermutlich kovalent unter Ausbildung eines Halbacetals an Matriptase. Im Falle der Entwicklung von Hemmstoffen für andere trypsinartige Serinproteasen, wie z. B.

Thrombin oder Faktor Xa, wurde jedoch gezeigt, dass solche übergangszustandsanalo- gen Peptidåldehyde für die Entwicklung eines medizinisch einsetzbaren Wirkstoffs nicht geeignet sind.

Von Long et al. (Bioorganic. Med. Chem. Lett. 11, 2515-2519, 2001) wurde die Syn- these eines bizyklischen Peptides aus 14, Aminosäuren beschrieben, das ursprünglich aus dem Samen von Sonnenblumen isoliert wurde. Das Peptid inhibiert Matriptase mit einer Hemmkonstante von 0,92 nM, doch ist davon auszugehen, dass diese Strukturen nicht für die Entwicklung eines Wirkstoffs geeignet sind.

Eine der der vorliegenden Erfindung zugrunde liegenden Aufgaben war es daher, einen auch für therapeutische Anwendungen geeigneten Wirkstoff bereitzustellen, der Matrip- tase mit hoher Aktivität und Spezifität hemmt.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung eine Verbindung gemäß Formel (I)

oder ein Salz oder ein Prodrug dieser Verbindung, wobei (a) Xi und X2 unabhängig voneinander Wasserstoff oder ein Alkylrest mit 1, 2 oder 3 C-Atomen sind und mindestens einer der Reste Xi und X2 ein Rest der Struktur (I') ist, wobei - gegebenenfalls mindestens eine der mit m oder n indizierten Methylengruppen gemäß (I') mindestens einfach mit einer Hydroxyl-, einer Halogen-, einer Pseudo- halogen-oder einer COORz'-Gruppe substituiert ist und R2'eine lineare, ver- zweigte oder cyclische Alkylgruppe mit 1 bis 10 C-Atomen ist, und/oder - gegebenenfalls mindestens eines der C-Atome der mit m oder n indizierten Me- thylengruppen gemäß (I') durch S, N oder O ersetzt ist und/oder -gegebenenfalls mindestens eine der den Cyclus gemäß (I') bildenden Bindungen eine Doppelbindung ist, oder wobei (b) Xi und X2 derart zu einem Cyclus verbrückt sind, dass die Verbindung gemäß (I) <BR> <BR> die Struktur (I")

aufweist, wobei - gegebenenfalls mindestens eine der mit m oder n indizierten Methylengruppen gemäß (I") mindestens einfach mit einer Hydroxyl-, einer Halogen-, einer Pseudo- halogen-oder einer COOR2'-Gruppe substituiert ist und R2'eine lineare, ver- zweigte oder cyclische Alkylgruppe mit 1 bis 10 C-Atomen ist, und/oder - gegebenenfalls mindestens eines der C-Atome der mit m oder n indizierten Me- thylengruppen gemäß (I") durch S, N oder O ersetzt ist und/oder unter Beibehaltung der C-terminal an die sulfonylierte Aminosäure gebundenen Iminogruppe gegebenenfalls mindestens eine der den Cyclus gemäß (I") bildenden Bindungen eine Doppelbindung ist, und wobei (i) Ri eine gegebenenfalls teilweise hydrierte Aryl-oder Heteroarylgruppe, enthal- tend mindestens eines der Atome O, N oder S, mit 5 bis 20 C-Atomen, oder eine lineare, verzweigte oder cyclische Alkylgruppe mit 1 bis 10 C-Atomen ist, wobei Ri gegebenenfalls substituiert ist mit mindestens einer Halogen-und/oder Pseudohalogengruppe und/oder mindestens einer linearen, verzweigten oder cyclischen Alkyl-oder Alkylo- xy-oder Alkylthiogruppe mit 1 bis 10 C-Atomen, die gegebenenfalls min- destens einfach substituiert ist mit einer Halogen-, Pseudohalogen-, Hydro- xy-, Amino-, Cyano-, Amidino-, Guanidino oder Carboxylgruppe, wobei die Carboxylgruppe gegebenenfalls mit einer linearen, verzweigten oder cycli- schen Alkylgruppe mit 1 bis 10 C-Atomen verestert ist, und wobei die linea-

re, verzweigte oder cyclische Alkylgruppe mit 1 bis 10 C-Atomen gegebe- nenfalls mindestens ein Heteroatom, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 0, N und S, enthält, und/oder - mindestens einer Aryl-oder Heteroarylgruppe mit 5 bis 20 C-Atomen, wo- bei diese Aryl-oder Heteroarylgruppe gegebenenfalls substituiert ist mit -- mindestens einer linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylgruppe mit 1 bis 10 C-Atomen und/oder -- mindestens einer COR2'-und/oder COOR2'-Gruppe, wobei R2'eine li- neare, verzweigte oder cyclische Alkylgruppe mit 1 bis 10 C-Atomen ist, und/oder mindestens einer Halogengruppe und/oder mindestens einer Pseudohalogengruppe und/oder mindestens einer Alkoxygruppe oder einer Älkylthiogrüppe, wobei der Alkylrest jeweils 1 bis 10 C-Atome aufweist, und/oder mindestens einer Nitrogruppe und/oder mindestens einer Halogenalkylgruppe mit 1 bis 10 C-Atomen, und wobei die Aryl-oder Heteroarylgruppe über eine Alkylengruppe mit 1 bis 3 C-Atomen oder ein Sauerstoffatom oder über ein Schwefelatom an den Rest Ri gebunden ist ; mindestens einer Hydroxy-, Amino-, Cyano-, Amidino-, Guanidino-, Car- boxyl-oder Carboxyalkylgruppe, wobei die Aminogruppe gegebenenfalls acyliert ist und/oder wobei die Alkylgruppe der Carboxyalkylgruppe 1 bis 10 C-Atome aufweist und/oder die Carboxylgruppe gegebenenfalls mit ei- ner linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylgruppe mit 1 bis 10 C- Atomen verestert oder amidiert ist ; (ii) R2 eine mindestens einfach substituierte Arylgruppe mit 1 bis 10 C-Atomen ist, wobei - gegebenenfalls mindestens eines dieser C-Atome durch S, N oder O ersetzt ist, - mindestens ein Substituent eine Gruppe gemäß R4 ist,

- R2 gegebenenfalls zusätzlich mit einer Hydroxy-, COR2'-oder COOR2'- Gruppe substituiert ist und R2'eine lineare, verzweigte oder cyclische Al- kylgruppe mit 1 bis 10 C-Atomen ist ; (iii) R3 einen Rest der folgenden Formel (II) darstellt : A1 T A2 R4 (II) wobei Ai entweder nicht vorhanden oder eine Alkylengruppe mit 1 bis 4 C- Atomen ist, die gegebenenfalls substituiert ist mit mindestens einer Halogen-und/oder Pseudohalogengruppe und/oder mindestens einer linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylgruppe mit 1 bis 10 C-Atomen und/oder mindestens einer Aryl-oder einer Aralkylgruppe mit 5 bis 10 C- Atomen und/oder mindestens einer Cycloalkylgruppe mit 3 bis 10-Atomen und/oder- mindestens einer Hydroxy-, Cyano-, Alkyloxy-oder Alkylthio mit 1 bis 10 C-Atomen, Carboxyl-oder Carboxyalkylgruppe, wobei die Al- kylgruppe der Carboxyalkylgruppe 1 bis 10 C-Atome aufweist und/oder die Carboxylgruppe gegebenenfalls mit einem linearen, ver- zeigten oder cyclischen Alkylrest mit 1 bis 10 C-Atomen verestert oder amidiert ist ; T entweder nicht vorhanden oder eine der folgenden Gruppen ist :

wobei Rs Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 C-Atomen oder eine mit A2 einen gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthaltenden Cyclus bildende Alkylengruppe mit 1 bis 6 C-Atomen ist ; wobei die Amid-oder Esterbindung in beiden Orientierungen eingebaut sein kann, also auch die folgenden Orientierungen mit umfasst sind : - A2 eine lineare, verzweigte oder cyclische Alkylengruppe mit 1 bis 10 C- Atomen oder eine Aryl-, Heteroaryl-oder Aralkylengruppe mit 1 bis 10 C- Atomen, gegebenenfalls enthaltend mindestens ein Heteroatom, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N, S und O, ist, die gegebenenfalls substitu- iert ist mit mindestens einer Halogen-und/oder Pseudohalogengruppe und/oder mindestens einer linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylgruppe mit 1 bis 10 C-Atomen und/oder - mindestens einer Aryl-oder einer Aralkylgruppe mit 5 bis 10 C- Atomen und/oder mindestens einer Cycloalkylgruppe mit 3 bis 10 C-Atomen und/oder- mindestens einer Hydroxy-, Cyano-, Alkyloxy-oder Alkylthio-mit 1 bis 10 C-Atomen, Carboxyl-oder Carboxyalkylgruppe, wobei die Al- kylgruppe der Carboxyalkylgruppe 1 bis 10 C-Atome aufweist und/oder die Carboxylgruppe gegebenenfalls mit einem linearen, ver- zweigten oder cyclischen Alkylrest mit 1 bis 10 C-Atomen verestert oder amidiert ist ; (iv) R4 eine der folgenden, gegebenenfalls modifizierten basischen Gruppen ist :

wobei t = 0, 1 ; R6 und R7 unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine Al- kylgruppe mit 1 bis 6 C-Atomen oder eine Alkylengruppe mit 1 bis 5 C-Atomen, die mit A2 einen Cyclus bildet, oder eine Hydroxyl-, Amino-, Alkylamino, Acyl- oder Alkyloxycarbonylgruppe sind, wobei die Alkylamino-, Acyl-und Alkyloxy- carbonylgruppen unabhängig voneinander 1 bis 6 C-Atome aufweisen, und wobei R$ Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 C-Atomen ist oder eine Alky- lengruppe mit 1 bis 3 C-Atomen ist, die mit R6 einen Cyclus bildet ; (v) Q entweder eine CH-Gruppe oder N ist ; (vi) j 0, 1, 2 ; k=0, 1, 2, 3 ; m, n unabhängig voneinander = 0, l, 2,3, 4, 5 sind, wobei m + n = 3, 4,5 ; und wobei die Verbindung gemäß Formel (I) weder mit s 0, 1, 2 noch

mit s = 0, 1 ist.

Liegen die oben genannten erfindungsgemäßen Verbindungen als Salz vor, so sind Sal- ze mit Mineralsäuren und/oder Salze mit geeigneten organischen Säuren bevorzugt.

Unter anderem bevorzugt liegen die erfindungsgemäßen Verbindungen als Hydrochlo- ride oder auch als Sulfate vor. Geeignete organische Säuren sind beispielsweise Amei- sensäure, Essigsäure, Methylsulfonsäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure und Trifluoressig- säure. Unter anderem bevorzugt sind als Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen mit geeigneten organischen Säuren Acetate.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Verbindung eine Struktur auf, bei der mindestens einer der Reste Xi und X2 eine Struktur (I') auf- weist. Im Rahmen dieser Ausführungsform der an die Carbonylgruppe der gemäß (I) mittelständigen Aminosäure gebundenen, nicht-cyclischen Imine sind Verbindungen bevorzugt, bei denen genau einer der Reste Xi und X2 eine Struktur gemäß (I') aufweist.

Der nicht-cyclische Rest ist hierbei besonders bevorzugt Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder n-Propyl, weiter bevorzugt Methyl oder Ethyl und besonders bevorzugt Methyl.

Was den substituierten cyclischen Rest anbelangt, so sind Ausführungsformen bevor- zugt, bei denen m + n gleich 3 oder 4 ist. Der in Rest R3 zwingend enthaltene Rest R4 kann generell im Rahmen der oben getroffenen Definitionen beliebig gewählt werden.

Ganz besonders bevorzugt sind solche Reste R4, die nicht modifiziert sind und die aus- gewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus

Die Indices m und n des Cyclus gemäß (I') können so gewählt werden, dass sich der Rest R3 grundsätzlich in 2-, 3-oder, je nach Ringgröße, auch in 4-Position bezüglich des an die Carbonylgruppe der mittelständigen Aminosäure gebundenen Stickstoffs befinden kann. Bevorzugt sind beispielsweise die 3-oder die 4-Position, bei m=n=2 besonders bevorzugt die 4-Position.

Im Rahmen der Ausführungsform der an die Carbonylgruppe der gemäß (I) mittelstän- digen Aminosäure gebundenen, nicht-cyclischen Imine sind weiter Reste R3 bevorzugt, bei denen A2 nicht vorhanden ist. Weiter bevorzugt sind Reste R3, bei denen die funkti- onelle Gruppe T entweder nicht vorhanden ist oder ausgewählt wird aus Ganz besonders bevorzugt sind Ausführungsformen, bei denen T nicht vorhanden ist.

Was die Gruppe A2 anbelangt, so sind im Rahmen der an die Carbonylgruppe der ge- mäß (I) mittelständigen Aminosäure gebundenen, nicht-cyclischen Imine Alkylengrup- pen mit 1, 2,3, 4 oder 5 C-Atomen, insbesondere die Methylen-, Ethylen, n-Propylen, Isopropylen, Butylen und Pentylengruppe bevorzugt.

Im Falle, dass A2 eine Aryl-, Heteroaryl-oder Aralkylengruppe ist, sind beispielsweise, Gruppen der Strukturen zu nennen, wobei v und w unabhängig voneinander 0, 1 oder 2 sein können und die bei- den Alkylengruppen auch in 1, 2-oder 1, 3-Stellung zueinander positioniert sein können.

Beispielweise bevorzugt ist die 1,4-Stellung. Sowohl der Arylrest als auch mindestens

eine der beiden Alkylengruppen können wie oben definiert geeignet substituiert sein.

Umfasst A2 eine Heteroarylgruppe, so weist diese bevorzugt 1 bis 3 Heteroatome auf.

Grundsätzlich kann der Cyclus gemäß (I') mindestens ein Heteroatom enthalten, wobei hierbei bevorzugt Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel zu nennen sind. Ist das Hetero- atom beispielsweise Stickstoff, so kann dieser Stickstoff als weiteren Rest beispielswei- se Wasserstoff oder eine lineare, verzweigte oder cyclische Alkylgruppe mit 1 bis 10 C- Atomen aufweisen oder mit einem benachbarten C-Atom des Cyclus eine Doppelbin- dung ausbilden. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist keine der Methylengruppen gemäß (I') durch ein Heteroatom substituiert.

Ist der Cyclus gemäß (I') zusätzlich substituiert, so sind als zusätzliche Substituenten unter anderem Carboxyalkylgruppem der allgemeinen Struktur-COOR2'bevorzugt, wobei weiter bevorzugt R2'eine Alkylgruppe mit 1, 2 oder 3 C-Atomen und insbeson- dere bevorzugt eine Methyl-oder Ethylgruppe ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weisen die erfindungsgemäßen Verbindun- gen gemäß (b) ein an die Carbonylgruppe der gemäß (I) mittelständigen Aminosäure gebundenes cyclisches Imin und somit eine Struktur gemäß (I") auf Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Verbindung, wie oben be- schrieben, wobei diese Verbindung die Struktur (I") 0 aufweist.

Der Cyclus gemäß (I") weist diesbezüglich bevorzugt 5,6 oder 7 Ringatome auf. Dem- gemäß ist es denkbar, dass sich der Rest R3 in 2-, 3-oder 4-Stellung zu dem an die Car-

bonylgruppe der mittelständigen Aminosäure gebundenen Imin-Stickstoff befindet. Un- ter anderem bevorzugt sind Ausfuhrungsfbrmen, gemäß denen der Cyclus des cycli- schen Amins 5 oder 6 Ringatome aufweist. Besonders bevorzugt ist ein Sechsring. Ge- mäß dieses besonders bevorzugten Sechsrings können die Indices m und n beliebig ge- wählt werden. Beispiele für die möglichen Kombinationen sind etwa m=0 und n=4, m=l und n=3, m=2 und n=2, m=3 und n=1, m=4 und n=0. Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verbindungen ist m=n=2. Die Gruppe Q gemäß der Struktur (I) befindet sich also ganz besonders bevorzugt in 4- Stellung zu dem an die Carbonylgruppe der mittelständigen Aminosäure gebundenen Imin-Stickstoff.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Verbindung, wie oben be- schrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass m = n= 2.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann der Cyclus des cyclischen Imins geeignet substituiert sein. Unter den oben beschriebenen Substituenten ist unter anderem die COOR2'-Gruppe besonders bevorzugt, wobei R2'wiederum bevorzugt eine Alkylgruppe mit 1, 2,3, 4,5 oder 6 C-Atomen und insbesondere bevorzugt eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe ist. Ist der Cyclus mit einem Halogen substituiert, so sind Fluor, Chlor und Brom besonders bevorzugt. Ebenso ist die Hydroxylgruppe ein geeigneter Substi- tuent. Weiter kann der Cyclus mit zwei oder mehr gleichen oder verschiedenen, insbe- sondere den als bevorzugt genannten Substituenten substituiert sein.

Mindestens eine der im Cyclus gemäß (I") mit m oder n indizierten Methylengruppen kann durch ein Heteroatom substituiert sein, wobei hierbei bevorzugt Sauerstoff, Stick- stoff oder Schwefel zu nennen sind. Ist das Heteroatom beispielsweise Stickstoff, so kann dieser Stickstoff als weiteren Rest beispielsweise Wasserstoff oder eine lineare, verzweigte oder cyclische Alkylgruppe mit 1 bis 10 C-Atomen aufweisen oder mit ei- nem benachbarten C-Atom des Cyclus eine Doppelbindung ausbilden. Ganz allgemein kann der Cyclus gemäß (I") mindestens eine Doppelbindung enthalten, die entweder zwischen zwei Heteroatomen, zwei C-Atomen oder einem C-Atom und einem Hetero- atom ausgebildet sein kann. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind demgemäß

Cyclen beschrieben, die mindestens eine Doppelbindung aufweisen und bei denen der an die Carbonylgruppe der mittelständigen Aminosäure gebundene Iminstickstoff bei- behalten wird, also mit drei Einfachbindungen an die benachbarten Atome gebunden ist.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist keine der Methylengruppen gemäß (I") durch ein Heteroatom substituiert. Gemäß einer weiter insbesondere bevor- zugten Ausführungsform sind die den Cyclus aufbauenden Methylengruppen nicht sub- stituiert.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Verbindung, wie oben be- schrieben, wobei der durch Xi und X2 gebildete Cyclus folgende Struktur aufweist und m, n unabhängig voneinander = 0, 1, 2,3, 4,5 sind, wobei m + n = 3, 4,5. Weiter bevorzugt sind dabei Verbindungen, bei denen m und n so gewählt sind, dass ein Sechs- ring gebildet wird. Hierbei kann sich Q demgemäß, wie bereits oben beschrieben, in 2-, 3-oder 4-Stellung zum Imin-Stickstoff befinden, wobei besonders bevorzugt die 4- Stellung ist. Weiter insbesondere bevorzugt ist m = n = 2.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist Q eine CH-Gruppe oder Stickstoff. Ebenso beschreibt die vorliegende Erfindung auch Verbindungen, bei denen diese CH-Gruppe statt Wasserstoff einen geeigneten Substituenten trägt. Als Substituenten sind unter an- derem bevorzugt solche zu nennen, mit denen auch die Methylengruppen des Cyclus substituiert sein können.

Demgemäß beschreibt die vorliegende Erfindung auch eine Verbindung, wie oben be- schrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass Q ein Stickstoffatom ist.

Im Rahmen dieser Ausführungsform kann die in dem Rest R3 gegebenenfalls enthaltene Gruppe Al im Rahmen der oben beschriebenen Definitionen beliebig gewählt werden.

Besonders bevorzugt ist eine Gruppe Al, die eine Methylen-oder Ethylen-oder Propy- lengruppe, insbesondere eine Methylen-oder Ethylengruppe ist und gegebenenfalls sub- stituiert ist, wobei als Substituenten unter anderem besonders bevorzugt Alkylreste mit 1, 2 oder 3-Atomen, insbesondere Methyl und Ethyl, besonders bevorzugt Methyl, und/oder Halogen, insbesondere Fluor, Chlor und Brom, und/oder Cycloalkylreste mit bevorzugt 5,6 oder 7 C-Atomen und/oder Carboxyalkylreste, wobei der Alkylrest be- vorzugt Methyl oder Ethyl ist und die Carboxylgruppe bevorzugt mit einer Methyl-oder Ethylgruppe verstert oder amidiert ist, sind.

Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verbindungen, bei denen Q ein Stickstoffatom ist, ist die Gruppe Ai nicht vorhanden.

Demgemäß beschreibt die vorliegende Erfindung auch eine Verbindung, wie oben be- schrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass Q ein Stickstoffatom ist und Al nicht vorhanden ist..

Hinsichtlich der im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Rest R3 gegebenenfalls ent- haltenen funktionellen Gruppe T können sämtliche der oben beschriebenen Gruppen gewählt werden. Insbesondere im Fall, dass Q ein Stickstoffatom ist, sind als funktio- nelle Gruppen T Gruppen der Strukturen bevorzugt. Besonders bevorzugt sind für T Gruppen der Strukturen

wobei weiter bevorzugt Rs Wasserstoff ist. Gemäß weiter besonders bevorzugter Aus- führungsformen ist T ein Gruppe der Strukturen wobei ganz besonders bevorzugt T eine funktionelle Gruppe der Struktur ist. Hierbei können die Amid-oder Estergruppen in beiden Orientierungen eingebaut sein.

Demgemäß beschreibt die vorliegende Erfindung auch eine Verbindung, wie oben be- schrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass Q ein Stickstoffatom ist und T eine funktionelle Gruppe der Struktur Was die im Rest R3 zwingend vorhandene Gruppe A2 anbelangt, so gibt es innerhalb der oben beschriebenen Definitionen keine Einschränkungen.

Insbesondere im Fall, dass ein Stickstoffatom ist und weiter insbesondere, dass T eine Carbonylgruppe ist, sind für die Gruppe A2 Alkylengruppen mit 1 bis 6 C-Atomen be- vorzugt, die Methylen-, Ethylen-, Propylen-, Butylengruppe besonders bevorzugt und die Methylen-, Ethylen-und Propylengruppe insbesondere bevorzugt.

Im Falle, dass A2 eine Aryl-, Heteroaryl-oder Aralkylengruppe ist, sind beispielsweise Gruppen der Strukturen

zu nennen, wobei v und w unabhängig voneinander 0, 1 oder 2 sein können und die bei- den Alkylengruppen auch in 1, 2- oder 1, 3-Stellung zueinander positioniert sein können.

Beispielweise bevorzugt ist die 1,4-Stellung. Sowohl der Arylrest als auch mindestens eine der beiden Alkylengruppen können geeignet substituiert sein. Umfasst A2 eine He- teroarylgruppe, so weist diese bevorzugt 1 bis 3 Heteroatome auf.

Die Gruppe A2 kann gemäß obiger Definition auch geeignet substituiert sein. Als Sub- stituenten sind hierbei besonders Halogene, bevorzugt Fluor, Chlor oder Brom, und/oder Alkylreste mit bevorzugt 1, 2 oder 3 C-Atomen wie Methyl, Ethyl, n-Propyl oder Isopropyl, insbesondere bevorzugt Methyl und Ethyl, und/oder Cycloalkylreste mit bevorzugt 5,6 oder 7 C-Atomen und/oder Carboxyalkylreste, wobei der Alkylrest be- vorzugt Methyl oder Ethyl ist und die Carboxylgruppe bevorzugt mit einer Methyl-oder Ethylgruppe verestert oder amidiert ist.

Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Gruppe A2 nicht substituiert. Demgemäß beschreibt die vorliegende Erfindung eine Verbindung, wie oben beschrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass As eine Methylen-, Ethylen-oder Propylengruppe ist. Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung eine Verbindung, wie oben beschrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie folgende Struktur aufweist : wobei s =1, 2, 3.

Gemäß einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfin- dung eine Verbindung, wie oben beschrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie als funktionelle Gruppe T eine Gruppe der Struktur

aufweist und damit folgende Struktur aufweist : wobei s = 1, 2,3, bevorzugt s = 2.

Als zwingend in Rest R3 enthaltener Rest R4 sind sämtliche der oben genannten Struktu- ren einsetzbar. Bevorzugt ist dabei t = 0. Insbesondere bevorzugt sind dabei Reste R4 der folgenden Strukturen : wobei weiter bevorzugt R6 und R7 gleich Wasserstoff sind.

Ganz besonders bevorzugt sind Reste R4 der folgenden Strukturen : wobei weiter bevorzugt R6 und R7 gleich Wasserstoff sind.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Verbindung, wie oben be- schrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass R4 ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Gemäß einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist Q eine CH-Gruppe. Daher beschreibt die vorliegende Erfindung auch Verbindungen, wie oben beschrieben, die dadurch gekennzeichnet sind, dass Q eine CH-Gruppe ist.

Im Rahmen dieser Ausführungsform kann die in dem Rest R3 gegebenenfalls enthaltene Gruppe A1 im Rahmen der oben beschriebenen Definitionen beliebig gewählt werden.

Besonders bevorzugt ist eine Gruppe Al, die eine Methylen-oder Ethylen-oder Propy- lengruppe, insbesondere eine Methylen-oder Ethylengruppe ist und gegebenenfalls sub- stituiert ist, wobei als Substituenten unter anderem besonders bevorzugt Alkylreste mit 1, 2 oder 3-Atomen, insbesondere Methyl und Ethyl, und/oder Halogen, insbesondere Fluor, Chlor und Brom, und/oder Cycloalkylreste mit bevorzugt 5,6 oder 7 C-Atomen und/oder Carboxyalkylreste, wobei der Alkylrest bevorzugt Methyl oder Ethyl ist und die Carboxylgruppe bevorzugt mit einer Methyl-oder Ethylgruppe verestert oder ami- diert ist, sind.

Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verbindungen, bei denen Q eine CH-Gruppe ist, ist die Gruppe A1 nicht vorhanden.

Demgemäß beschreibt die vorliegende Erfindung auch eine Verbindung, wie oben be- schrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass Q eine CH-Gruppe ist und A1 nicht vor- handen ist.

Hinsichtlich der im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Rest R3 gegebenenfalls ent- haltenen funktionellen Gruppe T können sämtliche der oben beschriebenen Gruppen

gewählt werden. Insbesondere im Fall, dass Q eine CH-Gruppe ist, sind als funktionelle Gruppen T Gruppen der Strukturen bevorzugt. Besonders bevorzugt sind für T Gruppen der Strukturen wobei weiter bevorzugt Rs Wasserstoff ist. Gemäß weiter besonders bevorzugter Aus- führungsformen ist T ein Gruppe der Strukturen wobei ganz besonders bevorzugt T eine funktionelle Gruppe der Struktur ist. Hierbei können die Amid-oder Estergruppen in beiden Orientierungen eingebaut sein.

Demgemäß beschreibt die vorliegende Erfindung auch eine Verbindung, wie oben be- schrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass Q eine CH-Gruppe ist und T eine funk- tionelle Gruppe der Struktur

Im Falle, dass Q eine CH-Gruppe ist und T eine der bevorzugt genannten funktionellen Gruppen ist, ist die Gruppe A1 gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nicht vorhanden.

Daher beschreibt die vorliegende Erfindung auch eine Verbindung, wie oben beschrie- ben, die folgende Struktur aufweist : Neben der in oben stehender Strukturformel explizit beschriebenen 4-Stellung des Res- tes R3 sind ebenso die 2-oder die 3-Stellung möglich, wobei die 4-Stellung bevorzugt ist.

Gemäß einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist weder die Gruppe A1 noch die funktionelle Gruppe T vorhanden.

Daher beschreibt die vorliegende Erfindung auch ein Verbindung, wie oben beschrie- ben, die folgende Struktur aufweist : Neben der in oben stehender Strukturformel explizit beschriebenen 4-Stellung des Res- tes R3 sind ebenso die 2-oder die 3-Stellung möglich, wobei die 4-Stellung bevorzugt ist.

Was die im Rest R3 zwingend vorhandene Gruppe A2 anbelangt, so gibt es, wie bereits oben diskutiert, innerhalb der oben beschriebenen Definitionen keine Einschränkungen.

Insbesondere im Fall, dass Q eine CH-Gruppe ist und weiter insbesondere, dass entwe- der T eine Gruppe der Struktur ist oder nicht vorhanden ist, sind für die Gruppe A2 Alkylengruppen mit 1 bis 6 C- Atomen, insbesondere die Methylen-, Ethylen-, Propylen-, Butylengruppe, weiter insbe- sondere die Methylen-, Ethylen-und Propylengruppe und ganz besonders die Ethylen- gruppe bevorzugt.

Im Falle, dass A2 eine Aryl-, Heteroaryl-oder Aralkylengruppe ist, sind beispielsweise Gruppen der Strukturen zu nennen, wobei v und w unabhängig voneinander 0, 1 oder 2 sein können und die bei- den Alkylengruppen auch in 1, 2-oder 1, 3-Stellung zueinander positioniert sein können.

Beispielweise bevorzugt ist die 1,4-Stellung. Sowohl der Arylrest als auch mindestens eine der beiden Alkylengruppen können geeignet substituiert sein. Umfasst A2 eine He- teroarylgruppe, so weist diese bevorzugt 1 bis 3 Heteroatome auf.

Die Gruppe A2 kann gemäß obiger Definition auch geeignet substituiert sein. Als Subsi- tuenten sind hierbei besonders Halogene, bevorzugt Fluor, Chlor oder Brom, und/oder Alkylreste mit bevorzugt 1, 2 oder 3 C-Atomen wie Methyl, Ethyl, n-Propyl oder I- sopropyl, insbesondere bevorzugt Methyl und Ethyl, und/oder Cycloalkylreste mit be- vorzugt 5,6 oder 7 C-Atomen und/oder Carboxyalkylreste, wobei der Alkylrest bevor- zugt Methyl oder Ethyl ist und die Carboxylgruppe bevorzugt mit einer Methyl-oder Ethylgruppe verestert oder amidiert ist.

Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die'Gruppe A2 nicht substituiert.

Demgemäß beschreibt die vorliegende Erfindung auch Verbindungen, wie oben be- schrieben, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie folgende Struktur aufweisen : Neben der in oben stehenden Strukturformeln explizit beschriebenen 4-Stellung des Restes R3 sind ebenso die 2-oder die 3-Stellung möglich, wobei die 4-Stellung bevor- zugt ist.

Ebenso beschreibt die vorliegende Erfindung daher auch Verbindungen, wie oben be- schrieben, die dadurch gekeimzeichnet sind, dass sie folgende Strukturen aufweisen :

Neben der in oben stehenden Strukturformeln explizit beschriebenen 4-Stellung des Restes R3 sind ebenso die 2-oder die 3-Stellung möglich, wobei die 4-Stellung bevor- zugt ist.

Als zwingend in Rest R3 enthaltener Rest R4 sind sämtliche der oben genannten Struktu- ren einsetzbar. Bevorzugt ist dabei t = 0. Insbesondere bevorzugt sind dabei Reste R4, der folgenden Strukturen : wobei weiter bevorzugt R6 und R7 gleich Wasserstoff sind.

Ganz besonders bevorzugt sind Reste R4 der folgenden Strukturen : wobei weiter bevorzugt R6 und R7 gleich Wasserstoff sind.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Verbindung, wie oben be- schrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass R4 ausgewählt wird aus der Gruppe be- stehend aus

Insbesondere bevorzugt ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung der im Rest R3 ent- haltene Rest R4 der Struktur Hinsichtlich des Restes R2 sind generell sämtliche unter die Definition gemäß (ii) fal- lenden Reste möglich. Demgemäß sind als Arylgruppen beispielsweise die Phenylgrup- pe oder die Naphthylgruppe denkbar, wobei mindestens eines der C-Atome dieser A- rylgruppe durch ein Heteroatom, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus S, N und O, ersetzt sein kann. Besonders bevorzugt ist als Rest R2 ein Phenylrest. Als ein mindes- tens ein Heteroatom enthaltender Arylrest sind Thienyl und Pyridyl bevorzugt.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung eine Verbindung, wie oben beschrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass R2 ein mindestens einfach substituierter Phenylrest, Thienylrest oder Pyridylrest ist.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der R2 ein mindestens einfach substituierter Phenylrest.

Der Arylrest, besonders bevorzugt der Phenylrest, R2 weist mindestens einen wie oben definierten Substituenten R4 auf, wobei eine der Strukturen bevorzugt ist.

Besonders bevorzugt ist dabei ein Substituent R4, der ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Ganz besonders bevorzugt als Rest R4 ist ein Substituent der Struktur

Der Substituent R4 kann generell an sämtlichen Positionen des Arylrestes positioniert sein. Bezüglich des besonders bevorzugten Phenylrestes ist demgemäß die 2-, 3-oder 4- Stellung des Restes R4 möglich, wobei besonders bevorzugt die 3-Stellung des Restes R4 am Phenylrest ist.

Neben dem Rest R4 kann der Arylrest weiter mindestens einen weiteren Substituenten aufweisen. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist der Arylrest einen einzigen Substituenten auf.

Die Alkylengruppe, mit der der Rest R2 an das alpha-C-Atom der mittelständigen Ami- nosäure gemäß (I) gebunden ist, weist im allgemeinen 0 bis 3 C-Atome auf. Bevorzugt weist diese Alkylengruppe 1, 2 oder 3 C-Atome, besonders bevorzugt 1 oder 2 C-Atome und ganz besonders bevorzugt 1 C-Atom auf.

Demgemäß beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verbindung, wie oben beschrie- ben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie die folgende Struktur aufweist :

Die oben gezeigte Struktur kann am oc-C-Atom des 3-Amidinophenylalanins generell sowohl in der der D-als auch in der L-Konfiguration vorliegen. Besonders bevorzugt ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung die L-Konfiguration. Ganz allgemein können die erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß (I) hinsichtlich der mittelständigen alpha- Aminosäure entweder in der L-oder in der D-Konfiguration oder als Racemat vorlie- gen.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Verbindung, wie oben be- schrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass k = 1 und R2 ein mit einer Amidi- nogruppe meta-substituierter Phenylrest ist, wobei das dadurch entstehende 3- Amidinophenylalanin in der L-Konfiguration vorliegt.

Grundsätzlich können die Verbindungen gemäß (I) bei Vorliegen eines neben dem oben erwähnten asymmetrischen C-Atoms weiteren asymmetrischen C-Atoms oder eines anderen Asymmetriezentrums sowohl in der L-als auch in der D-Konfiguration oder S- oder R-Konfiguration vorliegen. Ebenso kann die Verbindung gemäß (I) als Racemat vorliegen. Weiterhin sind Mischungen aus L-und D-Konfiguration oder S-und R- Konfiguration möglich, bei denen der Anteil der Moleküle mit D-Konfiguration oder der Anteil der Moleküle mit L-Konfiguration beziehungsweise der Anteil der Moleküle mit S-Konfiguration oder der Anteil der Moleküle mit R-Konfiguration überwiegt.

Als Rest Ri kann generell jeder der gemäß obiger Definition gemäß (i) beschriebene Rest Ri vorliegen.

Ist der Rest Ri beispielsweise mit mindestens einem Halogen substituiert, so sind hier- bei Fluor, Chlor und/oder Brom bevorzugt.

Ist der Rest Ri beispielsweise mit mindestens einer veresterten Carboxylgruppe substi- tuiert, so sind Methylester und/oder Ethylester bevorzugt.

Ist der Rest Ri beispielsweise mit mindestens einer Aminogruppe substituiert, so kann diese Aminogruppe acyliert sein, wobei insbesondere die Acetylgruppe bevorzugt ist.

Beispielsweise besonders bevorzugt sind mono-, bi- oder tricyclische Arylreste und Heteroarylreste, bei denen gegebenenfalls mindestens eine Doppelbindung hydriert ist und/oder die mindestens ein Heteroatom, ausgewählt aus O, S und N aufweisen, wobei ein Heteroarylrest Rl auch zwei oder mehr gleiche oder verschiedene Heteroatome ent- halten kann. Beispiele für bevorzugte Arylreste sind etwa Phenyl, Naphthyl, Anthracyl oder Phenanthryl. Diese Arylreste können gegebenenfalls in reduzierter oder/und oxi- dierter Form vorliegen. Hinsichtlich des Naphthylrestes ist beispielsweise ein 1,2- Dihydronaphthyl, ein 1, 4,-Dihydronaphthyl oder auch ein 1,2, 3,4- Tetrahydronaphthylrest möglich. In oxidierter Form kann der Naphthylrest beispiels- weise als 1,4-Naphthochinoylrest vorliegen. Der Anthrachinoylrest kann in oxidierter Form beispielsweise als 1, 4- oder 9,10-Anthrachinoylrest oder 1, 4-oder 9,10- Anthrahydrochinoylrest vorliegen, der Phenanthrylrest beispielsweise als Phenanthren- chinoylrest. Beispiele für Heteroarylreste sind etwa Pyrrolyl, Furanyl, Thiophenyl, Py- ridyl, Pyrimidyl, Pyrazyl, Triazyl, Imidazolyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Indolyl, Purinyl, Pyronyl, Pyridonyl, Quinolyl, Isochinolyl. Ebenso sind auch Reste Ri wie Indenyl oder Tetrahydroindenyl umfasst.

Weiter kann der Rest Ri geeignet substituiert sein, wobei als Substituenten beispiels- weise lineare, verzweigte oder cyclische Alkylreste mit 1 bis 10 C-Atomen bevorzugt sind. Besonders bevorzugt sind lineare oder verzweigte Alkyreste mit 1, 2,3, oder 4 C-

Atomen. Beispielsweise besonders bevorzugt sind als Substituenten Isopropyl und tert- Butyl. Ebenso sind cyclische Alkylreste als Substituenten bevorzugt, wobei cyclische Alkylreste mit 5,6 oder 7 C-Atomen und insbesondere 6 C-Atomen besonders bevor- zugt sind. Ebenfalls zu nennen sind Aryl-oder Heteroarylgruppen als Substituenten, wobei die Heteroarylgruppen ein Heteroatom, ausgewählt aus N, S und O, enthalten und zwei oder mehr gleiche oder verschiedene Heteroatome enthalten können. Die Substi- tuenten des Restes Rl können wiederum selbst geeignet substituiert sein.

Sowohl Heteroaryl-und Aryl-als auch Alkylreste können hierbei durch ein Schwefel- brückenatom oder ein Sauerstoffbrückenatom oder über eine Alkylenkette mit 1-3 C- Atomen an den Rest Ri gebunden sein. Demgemäß kann der Rest Rl beispielsweise mit einer Alkyloxy-, Alkylthio-, Acyloxy-, Arylthio, Heteroaryloxy-oder Heteroarylthi- ogruppe substituiert sein.

Beispiele für substituierte Reste Ri sind etwa

Ein bevorzugt vorliegender Arylrest kann grundsätzlich auch mehr als einen Substituen- ten tragen. Besonders bevorzugt sind Ausführungsformen, bei denen der Arylrest kei- nen, einen, zwei oder drei Substituenten aufweist. Weist der Arylrest beispielsweise drei.

Substituenten auf, so sind unter anderem Alkylrest mit 1, 2 oder 3 C-Atomen bevorzugt.

Besonders bevorzugt sind Alkylreste mit 2 oder 3 C-Atomen, insbesondere bevorzugt Alkylreste mit 3 C-Atomen, und insbesondere besonders bevorzugt Isopropyl. Insbe- sondere bevorzugt ist hierbei beispielsweise der 2,4, 6-Triisopropylphenylrest.

Weist der Arylrest beispielsweise einen Substituenten auf, so ist unter anderem der tert- Butylrest bevorzugt.

In einer weiteren geeigneten Ausführungsform ist der Rest Ri ein Arylrest, vorzugswei- se ein Phenylrest, der mit einem weiteren Arylrest oder Heteroarylrest über ein Sauer- stoffbrückenatom oder über eine Alkylenkette mit 1-3 C-Atomen wiederum mit einem Aryl-, Heteroaryl-oder Alkylrest substitutiert ist. Dabei kann der Aryl-oder Heteroarly- rest, beispielsweise ein Pyridin, unsubstituiert oder ebenfalls, an geeigneter Position, in ortho, meta oder para-Position, substituiert sein, beispielsweise mit mindestens einer Alkylgruppe, wie zum Beispiel einer Methylgruppe und/oder mit mindestens einem Halogenatom, vorzugsweise mit einem Chloratom oder zwei Chloratomen oder einem der zwei Fluoratomen und/oder mit mindestens einer Trihalogenmethylgruppe, vor- zugsweise mit einer oder zwei einer Trifluormethylgruppe (n) und/oder mit mit mindestens einer Alkoxygruppe, vorzugsweise einer Methoxygruppe.

Beispiele derartiger Reste Ri sind etwa

wobei der die beiden Aryle verbindende Sauerstoff durch eine Alkylenkette mit 1-3 C- Atomen ersetzt sein kann.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Rest Ri ausgewählt aus tert-Butylphenyl, Cyclohexylphenyl, 5,6, 7, 8-Tetrahydronaplitliyl, Naphthyl, Anthracyl, Anthrachinoyl und Anthrahydrochinoyl, Pyridyloxyphenyl, Phenyloxypyridyl, Pyridyl- alkylphenyl mit einem Cl-C3-Alkyl.

Die Alkylengruppe, die den Rest Ri und die Sulfonylgruppe verknüpft, weist im Allge- meinen kein, ein oder zwei C-Atome auf. Bevorzugt weist sie kein oder ein C-Atom auf, wobei sie insbesondere bevorzugt kein C-Atom aufweist und damit nicht vorhanden ist.

Eine alternative Ausführungsform der Erfindung sind Verbindungen der Formel I" wobei RI, R2, Q, j und k definiert sind wie oben beschrieben, m = n = 2 ist und R3 ein Aryl-oder Heteroarylrest ist, und wobei der Arylrest vorzugsweise ein Benzyl-oder ein Phenoxy-Rest ist und der Heteroarylrest vorzugsweise ausgewählt ist aus einem Pyridi- nylmethylen-, Pyridinyloxo-, Pyrimidinyloxo-, Pyrazinyloxo-, Pyridinylthiorest und wobei der Aryl-oder Heteroarylrest unsubstituiert oder substituiert ist mit mindestens einem Halogen, vorzugsweise Fluor oder Chlor, mindestens einem Alkoxyrest vor- zugsweise Methoxyrest und/oder mindestens einem Trifluormethylrest.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Rest R3 ein Guanidinooxyalkyl- rest.

Beispiele derartiger Verbindungen sind Verbindungen in denen der Baustein

in Formel I"ersetzt ist durch

welche kommerziell erhältlich sind von Array Bipharma, Bolder Colorado, U. S. A..

Ebenso umfasst sind Verbindungen, in denen zwischen der Sulfonylgruppe und der 3- Amidinophenylalaningruppe der Formel 1 eine Aminosäure, vorzugsweise Glycin, ein- gebaut ist.

Die oben beschriebenen Verbindungen können generell gemäß. sämtlicher geeigneter Verfahren hergestellt werden. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Verbindungen durch Verfahren hergestellt, bei denen in einem ersten Schritt ein Sulfonsäurechlorid mit einer Aminosäure oder einem Aminosäurederivat umgesetzt wird.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer wie oben beschriebenen Verbindung, das den folgenden Schritt (S1) umfasst : (S1) Umsetzung einer Verbindung der allgemeinen Struktur (E1') mit einer Verbindung der allgemeinen Struktur (E1") unter Erhalt einer Verbindung der allgemeinen Struktur (ZP1) wobei R2"der Arylrest R2, substituiert entweder mit R4 oder mit R4, geschützt mit einer geeigneten Schutzgruppe, oder mit einem Substituenten, der eine Vorstufe zu R4 darstellt.

Ist der Arylrest R2 beispielsweise bevorzugt mit einer Amidinogruppe R4 substituiert, so ist der Substituent, der eine Vorstufe zur Amidinogruppe darstellt, beispielsweise eine Cyanogruppe, die in einer, bevorzugt zwei oder mehr geeigneten Verfahrensstufen durch Umsetzung mit Hydroxylamin und anschließender Hydrierung zu einer Amidi- nogruppe umgewandelt werden kann. Diese Amidinogruppe kann im Folgenden wie- derum mit einer geeigneten Schutzgruppe geschützt werden, die in einem geeigneten Verfahrensschritt wieder entfernt werden kann.

Werden erfindungsgemäße Verbindungen der allgemeinen Struktur (I") hergestellt, bei denen die Gruppe Q gleich Stickstoff ist und die Alkylengruppe Al nicht vorhanden ist, so sind Herstellungsverfahren bevorzugt, bei denen, ausgehend von einer Verbindung der Struktur (ZP1), diese zunächst in einem Schritt (S2') mit einer cyclischen Verbin- dung der allgemeinen Struktur (E2') umgesetzt, wobei W eine geeignete Schutzgruppe ist. Dabei wird eine Verbindung der allgemeinen Struktur (ZP2') erhalten, aus der in einem nachfolgenden Schritt (S3') bevorzugt die Schutzgruppe W abgespalten wird. In einem nächsten Schritt (S4') wird die gemäß (S3') erhaltene Ver- bindung mit einer Verbindung der allgemeinen Struktur (E2") HOT=A2R4 (E2") umgesetzt, wobei eine Verbindung der allgemeinen Struktur (P1) erhalten wird, wobei R4'entweder R4 oder R4, geschützt mit einer geeigneten Schutzgruppe, oder eine Vorstufe zu R4 darstellt. Ist R4'ein mit einer Schutzgruppe geschützter Rest R4, so wird bevorzugt nach Schritt (S4') die Schutzgruppe entfernt.

Erfindungsgemäß kann dann als Rest R4 eine Aminogruppe vorliegen. Aus dieser kann in einem nächsten Schritt gemäß einem dem Fachmann bekannten Verfahren, bei- spielsweise durch Umsetzung mit Pyrazolcarboxamidin, eine Guanidinogruppe aufge- baut werden.

Ein ebenfalls bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Verbindung gemäß (I"), bei denen die Gruppe Q gleich Stickstoff ist und die Alkylengruppe A1 nicht vorhanden ist, umfasst einen Schritt (S2'), bei dem eine Verbindung der allgemeinen Struktur (E2"') wobei W eine geeignete Schutzgruppe ist, mit einer Verbindung der allgemeinen Struk- tur (E2")<BR> <BR> <BR> HOTA2 R4 (E2) umgesetzt wird, wobei eine Verbindung der allgemeinen Struktur (ZP2") erhalten wird, bei der R4'entweder R4 oder R4, geschützt mit einer geeigneten Schutz- gruppe, oder eine Vorstufe zu R4 darstellt. In diesem Verfahren wird also zuerst der C- terminale Rest der mittelständigen Aminosäure gemäß (I) aufgebaut. In einem nächsten Schritt (S3') wird bevorzugt die Schutzgruppe W abgespaltet, und in einem nächsten Schritt (S4') die gemäß (S3') erhaltene Verbindung mit einer Verbindung der allgemei- nen Struktur (ZP1) unter Erhalt einer Verbindung der allgemeinen Struktur (P1) umge- setzt. Ist hierbei der Rest R4 eine Aminogruppe, so kann auch hier, wie oben beschrie- ben, daraus eine Guanidinogruppe aufgebaut werden.

Werden erfindungsgemäße Verbindungen der allgemeinen Struktur (I") hergestellt, bei denen die Gruppe Q gleich CH ist, so sind Herstellungsverfahren bevorzugt, bei denen ausgehend von Verbindungen gemäß (ZP1) diese in einem Schritt (S2") mit einer Ver- bindung der allgemeinen Struktur (E3) umgesetzt werden, wobei R4'entweder R4 oder R4, geschützt mit einer geeigneten Schutzgruppe, oder eine Vorstufe zu R4 darstellt. Durch diese bevorzugte Umsetzung wird eine Verbindung der allgemeinen Struktur (P2) erhalten. Ist R4'ein mit einer Schutzgruppe geschützter Rest R4, so wird bevorzugt nach Schritt (S2") die Schutzgruppe entfernt. Erfindungsgemäß kann dann als Rest R4 eine Aminogruppe vorliegen. Aus dieser kann in einem nächsten Schritt gemäß einem dem Fachmann bekannten Verfahren, beispielsweise durch Umsetzung mit Pyrazolcarboxa- midin, eine Guanidinogruppe aufgebaut werden.

Werden erfindungsgemäße Verbindungen der allgemeinen Struktur (I") hergestellt, bei denen T gleich- (C=0)-NH- ist, Q gleich CH ist und A1 nicht vorhanden ist, so sind Herstellungsverfahren bevorzugt, bei denen in einem Schritt (S2"') zunächst Verbindun- gen der allgemeinen Struktur (E3')

mit einer Verbindung der allgemeinen Struktur (E3") H2NA2R4 (E3") umgesetzt werden, wobei eine Verbindung der allgemeinen Struktur (ZP3) erhalten wird. Der Rest R4'hat die bei den oben beschriebenen weiteren Herstellverfah- ren beschriebene Bedeutung. W ist auch hier eine geeignete Schutzgruppe. In einem nächsten Schritt wird die Schutzgruppe W gemäß einem geeigneten Verfahren bevor- zugt in einem Schritt (S3"') entfernt. Bevorzugt schließt sich daran ein Schritt (S4"') an, bei dem die gemäß (S3"') erhaltenene Verbindung mit einer Verbindung gemäß (ZP1) umgesetzt wird, wobei eine Verbindung der allgemeinen Struktur (P3)' erhalten wird. Ist R4'ein mit einer Schutzgruppe geschützter Rest R4, so wird bevorzugt nach Schritt (S2"') die Schutzgruppe entfernt. Erfindungsgemäß kann dann als Rest R4 eine Aminogruppe vorliegen. Aus dieser kann in einem nächsten Schritt gemäß einem dem Fachmann bekannten Verfahren, beispielsweise durch Umsetzung mit Pyrazolcar- boxamidin, eine Guanidinogruppe aufgebaut werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsfbrm dieser zuletzt beschriebenen Verfahrensva- riante kann als Verbindung der allgemeinen Struktur (E3") beispielsweise eine Verbin- dung eingesetzt werden, die als Rest R4'eine Vorstufe zu einem erfindungsgemäßen Rest R4 aufweist, wobei diese Vorstufe eine-CN-Gruppe ist. In einem oder mehreren geeigneten Schritten wird diese-CN-Gruppe weiter bevorzugt gemäß einem dem Fach- mann bekannten Verfahren, beispielsweise durch Umsetzung mit einem Hydroxylamin, anschließender Umsetzung mit Essigsäureanhydrid und nachfolgender Hydrierung, zu einer Amidinogruppe aufgebaut. Gemäß einer anderen Ausführungsform des erfin- dungsgemäßen Verfahrens kann das Hydroxyamidino-Derivat direkt durch Hydrierung in ein Amidin-Derivat überführt werden, wobei die Amidinogruppe gegebenenfalls nochmals intermediär mit einer geeigneten Schutzgruppe geschützt wird. Ganz beson- ders bevorzugt erfolgt die Umsetzung mit Hydroxylamin nach dem Schritt (S2"') und vor dem Schritt (S3"'). Weiter besonders bevorzugt erfolgt die Umsetzung mit Essigsäu- reanhydrid ebenfalls vor dem Schritt (S3"'). Die Hydrierung zur Amidinogruppe erfolgt bevorzugt nach dem Schritt (S4"').

Ganz besonders bevorzugt erfolgt die Endreinigung der gemäß derart hergestellten Ver- bindungen über präparative, reversed-phase HPLC oder durch Kristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemischsoder durch Gegenstromvertei- <BR> lung.<BR> lung.

Neben den wie oben beschriebenen Verbindungen an sich und Verfahren zu deren Her- stellung betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Arzneimittel, das eine der oben an- gegebenen Verbindungen enthält.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Arzneimittel, enthaltend mindes- tens eine Verbindung gemäß (I) oder ein Salz dieser Verbindung sowie gegebenenfalls pharmazeutisch geeignete Hilfs-und/oder Zusatzstoffe.

Ebenso beschreibt die vorliegende Erfindung eine Verbindung gemäß (I) zur Verwen- dung als Arzneimittel, wobei das Arzneimittel gegebenenfalls zusätzlich pharmazeu- tisch geeignete Hilfs-und/oder Zusatzstoffe enthält.

Geeignete Hilfs-und/oder Zusatzstoffe, die beispielsweise der Stabilisierung und/oder Konservierung des Arzneimittels dienen, sind beispielsweise in H. Sucker et al., Phar- mazeutische Technologie, 2. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1991) offenbart, wobei die diesbezügliche Offenbarung durch Bezugnahme in den Kontext der vorlie- genden Erfindung aufgenommen wird. Zu den pharmazeutisch geeigneten Hilfs- und/oder Zusatzstoffen zählen beispielsweise physiologische Kochsalzlösungen, Rin- ger-Dextrose, Ringer-Laktat, entmineralisiertes Wasser, Stabilisatoren, Antioxidantien, Komplexbildner, antimikrobielle Verbindungen, Proteinaseinhibitoren und/oder inerte Gase.

Generell können die erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß (I) in jedweder Form als Arzneimittel eingesetzt werden. In möglichen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das Arzneimittel beispielsweise in Form einer Tablette, eines Dragees, einer Kap- sel, eines Pellets, Suppositoriums, einer Lösung, insbesondere einer Injektions-oder Infusionslösung, von Augen-, Nasen und Ohrentropfen, eines Safts, einer Kapsel, einer Emulsion oder Suspension, eines Globuli, Styli, Aerosols, Puders, einer Paste, Creme oder Salbe eingesetzt.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Arzneimittel, wie oben beschrieben, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es in Form einer Tablette, eines Dragees, einer Kapsel, eines Pellets, eines Suppositoriums, einer Lösung, insbesondere einer Injekti- ons-oder Infusionslösung, von Augen-, Nasen-oder Ohrentropfen, eines Saftes, einer Emulsion oder Suspension, eines Globuli, eines Styli, eines Aerosols, eines Puders, ei- ner Paste, einer Creme oder einer Salbe eingesetzt wird.

Ebenso beschreibt die vorliegende Erfindung daher auch eine Verbindung gemäß (I) zur Verwendung als Arzneimittel, wobei das Arzneimittel in Form einer Tablette, eines Dragees, einer Kapsel, eines Pellets, eines Suppositoriums, einer Lösung, insbesondere einer Injektions-oder Infusionslösung, von Augen-, Nasen-oder Ohrentropfen, eines Saftes, einer Emulsion oder Suspension, eines Globuli, eines Styli, eines Aerosols, eines Puders, einer Paste, einer Creme oder einer Salbe eingesetzt wird.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die oben genannten Verbindungen gemäß (I) und/oder deren Salze oder die o- ben genannten Arzneimittel, enthaltend diese Verbindungen gemäß (I) und/oder deren Salze und gegebenenfalls mindestens einen pharmazeutisch geeigneten Hilfs-und/oder Zusatzstoff, eingesetzt, um einen Tumor zu diagnostizieren und/oder zu therapieren.

Ebenso ist auch zusätzlich oder alternativ die Prophylaxe eines Tumors möglich, wobei die Verbindungen besonders zur Verhinderung und/oder Reduktion der Metastasierung von Tumoren verwendet werden können.

Eine erfindungsgemäße Verbindung gemäß (I) oder deren Salz oder ein wie oben be- schriebenes Arzneimittel kann ganz allgemein weiterhin beispielsweise in parenteraler Anwendungsfonn, insbesondere in intraartieller, intravenöser, intramuskulärer oder subkutaner Form, in enteraler Anwendungsform, insbesondere zur oralen oder rektalen Anwendung, oder in topischer Anwendungsform, insbesondere als Dermatikum, einge- setzt werden. Bevorzugt sind intravenöse oder subkutane Anwendungen.

Insbesondere sind diese Anwendungsformen zur Diagnose und/oder Therapie und/oder Prophylaxe eines Tumors geeignet.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung einer Verbindung gemäß (I) oder eines Salzes dieser Verbindung oder eines wie oben beschriebenen Arzneimit- tels zur Diagnose, Therapie oder Prophylaxe eines Tumors und zur Verhinderung und/oder Reduktion der Metastasierung eines Tumors, insbesondere in oraler, subkuta- ner, intravenöser oder transdermaler Form.

Ebenso beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Verbindung gemäß (I) oder eines Salzes dieser Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Diagno- se, Therapie oder Prophylaxe eines Tumors und zur Verhinderung und/oder Reduktion der Metastasierung eines Tumors.

Weiter beschreibt die vorliegende Erfindung diese Verwendung zur Herstellung eines oral, subkutan, intravenös oder transdermal anzuwendenden Arzneimittels.

Gemäß einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine erfindungsgemäße Verbindung gemäß (I) zur Reduzierung von Tumormetas- tasen eingesetzt.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung die oben beschriebene Verwendung der Verbindung gemäß (I) oder eines Salzes dieser Verbindung oder eines wie oben be- schriebenen Arzneimittels, wobei die Bildung von Tumormetastasen reduziert wird.

Ebenso beschreibt die vorliegende Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Reduzierung der Bildung von Tumormetastasen.

Ebenso betrifft die vorliegende Erfindung daher insbesondere die Verwendung einer Verbindung gemäß (I) oder eines Salzes dieser Verbindung oder eines Arzneimittels, enthaltend die Verbindung gemäß (I) oder ein Salz dieser Verbindung, zur Hemmung der Matriptase.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung einer Verbindung gemäß (I) oder eines Salzes dieser Verbindung oder eines Arzneimittels, enthaltend die Verbindung gemäß (I) oder ein Salz dieser Verbindung, zur Hemmung der Matriptase, wobei die Matriptase MT-SP1 ist.

Demgemäß beschreibt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, enthaltend eine Verbindung gemäß (I) oder ein Salzes dieser Ver- bindung, zur Hemmung der Matriptase.

Ebenso beschreibt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, enthaltend eine Verbindung gemäß (I) oder ein Salzes dieser Verbindung, zur Hemmung der Matriptase, wobei die Matriptase MT-SP1 ist.

Die oben beschriebenen Verbindungen können auch in Form von Prodrugs, z. B. durch Modifizierung der Amidinogruppe mit einer Hydroxyl-oder einer C1-C6- Alkyloxycarbonylgruppe, vorliegen, die erst nach Aufnahme in den Organismus spon- tan und/oder durch ein oder mehrere körpereigene Enzyme in die inhibitorisch wirksa- me Spezies umgewandelt werden, wodurch die Bioverfügbarkeit und die pharmakokine- tischen Eigenschaften der Verbindungen verbessert werden können.

In den folgenden Beispielen und Figuren wird die Erfindung näher erläutert.

Beschreibung der Figuren Figur 1 zeigt die Hemmung des invasiven Wachstums durch die Matriptase Hemmstoffe 37 und 54 aus Beispiel 9.

Figur 2 zeigt die Hemmung des proHGF induzierten, scatterings'von PC-3 Zellen durch die Matriptase Inhibitoren 37 und 54 aus Beispiel 10.

Beispiele Methoden Analytische HPLC : Shimadzu LC-10A System, Säule : Phenomenex Luna C18, 5lem, 100 Ä (250 x 4,6 mm) Lösungsmittel A : 0,1 % TFA in Wasser, B : 0,1 % TFA in ACN, Gradient : 10 % B bis 70 % B in 60 min, 1 ml/min Fluss, Detektion bei 220 oder 215 nm.

Präparative HPLC : Shimadzu LC-8A System, Säule : Phenomenex Luna Cis, 5 u. m, 100 A (250 x 30 mm) Lösungsmittel A : 0,1 % TFA in Wasser, B : 0,1 % TFA in ACN, Gradient : 10 % B bis 55 % B in 120 min, 10 ml/min Fluss, Detektion bei 220 nm.

Massenspektroskopie : Die Massenspektren wurden auf einem Kompact Probe der Firma Kratos (Manchester, England) mit einem Flugzeitmessungsdetektor und a-

Cyano-Hydroxyzimtsäure als Matrix, bzw. auf einem ESI-MS LCQ der Firma Finnigan (Bremen, Deutschland), gemessen.

Verwendete Abkürzungen Ac Acetyl AcOH Essigsäure ACN Acetonitril ß-Ala ß-Alanin Boc tert.-Butyloxycarbonyl CKIBE Chlorkohlensäureisobutylester DAE 1, 2-Diaminoethan DCM Dichlormethan DIEA Diisopropylethylamin DMF N, N-Dimethylformamid iNip Isonipecotinsäure Ki Hemmkonstante NMM N-Methylmorpholin Phe (3-AcOxam) 3- (Acetyloxamidino) Phenylalanin Phe (3-Am) 3-Amidinophenylalanin Phe (3-CN) 3- (Cyano) Phenylalanin Phe (3-Oxam) 3- (Oxamidino) Phenylalanin PyBop Benzotriazol-1-yl-N-oxytris (pyrrolidino) phosphoniumhexa- fluorophosphat Pzd Piperazid RT Raumtemperatur TFA Trifluoressigsäure THF Tetrahydrofuran Tips 2,4, 6- (Triisopropyl) Phenylsulfonyl Z Benzyloxycarbonyl

Beispiel 1 : Synthese von Anthracensulfonyl-Phe (3-Am)-Pzd-ß-Ala x 2 TFA (Verbindung 10 aus Tabelle 1) la) Boc-Pzd-ßAla-Z 2 g (8,96 mmol) Z-ßAla-OH wurden in 20 ml THF gelöst und bei-15 °C mit 0,99 ml (8, 96 mmol) NMM und 1,17 ml (8,96 mmol) CKIBE versetzt. Der Ansatz wurde 10 min bei-15 °C gerührt, dann wurden 1,67 g (8,96 mmol) Boc-Piperazid (Fluka) und zusätzlich 400 ul (3,6 mmol) NMM zugegeben. Der Ansatz wurde eine weitere Stunde bei-15 °C und weiter über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, der Rückstand in Essigester aufgenommen, jeweils 3 x mit 5 % KHS04, gesättigter NaHCO3-Lösung und NaCl-gesättigtem Wasser gewa- schen und anschließend über Na2SO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Als Rückstand verblieb ein helles Öl, welches über Nacht im Kühlschrank kris- tallisierte.

Ausbeute : 3,2 g (8,17 mmol), HPLC : 51, 69 % B lb) H-Pzd-ßAla-ZxHCl 3,2 g (8,17 mmol) Boc-Pzd-ßAla-Z wurden in Eisessig angelöst, mit 50 ml IN HC1 in Eisessig versetzt und lh unter gelegentlichem Schütteln bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Lösungsmittel wurde teilweise im Vakuum entfernt und das Produkt durch Zugabe von Diethylether gefällt, abgesaugt, nochmals mit Diethylether gewa- schen und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute : 2, 13 g (6,5 mmol) weißer Feststoff, HPLC : 28, 19 % B lc) Boc-Phe (3-CN)-OH 2,5 g (13,1 mmol) H-Phe (3-CN)-OH wurden in 100 ml Dioxan gelöst und bei 0 °C mit 13 ml (13 mmol) IN NaOH und 3,16 g (14,5 mmol) Boc-Pyrocarbonat versetzt. Der Ansatz wurde 20 min bei 0 °C und anschließend 4h bei Raumtemperatur gerührt, dabei wurden insgesamt 7ml (7 mmol) IN NaOH portionsweise zugegeben, dadurch wurde der pH-Wert auf 8-8,5 konstant gehalten. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum ent- fernt, der Rückstand mit Essigester aufgenommen, jeweils 3 x mit 5 % KHS04 und 3 x mit NaCl-gesättigtem Wasser gewaschen und anschließend über Na2S04 getrocknet.

Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Als Rückstand wurde ein weißer Fest- stoff erhalten.

Ausbeute : 2, 11 g (7,3 mmol) weißer Feststoff, HPLC : 45, 93 % B ld) Boc-Phe (3-AcOxam)-OH . 2, 11 g (7,3 mmol) Boc-Phe (3-CN) -OH wurden in 100 ml Methanol gelöst und mit 760 mg (10,95 mmol) Hydroxylamin x HC1 und 1,9 ml (10,95 mmol) DIEA versetzt. Der Ansatz wurde 6 h unter Rückfluss gerührt. Es wurden nochmals 266 mg (3, 84 mmol) Hydroxylamin x HC1 und 665 111 (3, 84 mmol) DIEA zugegeben und der Ansatz wurde weitere 3 h unter Rückfluß und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Als Rückstand verblieb ein helles Öl, das in 50 ml Eisessig gelöst und mit 2 ml (22 mmol) Acetanhydrid ver- setzt wurde. Der Ansatz wird 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, der Rückstand mit Essigester aufgenommen, jeweils 3 x mit 5 % KHS04 und NaCl-gesättigtem Wasser gewaschen und anschließend über Na2S04 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, Ausbeute : 3,31 g (farbloses Öl), HPLC : 26, 59 % B

le) Boc-Phe (3-AcOxam)-Pzd-ßAla-Z 0,92 g (2,8 mmol) H-Pzd-ßAla-Z x HCl und 1,02 g (2,8 mmol) Boc-Phe (3-AcOxam)- OH wurden in 40 ml DMF gelöst und bei 0 °C mit 1,46 g (2, 8 mmol) PyBop und 1,46 ml (8,4 mmol) DIEA versetzt. Der Ansatz wurde 20 min bei 0 °C und weitere 2h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, der Rückstand in Essigester aufgenommen, jeweils 3 x mit 5 % KHSO4, gesättigter NaHC03-Lösung und NaCl-gesättigtem Wasser gewaschen und anschließend über Na2S04 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt.

Ausbeute : 2,49 g (helles Öl), HPLC : 48, 13 % B lf) H-Phe (3-AcOxam)-Pzd-ßAla-Z x HCl 2,49 g Boc-Phe (3-AcOxam) -Pzd-ßAla-Z (Rohprodukt) wurden in Eisessig angelöst, mit 30 ml 1N HCl in Eisessig versetzt und lh unter gelegentlichem Schütteln bei Raumtem- peratur stehen gelassen. Das Lösungsmittel wurde teilweise im Vakuum entfernt und das Produkt durch Zugabe von Diethylether gefällt, abgesaugt, nochmals mit Diethy- lether gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute : 1, 32 g (2,3 mmol) weißer Feststoff, HPLC : 32, 89 % B lg) Anthracensuflonyl-Phe (3-AcOxam)-Pzd-ßAla-Z Bei 0 °C wurden und 207,7 mg (0,361 mmol) H-Phe (3-AcOxam)-Pzd-ßAla-Z, 127 ul (0,73 mmol) DIEA und 100 mg (0,361 mmol) Anthracensulfonylchlorid (Fluka) in 10 ml DMF gelöst. Der Ansatz wurde 20 min bei 0 °C und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, der Rückstand in Essigester aufgenommen, jeweils 3 x mit 5 % KHSO4, gesättigter NaHCO3-Lösung

und NaCl-gesättigtem Wasser gewaschen und anschließend über Na2S04 getrocknet.

Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Als Rückstand blieb ein helles Öl, das ohne weitere Reinigung direkt für den nächsten Syntheseschritt eingesetzt wurde HPLC : 57, 65 % B lh) Anthracensuflonyl-Phe (3-Am) -Pzd-ßAla Das Rohprodukt lg wurde in 50 ml 90 % Essigsäure und 5 ml 1 N HC1 gelöst und mit 30 mg Katalysator (10% Pd/C) versetzt. Der Ansatz wurde bei 40 °C und Normaldruck über Nacht mit Wasserstoff hydriert. Anschließend wurde der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum eingeengt. Ein Teil des Rohproduktes wurde mit präpa- rativer reversed-phase HPLC gereinigt.

HPLC: 34,11 % B MS : berechnet 586,24 (monoisotopic), gefunden 587,79 [M+H] + Beispiel 2 : Synthese von Anthracensulfonyl-Phe (3-Am)-Pzd-CO-CH2-CH2- Guanidino x 2 TFA (Verbindung 11 aus Tabelle 1) 2a) Anthracensulfonyl-Phe (3-Am)-Pzd-CO-CH2-CH2-Guanidino Ca. 115 mg Rohprodukt an Anthracensuflonyl-Phe (3-Am)-Pzd-ßAla (lh) wurde in 10 ml DMF gelöst und mit 90,3 mg (0, 616 mmol) Pyrazolcarboxamidin x HC1 und 107 gl (0,616 mmol) DIEA versetzt. Der Ansatz wurde über Nacht gerührt und anschließend

das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der verbleibende Rückstand wurde im Vakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung mit präparativer reversed-phase HPLC gerei- nigt.

HPLC : 35, 09 % B MS : berechnet 628,26 (monoisotopic), gefunden 629,4 [M+H] + Beispiel 3 : Synthese von 2,4, 6-Triisopropyl-phenylsulfonyl-Phe (3-Am)- iNip-DAE-H x 2 TFA. (Verbindung 3 aus Tabelle 1) 3a) Tips-Phe (3-CN)-OH Zu einer Lösung von 1,05 eq. H-L-Phe (3-CN) -OH (3 g, 15, 8mmol) in Dioxan und 2,1 eq. 1M NaOH (31,5 ml) wurden unter Rühren bei RT eine Lösung von 1 eq. Tips-Cl (97 % ig, 4,69 g, 15 mmol) in Dioxan zugetropft. Dabei wurde der pH-Wert der Lösung kontrolliert und mit 1M NaOH åuf pH 8-9 gehalten. Nach 4 h wurde das LM im Vakuum entfernt, der Rückstand in Essigester aufgenommen, 3 x sauer (5 % KHS04) und 3 x neutral (gesättigte NaCI-Lösung) gewaschen. Die organische Phase wurde über Na2S04 getrocknet, das LM im Vakuum entfernt und das erhaltene Produkt aus Essigester/Hexan umlcristallisiert (gelblich, kristalline Verbindung).

Ausbeute : 6,6 g (96, 3 %) HPLC : 71, 1 % B

3b) Tips-Phe (3-OAm)-OH Eine Lösung von 1 eq. Tips-Phe (3-CN) -OH (3 g, 6,6 mmol), 1,5 eq.

Hydroxylamin x HCl (685 mg, 9,9 mmol) und 3 eq. DIEA (3,4 ml, 19,8 mmol) wurden in absolutem Ethanol gelöst, 4h unter Rückfluß gekocht und anschließend unter nachdosieren von Hydroxylamin x HCl und Base (DIEA, pH 8-9) bei RT gerührt, bis in der HPLC kein Ausgangsmaterial mehr gefunden wurde. Nach Entfernen des LM wurde der Rückstand in Essigester aufgenommen, 3 x sauer (5 % KHSO4) und 3 x neutral (gesättigte NaCl-Lösung) gewaschen. Die organische Phase wurde über Na2S04 getrocknet, das LM im Vakuum entfernt und das erhaltene Produkt aus Essigester/Hexan umkristallisielt.

Ausbeute : 1, 63 g (weiße Kristalle ; 50, 4 %), HPLC : 51, 0 % B 3c) Tips-Phe (3-AcOAm)-OH 1 eq. Tips-Plie (3-OAm)-OH (2,5 g, 5,1 mmol) wurde in 100 ml Eisessig gelöst, anschließend wurde 1,5 eq. Essigsäureanhydrid (724 gl, 7,6 mmol) zugegeben und 15 min gerührt. Nach Entfernen des LM im Vakuum fällt das Produkt als weißes Pulver an.

Ausbeute : 2, 7 g (99, 4 %) HPLC : 64, 5 % B 3d) H-iNip-DAE-Z x HCl 497 mg (2,17 mmol) Boc-Isonipecotinsäure wurden mit 250 pl (2, 27 mmol) NMM in 10 ml getrocknetem THF gelöst. Bei -15°C wurden 296 µl (2, 27 mmol) Isobutylchloroformiat zugegeben und der Ansatz weitere 10 min gerührt. Anschließend wurden 500 mg (2,17 mmol) N-Z-1, 2-Diaminoethan x HCl und 250 1 (2,27 mmol) NMM zugegeben, der Ansatz wurde weiter 1 h bei-15 °C und dann 4h bei RT gerührt.

Das LM wurde im Vakuum entfernt, der Rückstand in Essigester aufgenommen und 3 xsauer (5% KHSO4), 1 xneutral (gesättigte NaCl-Lösung), 3 x basisch (NaHC03 gesättigt) und 3 x neutral (gesättigte NaCI-Lösung) gewaschen. Die Essigester-Phase wurde anschließend über Na2S04 getrocknet und das LM im Vakuum entfernt, wobei das Produkt als amorphe Substanz anfiel (HPLC : 50,3 % B). Das Rohprodukt wurde in 20 ml 1 N Chlorwasserstoff in Eisessig gelöst und lh bei RT stehen gelassen.

Anschließend wurde das LM im Vakuum entfernt und das Produkt lyophilisiert.

Ausbeute : 722 mg HPLC : 26, 4 % B 3e) Tips-Phe (3-Am)-iNip-DAE-H x 2 TFA 150 mg (0, 28 mmol) Tips-Phe (3-AcOAm) -OH wurden mit 97 mg (0,28 mmol) H-iNip- DAE-Z x HC1 in 5 ml DMF gelöst und unter Rühren im Eisbad auf 0 °C gekühlt. Zu der gekühlten Lösung wurden 122 vL1 (0,70 mmol) DIEA und 154 mg (0,29 mmol) PyBOP zugegeben. Nach 15 min wurde das Eisbad entfernt und weitere 2 h bei-RT gerührt.

Anschließend wurde das LM im Vakuum entfernt und der Rückstand in Essigester aufgenommen und 3 x sauer (5 % KHS04), 1 x neutral (gesättigte NaCl-Lösung), 3 x basisch (NaHC03 gesättigt) und 3 x neutral (gesättigte NaCI-Lösung) gewaschen. Die Essigester-Phase wurde anschließend über Na2S04 getrocknet und das LM im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in 90 % igem Eisessig gelöst, mit 10 Gewichtsprozent Katalysator (10 % Pd/C) versetzt und mit Wasserstoff bei RT über Nacht hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das LM im Vakuum bis zur Trockene entfernt und der Rückstand mittels präparativer reversed-phase HPLC gereinigt.

Ausbeute : 92 mg HPLC : 43, 3 % B MS : berechnet 626,36 (monoisotopic), gefunden 628,1 [M+H] +

Beispiel 4 : Synthese von 2,4, 6-Triisopropyl-phenylsulfonyl-Phe (3Am) -iNip-NH- CH2-CH2-Guanidino x 2 TFA (Verbindung 34 aus Tabelle 1) 4a) Tips-L-Phe (3-Am)-iNip-NH-CH2-CH2-Guanidino x 2 TFA 85 mg (0,1 mmol) Tips-Phe (3-Am) -iNip-DAE-H x 2 TFA wurden in 5 ml DMF gelöst und mit 30 mg (0,2 mmol) Pyrazolcarboxamidin und 55 111 (0,3 mmol) DIEA versetzt.

Der Ansatz wurde über Nacht bei RT gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand mit präparativer reversed-phase HPLC gereinigt.

HPLC : 43, 7 % B MS : berechnet 668,38 (monoisotopic), gefunden 669,8 [M+H] +

Beispiel 5 : Synthese von 2-Nas-Phe (3-Am)-4 (Aminoethyl) piperidid x 2 TFA (Verbindung 36 aus Tabelle 1) 5a) 2-Nas-Phe (3-CN) -OH Zu 1,9 g (10 mmol) H-Phe (3CN)-OH, gelöst in 100 ml Dioxan/Wasser-Gemisch und 22 ml 1 N NaOH-Lösung, wurden bei 0 °C 2,49 g (11 mmol) 2-Nas-chlorid (gelöst in Dio- xan) über einen Zeitraum von 30 min zugetropft. Der Ansatz wurde 1 h bei 0 °C und weiter über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand in Wasser gelöst (mit NaOH auf pH 8-9 einge- stellt). Die Wasserphase wurde 2 x mit Diethylether extrahiert und anschließend der pH mit 1 N HC1 auf pH 3-4 eingestellt. Das Produkt wurde 3 x mit Essigester extrahiert und die Essigesterphase jeweils 3 x mit 5 % KHS04 und NaCl-gesättigtem Wasser gewa- schen und anschließend über Na2S04 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Es verblieb ein helles Öl, das im Kühlschrank auszukristallisierte.

Ausbeute : 3,51 g (9 mmol), HPLC : 51, 02% B 5b) 2-Nas-Phe (3-AcOxam)-OH 3,5 g (9 mmol) 2-Nas-Phe (3CN)-OH wurden in 100 ml Methanol gelöst und mit 1,04 g (15 mmol) Hydroxylamin x HC1 und 2,61 ml (15 mmol) DIEA versetzt. Der Ansatz wurde 6 h unter Rückfluss gerührt. Danach wurden nochmals 700 mg (10 mmol) Hydroxylamin x HC1 und 1,74 ml (10 mmol) DIEA zugegeben. Der Ansatz wurde wei- tere 4 h unter Rückfluß und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. An-

schließend wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Als Rückstand verblieb ein helles Öl, das in 50 ml Eisessig gelöst und mit 2,83 ml (30 mmol) Acetanliydrid versetzt wurde. Der Ansatz wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel. wurde im Vakuum entfernt, der Rückstand mit Essigester aufgenommen, 1 x mit 5 % KHS04- Lösung und 3 x mit NaCl-gesättigtem Wasser gewaschen und anschließend über Na2S04 getrocknet. Das Lösungsmittel. wurde im Vakuum nahezu entfernt. Das Produkt begann langsam auszukristallisieren und wurde abgesaugt.

Ausbeute : 3, 02 g (6, 64 mmol) heller Feststoff, HPLC : 44, 04 % B 5c) 2-Nas-Phe (3-AcOxam)-4 (Aminoethyl) piperidid x HCI 100 mg (0,22 mmol) 2-Nas-Phe (3-AcOxam) -OH und 50 mg (0,22 mmol) 4- (2-Boc- Aminoethyl) piperidin (Tyger Scientific Inc., Princeton, NY) wurden in 10 ml DMF ge- löst und bei 0 °C mit 115 mg (0,22 mmol) PyBop und 115 1ll (0,22 mmol) DIEA ver- setzt. Der Ansatz wurde 20 min bei 0 °C und weitere 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mit Essigester aufgenommen, 2 x mit 5 % KHS04-Lösung, 1 x mit NaCl-gesättigtem Was- ser, 2 x mit ges. NaHC03-Lösung und 3 x mit NaCl-gesättigtem Wasser gewaschen und anschließend über Na2S04 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum ent- fernt.

Das Rohprodukt wurde in Eisessig angelöst, mit 5 ml IN HC1 in Eisessig versetzt und lh unter gelegentlichem Schütteln bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Lösungs- mittel wurde im Vakuum entfernt, es verblieb ein helles Öl.

Ausbeute : 105 mg Öl, HPLC : 35,66 % B 5d) 2-Nas-Phe (3-Am)-4 (Aminoethyl) piperidid x 2 TFA Das Rohprodukt 5c wurde in 50 ml 90 % Essigsäure gelöst und mit 15 mg Katalysator (10% Pd/C) versetzt. Der Ansatz wurde bei 40 °C und Normaldruck über Nacht mit

Wasserstoff hydriert. Anschließend wurde der Katalysator abfiltriert und das Lösungs- mittel im Vakuum eingeengt. Ein Drittel des Rohproduktes wurde mit präparativer re- versed-phase HPLC gereinigt.

Ausbeute : 17,6 mg HPLC : 29, 03 % B MS : berechnet 507,23 (monoisotopic), gefunden 508,4 [M+H] + Beispiel 6 : Synthese von 2-Nas-Phe (3-Am) -4 (Guanidinoethyl) piperidid x 2 TFA (Verbindung 37 aus Tabelle 1) 6a) 2-Nas-Phe (3-Am)-4 (Guanidinoethyl) piperidid x 2 TFA.

Ca. 80 mg Rohprodukt an 2-Nas-Phe (3-AcOxam) -4 (Aminoethyl) piperidid x HC1 (5d) wurde in 5 ml DMF gelöst und mit 65 mg (0,45 mmol) Pyrazolcarboxamidin x HC1 und 105 ul (0,6 mmol) DIEA versetzt. Nach 3 h wurden nochmals 21,5 mg (0,15 mmol) Pyrazolcarboxamidin x HCl und 35 111 (0, 15 mmol) DIEA zugegeben und der Ansatz weiter über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der verbleibende Rückstand mit präparativer reversed-phase HPLC gereinigt.

Ausbeute : 42 mg HPLC : 31,19 % B MS: berechnet 549,25 (monoisotopic), gefunden 550,4 [M+H]+

Beispiel 7 : Herstellung der katalytischen Domäne von Matriptase Klonierung : Die katalytische Domäne von Matriptase wurde mit folgendem Primerpaar durch PCR amplifiziert : Sense Primer : 5'-GGCAATTCCATATGAAACATCACCATCATCACCATGTTGTTGGGGGCACGGATGCG- 3' Antisense Primer : 5'-GCATGAATTCTTATACCCCAGTGTTCTCTTTGATCCA-3 'Sense Primer und Antisense Primer wurden so gewählt, dass am 5'-Ende vor der Protcasedomäne (kursiv) eine Ndel Schnittstelle (fett) gefolgt von der Peptidsequenz Met Lys (His) 6 bzw. an das 3'-Ende von Matriptase (kursiv) eine EcoRl Schnittstelle (fett) eingefügt wurden. Das PCR Produkt wurde über Ndel und EcoRl in pET24 (Novagen), einen Vektor für Expression in Escherichia coli, kloniert.

Die katalytische Domäne von Matriptase wurde in inaktiver und unlöslicher Form in Escherichia coli exprimiert, gereinigt, rückgefaltet und anschließend aktiviert. Die Schritte waren im Einzelnen : Expression und Reinigung : BL21 (DE3) Zellen (Novagen), die den Vektor aus der oben beschriebenen Klonierung enthielten, wurden in LB, 30 Fg/ml Kanamycin bei 37 °C und 250 rpm inkubiert. Die Expression wurde bei einer OD600 von 0,6 durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert und die Inkubation für eine Stunde fortgesetzt. Dann wurden die Zellen pelletiert, mit 5 ml Bug Buster Protein Extraction Reagent (Novagen) auf- geschlossen und die DNA mit 25 U/ml pro 1 g Zellpellet Benzonaseo Nuclease (Nova- gen) verdaut. Die Proteinaggregate wurden gewaschen und mit 5 ml Denaturierungspuf- fer (6 M Guanidinium HCL, 10 mM Tris HCI, 100 mM Na Phosphat, pH 8,0) pro 1 g Pellet denaturiert. Unlösliche Bestandteile wurden abzentrifugiert (16 000g, 30 min, 20°C), der Überstand filtriert (0,2 u. m), mit 10 mM ß-Mercaptoethanol versetzt und an- schließend zur Reinigung der katalytischen Domäne von Matriptase auf eine Metal-

Chelat-Chromatographie Säule gegeben (1 ml NiNTA (Qiagen) pro 10 ml Überstand).

Die Säule wurde gewaschen (8 M Urea, 10 mM Tris HCl, 100 mM Na Phosphat, pH 6,3) und das angereinigte Protein mit 8 M Urea, 10 mM Tris HCl, 100 mM Na Phos- phat, pH 4,5 eluiert.

Rückfaltung : Die Matriptase enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, mit Glutathion derivatisiert und anschließend zur Rückfaltung in einer Endkonzentration von 50, ug/ml in Rückfaltungspuffer (50 mM Tris HCl, 0,5 M L-Arginin, 20 mM CaCl2, 1 mM EDTA, 0,1 M NaCl, pH 7,5) verdünnt. Nach 3-tägiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Rückfaltungsansatz filtriert, auf eine Konzentration von > 300 ug/ml aufkonzent- riert (Centricon Plus-80, Amicon) und mittels Gelfiltration (PD 10 Säulen, Pharmacia) in Aktivierungspuffer (20 mM Na Phosphat, 150 mM NaCl, pH 7,0) umgepuffert.

Aktivierung : Da ein korrekt prozessierter N-Terminus Voraussetzung für die Aktivität von Serinproteasen ist, musste zur Aktivierung der rückgefalteten Matriptase das Peptid MK (His) 6 am N-Terminus entfernt werden. Hierzu wurde der Rückfaltungsansatz für 2 h bei 30°C mit 2,5 mU pro 50 llg Protein aktivierter DAPase (Qiagen) inkubiert und die aktivierte Matriptase von der nicht aktivierten Matriptase und der DAPase über Me- talchelat Chromatographie getrennt.

Die Ausbeute an aktiver Matriptase betrug ca. 0,9 mg/1 Bakterienkultur. Die proteolyti- sche Aktivität wurde durch Spaltung des chromogenen Substrates Pefachröme tPA (Pentapharm) nachgewiesen.

Beispiel 8 : Bestimmung der Hemmwirkung von Matriptase mit den in Tabelle 1 aufgelisteten Inhibitoren Zur Bestimmung der Hemmwirkung wurden 200 u. I Tris-Puffer (0,05 M, 0,154 M Na- CI, 5 % Ethanol, pH 8, 0 ; enthält den Inhibitor), 25 pI Substrat (CH3S02-D-HHT-Gly- Arg-pNA ; 2 und 1 mM) und 50 ul Matriptase (0, 5, ug/ml) bei 25'C inkubiert. Nach 3 min wurde die Reaktion durch Zugabe von 25 ul Essigsäure (50%) unterbrochen und

die Absorption bei 405 nm mittels Microplate Reader (Dynatech MR 5000) bestimmt.

Die Ki-Werte wurden nach Dixon (Biochem. J. 55, 170-171, 1953) durch lineare Reg- ression mittels eines Computerprogramms ermittelt. Die Ki-Werte (Tabelle 1) sind das Mittel aus mindestens drei Bestimmungen.

Tabelle 1 : Bestimmung der Kj-Werte für die Hemmung von Matriptase Nr.. Inhibitorstruktur K ;/, uM ---0 1 0 1, 5 S-Phe (3-Am)-NC N 0 0 0 01 2 0 0, 16 S-Phe (3-Am)-N N NH2 . O 0 0 0 0 3 7-\ NH 0, 053 .,/ g-phe (3-Am-NN 0 0 0. NH2 0 4 S-Phe (3-Am)-N N NH2 0, 14 "=\ 6 - o 0 nu 5 S-Phe (3-Am)-N N- HN 0, 057 CH2 0 6-N---'N---NH2 0, 14 ß X < F le (3-Am) N N X NHz 0, 14 p O 0

Beispiel 9 : Hemmung des invasiven Wachstums durch Matriptase Inhibitoren (Matrigel Assay) Ein gängiges Testsystem für invasives Wachstum auf zellulärere Ebene ist der Matrigel- Invasionsassay. Dabei werden Zellen auf eine künstliche extrazelluläre Matrix aufge- bracht und untersucht, wie viele Zellen diese innerhalb eines bestimmten Zeitraumes durchwandern.

Beispielhaft ist hier für die Matriptase Inhibitoren 37 und 54 gezeigt, dass das invasive Wachstum beeinflusst und die Wanderung von Matriptase-exprimierenden Kolonlcarzi- nomzelllinie DLD-1 durchs Matrigel gehemmt wird : Die Vertiefungen einer'Transwell'Platte wurden mit je 10 llg Matrigel beschichtet, je 160 000 DLD-1 Zellen (Dexter et al, Cancer Research 39 : 1020-1025 (1979)) in 100 gl Medium (RPMI 1640, mit 2 % Serumersatz Ultroser HY) wurden aufgebracht und das invasive Wachstum durch die Zugabe von ProHGF in 400 111 Medium mit und ohne Inhibitor (30 uM) stimuliert. Nach 48-stündiger Inkubation bei 37°C und 5 % C02 wur- den die Zellen, die durch die Matrix gewandert waren, fixiert, angefärbt und bei 100-

fächer Vergrößerung fotografiert.

Wie Figur 1 zeigt, wird die Invasion der DLD-1 Zellen durch die extrazelluläre Matrix durch die Zugabe von proHGF stimuliert. Dies deutet darauf hin, dass das Zymogen an der Zelloberfläche aktiviert wird. Dieser Effekt wird durch die Matriptase Inhibitoren deutlich gehemmt.

Beispiel 10 : Hemmung des Zell-Scatterings durch Matriptase Inhibitoren Aufgrund seiner Fähigkeit, das Ablösen von Zellen vom inselförmigen Verband sowie die Ausbreitung der Zellen zu induzieren, wird HGF auch als'scatter factor', bezeichnet.

Diese Funktion kann auf zellulärer Ebene mit Hilfe des sogenannten Scatter Assays' ,... nachgewiesen werden. Hierbei werden Zellen ausgesät und ihre durch die Zugabe von HGF stimulierte Ausbreitung nach einem bestimmten Zeitpunkt dokumentiert. HGF kann durch die Aktivierung der inaktive Proform von HGF (proHGF) gebildet werden.

Im Folgenden wird beispielhaft für die Matriptase Inhibitoren 37 und 54 gezeigt, dass die Aktivierung von proHGF durch zelluläre Matriptase verhindert und das'Scattering'. von proHGF stimulierten Zellen reduziert wird.

Hierfür wurden je 500 Matriptase-exprimierende Prostatakärzinomzellen (PC-3) pro Vertiefung einer 96-well Platte ausgesät, über Nacht in 100 ul Medium ohne fötales Kälberserum (Nut Mix. F-12,2% Ultroser HY) inkubiert (37°C, 5% CO2) und dann das Scattering'mit und ohne Matriptase Inhibitoren (3 p1M) durch die Zugabe von proHGF stimuliert. Nach 6 Tagen wurden die Zellen fixiert, gefärbt und repräsentative Aus- schnitte bei 100-facher Vergrößerung fotografiert.

Wie Figur 2 zeigt, hemmen die Matriptase Inhibitoren 37 und 54 das proHGF induzierte 'Scattering'von PC-3 Zellen.

In den verwendeten Konzentrationen haben weder proHGF noch die Inhibitoren einen Einfluss auf die Proliferation von PC-3 Zellen. Dies spricht dafür, dass der gezeigte Effekt auf einem veränderten'Scatter'-Verhalten und nicht einer veränderten Verdopp- lungszeit der Zellen beruht.