Titulo

NANOPARTíCULA BIOSENSORA, PROCEDIMIENTO DE ELABORACIóN Y SUS APLICACIONES

Sector de la técnica

La presente invención se refiere al campo de los biosensores, en concreto a la utilización de sondas de ácidos nucleicos peptidicos (PNAs) inmovilizadas sobre nanoparticulas para la detección de la hibridación de ácidos nucleicos naturales (DNA o RNA) de secuencias especificas. En particular, las nanoparticulas están compuestas de un núcleo magnético y una capa externa de carácter metálico, sobre la que se inmovilizan las sondas pertinentes con secuencias de bases complementarias a la diana objeto de identificación y detección. Se aprovechan las propiedades magnéticas, eléctricas y ópticas de las nanoparticulas para mejorar el método, centrándose en la diferencia de señal magnética, óptica o eléctrica que se obtiene de dichas nanoparticulas antes y después de la modificación que supone un ensayo de hibridación positivo. El tipo de ensayos al que se refiere la presente invención pueden ser también llevado a cabo espectroscópicamente sobre superficies metálicas macroscópicas.

Antecedentes de la invención

Desde que en 1953 Watson y Crick publicaran la estructura en doble hélice del DNA, y con ello quedara inaugurada la era de la biologia molecular (Watson y Crick, 1953) , los avances de la ciencia en materia de genética, genómica y biotecnologia han sido espectaculares. Una de las aplicaciones analiticas más extendidas del DNA consiste en la detección de otras moléculas de DNA o RNA con secuencias complementarias concretas, dada la especificidad de unión existente entre nucleótidos a través de sus bases

nucleotidicas, lo que se conoce como regla de paridad de Watson-Crick: adenina (A) con timina (T), y guanina (G) con citosina (C) . Asi, una determinada secuencia formada por un cierto número de nucleótidos llega a ser única dentro del genoma de una o más especies, y de esta forma dicha secuencia es utilizable para detectar y caracterizar la presencia del organismo que la posee. Dado el desarrollo tecnológico actual, es incluso posible detectar la presencia de un organismo, cepa o variante que difiere tan sólo en un nucleótido respecto de otras variantes, lo que permite por ejemplo diferenciar entre dos mutantes de un mismo microorganismo.

En el ámbito de la biotecnologia ha supuesto un avance importante el desarrollo de la tecnologia de microarrays, también llamados chips o microchips (Southern y col., 1994; revisiones en Nature Genetics 21, suplemento, 1999; Harris, 2005) , según la cual miles de sondas moleculares, principalmente ácidos nucleicos o proteinas, se pueden fijar covalentemente a un soporte sólido (vidrio, nitrocelulosa, nylon etc.) Mediante microarrays de DNA se pueden realizar experimentos de expresión génica, estudios de polimorfismos de nucleótidos (SNPs) , minisecuenciación y tipado de microorganismos. Esta técnica explota la metodologia experimental desarrollada por E. Southern (Southern, 1975) , según la cual los ácidos nucleicos (tanto cadenas largas como oligonucleótidos cortos) se pueden fijar a un soporte sólido y formar hibridos estables con sus complementarios marcados radiactiva o fluorescentemente. La estabilidad de los hibridos viene determinada por el grado de complementariedad de la secuencia de nucleótidos y por factores externos tales como la fuerza iónica del medio, el pH o la temperatura. (Parinov y col., 1996; Hacia, 1999; Relógio et al., 2002).

En biotecnología también ha resultado relevante el uso de moléculas análogas de los ácidos nucleicos naturales para diversas aplicaciones. Dentro de dichas moléculas, es particularmente interesante el caso de los ácidos nucleicos peptídicos ("Peptide Nucleic Acids", abreviados como PNA) descritos por vez primera por Nielsen y colaboradores en 1991 (Nielsen y col., 1991) . El PNA consiste en un polímero cuyo esqueleto es de naturaleza peptídica, a diferencia del esqueleto de azúcares y fosfatos característico de los ácidos nucleicos naturales (DNA y RNA) . El esqueleto del PNA está formado por unidades de N- (2-aminoetil) glicina unidas por enlaces peptídicos, es aquiral, eléctricamente neutro y carece de átomos de fósforo (Egholm y col., 1992; Egholm y col., 1993) . Al esqueleto del PNA están unidas, mediante enlaces metilencarbonilo, las bases nucleotídicas púricas (A y G) y pirimidínicas (C y T) , en una conformación tal que puedan interaccionar exactamente con las bases nucleotídicas de los ácidos nucleicos naturales .

El PNA se caracteriza por su capacidad para hibridarse de manera estable y especifica con DNA complementario, de acuerdo con las reglas de paridad de bases de Watson-Crick (Egholm y col., 1993) . De hecho, los PNAs de cadena sencilla (ssPNA) presentan mayor afinidad por el ssDNA complementario que el propio ssDNA de secuencia igual a la del PNA. Esto se debe principalmente al carácter eléctricamente neutro del PNA, que evita fenómenos de repulsión entre cadenas presentes en la interacción DNA-DNA (Nielsen y col., 1991; Wittung y col., 1994). La alta afinidad del PNA por el DNA permite incluso la hibridación de ssPNA a DNA de cadena doble (dsDNA) mediante un proceso denominado "invasión de hebra" (Demidov y col., 1995; Nielsen, 2001; Demidov y col., 2002) y permite usar sondas de PNA para inducir recombinación y/o bloqueo específico de genes concretos (Rogers y col., 2002) . Además, la

interacción del PNA al DNA es muy especifica, y prácticamente para todos los pares de bases que pueden formarse, la diferencia en estabilidad térmica entre el apareamiento correcto y el incorrecto es mayor en un dúplex PNA-DNA que en el dúplex DNA-DNA (Egholm y col., 1993). Por tanto, la diferencia de temperatura entre aquélla a la que se produce un apareamiento completo y aquélla en la que una de las bases está desapareada es mayor en el caso PNA-DNA que en el DNA-DNA. Con ello, un biosensor basado en sondas inmovilizadas de PNA será potencialmente más eficiente que otro basado en DNA para la detección de mutaciones y SNPs en una molécula de ácido nucleico diana.

Dada la estructura de su esqueleto peptidomimético artificial, el PNA no es sensible a la acción de enzimas biodegradadoras naturales como DNasas, RNasas o proteasas, por lo que su estabilidad biológica es mucho mayor que la del DNA o RNA. (Nielsen, 1999) . Finalmente, la insensibilidad del PNA a las variaciones de pH o de fuerza iónica hacen que posea también mucha mayor estabilidad quimica y ofrezca mayores posibilidades experimentales para su hibridación a distintas moléculas en diferentes composiciones del medio (Egholm y col., 1993; Kambhampati y col., 2001) . Por todo ello, es evidente el interés que posee aprovechar las peculiaridades fisico-quimicas del PNA para su uso en sistemas de detección y cuantificación de ácidos nucleicos naturales .

Algunos de los cambios fisico-quimicos asociados a la hibridación PNA/DNA o PNA/RNA son obvios . Uno de ellos es el aumento de masa que conlleva este apareamiento; a este respecto se han desarrollado biosensores de PNA/DNA (RNA) que utilizan la microbalanza de cristal de cuarzo como instrumento muy sensible para la detección de los pequeños cambios de masa que tienen lugar tras la hibridación entre secuencias complementarias (Wang y col., 1997) o bien la

espectrometría de masas en la modalidad MALDI-TOF (Griffin y col., 1997; Arlinghaus y col., 2003; Brandt y col, 2003).

Además, se han desarrollado otros sistemas de detección de la hibridación entre una sonda de PNA y la diana de DNA que basan la detección de la hibridación en la aparición de una señal de fósforo, puesto que este elemento no está presente en la cadena de PNA pero sí forma parte del esqueleto de las cadenas del DNA (o RNA) diana. Esta posibilidad se ha puesto de manifiesto Arlinghaus y colaboradores con la técnica SIRIMP (Sputter-Initiated Resonance Ionization Microprobe Phosphorous Image) (Arlinghaus y col., 1997). Resultados análogos han sido obtenidos por parte de los inventores de la presente invención utilizando la técnica de Espectroscopia de Fotoemisión de Rayos X (XPS) en sondas de PNA inmovilizadas sobre placas planas con una superficie de oro, antes y después de la hibridación a dianas de DNA complementarias . Mediante XPS se ha observado que con la hibridación (y tras el correspondiente lavado en condiciones controladas para evitar la unión inespecífica de la diana) se produce un incremento de entre 2 y 4 veces en la señal de nitrógeno

(pico de fotoemisión correspondiente al NIs, normalizado al pico Au4f del sustrato) , y la aparición de una señal de fósforo (pico P2p normalizado a Au4f) que no existía en el PNA (Briones y col., 2004; Briones y col., 2005).

La realización de muchos de estos ensayos en fase homogénea presenta numerosas dificultades debido a lo extremadamente diluidas que habitualmente están las moléculas diana de DNA o RNA en las muestras naturales, por lo que suele realizarse la reacción de hibridación sobre superficies en las que se ha inmovilizado previamente la molécula sonda de PNA. Esto representa una limitación del ensayo ya que la cantidad de sonda se limita a una capa de moléculas de PNA sobre la superficie en cuestión, con la

que forzosamente debe ponerse en contacto la muestra a analizar para dar una señal positiva. Con ello, la sensibilidad y el limite de detección de estas técnicas es también limitado. Llegados a este punto, el uso de nanoparticulas, y en particular nanoparticulas magnéticas, supone un salto muy significativo, ya que una pequeña cantidad de nanoparticulas magnéticas puede ser resuspendida en grandes volúmenes de muestra y ser recuperada posteriormente mediante la aplicación de un campo magnético externo. Asi, es posible purificar y/o pre-concentrar cantidades muy minoritarias y diluidas del DNA diana que especificamente se hibrida con el PNA inmovilizado sobre las nanoparticulas, con lo que se reduce el limite de detección en gran medida. Este tipo de sistemas permite determinar la presencia de secuencias de DNA concretas de interés en situaciones donde una detección precoz de la misma puede ser critica, por ejemplo para evitar los efectos perjudiciales que tuviera la existencia de las especies o cepas de organismos que poseen dichas secuencias caracteristicas . Este hecho posee gran aplicación en biomedicina humana y veterinaria, entre otros en los siguientes aspectos: i) detección de patógenos de tipo viral, bacteriano, fúngico o protozoario; ii) caracterización de mutaciones o polimorfismos genéticos

(SNPs) en dichos agentes que pueden hacerlos resistentes a fármacos o facilitar su escape al sistema inmune o a vacunas; iii) caracterización de mutaciones o SNPs en genes humanos o animales, relacionados con enfermedades o con propensión a ellas; iv) detección de marcadores tumorales concretos. Asimismo, este potencial de detección presenta importantes aplicaciones en alimentación y control medioambiental, en aspectos que incluyen los siguientes: i) detección de microorganismos concretos, patógenos o

contaminantes; ii) detección de la presencia de organismos manipulados genéticamente (OMG) o transgénicos, pudiendo cuantificarse si su presencia está por encima de los limites permitidos . En todos estos casos se puede conseguir analizar un volumen importante de muestra usando apenas unos microgramos de nanoparticulas en suspensión, que posteriormente son concentrados mediante un campo magnético externo. Con ello, es posible aumentar en varios órdenes de magnitud la sensibilidad de la detección. De particular interés para las aplicaciones analiticas que se contemplan en esta patente de invención son los ferrofluidos, que son suspensiones estables de nanoparticulas ferro ó ferrimagnéticas, con una estrecha distribución de tamaños de particula. Este tipo de nanoparticulas se obtenian, en un principio, mediante el molido mecánico de muestras de óxidos de hierro con propiedades magnéticas. Sin embargo este método, además de ser costoso y lento, produce una elevada distribución de tamaño en las particulas obtenidas . La alternativa surgió con los métodos de co-precipitación, en los que se utilizan sales disueltas con los iones apropiados (por ejemplo, Fe ²⁺ y Fe ³⁺ en relación 1:2) y se llevan a unas condiciones en las que dicha disolución se vuelva inestable y precipite el sólido deseado (en el mismo ejemplo, la precipitación se consigue llevando la disolución a NaOH I M a ebullición) . Estos métodos producen unas nanoparticulas suficientemente pequeñas como para presentar superparamagnetismo . Este fenómeno supone que en una particula, debido a su minúsculo tamaño, sólo hay un dominio magnético permanente, pero que tiene capacidad de rotar. Consecuentemente, en un ferrofluido cada nanoparticula tiene su momento magnético orientado al azar y se anulan unos a otros, de modo que en ausencia de un campo externo el fluido se comporta como si no se tratase de un sólido magnético. Al someterse a un

campo magnético todas estas nanoparticulas, bien por rotación en el seno de la disolución o bien por orientación de su campo magnético, se orientan según el campo externo. Ello produce una fuerte atracción particula-particula que se transmite por todo el fluido. Aunque obviamente es interesante la posibilidad de que las particulas sean concentradas a través de la aplicación de un campo magnético externo, no es deseable que las interacciones magnéticas sean tan fuertes como para promover una orientación colectiva, y una posible agregación y coagulación.

Por tanto, para obtener un ferrofluido estable bajo un campo magnético moderadamente fuerte, esto es, que la fuerza de atracción entre particulas sea menor que la energia térmica asociada a las particulas, éstas deben ser muy pequeñas. Para que aparezca el monodominio magnético propio del superparamagnetismo, el limite superior del tamaño de particula admitido a temperatura ambiente es de unos 3 nm para hierro, y unos 10 nm para Fe ₃ ü4 (magnetita) y para su forma oxidada μ-Fe2ü ₃ (maghemita) . En el caso de CoFe2θ4 (ferrita de cobalto) , el tamaño de particula puede llegar hasta 20 nm. Por encima de estos limites, particulas demasiado grandes pueden actuar como núcleos de agregación y crecer desestabilizando la suspensión. De esta forma, queda patente que es necesario un tamaño de particula pequeño y una distribución estrecha de tamaños dentro de la población de particulas. Con estas caracteristicas, los ferrofluidos estarán constituidos por fases estables de materiales que pueden ser desplazados o controlados por gradientes magnéticos. Los tres óxidos mencionados, si son sintetizados en un tamaño adecuado y coherente, presentan una alta aplicabilidad para estos fines .

El principal método directo de obtención de nanoparticulas magnéticas de magnetita en disolución, con

una estrecha distribución de tamaño, es a partir de sales de hierro (Massart, 1981) . También se pueden sintetizar nanoparticulas magnéticas mediante métodos de vapor como la pirólisis via láser (Veintenillas y col., 1998), que da lugar a particulas muy dispersas y de muy pequeña saturación magnética, o el método de la llama (Urakawa y col., 1996) que origina particulas polidispersas . También se ha utilizado una red de silice para obtener nanoparticulas magnéticas, pero la distribución de tamaño resulta demasiado amplia (del Monte y col., 1997) .

En la actualidad se conocen varios métodos de sintesis para obtener nanoparticulas esféricas de magnetita en disolución. Según uno de dichos sistemas, una suspensión de hidróxido férrico es parcialmente oxidada con diferentes agentes oxidantes. Se han obtenido particulas esféricas de magnetita de una estrecha distribución de tamaños para rangos seleccionados entre los limites 30 a 1100 nm, mezclando FeSC>4 con KOH en presencia de ion nitrato y llevando el gel resultante a 90 °C durante varias horas (Sugimoto y Matijevic, 1980) . Sin embargo la aplicación de éste método es limitada, ya que las nanoparticulas de magnetita con diámetros superiores a 30 nm ya no son super- paramagnéticas .

No obstante, como se ha indicado el método principal para obtener nanoparticulas esféricas es el de Massart, que consiste en el envejecimiento de una mezcla de disoluciones de hidróxido ferroso y férrico en medio acuoso (Massart y Cabuil, 1987). Con una estequimetria de Fe ² VFe ³⁺ = 0.5 se forman particulas muy homogéneas en tamaño y composición quimica. Además, se ha observado que, ajustando el pH y la fuerza iónica del medio de precipitación, se puede controlar el tamaño medio de las particulas en un orden de magnitud dentro del rango de los nanómetros (entre 1.6 y 12.5 nm) (Jolivet y col., 1983), de modo que el tamaño de

partícula decrece conforme aumenta el pH y la fuerza iónica. Ambos factores determinan el cambio isostático de la superficie de las partículas y en consecuencia la composición química de la superficie. En una de las descripciones de preparación de este material, las partículas esféricas de magnetita entre 8 y 14 nm se obtuvieron variando la naturaleza de la base usada en la precipitación (NH ₄ OH, NaOH o KOH) y la temperatura. Para la precipitación de estas partículas se añadieron 50 mL de una disolución acuosa 0.33 M de FeCl2 y 0.66 M de FeCl ₃ a 450 mL de solución básica 1 M bajo fuerte agitación. Un flujo de N ₂ gas se pasó previamente a través de la solución básica para asegurar que el precipitado final estuviera constituido solamente por magnetita. Las partículas más pequeñas se obtuvieron añadiendo a la mezcla de sales de hierro una disolución de KOH IM con un 1% en peso de poli (alcohol vinílico) (PVA) a temperatura ambiente (Lee y col. , 1996) .

Para sintetizar nanopartículas de CoFe2θ4 se sigue un método similar al método de Massart, en el que se cambia el Fe ²⁺ por Co ²⁺ y alguna otra de las condiciones experimentales, como la temperatura de adición de reactivos al medio básico. El proceso es análogo al de la magnetita ya mencionado previamente (Wagner y col., 2002) . Las partículas magnéticas de tamaño adecuado sintetizadas por los métodos anteriores, tienen un punto isoeléctrico cercano a 7 para la magnetita, y de 9 en el caso de la ferrita de cobalto, lo que las hace muy inestables en disolución acuosa a pHs neutros; a valores de pH ±2 unidades del punto isoeléctrico se nota ya cierta agregación, y a valores ±1.5 unidades de pH precipitan. Por este motivo es necesario recubrirlas de un compuesto que estabilice la suspensión en agua a valores de pH cercanos a la neutralidad. Este recubrimiento puede ser de diversa

índole: polímeros, substancias orgánicas, o bien diferentes metales u óxidos . En el caso de recubrir las partículas con una capa de sílice se consigue una gran estabilidad frente a la agregación, reduciéndose en gran medida las atracciones magnéticas e interacciones de Van de Waals que se producen entre dichas nanopartículas . Además, se proporciona una alta resistencia frente a los tratamientos térmicos (Tartaj y col., 2001) . Un problema que conlleva el recubrimiento con sílice es la baja resistencia mecánica que presenta dicha capa dentro de un tanque de agitación. Por otra parte, este recubrimiento de sílice podría producirse no sobre nanopartículas individuales sino sobre agregados de unas cinco nanopartículas (Philipse y col., 1994) . Por el contrario, la presencia de dicha capa de sílice ofrece varias ventajas además de su estabilización a pH neutro, como por ejemplo la posibilidad de modificar su superficie añadiendo grupos funcionales existentes en moléculas de unión tipo silano. Estas moléculas tienen un grupo trialcoxisilano en uno de sus extremos, y del enlace libre del silicio sale una cadena corta con el grupo funcional pertinente (amino, mercapto, hidróxido, epóxido, etc) en el extremo de la cadena. De esta forma, en lugar de tener las nanopartículas en capa cerrada de sílice se pueden modificar químicamente para crear la superficie funcionalizada deseada.

Así, una modificación con una capa de oro externa se ha llevado a cabo sobre nanopartículas de sílice (Oldenburg y col., 1998) . Para ello se silaniza la superficie de sílice con μ-aminopropiltrietoxisilano, de modo que en la superficie se incorporan multitud de grupos amino. Sobre estos grupos se inmovilizan nanopartículas de oro previamente sintetizadas y se hace una etapa posterior de crecimiento reduciendo iones de oro (III) hasta que se desee, cerrándose la capa de oro sobre la sílice.

Esta capa externa metálica (preferiblemente oro o plata) añade muchas otras propiedades a las nanoparticulas magnéticas recubiertas de silice entre las que merece destacar en relación con la presente invención el de proporcionar una propiedad óptica singular: el fenómeno del plasmón superficial.

Sin embargo, no se conocen nanoparticulas que reúnan todas las propiedades anteriormente descritas y la viabilidad de su uso como soporte para la detección de hibridación entre moléculas orgánicas complementarias y su aplicación en el desarrollo de nuevas herramientas o plataformas tecnológicas en nano-biotecnologia.

Breve descripción de la invención Un primer aspecto de la invención se refiere a una nanoparticula biosensora que comprende: una nanoparticula magnética, una capa de silice, una capa o varias capas externas metálicas que pueden ser de distinta naturaleza y depositadas con distinta alternancia e inmovilizada en su superficie externa, y una capa de moléculas biosensoras orgánicas o inorgánicas, sintéticas o de origen natural con capacidad de unirse a biomoléculas . Preferentemente la nanoparticula biosensora de la invención comprende una nanoparticula magnética de un espesor entre 4-30 nm de diámetro, una capa de silice de una espesor entre 1-20 nm, una capa metálica de un espesor entre 1-200 nm y una capa de moléculas biosensoras orgánicas o inorgánicas, sintéticas o de origen natural con capacidad de unirse a biomoléculas . Un segundo aspecto de la invención se refiere al procedimiento de obtención de la nanoparticula biosensora de la invención comprendiendo las etapas de preparación de un coloide de particulas magnéticas de entre 4-20 nm de tamaño; condicionamiento del coloide para que sea estable a

pHs básicos (mayores de pH=7); recubrimiento de las nanoparticulas coloidales en medio básico con una capa de silice de un espesor entre 1-20 nm; funcionalización quimica de la superficie de las nanoparticulas magnéticas recubiertas de silice de la etapa anterior con una capa metálica y la inmovilización de la molécula biosensora orgánica sobre la superficie de la nanoparticula resultante .

Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a las diversas aplicaciones de las nanoparticulas biosensoras de la presente invención.

Un cuarto aspecto de la invención se refiere a métodos para la determinación de la hibridación o unión de una molécula biológica a la molécula biosensora orgánica o inorgánica inmovilizada a una nanoparticula biosensora de la invención. Preferentemente dichos métodos son pero no se limitan a: métodos de detección espectroscópica utilizando radiación ultravioleta, visible o infrarroja, o espectroscopia Raman, o XPS, o bien métodos de detección electroquimicos .

Otros aspectos de la presente invención resultarán evidentes para un experto en la materia a la vista de la descripción de la invención.

DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS

Figura 1.- Esquema de la nanoparticula biosensora, indicando sus diferentes capas.

Figura 2.- Imagen de Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM) de nanoparticulas de ferrita de cobalto/silice/oro . La imagen posee 120.000 aumentos y la barra blancarepresenta 50 nm.

Figura 3.- Espectros de transmisión en la zona del infrarrojo de nanoparticulas magnéticas con capa externa de oro sobre cuya superficie se ha quimisorbido una capa de

PNA tiolado de secuencia conocida ("P-G", ver Ejemplo 1) , y la misma preparación tras ser incubada en presencia de una molécula complementaria de DNA ("DNA-G", ver Ejemplo 2) y lavada para eliminar las posibles hibridaciones inespecificas .

Figura 4.- Espectros de transmisión en la zona del infrarrojo de nanoparticulas magnéticas con capa externa de oro-plata-oro sobre cuya superficie se ha quimisorbido una capa de PNA tiolado de secuencia conocida "P-G" (ver Ejemplo 1) . En el espectro superior, esas nanoparticulas han sido incubadas con el DNA complementario "DNA MG", que resiste el ciclo de lavado y se mantiene hibridado, mostrando sus bandas caracteristicas en el IR. En el espectro inferior, las nanoparticulas se han incubado con un DNA no especifico "DNA L", que no hibrida al PNA y por tanto es eliminado por completo en el ciclo de lavado; de esta forma, las bandas de IR observadas al final del proceso son únicamente las caracteristicas del PNA (ver Ejemplo 2 ) . Figura 5.- Voltametrias ciclicas de electrodos de oro (discos de 3mm de diámetro) recubiertos de una monocapa de PNA tiolado, incubados en una disolución de DNA complementario (a las concentraciones indicadas en la figura) , lavados y posteriormente incubados en tionina 10 ^~6 M, H2O2 10 ^"3 M y la enzima peroxidasa 0.1 mg/ml .

Descripción detallada de la invención

La presente invención se enfrenta al problema de proporcionar nuevas herramientas para la identificación y caracterización de biomoléculas, y más concretamente nuevos biosensores con capacidad de unirse a ácidos nucleicos con elevada sensibilidad y especificidad.

La invención se basa en que los inventores han observado que es posible identificar la hibridación

específica producida entre ácidos nucleicos naturales (DNA o RNA) y moléculas análogas a ellos (más concretamente, PNA) cuando estas sondas de PNA están inmovilizadas sobre la superficie metálica de nanopartículas con núcleo magnético.

En la superficie de estas nanopartículas magnéticas recubiertas con una capa metálica se puede inmovilizar, gracias a las propiedades de dichas superficies, cualquier tipo de molécula orgánica o inorgánica, siempre que incluya grupos funcionales con capacidad de aceptar densidad electrónica, como los grupos amino o los grupos tiol (ver Ejemplo 1) . Las moléculas inmovilizadas pueden originar o no, disposiciones en forma de monocapas autoensambladas (SAMs) en cuyo caso se obtiene una densidad de empaquetamiento óptima. La formación de SAMs ocurre, por ejemplo, en el caso de la inmovilización de PNAs tiolados sobre superficies de oro.

De esta forma, pueden aprovecharse las nuevas propiedades magnéticas, eléctricas y ópticas -que se encuentran integradas y se complementan entre si- de las nanopartículas con la molécula orgánica o inorgánica inmovilizada sobre su superficie para desarrollar biosensores específicos. En primer lugar, el núcleo magnético permite que dichas partículas puedan ser capturadas por un campo magnético externo y permite la concentración de la muestra analizada cuando ésta se encuentra a bajas concentraciones. En segundo lugar, es posible analizar (ver Ejemplo 2 y 3) la diferencia de señal óptica que producen dichas nanopartículas con una molécula biosensora inmovilizada en su superficie, antes y después de la hibridación de un ácido nucleico complementario presente en una muestra biológica problema.

Además, el metal utilizado como capa externa proporciona una propiedad óptica singular: el fenómeno del

plasmón superficial. Este fenómeno consiste en la vibración colectiva de los electrones de la superficie metálica, provocando una banda de absorción situada en el ultravioleta-visible (caracteristica del metal y del tamaño de las nanoparticulas) a la longitud de onda en que se da la condición de resonancia en dichos electrones . El fenómeno del plasmón superficial también tiene consecuencias en la región de energias de vibración de enlaces quimicos, siendo el causante de los efectos de Surface Enhancement Raman Spectroscopy (SERS) (Vo-Dinh, 1998) y Surface Enhancement InfraRed Absorption (SEIRA) (Osawa y col., 1991) . Estos efectos provocan un aumento considerable en ciertos modos de vibración de las moléculas situadas sobre las superficies metálicas, que en el caso del SERS puede llegar hasta 10 ⁶ veces, mientras que en el SEIRA se puede alcanzar un aumento de 10 ² veces. Estos efectos ópticos de aumento de señal dependen fundamentalmente del material que las provoca (Au, Ag, Cu) , del espesor de la capa y de su rugosidad externa, y también del grosor (en el caso de láminas) o del diámetro de la particula (en el caso de nanoparticulas" y pueden ser medidos por técnicas de espectroscopia.

Finalmente, otra de las propiedades que aporta la superficie metálica es su facilidad para servir de soporte de monocapas autoensambladas, especialmente de grupos tiolados sobre superficies de oro (Madoz y col., 1997; Madoz-Gúrpide y col., 2000; Abad y col., 2002; Briones y col., 2004) .

Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención lo constituye una nanoparticula biosensora que comprende : a) una nanoparticula magnética b) una capa de silice

c) una (o varias) capa(s) externa (s) metálica (s) , que pueden ser de diferente naturaleza y depositadas con distinta alternancia, e inmovilizada en su superficie externa d) una capa de moléculas biosensoras orgánicas o inorgánicas, sintéticas o de origen natural con capacidad de unirse a biomoléculas .

El término "nanoparticula biosensora" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a particulas de un tamaño comprendido entre 5 y 250 nanómetros (nm) , preferentemente entre 50 y 100 nm y más preferentemente de 60 nm que además comprenda todas las caracteristicas descritas anteriormente.

El tamaño de la nanoparticula puede variar en función del espesor de las distintas capas descritas anteriormente que a, titulo descriptivo, pueden variar como sigue: i) particula magnética entre 4 y 30 nm y ii) capa de silice de un espesor entre 1 y 20 nm y iii) capa metálica de un espesor controlado entre 1 y 200 nm

De los numerosos óxidos de hierro que existen (Garcell y col., 1998; Solinas y col., 2001) presentan propiedades magnéticas permanentes la maghemita (μ-Fe2ü ₃ ) y la magnetita (FesCU) . Por otro lado, se puede usar nanoparticulas de ferrita de cobalto (CoFe2θ4) , un compuesto con la misma estructura de espinela inversa caracteristica de la magnetita, en la que el cobalto ha sustituido al hierro de estado de oxidación II. Otro ejemplo de material magnético alternativo a los descritos es el hierro-platino (FePt), aunque no es un óxido.

Por lo tanto, tal y como se utiliza en la presente invención el término "nanoparticula magnética" se refiere a un material magnético, oxidado o no, perteneciente, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la

presente invención, respectivamente, a uno de los siguientes grupos o a cualquier combinación de éstos: i) óxido de hierro, como la magnetita (FesCU) y su forma oxidada maghemita (μ-Fe2ü ₃ ) o un óxido de hierro- cobalto como la ferrita de cobalto (CoFe2ü4) o ii) materiales magnéticos no óxidos como el hierro- platino (FePt) ;

Tal como se utiliza en la presente invención el término "capa externa metálica" se refiere a metales que inducen el incremento de la señal espectroscópica pertenecientes, a titulo ilustrativo y sin que se limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: oro (Au), plata (Ag) , cobre (Cu) , platino (Pt) o una aleación formada por varios o todos estos metales . Tal como se utiliza en la presente invención el término "moléculas biosensoras" se refiere a una molécula biológica o a una molécula análoga a una molécula biológica, de naturaleza orgánica o inorgánica, inmovilizada sobre una nanoparticula que actúa como soporte fisico, con capacidad para unirse o hibridarse especificamente a otras moléculas biológicas o análogas de ellas de forma que se pueda realizar un seguimiento del proceso de unión. Dichas moléculas biológicas o análogos de moléculas biológicas además incluyen un grupo funcional con capacidad de aceptar densidad electrónica que conlleve su quimisorción o fisisorción perteneciente, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, a la siguiente lista: grupos amino, grupos tiol, grupos epoxi, grupos disulfuro, di-alquil sulfuros, asi como las aminas y alcoholes en platino. Las moléculas que poseen dichos grupos funcionales, tanto en la propia estructura de la molécula como por efecto de la adición sintética de dicho grupo, pueden seleccionarse, a titulo

ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, de uno de los siguientes conjuntos: a) biomoléculas naturales: ácidos nucleicos (DNA o RNA) de cadena sencilla o doble, enzimas, anticuerpos, proteinas de membrana, proteinas de choque térmico, chaperoninas, otras proteinas, monosacáridos, polisacáridos, glucoproteinas, ácidos grasos, terpenos, esteroides, otras moléculas de naturaleza lipidica, lipoproteinas, hormonas, vitaminas, metabolitos, hidrocarburos, moléculas naturales con actividad antibiótica o antiviral, o bien agregados macromoleculares compuestos por proteinas y/o ácidos nucleicos u otras combinaciones de las moléculas citadas anteriormente; b) biomoléculas naturales obtenidas por procedimientos de selección in vitro: aptámeros, ribozimas o aptazimas; c) biomoléculas artificiales: PNAs, otros análogos de ácidos nucleicos naturales, quimeras de ácidos nucleicos naturales y artificiales, polimeros con capacidad de reconocimiento de forma ("molecular imprinted polymers" o MIPs) , anticuerpos artificiales, anticuerpos recombinantes, minianticuerpos, o moléculas sintéticas con actividad antibiótica o antiviral.

Tal como se utiliza en la presente invención el término "hibridación" se refiere a la interacción entre dos hebras complementarias de ácidos nucleicos naturales o sus análogos artificiales, o bien, genéricamente, a la interacción especifica entre dos proteinas, un anticuerpo y el antigeno que reconoce, o una proteina de unión y su ligando . Las nanoparticulas de la presente invención también se pueden utilizar en diferentes formatos de biosensores basados en el reconocimiento molecular entre antigeno- anticuerpo, receptor-ligando, enzima-substrato o enzima- inhibidor, en los que el evento de reconocimiento molecular

de lugar a cambios en propiedades ópticas y/o eléctricas del sistema que puedan ser detectadas gracias a la composición y estructura de las nanoparticulas objeto de esta invención: espectroscopia ultravioleta, visible o infrarroja; espectroscopia Raman y "Surface Enhanced Raman Spectroscopy" (SERS) , microscopia Raman; Infrarrojo de transmisión, incluyendo FTIR y microscopia de infrarrojo; "Surface Enhanced InfraRed Absorption" (SEIRA) y "Atenuated Total Reflection Spectroscopy" (ATR) ; técnicas basadas en rayos X, XPS, NEXAFS, XANES.

Tal y como se utiliza en la presente invención el término "ácido nucleico" se refiere a una secuencia de ácido desoxirribonucleico (DNA) , ácido ribonucleico (RNA) o ácido nucleico peptidico (PNA) , de longitud igual o superior a 2 nucleótidos (DNA o RNA) o 2 bases nucleotidicas unidas a su correspondiente esqueleto (PNA) (abreviado como nt) que puede ser de cadena sencilla o cadena doble.

Tal como se utiliza en la presente invención el término "ácido nucleico peptidico (PNA) " se refiere a una molécula análoga estructuralmente al DNA en la que el esqueleto estructural es un polimero de naturaleza peptidica formado por polimerización de N- (2- aminoetil) glicina, al cual las bases nucleicas están unidas mediante enlaces metilencarbonilo .

Tal como se utiliza en la presente invención el término "anticuerpos recombinantes" o "minianticuerpos" se refiere a fragmentos derivados de anticuerpos construidos por tecnologia de DNA recombinante, y que, pese a su menor tamaño, conservan la capacidad de unión al antigeno ya que mantienen al menos un dominio variable de inmunoglobulina

(Fab) donde residen las zonas de unión a antigenos. Los minianticuerpos pueden pertenecer, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente

grupo: Fab, F(ab')2, scFv, y anticuerpos recombinantes monodominio . En el marco de la presente invención, se entiende por anticuerpos recombinantes monodominio y/o dominios tipo inmunoglobulina con capacidad de unión y reconocimiento independiente, tanto a los dominios variables de cadena pesada (VH) , a los dominios variables de cadena ligera (VL) , a los anticuerpos recombinantes de camélidos (VHH) , los anticuerpos recombinantes de camélidos humanizados, los anticuerpos recombinantes de otras especies camelizadas, los anticuerpos monodominio IgNAR de peces cartilaginosos; es decir, se incluyen tanto dominios que de forma natural son monodominio (caso de VHH e IgNAR) , como anticuerpos que por ingenieria genética se han alterado para que por si solos sean capaces de interaccionar con el antigeno y mejorar sus propiedades de estabilidad y solubilidad.

Una realización particular de la invención lo constituye la nanoparticula biosensora de la invención en que la nanoparticula magnética esté constituida por ferrita de cobalto, la capa de silice esté funcionalizada con grupos amino y grupos tiol, la capa metálica sea de oro, y la biomolécula inmovilizada sea un PNA modificado en uno de sus extremos, consistiendo dicha modificación en la inserción de un grupo tiol en dicho extremo (ver Ejemplo 1.1) .

Otra realización particular de la presente invención lo constituye la nanoparticula biosensora en que la nanoparticula magnética es de ferrita de cobalto, la capa de silice esté funcionalizada con grupos amino y grupos tiol, y la capa metálica esté formada por una capa de plata y sucesivamente otra de oro, y la biomolécula inmovilizada sea un PNA modificado en uno de sus extremos, consistiendo dicha modificación en la inserción de un grupo tiol en dicho extremo (ver Ejemplo 1.4) .

En otro aspecto particular de la invención la nanoparticula biosensora de la invención puede ser másica, es decir, no poseer núcleo magnético ni capa de silice y estar formada únicamente por un núcleo metálico. Un segundo aspecto de la presente invención lo constituye el procedimiento de obtención de las nanoparticulas biosensoras de la invención, en adelante procedimiento de la invención, que comprende las etapas de: a) preparación de un coloide de particulas magnéticas de entre 4 y 30 nm b) condicionamiento del coloide para que sea estable a pHs básicos (mayores de pH = 7), c) recubrimiento de las nanoparticulas coloidales en medio básico con una capa de silice de un espesor entre 1 y 20 nm, d) funcionalización quimica de la superficie de las nanoparticulas obtenidas en la etapa c) para introducir grupos funcionales, e) recubrimiento de las nanoparticulas magnéticas funcionalizadas de la etapa d) con una capa metálica que comprende las etapas de: e.i) sintesis de nanoparticulas de metal estables en agua, con un diámetro de entre 3 y 20 nm e.ii) quimisorción de las nanoparticulas de metal sobre las nanoparticulas resultantes de la etapa d) anteriormente mencionada, e.iii) crecimiento sobre el producto obtenido en e.ii) de una capa metálica, formando una capa de un espesor controlado entre 1 y 200 nm f) inmovilización de la molécula biosensora sobre la superficie de la nanoparticula resultante de la etapa e) .

Un aspecto preferido de la presente invención lo constituye el procedimiento de la invención en el que la particula magnética está constituida, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, por los siguientes grupos de materiales magnéticos, oxidados o no, respectivamente o por cualquier combinación de los mismos: i) óxido de hierro, como la magnetita (FesCU) y su forma oxidada, la maghemita (μ-Fe ₂ θ ₃ ) , o un óxido de hierro-cobalto como la ferrita de cobalto (CoFe ₂ O ₄ ), ii) materiales magnéticos no óxidos como el hierro- platino (FePt) .

Preferentemente en dicho procedimiento el óxido de hierro y cobalto es ferrita de cobalto (ver Ejemplo 1) , magnetita (FesCU) o su forma oxidada (P-Fe ₂ Os) •

Un aspecto más preferido de la invención lo constituye un procedimiento de la invención en el que el condicionamiento de la etapa b) del procedimiento de la invención se realiza con hidróxido de tetrametilamonio . Un aspecto aún mas preferido de la presente invención lo constituye un procedimiento de la invención en el que el recubrimiento de silice de la etapa c) del procedimiento de la invención se realiza por tratamiento con una solución de silicato sódico. Por otro lado, el grosor de la capa de silice de la etapa c) del procedimiento de la invención puede variar en función del tamaño de las nanoparticulas deseadas. Asi, otra realización de la presente invención lo constituye un procedimiento de la invención que comprende adicionalmente la siguiente etapa: c2) una extensión de la etapa c) tras el tratamiento con silicato sódico, promoviendo un crecimiento adicional de la capa de silice con tetraetoxi ortosilicato .

Una realización preferida de la presente invención lo constituye el procedimiento de la invención en el que la funcionalización quimica de la superficie de la etapa d) del procedimiento de la invención se realiza con un reactivo del tipo trialcoxi silano perteneciente, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, al siguiente grupo de compuestos: μ-aminopropil trietoxisilano, μ-mercaptopropil trimetoxi silano o una mezcla de ambos. Preferentemente se pueden introducir en general cualquier molécula del tipo trialcoxi silano o diferentes moléculas con esta estructura simultáneamente, obteniéndose de este modo la funcionalización deseada.

Otra realización particular del procedimiento de la invención lo constituye un procedimiento en el que la capa metálica de e) del procedimiento de la invención se elabora a partir de un metal, perteneciente, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: oro (Au), plata (Ag), cobre (Cu) o platino (Pt), o una aleación formada por varios o todos estos metales, por ejemplo Au/Ag o Au/Cu.

En otra realización particular del procedimiento de la invención, las nanoparticulas metálicas de la etapa e.i) son nanoparticulas de oro que se preparan por la reducción de HAUCI4 disuelto en agua básica con cloruro de tetrakis (hidroxifenil) fosfonio.

En aún otra realización particular del procedimiento de la invención, para producir la quimisorción de la etapa e.ii) se mezclan las nanoparticulas de la etapa d) con las de la etapa e) , de modo que las nanoparticulas de metal estén en exceso.

En otra realización preferente del procedimiento de la invención, el crecimiento de una capa de oro mencionado en la etapa e.iii) del procedimiento de la invención se realiza por la reducción sobre las semillas de nucleación

en etapas sucesivas de Au ³⁺ con hidrocloruro de hidroxilamina .

En otra realización particular del procedimiento de la invención, el crecimiento de una capa de oro mencionado en la etapa e.iii) del procedimiento de la invención se realiza por la reducción sobre las semillas de nucleación en etapas sucesivas de Au ³⁺ con formaldehido .

En otra realización aún más preferente del procedimiento de la invención, el crecimiento de una capa metálica de la etapa e.iii) del procedimiento de la invención consiste en la generación de una aleación oro/plata que se realiza por la reducción sobre las semillas de nucleación en etapas sucesivas de Ag ⁺ con formaldehido en presencia de amoniaco (ver ejemplo 1.2) . Otro objeto particular de la invención lo constituye el procedimiento de la invención en el que la molécula biosensora inmovilizada en la etapa f) del procedimiento de la invención pertenece, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, de uno de los siguientes conjuntos: a) biomoléculas naturales: ácidos nucleicos (DNA o RNA) de cadena sencilla o doble, enzimas, anticuerpos, proteinas de membrana, proteinas de choque térmico, chaperoninas, otras proteinas, monosacáridos, polisacáridos, glucoproteinas, ácidos grasos, terpenos, esteroides, otras moléculas de naturaleza lipidica, lipoproteinas, hormonas, vitaminas, metabolitos, hidrocarburos, tioles, moléculas naturales con actividad antibiótica o antiviral, o bien agregados macromoleculares compuestos por proteinas y/o ácidos nucleicos u otras combinaciones de las moléculas citadas anteriormente; b) biomoléculas naturales obtenidas por procedimientos de selección In vitro: aptámeros, ribozimas, aptazimas;

c) biomoléculas artificiales: PNAs, otros análogos de ácidos nucleicos naturales, quimeras de ácidos nucleicos naturales y artificiales, polimeros con capacidad de reconocimiento de forma ("molecular imprinted polymers" o MIPs) , anticuerpos artificiales, anticuerpos recombinantes, minianticuerpos, o moléculas sintéticas con actividad antibiótica o antiviral.

Como se ha comentado anteriormente dicha molécula biosensora incluye un grupo funcional, tanto en la propia estructura de la molécula como por efecto de la adición sintética de dicho grupo, con capacidad de aceptar densidad electrónica perteneciente, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, a la siguiente lista: grupos amino, grupos tiol, grupos disulfuro, di- alquil sulfuros, grupos epoxi, asi como las aminas y alcoholes en platino.

Otro aspecto particular de la invención lo constituye el procedimiento de la invención en el que la biomolécula inmovilizada en la etapa f) del procedimiento de la invención es una molécula de ácido nucleico peptidico (PNA) .

Dadas las caracteristicas de estas moléculas biosensoras inmovilizadas es posible conseguir que, en condiciones controladas de hibridación y lavado, las moléculas biosensoras, por ejemplo moléculas de PNA se hibriden únicamente con sus cadenas de DNA perfectamente complementarias. Esta especificidad de detección puede ser tan alta como para discriminar entre dos moléculas de DNA diana que se diferencien en una sola mutación o polimorfismo genético (SNP) . Por tanto, tales biomoléculas inmovilizadas pueden detectar la existencia de dichas cadenas de DNA en una muestra empleando métodos adecuados, lo que permite su aplicación en distintos sectores

industriales principalmente en biomedicina humana y veterinaria, alimentación y control medioambiental.

Por lo tanto un tercer aspecto de la presente invención lo constituye el uso de las diversas aplicaciones de la nanoparticula biosensora de la invención a titulo ilustrativo, en al menos uno de los siguientes aspectos: i) detección de patógenos de tipo viral, bacteriano, fúngico o protozoario, ii) caracterización de mutaciones o polimorfismos genéticos (SNPs) en dichos agentes que pueden hacerlos resistentes a fármacos o facilitar el escape a vacunas, iii) caracterización de mutaciones o SNPs en genes humanos o animales, relacionados con enfermedades o con propensión a ellas, iv) detección de marcadores tumorales concretos . v) detección de microorganismos concretos, patógenos o contaminantes en alimentos, vi) detección de la presencia de organismos manipulados genéticamente (OMG) o transgénicos en alimentos, y vii) detección de microorganismos o toxinas contaminantes del medio ambiente.

Por otro lado, las nanoparticulas biosensoras de la presente invención también pueden utilizarse para la elaboración de un microarray o micromatriz en el que cada punto del microarray pudiera estar constituido por una nanoparticula biosensora de la presente invención dirigida a un determinado elemento biológico (por ejemplo, un ácido nucleico con una secuencia determinada) . Con ello seria posible el análisis en paralelo de una bateria de distintas hibridaciones producidas sobre otros tantos tipos de nanoparticulas biosensoras. Asi, otro objeto particular de la presente invención lo constituye un dispositivo

biosensor constituido por una serie de nanoparticulas biosensoras de la presente invención dispuestas sobre una superficie tipo micromatriz o microarray .

Un cuarto aspecto de la presente invención lo constituye un ensayo de determinación de la hibridación, unión o interacción de una molécula biológica a la molécula inmovilizada en una nanoparticula biosensora de la invención, en adelante ensayo de determinación de la hibridación de la invención, que comprende las siguientes etapas : i) reacción de la nanoparticula biosensora de la invención con una muestra susceptible de contener la molécula biológica candidata, que puede poseer o no secuencias complementarias a la biomolécula orgánica inmovilizada, en condiciones adecuadas para su hibridación, ii) captura de las nanoparticulas biosensoras por sedimentación magnética, y iii) determinación de la hibridación, o no, ocurrida en la i) . iv) deducción de la existencia, o no, de la molécula biológica candidata en la muestra susceptible de contenerla y en su caso, deducción de la secuencia de tal molécula biológica candidata en función de su grado de hibridación con la nanoparticula biosensora. v) opcionalmente, cuantificación de la concentración de la molécula biológica candidata en la muestra.

Como se ha comentado anteriormente, una realización particular de la invención es una nanoparticula biosensora que posee en su superficie PNAs como molécula biosensora inmovilizada del apartado i) del ensayo de determinación de la hibridación, y donde el objeto de la hibridación es una molécula biológica candidata consistente en un ácido

nucleico natural (DNA o RNA) . Por ello, otro aspecto particular de la presente invención lo constituye el uso de la nanoparticula biosensora de la invención en el que la determinación de la hibridación o no en la etapa i) del ensayo de determinación de la hibridación consiste en la hibridación entre una molécula de PNA inmovilizada en la nanoparticula biosensora y una molécula de DNA presente en una muestra problema.

Otra realización particular de la invención es una nanoparticula biosensora que posee en su superficie anticuerpos naturales, anticuerpos artificiales, anticuerpos recombinantes o minianticuerpos como molécula biosensora inmovilizada del apartado i) del ensayo de determinación de la hibridación, y donde el objeto de la hibridación o unión es el antigeno que dicho anticuerpo reconoce especificamente . En ese caso, el antigeno ha de poseer en su estructura molecular grupos funcionales diferentes de los de la proteina que actúa como anticuerpo, de forma que sea posible su detección por técnicas espectroscópicas o electroquimicas . Dichos grupos funcionales especificos del antigeno y no presentes en la proteina pueden ser, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención: hidrocarburos alifáticos, hidrocarburos aromáticos, heterociclos, D-aminoácidos, grupos funcionales que contengan nitrógeno, azufre, fósforo o metales formando enlaces de coordinación.

Otra realización particular de la invención es una nanoparticula biosensora que posee en su superficie, como molécula biosensora inmovilizada del apartado i) del ensayo de determinación de la hibridación, aptámeros, ribozimas, aptazimas u otros ácidos nucleicos a los que mediante procedimientos de selección in vitro se les ha dotado de (o enriquecido en) la capacidad para reconocer ligandos concretos y unirse especificamente a ellos. En ese caso, el

ligando cuya unión se podrá detectar ha de poseer en su estructura molecular grupos funcionales diferentes de los del ácido nucleico que actúa como molécula biosensora, es decir, cualquier grupo distinto a los siguientes: ribosa, desoxirribosa, fosfato, base nitrogenada púrica o pirimidinica . Dichos grupos funcionales especificos del ligando pueden ser, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención: hidrocarburos alifáticos, hidrocarburos aromáticos, heterociclos, D-aminoácidos, otros grupos funcionales que contengan nitrógeno, azufre, fósforo o metales formando enlaces de coordinación.

Una realización preferente de la presente invención lo constituye un método de detección de la hibridación de la etapa iii) del ensayo de determinación de la hibridación o unión llevado a cabo mediante detección espectroscópica. Preferentemente, la medida de detección espectroscópica se puede llevar a cabo mediante radiación ultravioleta. Más preferentemente la medida espectroscópica se puede llevar a cabo mediante radiación infrarroja. En otro aspecto preferido de la invención la detección de la hibridación se realiza mediante espectroscopia Raman.

La técnica de Raman y el infrarrojo (IR) miden en la misma región del espectro de radiación electromagnética, la de energia vibracional de las moléculas, si bien ambas técnicas detectan diferentes fenómenos que suceden con los enlaces quimicos . La diferencia es que el IR proporciona la señal de los cambios de polaridad del enlace excitado según una u otra vibración, y el Raman proporciona el cambio de polarizabilidad que sufre el enlace. La medida espectroscópica proveerá una serie de bandas de absorción

(en el caso del IR) o de dispersión (en el caso del Raman) en las que se buscan las frecuencias de vibración de las partes no comunes entre la molécula biosensora inmovilizada sobre las nanoparticulas y la molécula biológica candidata

cuya presencia se desea detectar. En el caso de la detección de DNA o RNA empleando PNA inmovilizado sobre nanoparticulas, estas bandas son las que corresponden al esqueleto sobre el que se disponen las bases nucleicas, que como ya se comentó en el caso del PNA es una cadena de naturaleza peptidica, y para los ácidos nucleicos naturales (DNA y RNA) es de tipo azúcar-fosfato (2-desoxirribosa o ribosa, respectivamente, unida por enlaces fosfodiéster) .

Asi, una realización particular de la invención lo constituye un método de detección espectroscópica del ácido nucleico hibridado sobre la nanoparticula en la región del infrarrojo que se lleva a cabo mediante un método, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, perteneciente al siguiente grupo: a) mediante el uso de un equipo de infrarrojo, midiendo la absorción de las nanoparticulas por transmisión b) mediante el uso de un equipo de infrarrojo, midiendo la absorción de las nanoparticulas por reflexión total atenuada (ATR) c) mediante el uso de un equipo de infrarrojo, midiendo la absorción de las nanoparticulas en la modalidad de ángulo rasante.

En una realización particular de la invención, el equipo infrarrojo utilizado en el apartado a) anterior es un equipo de sobremesa emplazado en un laboratorio, integrando la técnica de la Transformada de Fourier (FT) para la resolución de espectros, y utilizando ventanas de transmisión de fluoruro de bario, fluoruro de calcio u otro tipo de ventana transparente a la radiación infrarroja, a titulo de ejemplo y sin limitarse a ellos: el bromuro potásico, cloruro potásico, cloruro sódico o bromuro sódico. En otra realización particular de dicho método, las ventanas trasparentes a la radiación infrarroja pueden

adoptar una configuración en flujo mediante el cual sucesivas muestras pueden ser analizadas en continuo.

En una realización preferente de la invención, el equipo infrarrojo utilizado en el apartado a) anterior es un equipo portátil para el análisis en muestras de campo, pudiendo ser un equipo de Transformada de Fourier o por el contrario presentar un sistema dispersivo de irradiación continua y detector limitado a las frecuencias de interés .

En una realización aún más preferente de la invención, en el equipo infrarrojo utilizado en el apartado b) anterior, en la modalidad de reflexión total atenuada (ATR) puede adoptarse la configuración en flujo con o sin aplicación de un campo magnético externo que permita mantener posicionadas las nanoparticulas magnéticas en la celda. En una realización aún más preferente de la invención, el equipo infrarrojo utilizado en el apartado b) anterior mediante la modalidad de reflexión total atenuada (ATR) en la configuración en flujo puede utilizarse la celda con campo magnético externo y termostatizada. De esta forma se puede aplicar una rampa de temperatura y estudiar el efecto de dicha temperatura en la estabilidad de la hibridación entre la sonda de PNA inmovilizada sobre la nanoparticula y el ácido nucleico diana (DNA o RNA) .

En otra realización particular de la invención, el equipo infrarrojo utilizado en el apartado b) presenta una ventana de seleniuro de zinc, pudiendo ser sustituida por cualquier otro cristal apropiado para la técnica de ATR

(como el germanio, por ejemplo) . En otra realización particular el cristal apropiado para técnica de ATR puede estar recubierto por una pelicula delgada de oro o plata.

En otra realización particular de dicho método las nanoparticulas biosensoras conteniendo sondas de PNA se pueden disponer regularmente en áreas discretas de una superficie y tras la etapa de hibridación ser analizadas

mediante microscopía infrarroja individualmente o en disposición de microarray.

Por otro lado, la capa metálica externa que presentan las nanopartículas les da otra propiedad: son capaces de conducir la electricidad a lo largo de su superficie. Esto les confiere el carácter de nanoelectrodos, pudiendo transmitir señal eléctrica en disolución hasta un electrodo sobre el que se confinan las partículas magnéticas por gravedad o por la influencia de un campo magnético externo. Un ejemplo práctico de esta realización, llevada a cabo sobre electrodos de disco de oro, funcionalizados con una monocapa de PNA tiolado, se muestra en la figura 5. Se han obtenido resultados similares con las nanopartículas magnéticas biosensoras descritas en esta patente. En una realización particular de dicho método, en el apartado i) del ensayo de determinación de la hibridación de la invención, se dejan reaccionar las nanopartículas que contienen sondas de PNA inmovilizadas con la disolución donde presumiblemente se encuentran las moléculas de ácidos nucleicos con secuencias complementarias a dicho PNA. En el paso ii) del ensayo de determinación de la hibridación de la invención, las nanopartículas con el ácido nucleico hibridado se recuperan y se incuban en una disolución que contienen un compuesto redox, es decir, con propiedades diferentes en su estado oxidado y en su estado reducido. Dicho compuesto redox, en su estado oxidado tiene carga neta positiva mientras que en su estado reducido no presenta carga. Estos compuestos, que en lo sucesivo llamaremos mediadores redox, pertenecen, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: el compuesto tionina, el compuesto azul de metileno, el compuesto osmio-bipiridilo o el compuesto bencil viológeno.

Uno de los hechos experimentales originales que sustentan la presente invención es que dichos mediadores redox se adsorben electrostáticamente sobre las cadenas de DNA hibridadas sobre cadenas de PNA complementarias . Sin embargo, tal como se ha observado experimentalmente, tras su reducción electroquimica dichos mediadores redox pierden su carga eléctrica y con ello su afinidad electrostática por el DNA, por lo que difunden al medio y pueden ser detectados electroquimicamente . Este fenómeno tiene lugar cuando los heterodúplex PNA/DNA se han formado sobre un electrodo másico, y también cuando se han formado sobre nanoparticulas conductoras que depositadas sobre un electrodo colector o atraidas sobre él por un campo magnético externo, se comportan como un array de nanoelectrodos . Se ha determinado experimentalmente que las moléculas de los mediadores redox difundidas al medio pueden ser reducidas por la acción catalitica de un enzima apropiado (a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, un enzima peroxidasa) , con lo que se obtiene un efecto de amplificación (ver Ejemplo 3) .

Por tanto, una realización particular de la presente invención la constituye un método para la determinación de la hibridación de iii) mediante técnicas electro-analiticas conocidas como dinámicas . En una realización particular de la invención las técnicas dinámicas pertenecen a la categoria de técnicas electroquimicas de potencial controlado, estando comprendidas, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: cronoamperometria y voltametria ciclica y/o lineal. Tal como es aceptado por cualquier experto en el campo, son variables de estas técnicas las modalidades de barrido o de pulso y las de electrodo estacionario o rotatorio.

En una realización particular de la invención las técnicas dinámicas pertenecen a la categoria de técnicas electroquimicas de corriente controlada, de pequeña amplitud, o de gran amplitud. Entre ellas están comprendidas, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, la cronopotenciometria y la culombimetria .

En una realización particular de la invención las técnicas voltamétricas pertenecen a la categoria de "stripping" y sus variantes: de barrido lineal, de pulso diferencial, de barrido lineal diferencial de onda cuadrada.

En una realización preferente de la presente invención, las variantes de las técnicas electroanaliticas pueden realizarse, en lugar de con nanoparticulas metálicas, con electrodos metálicos como soporte de las sondas de PNA. Estos electrodos pueden tener forma, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, de: discos, hilos, anillos, esferas o esferoides.

A continuación, los ejemplos describen en mayor detalle ciertas realizaciones de la presente invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1.- Síntesis de las nanoparticulas magnéticas metalizadas biosensoras de la invención.

Ejemplo 1.1.- Nanoparticulas biosensoras de oro.

El objeto inicial de este ejemplo de realización es preparar una suspensión magnética compuesta por nanoparticulas de ferrita de cobalto (CoFe2θ4) de tamaño uniforme, recubiertas con una capa delgada de silice funcionalizada con grupos amino, más un recubrimiento final con una capa de oro (tal como se esquematiza en la figura

1) sobre la cual se quimisorberán las moléculas de PNA tiolado como ejemplo de molécula biosensora. El recubrimiento de silice tiene lugar sobre las nanoparticulas magnéticas de forma individual, pudiendo también obtenerse el recubrimiento de varios núcleos magnéticos simultáneamente. Las nanoparticulas asi preparadas cumplen las propiedades buscadas: que sean estables en suspensión durante un largo periodo de tiempo, pero que en presencia de un campo magnético sedimenten. Además, retirando dicho campo magnético las nanoparticulas deben redispersarse al aplicar una agitación suave.

En un ejemplo particular se ha empleado ferrita de cobalto con una estructura de espinela inversa, sintetizada a un tamaño de 17+3 nm, con unas propiedades magnéticas adecuadas (M _s =73 emu/g) . Estas nanoparticulas se sintetizan por coprecipitación de Fe ³⁺ y Co ²⁺ en solución alcalina a ebullición por el método de Wagner (Wagner y col., 2002) . Las nanoparticulas asi obtenidas tienen un punto isoeléctrico aproximado a 8.5, lo que las hace bastante inestables en disoluciones acuosas con pH comprendido entre 7 y 10. El siguiente paso consiste en recubrir este ferrofluido con una capa de silice, con lo que se consigue bajar hasta 3 el punto isoeléctrico de las nanoparticulas haciéndolas estables en disolución a pHs neutros. La capa de silice permite, a su vez, insertar posteriormente grupos funcionales para trabajar sobre la superficie de las nanoparticulas .

El recubrimiento con silice de las nanoparticulas se hace del siguiente modo: se toman 30 mL del ferrofluido de ferrita de cobalto sintetizada previamente y se diluyen hasta 150 mL con agua. Luego se añade 500 μL de hidróxido de tetrametilamonio (TMA), subiendo el pH hasta 11.5-12, y se llevan al matraz de reacción. A continuación se prepara 100 mL de silicato sódico en disolución al 0.50%, y con la

resina Dowex W X8 previamente activada se disminuye el pH hasta 10.5, tras lo cual se filtra con papel de filtro para eliminar la resina de intercambio iónico.

El matraz con el ferrofluido se calienta hasta ebullición con un sistema de reflujo, y se van añadiendo los 100 mL de silicato sódico a lo largo de 2 horas, gota a gota durante la primera hora y media con la ayuda de una bomba peristáltica. El volumen se ha de mantener constante, para lo que se va liberando poco a poco algo de vapor en caso que sea necesario. Cuando la reacción termina, se deja enfriar a temperatura ambiente al aire. El producto de la reacción se dializa durante cuatro dias en tubos de cellophane frente a agua, llevada a pH = 10 por adición de dos gotas de TMA. Se cambia el agua de diálisis cada dia. Para introducir el grupo amino en la superficie de las nanoparticulas magnéticas ya recubiertas por silice se utiliza una reacción basada en el método de Stóber (Wang y col., 1996), una condensación de grupos siloxanos entre los grupos silano del μ-aminopropiltrietoxisilano (APTES) y la capa de silice depositada en la etapa previa sobre el ferrofluido. Para ello se pone en un matraz de reacción la cantidad pertinente de etanol absoluto con amoniaco al 1%, el ferrofluido al 1.5% y el APTES en concentración 1 milimolar (mM) , y se deja agitando suavemente, a 400 revoluciones por minuto (rpm) y con una varilla de vidrio, hasta el dia siguiente. Luego, las particulas se sedimentan magnéticamente y se lavan con etanol, redispersándolas tras dos lavados en un volumen igual a la cantidad original de ferrofluido. Para ello se necesita una inmersión corta (entre 15 y 20 segundos) en un baño de ultrasonidos.

Para llevar el ferrofluido funcionalizado a fase acuosa, las nanoparticulas se sedimentan magnéticamente y se decanta el etanol, siendo sustituido por un volumen igual de disolución acuosa de HEPES 20 mM a pH = 12. Luego

se introduce en el baño de ultrasonidos el tiempo necesario para una correcta dispersión. Este procedimiento se realiza tres veces para eliminar todo el etanol .

Paralelamente se sintetizaron nanoparticulas de oro siguiendo el método de reducción de una sal de oro (III) descrito por D. Duff y A. Baiker (Duff y Baiker, 1993) . En este caso se preparó una disolución básica con concentraciones finales 60 rtiM de NaOH, 1 rtiM del agente reductor [cloruro de tetrakis- (hidroxifenil) fosfonio, (THPC) ] y 1 rtiM de HAUCI4. En un medio acuoso se añaden estos compuestos bajo agitación a 600 rpm, por ese orden y en los volúmenes correspondientes a la cantidad final que se quiera preparar. Tras la formación del coloide, que sucede a los pocos segundos de añadir la sal de oro, se filtra con un filtro Whatman de nitrato de celulosa con un tamaño de poro de 450 nm, y se almacena.

Sobre el ferrofluido de ferrita de cobalto funcionalizado con grupos amino y/o tiol en su superficie se inmovilizan las nanoparticulas de oro por autoensamblaje a estos grupos funcionales, aprovechando la afinidad bien conocida de estos grupos por el oro, produciéndose una quimisorción. En concreto, la presencia de nanoparticulas de oro junto a las nanoparticulas magnéticas funcionalizadas conduce a la decoración superficial de estas últimas con las primeras, quedando recubierta cada nanoparticula magnética por varias nanoparticulas de oro. Estas nanoparticulas de oro son la semilla para reducir metales en la superficie, promoviendo el crecimiento de una capa de oro o de plata sobre la nanoparticula. Esto sucede cuando se ponen en presencia de los iones metálicos con los que se quiere recubrir la nanoparticula y un agente reductor suave capaz de hacer crecer una superficie metálica pero incapaz de producir nucleación secundaria.

Dado que ambas dispersiones -ferrofluido de ferrita de cobalto funcionalizado y las nanoparticulas de oro- están a pH básico, se pueden mezclar ambos coloides sin que haya problemas posteriores de floculación durante el autoensamblaje . En un principio se añaden cantidades iguales de ambos fluidos y tras homogeneizar por agitación en vortex la mezcla se deja reaccionar dos horas. Luego, se sedimentan las nanoparticulas magnéticamente y se comprueba mediante espectrofotometria si en el sobrenadante hay nanoparticulas de oro. Si no las hay, se redispersa el sedimento y se añaden más nanoparticulas de oro, repitiéndose el proceso hasta que se sature la superficie de las nanoparticulas magnéticas con las de oro, momento en el que se detectará un exceso de oro en el sobrenadante. Posteriormente, se lavan las particulas por sedimentación magnética y posterior redispersión en un medio HEPES 20 rtiM a pH = 11 tres veces, para eliminar el exceso de nanoparticulas de oro.

Sobre las nanoparticulas anteriores ya decoradas con nanoparticulas de oro se hace crecer una capa de oro mediante la reducción de HAUCI4 con un reductor suave que favorezca el crecimiento en lugar de la nucleación de nuevas particulas de oro, como es la hidroxilamina (NH2OH) . En cada reducción, las nanoparticulas magnéticas decoradas con nanoparticulas de oro actúan como centros de nucleación. Repitiendo este proceso de reducción varias veces se consigue que se forme una capa continua de oro sobre las nanoparticulas magnéticas. Además, en función de la cantidad de oro que se añada y del número de etapas de reducción se pueden lograr diferentes tamaños de particula. Esto se ve reflejado en la banda de absorción de resonancia de plasmón superficial, que se desplaza en función de la cantidad de oro añadida.

El tamaño final de las nanopartículas biosensoras producidas en el presente ejemplo está comprendido entre 50 y 80 nm de diámetro, como puede comprobarse por microscopia electrónica de transmisión (Figura 2) . Las particulas magnéticas que constituyen el núcleo de las nanoparticulas tienen 18+3 nm, y el espesor de la capa de silice es entre 1 y 15 nm.

Ejemplo 1.2.- Síntesis de nanoparticulas biosensoras de aleación oro/plata.

El proceso de obtención de nanoparticulas recubiertas por una aleación Au/Ag se basa en la reducción del ion plata sobre las nanoparticulas magnéticas decoradas con nanoparticulas de oro obtenidas tal como se indica en el apartado 1.1. Para ello se ponen 500 μL del ferrofluido decorado con particulas de oro, 400 μL de glicina 0.5 M, 600 μL de agua (de pureza milli-Q) , 20 μL de AgNO ₃ 12 rtiM y 100 μL de ácido ascórbico 10 mM. Esta solución se deja a temperatura ambiente y en oscuridad durante 6 horas, se lavan las nanoparticulas por sedimentación magnética tres veces, resuspendiendo en 500 μL de agua cada vez, y se repite el proceso (Huang y col., 2004) . La inmovilización de las moléculas de PNA se realiza tal como se detallará en el Ejemplo 1.4.

Ejemplo 1.3.- Sintesis de nanoparticulas biosensoras de oro, plata y oro.

Se toman 2 mL de un ferrofluido de ferrita de cobalto cuya sintesis de ha descrito en el ejemplo 1.1. y se hace reaccionar con una mezcla de dos silanos, en proporciones diferentes entre 50 y 80% de μ-APTES y el resto de μ-MPTMS . El volumen añadido de estos reactivos suma 50 μL. Todo esto se hace en un matraz, bajo agitación suave (100 rpm) con varilla de vidrio, poniendo 288 mL de etanol absoluto y 10

rtiL de NH ₃ al 25%. Luego se vierte el ferrofluido y, por último, los silanos. Esto se deja reaccionar a temperatura ambiente hasta el dia siguiente. Posteriormente se lavan, se resuspenden en 20 mL de etanol 2 veces y otras 3 veces en agua, y se dejan en un volumen final de 10 mL (con ello se diluye la concentración de nanoparticulas 5 veces, de modo que queda aproximadamente 3 mg/mL) .

Por otro lado se sintetizan nanoparticulas de oro según el método descrito en el apartado 1.1. Las nanoparticulas de oro se ponen en presencia de las nanoparticulas magnéticas funcionalizadas, y se acidifica la suspensión de forma que el oro se inmovilice sobre el ferrofluido, durante al menos una hora. Luego se lava y al resuspender en 5 mL de agua, se sube el pH hasta 11 con NaOH IN. En ese punto, al atraer con un imán no ha de quedar oro en la disolución.

A continuación se recubre con plata según el método del formaldehido descrito por N. Halas (Hallas y col., 2005) , etapa que se hace el número necesario de veces para conseguir un recubrimiento total. El método consiste en tomar 9 mL de agua con una concentración 0.15 rtiM de AgNO ₃ y añadir 500 μL de las nanoparticulas magnéticas decoradas con oro. Acto seguido se añaden 50 μL de formaldehido al 37%, se agita con el vórtex rápidamente y se vierte de inmediato 50 μL de NH ₃ al 25%. Se vuelve a agitar, y al cabo de dos minutos se sedimenta magnéticamente. Se mide el plasmón del sobrenadante, y tras lavar dos veces, el de las nanoparticulas . Estas medidas se hacen en todas las etapas del recubrimiento, hasta que se vea que el plasmón de la plata se extiende a lo largo de todo el rango visible, punto en el que se considera que la capa de plata está prácticamente cerrada.

Posteriormente, la capa de plata se recubre a su vez con oro por el método descrito en el Ejemplo 1.1.,

resuspendiéndose hasta una dilución mayor: 0.3 mg/itiL en lugar de 3 mg/itiL. El resultado final es que las nanoparticulas adquieren una estabilidad en disolución mucho mayor, y no se agregan. Se ponen tres etapas de recubrimiento de oro en las siguientes condiciones : 5 mL de nanoparticulas a 0.3 mg/mL, 50 μL de HAUCI4 25 rtiM y 80 μL de NH ₂ OH-HCl 100 mM, bajo agitación en el vortex. Se lava dos veces, y se siguen las etapas de recubrimiento con la variación de la banda de resonancia del plasmón superficial. Se observa cómo va creciendo la banda a 520 nm, y el máximo se desplaza hacia longitudes de onda más largas, lo que indica la progresión del recubrimiento. Cuando se recubren las nanoparticulas 10 veces más diluidas, como es en este caso, su estabilidad en superficie resulta mucho mayor.

Ejemplo 1.4.- Inmovilización de PNA sobre las nanoparticulas biosensoras con capa externa de oro ó plata.

Posteriormente a lo indicado en los Ejemplos 1.1 a 1.3, en las nanoparticulas magnéticas con recubrimiento de oro asi elaboradas se procede a la inmovilización de una molécula biosensora. En concreto para el presente ejemplo se ha utilizado una molécula orgánica tipo PNA, lo que confiere a la nanoparticula biosensora de la invención la funcionalidad de poder hibridarse a ácidos nucleicos naturales (DNA o RNA) con secuencias complementarias a las del PNA. La capa de oro externa de las nanoparticulas presenta unas propiedades de soporte, y sobre ella se pueden quimisorber compuestos tiolados . Por ello, los PNAs que se van a inmovilizar sobre las nanoparticulas tienen en un extremo un grupo tiol aportado por una cisteina (Cys) , de modo que van a formar monocapas orientadas de hebras de PNA, tal como los inventores han demostrado previamente con cristales de oro (Briones y col., 2004; 2005).

En realizaciones particulares de este ejemplo se han empleado dos moléculas diferentes de PNA de cadena sencilla, ambas con una cisteina en su extremo amino . A continuación de la Cys, las moléculas de PNA poseen dos grupos espaciadores de tipo "0" que corresponden a moléculas de ácido 8-amino-3, 6-dioxaoctanoico, y que en conjunto forman un espaciador de 3 nm de longitud que permite separar el extremo de la molécula inmovilizado sobre la nanoparticula de la región sensora con capacidad para hibridarse a ácidos nucleicos . La primera molécula de PNA utilizada se denomina "P-G", posee 11 bases nucleotidicas de longitud y su secuencia (escrita desde el extremo amino al extremo carboxilo) es: Cys-O-O-SEQ ID N° 1. Esta secuencia ha sido elegida por su relevancia en virologia animal, ya que corresponde a la región más antigénica (denominada "loop RGD") de la proteina VPl de la cápsida del virus de la fiebre aftosa (FMDV) (Martinez y col., 1997) .

La segunda secuencia de PNA se denomina "P-M" y su secuencia (de 9 bases nucleotidicas de longitud) es: Cys-O- O-SEQ ID N° 2. Esta secuencia ha sido elegida debido a su relevancia biosanitaria, ya que incluye la secuencia complementaria al codón 41 de la región de la transcriptasa reversa (RT) del gen pol del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) , una posición en la que se ha descrito la frecuente aparición de la mutación M41L implicada en la resistencia de HIV al fármaco antiviral denominado Zidovudina (AZT) (Yeni y col., 2002).

Para inmovilizar el PNA sobre las nanoparticulas, se toman 76 μL del ferrofluido recubierto con oro elaborado previamente, y se añaden 4 μL de una disolución de las moléculas de PNA diluida en agua (pureza milli-Q) a concentración 10 μM. La quimisorción del PNA sobre las nanoparticulas se logra mediante incubación a una

temperatura de entre 20 y 25 ⁰ C, durante tres horas y cuarto. Posteriormente, las nanopartículas se sedimentan magnéticamente y el sobrenadante se cambia por agua. Se resuspenden las nanoparticulas, y se repite el proceso dos veces más para eliminar todo el PNA que no haya reaccionado con el recubrimiento de oro de las nanoparticulas . Las nanoparticulas ya decoradas con PNA se concentran bajo la acción de un campo magnético y se comprueba la adsorción de las moléculas de PNA por espectroscopia infrarroja de transmisión (linea discontinua en Figura 3) . Este espectro de PNA sobre la nanoparticula se considerará el "blanco" en los experimentos posteriores de hibridación de las nanoparticulas a DNA de una muestra, tal como se expone en el Ejemplo 2.

Ejemplo 2.- Hibridación de la nanoparticula biosensora recubierta de oro y PNA a una molécula de DNA con secuencia complementaria a la del PNA. Determinación mediante el aumento de la intensidad de las bandas de absorción en el infrarrojo debidos a la hibridación del DNA con el PNA.

Como se ha indicado previamente, la diferencia estructural más importante entre el PNA y los ácidos nucleicos naturales es que aquél posee un esqueleto de naturaleza peptidica mientras que el DNA y el RNA presentan en su esqueleto una sucesión de grupos desoxirribosa (el DNA) o ribosa (el RNA) y fosfato (Nielsen y col., 1991; Egholm y col., 1992) . Por tanto, el PNA carece de grupos fosfato y de anillos glucidicos, lo que le ofrece una utilidad especial en el diseño de biosensores para la detección de hibridación de DNA o RNA. En este ejemplo se aprovecha precisamente que el cambio más notable que produce la hibridación PNA/DNA en la región del infrarrojo lo proporcionan los grupos fosfato del DNA, ya que tienen la tensión antisimétrica (una banda ancha en el intervalo

1260-1200 cπf ¹ ) y la simétrica del enlace P=O (en torno a 1100 cm ^"1 ) . Otros hechos espectrales atribuibles a los residuosde desoxirribosa o ribosa de las cadenas DNA/RNA se detectan a 1065 cm ^"1 . Estas bandas se observan en una zona del espectro donde no absorben radiación ni las bases nucleotidicas del PNA y el DNA ni el esqueleto peptidomimético del PNA. Además, se produce un aumento en la señal en torno a 1580 cm ^"1 debida al apareamiento de las bases nitrogenadas (Ver figuras 3 y 4) . En el presente ejemplo se han empleado nanoparticulas magnéticas recubiertas de oro funcionalizadas con moléculas del PNA "P-G" o bien con el "P-M", cuyas secuencias se indican en el ejemplo 1.4. Se han diseñado moléculas de DNA de cadena sencilla que poseen una región central complementaria a la de dichos PNAs. Se han diseñado y sintetizado cuatro moléculas de DNA diana, de 31 nucleótidos (nt) de longitud, que corresponden con las secuencias de tipo salvaje y mutante de FMDV ("DNA-G" 5'- SEQ ID N° 3 -3', y "DNA-E" 5'- SEQ ID N° 4 -3', respectivamente, que difieren en la mutación de tipo "transición" G—>A en su posición central) y de HIV ("DNA-M" 5'-SEQ ID N° 5 -3', y "DNA-L" 5'- SEQ ID N° 6 -3', respectivamente, que difieren en la mutación de tipo "transversión" A—>T en su posición central) . De esta forma, se estudia la capacidad de cada familia de nanoparticulas funcionalizadas con un tipo de PNA no sólo para detectar la presencia del DNA o RNA complementario en una muestra sino incluso para discriminar entre secuencias de DNA o RNA con una mutación puntual. Por tanto se aplica nuestro sistema biosensor en biosanidad animal y humana, tanto para la detección de secuencias de DNA/RNA caracteristicas de virus patógenos como para determinar si tales secuencias informan sobre la existencia de una población viral con capacidad de

evadir el sistema inmune, escapar a vacunas o ser resistente a fármacos antivirales. En cada caso, las secuencias de DNA de la otra familia se utilizan como control de no hibridación, es decir, aquellas hibridaciones que no deben producirse (o, si se producen, deben lavarse completamente) puesto que la complementariedad de secuencia PNA/DNA es despreciable (por ejemplo, el PNA "P-G" con los DNAs "DNA-M" y "DNA-L") .

Por otra parte, se han diseñado y sintetizado otras dos moléculas de DNA, de cadena sencilla y 20 nt de longitud, que son complementarias a la vez a los dos PNAs utilizados en una y otra orientación: "DNA-GM": 5'-SEQ ID N° 7 -3' (hibridación paralela con "P-G" y antiparalela con "P-M") y "DNA-MG": 5'-SEQ ID N° 8 -3' (hibridación antiparalela con "P-G" y paralela con "P-M") . Por tanto, cada una de estas dos moléculas de DNA podrá hibridar con los dos PNAs que recubren sendas nanoparticulas diferentes.

En todos los casos, la hibridación de las nanoparticulas recubiertas con PNA y el DNA se realiza durante 1 hora, a temperaturas comprendidas entre los 41 y 58 °C, con concentraciones de DNA de 100 μM, y seguidas de un lavado de dos ciclos de 15 minutos a temperaturas comprendidas entre 37 y 50 °C. Las soluciones de hibridación (SH) y lavado (SL) empleadas han sido de dos tipos: i) SH compuesta de NaCl 7mM + citrato de Na 0.7 rtiM (pH = 7.2), SL compuesta de NaCl 45mM + citrato de Na 4.5 rtiM (pH = 7.0); ii) SH y SL compuesta de NaCl 6OmM + citrato de Na 6 rtiM + laurilsarcosina 0.72%. Previamente al análisis, en todos los casos se realiza un último lavado en agua (milli Q) para eliminar restos de sales .

Como ejemplo de los resultados producidos, el espectro de infrarrojo obtenido tras la hibridación y lavado de las nanoparticulas biosensoras con cobertura metálica de oro y

recubiertas por PNA de tipo "P-G" con el "DNA MG" se muestra en trazo continuo en la Figura 3. En ella se hace patente que tras la hibridación entre PNA y DNA perfectamente complementario aparecen entre otros los picos correspondientes a los grupos fosfato del DNA, como señal que claramente indica el evento de hibridación producido, a una frecuencia de 1220 y 1060 cm ^"1 .

Como ejemplo de los resultados obtenidos con nanoparticulas biosensoras con cubierta metálica formada por capas sucesivas de oro/plata/oro, se muestra en el panel superior de la Figura 4 el espectro de infrarrojo obtenido tras la hibridación y lavado de estas nanoparticulas biosensoras recubiertas por PNA de tipo "P- G" con el "DNA MG" de secuencia complementaria. Por comparación, el espectro inferior corresponde a nanoparticulas idénticas a las anteriores (recubiertas por PNA tipo "P-G") pero hibridadas con una sonda de DNA de secuencia no complementaria al PNA ("DNA L") , que al no hibridar especificamente es eliminada durante el ciclo de lavado. En el espectro superior de la figura aparecen los picos a 1225 y 1036 cm ^"1 correspondientes a los grupos fosfato del DNA, ligeramente desplazados respecto a sus posiciones en la figura 3 por efecto de la capa de plata. Además, análogamente a lo que se observa en la Figura 3, otro hecho espectral caracteristico de la hibridación del PNA a un DNA complementario es la banda a 1590 cm ^"1 , correspondiente al apareamiento especifico de las bases nitrogenadas del PNA con las del DNA.

Ejemplo 3.- Hibridación de la nanoparticula biosensora recubierta de oro y PNA a una molécula de DNA con secuencia complementaria a la del PNA. VoItamogramas ciclicos de la tionina incorporada a través de interacciones iónicas con los residuos fosfatos de las cadenas de DNA.

Empleando las nanopartículas biosensoras elaboradas como se detalla en el Ejemplo 1 se ha llevado a cabo el proceso indicado en el Ejemplo 2, pero empleando una diferente técnica de detección de la hibridación. Se han obtenido voltamogramas ciclicos empleando electrodos planos de oro modificados con las moléculas de PNA indicadas en el Ejemplo 1.4, posteriormente incubadas con diferentes concentraciones de DNA complementario. En este caso, tras la hibridación y el lavado, las nanoparticulas hibridadas se incuban con una disolución de tionina y se someten a volametria ciclica en presencia de peroxidasa y H2O2.

La Figura 5 muestra las corrientes obtenidas empleando nanoparticulas funcionalizadas con el PNA "P-M", en un rango de concentración de "DNA-M" entre 10 ^"14 y 10 ^"6 M. Posteriores aumentos de sensibilidad se obtienen disminuyendo el volumen de reacción, con lo que se llega a sensibilidades de detección de 10 ^~16 M de DNA, es decir, de 0.1 femtomolar.

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