In lebenden biologischen Geweben ist eine koordi- nierte Signalübertragung zwischen unterschiedlichen Zellen und/oder Zellkompartimenten, das heißt über Membranstrukturen hinweg, erforderlich, um die Ho- möostase zu erhalten und eine Adaption an äußere Veränderungen zu ermöglichen. Während die durch lösliche Mediatoren vermittelten inter-und intra- zellulären Signaltransduktions-Mechanismen bereits heute anhand zahlreicher Beispiele gut charakteri- siert sind, sind interzelluläre Signale, die durch membranständige Interaktionspartner vermittelt wer- den, oft noch weitgehend unverstanden. Zellvermit-

telte Signale sind jedoch für alle vielzelligen Or- ganismen und damit auch für die Aufrechterhaltung multizellulärer Organverbände bei höheren Lebewesen essentielle. So hat sich gezigt, dass normale Kör- perzellen bei Entfernung aus ihrem Gewebeverband wichtige Überlebenssignale verlieren. Sie sterben dann über einen Prozess ab, der als Anoikis (Ver- einsamung) bezeichnet wird, wobei dessen molekula- rer Mechanismus dem programmierten Zelltod (Apopto- se) entspricht. Die Kenntnis solcher Überlebenssig- nale und ihrer molekularen Wirkmechanismen ist ins- besondere für das gesamte Gebiet der Onkologie re- levant, da Tumorzellen genau diese Regulationssys- teme umgehen beziehungsweise ausschalten müssen, damit maligne Tumore gebildet werden können.

Die Probleme bei der Erforschung interzellulärer Signalmechanismen sind teilweise rein technischer Art. So ist es beispielsweise in vielen Fällen nicht möglich oder aus methodischen oder techni- schen Gründen sehr aufwendig, zwei unterschiedliche t Zellpopulationen räumlich und zeitlich kontrolliert interagieren zu lassen und dabei ihre Reaktionen parallel zu beobachten. Darüber hinaus löst eine solche Interaktion stets eine Vielzahl von Signalen aus, die nicht oder kaum der großen Zahl von Sig- nalmolekülen zugeordnet werden können. Um die Wir- kung eines einzelnen Signalstoffes gezielt bestim- men zu können, werden im Stand der Technik daher rekombinante lösliche Derivate membranständiger Li- ganden und ihrer Rezeptoren hergestellt und unter- sucht. Die auf diese Weise erhaltenen Daten können jedoch zu einer Fehleinschätzung der eigentlichen

physiologischen Bedeutung eines definierten Signal- prozesses führen, da das zugrunde liegende Testsys- tem gegenüber dem tatsächlichen Geschehen eine gro- be Vereinfachung darstellt.

Der Tumor-Nekrose-Faktor gehört zu der Klasse der Cytokine, bei denen es sich um Substanzen handelt, die von einer Vielzahl von Zellarten gebildet und sezerniert werden und die als interzelluläre Media- toren eine Vielzahl zellulärer Prozesse regulieren.

Cytokine umfassen beispielsweise Lymphokine, Inter- leukine, Monokine und Wachstumsfaktoren. Der Tumor Nekrose Faktor (TNF, auch TNF-a oder Kachektin ge- nannt) ist das namensgebende Mitglied einer großen Gen-Familie von Cytokinen, die strukturell homolog sind und vielfältige, teilweise überlappende biolo- gische Eigenschaften besitzen. Zu den heute bekann- ten Mitgliedern gehören TNF selbst und u. a. Lympho- toxin alpha (LT-a), das wie TNF an die gleichen Re- zeptoren (TNFR1 und TNFR2) bindet und daher sehr ähnliche Signaleigenschaften aufweist, sowie LT-ß, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, TWEAK, OX40L, EDA, AITRL, VEGI, LIGHT, 4-1BBL, APRIL, BLYS, RANKL und TRAIL, für die jeweils ein oder mehrere spezifische Membranrezeptoren existieren (Locksley et al, Cell, 104 : 487-501,2001). Die Moleküle der Tumornekrose- faktor (TNF)-Ligandenfamilie sind über ihre komple- mentären Rezeptoren, die als TNF-Rezeptorfamilie zusammengefasst sind, an einer Vielzahl vor allem immunregulatorischer Prozesse beteiligt. Von ganz wenigen Ausnahmen abgesehen handelt es sich bei den Mitgliedern der TNF-Ligandenfamilie um Membranpro- teine des Typ II (Locksley et al, s. o. ). Von diesen

membranständigen Formen können sich durch spezifi- sche Proteolyse oder alternatives Spleißen jedoch in vielen Fällen auch lösliche Formen ableiten. In manchen Fällen können sich die löslichen und memb- ranständigen Formen von Mitgliedern der TNF- Ligandenfamilie beträchtlich in ihrer Bioaktivität unterscheiden (Grell et al, Cell, 1995). Im Gegen- satz zu Lymphotoxin (LT-a), das ein echtes sezer- niertes Protein darstellt, wird TNF, wie die meis- ten anderen Mitglieder der TNF-Familie von der pro- duzierenden Zelle jedoch immer erst als membran- ständiges TNF produziert, aus dem sich das klassi- sche lösliche Cytokin TNF erst durch proteolytische Spaltung bildet. Dieses Membran-TNF stellt ein ech- tes Transmembranprotein dar, welches in trimerer Form vorliegt und biologisch aktiv ist. Dabei konn- te gezeigt werden, dass Membran-TNF ein besonderes Spektrum an zellulären Wirkungen besitzt, die von löslichem TNF und auch von LT-a nicht erreicht wer- den (Grell et al., Cell, 83 (1995), 793-802). Inte- ressanterweise verhalten sich andere Mitglieder der TNF Familie ähnlich, d. h. sie sind in der normalen, membranständigen Form bioaktiv und als proteoly- tisch prozessierte lösliche oder anderweitig in löslicher Form vorkommende Moleküle entweder biolo- gisch gänzlich inaktiv oder zeigen, wie im Falle von TNF, ein eingeschränktes Wirkspektrum. Bei- spielsweise ist dies außer bei TNF auch für FasL, TRAIL und CD40L gezeigt (Wajant und Pfizenmaier, Onkologie, 24 : 6-10,2001). TNF wird vor allem von Makrophagen/Monocyten, Lymphocyten und Mastzellen gebildet und hat Einfluss auf Entzündungen, Sepsis, den Lipid-und Proteinstoffwechsel, die Blutbil-

dung, Angiogenese, Wundheilung und Immunabwehr und übt cytotoxische beziehungsweise cytostatische Wir- kung auf bestimmte Tumorzellen aus. Lymphotoxin-a wirkt ebenfalls cytotoxisch auf einige Tumorzellli- nien. Über die molekulare Basis der vielfältigen TNF-a-Wirkungen in vivo und in vitro ist relativ wenig bekannt. Die Analyse der Kristallstruktur des rekombinanten, löslichen TNF-a-Moleküls hat erge- ben, dass diese Substanz ein oligomeres Protein ist, das aus drei identischen Untereinheiten von jeweils 17,5 kDA besteht.

Bislang sind zwei verschiedene TNF-spezifische Membranrezeptoren von 55 kDA (TNFR1) und 75 kDA (TNFR2) identifiziert worden. Es ist bekannt, dass TNF-a-Oligomere an die Membranrezeptoren binden müssen, damit zumindest in physiologischen Lösungen einige der verschiedenen biologischen Aktivitäten von TNF-a induziert werden können. Obwohl gezeigt worden ist, dass TNF-a in Lösung als Oligomer vor- kommt, hat sich jedoch herausgestellt, dass diese nicht-kovalent verknüpften TNF-a-Oligomere instabil sind und in inaktive Formen überführt werden. Man geht allerdings davon aus, dass die strukturellen Veränderungen von TNF-a auch in vivo erfolgen, da Monomere und Oligomere in unterschiedlichen Antei- len in der Hirn-Rückenmark-Flüssigkeit von Patien- ten mit Meningitis gefunden werden.

TNF-a wurde ursprünglich als ein Endotoxin- induzierter Faktor identifiziert, der die Nekrose von Tumoren in Mäusen induzieren kann. Es ist je- doch bekannt, dass die Antitumor-Wirkung von TNF-a nicht nur aus den cytotoxischen Wirkungen gegen Tu-

morzellen resultiert, sondern auch auf einer Akti- vierung von Antitumor-Effektor-Immunzellen im Blut, beispielsweise Makrophagen, cytotoxische Lymphocy- ten und Neutrophilen, basiert. Die Antitumorwirkung von TNF-α beruht ferner auf einer spezifischen Schädigung von Tumor-Blutgefäßen.

Da TNF-a sehr geringe Stabilität aufweist und in vivo pleiotrope Wirkungen ausübt, waren die bishe- rigen Versuche, TNF-a als systemisches Antitumor- Mittel einzusetzen, nicht erfolgreich. Es zeigte sich, das bei Verabreichung von TNF-a äußerst schwere systemische Nebenwirkungen, wie Fieber und niedriger Blutdruck auftreten, bevor therapeutisch- wirksame Dosen erreicht werden. Trotz der nach wie vor großen Erwartungen bezüglich einer potentiellen Verwendung von TNF-a als Antitumormittel ist die klinische Anwendbarkeit dieser Substanz also nach wie vor stark eingeschränkt.

Im Allgemeinen ist es schwer,. biologisch aktive Proteine, wie Cytokine, für therapeutische Zwecke einzusetzen, da biologisch aktive Proteine sehr häufig geringe Stabilität und kurze Halbwertzeiten aufweisen. Die Proteine werden durch Leber, Nieren und andere Organe schnell aus dem Blut entfernt, wobei die Clearance-Rate von der Größe der Moleküle und dem Ausmaß der Proteolyse abhängt. Insbesondere Plasma-Proteasen verursachen den Abbau solcher Pro- teine und bewirken den schnellen Verlust der biolo- gischen Aktivität.

Um diese Probleme zu überwinden, wurden in den letzten Jahren Systeme zur Immobilisierung biolo-

gisch aktiver Proteine an oder in Trägersystemen entwickelt. Beispielsweise sind Controlled Release- Systeme für therapeutische Wirkstoffe oder Arznei- stoffe bekannt, wobei Arzneistoffe beispielsweise durch Einschluss in eine Matrix, immobilisiert wer- den. Nach Verabreichung solcher Controlled-Release- Systeme werden dann die Arzneistoffe durch Degrada- tionsprozesse innerhalb des lebenden Körpers kon- trolliert freigesetzt. Bei diesen Systemen ist die Konformation des Wirkstoffes im immobilisierten Zu- stand nicht entscheidend. Wichtig ist vielmehr, dass nach der Freisetzung der Wirkstoff im aktiven Zustand vorliegt.

Auch die Immobilisierung von Proteinen an partiku- läre Systeme ist bekannt (Cell Separation and Pro- tein Purification, Technical Handbook, 2. Ausgabe (1996), Dynal, Oslo), wobei die Proteinbindung an die Partikel jedoch unselektiv, beispielsweise mit- tels Adsorption, und nicht gerichtet erfolgt (Mi- chaelis et al., Anticancer Drugs, 11 (5) (2000), 369-376). Darüber hinaus ist eine einfache Übertra- gung der dabei gewonnenen Erkenntnisse auf die Im- mobilisierung an Nanopartikeln nicht ohne weiteres möglich, da eine Variation der funktionellen Ober- flächengruppen immer mit einem Eingriff in das kol- loidale System verbunden ist und beispielsweise ei- ne unerwünschte Koagulation auslösen kann.

Yokozawa et al., Exp. Hemato., 28 (10) (2000), 1129-1136, beschreiben die nicht-kovalente Immobi- lisierung von Fas-spezifischen Antikörpern auf 2,5 um großen Gelatine-Beads. Dabei werden die Antikör- per adsorptiv, das heißt nicht gerichtet, immobili-

siert. Diese künstliche Zellen genannte Systeme können auf Zielzellen Apoptose auslösen.

Hurst et al., Anal. Chem., 71 (1999), 4727-4733, beschreiben die kovalente Oberflächenmodifizierung von magnetischen Polymerpartikeln mit einer Größe im um-Bereich mit TNF-Antikörpern, mit denen an- schließend TNF aus einer komplexen Lösung gefischt werden kann. Dieses Verfahren dient zur Probenvor- bereitung von MALDI-TOF-MS-Verfahren. Die Immobili- sierung eines Proteins über einen Antikörper ist zwar im Prinzip eine gerichtete Immobilisierung.

Eine derartige Protein-Immobilisierung ist jedoch gegenüber einer kovalenten Bindung sehr instabil.

Ferner ist die Immobilisierung von TNF auf Agarose- Partikeln beziehungsweise in PLGA-Partikeln bekannt (Kanulainen et al., J. Biol. Chem., 273/31 (1996), 18759-18766 ; Iwata et al., J. Microencaps., 16 (1999), 777-792). Auch hier erfolgt keine kovalente Anbindung von TNF. TNF wird anschließend langsam von den Partikeln freigesetzt und ist erst in ge- löster Form biologisch aktiv.

Chong et al., Cell. Immunol., 134 (1) (1991), 96- 110, beschreiben die Immobilisierung von Tumor- Membranproteinen auf hydrophoben Partikeln. Diese Pseudocytes genannten Systeme werden genutzt, um auf anderen Zellen die Produktion von Cytokinen, beispielsweise TNF, zu stimulieren und dadurch die Lyse von Tumorzellen auszulösen. Hierbei handelt es sich also um einen indirekten Ansatz.

Poiesi et al., Cytokine, 5/6 (1993), 539-545, be- schreiben die Immobilisierung von TNF auf planaren Chip-Oberflächen für Oberflächen-Plasmonen- Resonanz-Untersuchungen. Zur Immobilisierung wurden Verfahren der Standard-Proteinchemie wie EDC und NHS eingesetzt. Hier zeigte sich, dass das Molekül nicht stabil gebunden wurde, da ein Teil des TNF durch Waschen entfernt werden konnte.

Fassina et al., Arch. Biochem. Biophys., 296 (1992), 137-143, beschreiben die Herstellung multi- merer komplementärer Peptide für TNF. Diese wurden anschließend auf Chromatographie-Säulen beziehungs- weise Mikrotiterplatten immobilisiert. Diese Ober- flächen wurden dann genutzt, um TNF-Trimere aus komplexen Matrices abzutrennen. Allerdings ist die Wechselwirkung zwischen Peptid und TNF zu gering, um TNF dauerhaft zu immobilisieren.

Kamada et al., Cancer Res., 60 (2000), 6416-6420, beschreiben die kovalente Konjugation von TNF mit Polymeren wie PVP oder PEG, um die biologische Ak- tivität und die biologische Verfügbarkeit zu erhö- hen. Hierzu werden kurzkettige Polymere an Ami- nogruppen des TNF kovalent gebunden, einzelne TNF Moleküle quasi mit Polymer beschichtet. Durch die Immobilisierung der Polymere auf dem TNF wird kei- nerlei Quervernetzung oder ähnliches erreicht, die TNF Trimere also auch nicht stabilisiert. Im Gegen- teil, die Bioaktivität des TNFs nimmt mit dem Grad der Beschichtung stark ab. Durch diesen Ansatz soll die Bioverfügbarkeit der gelösten TNF-Form verbes- sert werden. Im Gegensatz zu der vorliegenden Er-

findung kann damit die Wirkungsweise der membran- ständigen Form nicht erreicht werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher das techni- sche Problem zugrunde, Mittel und Verfahren zur Im- mobilisierung von Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) bezie- hungsweise einem anderen Mitglied der TNF-Familie an einer Trägeroberfläche bereitzustellen, wobei TNF so immobilisiert wird, dass seine vor der Immo- bilisierung vorhandenen biologischen Aktivitäten auch im immobilisierten Zustand beibehalten werden, so dass immobilisiertes TNF beispielsweise mit sei- nen Rezeptoren wechselwirken kann und dadurch seine biologischen Aktivitäten induziert werden können.

Das immobilisierte TNF-beziehungsweise ein anderes Molekül der gleichen Familie-soll insbesondere diejenigen biologischen Eigenschaften aufweisen, die charakteristisch für die membranständige Form des TNF-moleküls-respektive der membranständigen Form eines anderen Mitglieds der TNF-Familie-sind.

Dabei soll TNF im immobilisierten Zustand,, also ge- meinsam mit seinem Träger, sowohl für in vitro- Untersuchungen, beispielsweise bezüglich seiner Wechselwirkungen mit anderen zellulären Bestandtei- len, als auch als Arzneistoff zur Behandlung von Krankheiten, insbesondere von Tumorerkrankungen einsetzbar sein, ohne dass die im Stand der Technik bekannten Nebenwirkungen auftreten. Im Zeitraum der Verwendung soll keine nennenswerte Degradation der Trägersysteme beziehungsweise von immobilisiertem TNF stattfinden beziehungsweise bei einer in vivo- Anwendung soll die Degradation erst nach Entfaltung

der biologischen Aktivität von immobilisierten TNF zu einem späteren Zeitpunkt stattfinden.

Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem durch die Bereitstel- lung von Nanopartikeln, umfassend einen Träger mit einer funktionelle Gruppen 1 A aufweisenden Ober- fläche und zumindest einem Monomer eihes Proteins der TNF-Familie, wobei dieses mindestens eine Mono- mer die funktionellen Gruppen 1 A bindende komple- mentäre funktionelle Gruppen 2 A aufweist und über die funktionellen Gruppen 2 A mit den funktionellen Gruppen 1 A des Trägers verbunden ist. Die Erfin- dung sieht also vor, dass über eine Bindung zwi- schen ersten auf der Trägeroberfläche vorhandenen funktionellen Gruppen 1 A und in dem Monomer des Proteins der TNF-Familie vorhandenen funktionellen Gruppen 2 A, die komplementär zu den funktionellen Gruppen 1 A sind und mit diesen eine affine, vor- zugsweise kovalente Bindung, eingehen können, eine Immobilisierung des Monomers an der Oberfläche stattfindet. Vorzugsweise ist die funktionelle Gruppe 2 A so innerhalb des Monomers des Proteins der TNF-Familie positioniert, dass sie außerhalb der für die biologische Aktivität verantwortlichen Domänen in einem geeigneten Abstand zu diesen Domä- nen angeordnet ist, und so eine Beibehaltung der biologischen Aktivität der Monomeren oder eines Mo- nomer-Komplexes auf dem Träger gewährleistet. Er- findungsgemäß kann vorgesehen sein, dass lediglich ein Monomer in der dargestellten Weise mit dem Trä- ger verbunden und so immobilisiert ist. Erfindungs- gemäß kann in bevorzugter Ausführungsform jedoch

auch vorgesehen sein, dass mehrere, insbesondere drei Monomere, jeweils über ihre funktionellen Gruppen 2 A mit dem Träger verbunden sind, und in besonders bevorzugter Ausführungsform in Form eines Trimers immobilisiert sind. In einer weiteren be- vorzugten Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass lediglich ein erstes Monomer über seine funk- tionellen Gruppen 2 A mit den funktionellen Gruppen 1 A des Trägers verbunden ist, wobei jedoch dieses erste Monomer über zum Beispiel eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung assoziiert mit mindestens einem weiteren, zum Beispiel zwei weiteren Monome- ren, in biologisch funktioneller Einheit, zum Bei- spiel in Form eines Trimers, vorliegt. Dieses eine oder mehrere weitere Monomere sind in bevorzugter Ausführung nicht direkt kovalent oder nicht- kovalent mit dem Träger verbunden, sondern allein durch die Wechselwirkung mit dem ersten Monomer am Träger immobilisiert. Die Immobilisierung eines je- den dieser Monomere kann also einerseits dadurch geschehen, dass dieses Monomer direkt eine affine, vorzugsweise kovalente Bindung, über seine funktio- nelle Gruppen 2 A mit den funktionellen Gruppen 1 A des Trägers eingeht. Andererseits kann erfindungs- gemäß die Immobilisierung auch dadurch gegeben sein, dass ein Monomer über eine nicht-kovalente oder kovalente Bindung assoziiert zu einem anderen Monomer vorliegt, welches wiederum über seine funk- tionellen Gruppen 2 A mit den funktionellen Gruppen 1 A des Trägers verbunden ist, sodass das assozi- ierte Monomer gar keine direkte Bindung zu dem Trä- ger eingeht. Die Erfindung sieht in einer bevorzug- ten Ausführung auch vor, dass jedes Monomer eine

Bindung sowohl zu dem Träger als auch zu einem wei- teren Monomer aufweist.

Es gibt also erfindungsgemäß verschiedene Möglich- keiten TNF als Trimer zu immobilisieren. Jede Mono- mereinheit trägt in bevorzugter Ausführungsform ei- ne funktionelle Gruppe, die für eine bevorzugt ko- valente Immobilisierung geeignet ist. Bevorzugt ist es so, daß jedes Trimer über drei kovalente Bindun- gen immobilisiert ist. Es aber auch möglich, daß sich nur eine oder zwei kovalente Bindungen zwi- schen TNF-Trimer und Partikel ausbilden und das Trimer durch Disulfid-Brücken zwischen den Monome- ren und/oder nicht-kovalente Wechselwirkungen sta- bilisiert wird.

Erfindungsgemäß ist es, zum Beispiel bei LT-a und LT-ß, auch möglich, daß sich bioaktive Heteromere bilden z. B. LT-alLT-ß2 oder LT-a2LT-ß1, die auch wieder bevorzugt über drei oder aber über ein bzw. zwei kovalente Bindungen immobilisiert werden.

Die Bioaktivität von membranständigem TNF wird un- ter anderem erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß mehrere TNF-Trimere auf der Zelloberfläche benach- bart angeordnet sind. Bei der Wechselwirkung dieser Zelle mit einer benachbarten Zelle werden entspre- chende Rezeptoren gebunden und auf der Nachbarzelle komplementär arrangiert. Erst wenn sich dieser Re- zeptor-Cluster gebildet hat, wird die entsprechende Signalantwort ausgelöst. Genau ein solches Cluste- ring und die damit verbundene Signalkaskade wird durch die Immobilisierung des TNF auf der Partikel- oberfläche ausgelöst, d. h. auf den erfindungsgemä-

ßen Partikeln sind TNF-Moleküle in günstiger geo- metrischer Dichte an der Partikeloberfläche immobi- lisiert. Diese Dichte der TNF-Immobilisate wird un- ter anderem dadurch erreicht, dass die zur Bindung der TNF-Moleküle genutzten funktionellen Gruppen 1 A und 1 B in entsprechender Dichte angebracht wer- den (dies wird z. B. durch Zetapotenzialmessungen nachgewiesen, vergleich Figur 12).

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegen- den Erfindung kann in dem Fall, dass mehr als ein Monomer immobilisiert am Träger vorliegt, diese Mo- nomere einander gleiche Monomere sind, dass heisst aus Homomeren gebildete Trimere immobilisiert vor- liegen. In einer weiteren Ausführungsform kann vor- gesehen sein, dass mehrere Monomere verschiedener Art vorliegen, dass heißt in besonders bevorzugter Ausführungsform aus Heteromeren gebildete Trimere immobilisiert vorliegen.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer- den unter einem"Protein der TNF-Familie" (TNF : Tu- mor-Nekrose-Faktor) das TNF-Molekül selbst sowie alle Mitglieder der zur TNF-Familie gehörigen Pro- teine verstanden, die spezifische Aktivitäten in vivo und/oder in vitro über entsprechende, für das jeweilige TNF-Familienmitglied spezifische, dass heißt komplementäre Rezeptoren ausüben, insbesonde- re TNF-a, LT-a und LT-ß, FasL, TRAIL, CD40L, CD27L,, CD30L, OX40L, EDA, AITRL, VEGI, LIGHT, TWEAK, 4-1BBL, APRIL, BLYS und RANKL. Im folgenden wird der Begriff Protein der TNF-Familie"gleich- bedeutend mit der Abkürzung TNF und umgekehrt ver- wendet, wenn nicht anders angegeben. Erfindungsge-

mäß ist TNF daher ein Protein, dass in vivo Ein- fluss auf Entzündungen, Sepsis, den Lipid-und Pro- teinstoffwechsel, die Blutbildung, Angiogenese, Wundheilung und Immunabwehr hat und in vitro und/oder in vivo unter anderem cytotoxische (Apop- tose und Nekrose) beziehungsweise cytostatische, Wirkungen ausübt, aber auch Zellproliferation und Differenzierung beeinflusst. TNF ist darüber hinaus ein Protein, das sich zumindest zeitweise an einer Zelloberfläche innerhalb eines natürlichen Zellver- bandes befindet und die Kommunikation der Zelle mit ihrer Umgebung steuert. Insbesondere kann TNF mit Zellen, auf deren Oberfläche die komplementären Re- zeptoren (zum Beispiel für das TNF der TNFR1 und TNFR2, für TRAIL die TRAILR 1-4) vorliegen, in Kon- takt treten und TNF-spezifische Signale und damit TNF-spezifische Wirkungen auslösen.

Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem in bevorzugter Ausfüh- rungsform der vorliegenden Erfindung durch die Be- t reitstellung von Nanopartikeln, umfassend einen Träger mit einer funktionelle Gruppen 1 A aufwei- senden Oberfläche und an dem Träger immobilisiertem TNF mit die funktionellen Gruppen 1 A bindenden komplementären funktionellen Gruppen 2 A, wobei TNF in Form eines Trimers immobilisiert ist.

Die vorliegende Erfindung stellt in bevorzugter Ausführung nanopartikuläre Trägersysteme, insbeson- dere Nanopartikel, mit daran immobilisiertem TNF bereit, wobei die Immobilisierung auf einer affinen Bindung von TNF an die Nanopartikel-Oberfläche ba- siert. Die'Immobilisierung von TNF an den Nanopar-

tikeln erfolgt erfindungsgemäß über eine Bindung zwischen ersten auf der Trägeroberfläche vorhande- nen funktionellen Gruppen 1 A und im TNF-Molekül vorhandenen funktionellen Gruppen 2 A, die komple- mentär zu den funktionlellen Gruppen 1 A sind und mit diesen eine affine, vorzugsweise kovalente Bin- dungen eingehen können. Vorzugsweise ist die funktionelle Gruppe 2 A von TNF innerhalb des TNF- Moleküls so positioniert, dass sie außerhalb der für die biologische TNF-Aktivität verantwortlichen Domänen in einem geeigneten Abstand zu diesen Domä- nen angeordnet ist. Auf diese Weise ist es erfin- dungsgemäß möglich, TNF gerichtet und unter Beibe- haltung seiner biologischen Aktivitäten auf dem Träger zu immobilisieren.

Nach TNF-Immobilisierung ist TNF erfindungsgemäß so auf der Trägeroberfläche fixiert, dass die dreidi- mensionale Struktur der für die biologische Aktivi- tät erforderlichen Domäne (n) gegenüber nicht- immobilisiertem TNF nicht verändert ist, und dass die TNF-Domäne (n) bei Kontakt mit zellulären Reak- tionspartnern für diese frei zugänglich ist/sind.

Dabei ist TNF in Form von Trimeren fixiert. Erfin- dungsgemäß ist es vorgesehen, dass der Zerfall von TNF-Trimeren durch die Einbringung bestimmter Pro- teinelemente verhindert wird, insbesondere solchen Proteinstrukturen, die natürlicherweise fest ver- knüpfte Trimere bilden. Nach einer solchen Stabili- sierung ist dann erfindungsgemäß vorgesehen, dass nicht jede TNF-Üntereinheit eines TNF-Trimers über affine Bindungen zwischen den funktionellen Gruppen 1 A und 2 A an der Oberfläche des Nanopartikel-

Trägers fixiert sein muss, sondern es ist ausrei- chend, wenn mindestens eine TNF-Untereinheit eines Trimers am Träger gebunden ist.

Erfindungsgemä# ist insbesondere vorgesehen, dass es sich bei den erfindungsgemäß verwendeten Trä- gersystemen um kompakte oder hohle Nanopartikel mit Größen zwischen 5 und 500 nm handelt. Diese beste- hen entweder aus organischen oder anorganischen Partikelmaterialien. Die Art des Materials kann er- findungsgemäß entsprechend der späteren Anwendung variiert werden, wobei der Träger der Nanopartikel vorzugsweise aus biologisch verträglichen und/oder biologisch abbaubaren Materialien besteht.

Erfindungsgemäß verhalten sich daher die erfin- dungsgemäßen Nanopartikel, an deren Oberfläche TNF fixiert ist, bezüglich der immobilisierten TNF- Moleküle wie Zellen. Das heißt, die erfindungsgemä- ßen Nanopartikel können beispielsweise mit Zellen, auf deren Oberfläche einer oder mehrere TNF- Rezeptoren, beispielsweise TNFR1 und TNFR2 vorhan- den sind, in Kontakt treten und TNF-spezifische Signale und damit TNF-spezifische Wirkungen auslö- sen. Da die Nanopartikel zumindest in einer Dimen- sion kleiner als 1 Mm sind, werden sie erfindungs- gemäß auch als"Nanocytes"bezeichnet.

Da die erfindungsgemäßen Nanopartikel einerseits in Analogie zu membranständigen Molekülen reagieren, andererseits aber auch vollkommen neue überraschen- de Funktionen entwickeln, besitzen die erfindungs- gemäßen Nanocytes ein sehr breites Anwendungspoten- tiäl. Erfindungsgemäß können die Nanopartikel als.

Werkzeuge für die molekularbiologische, zellbiolo- gische und klinische Forschung eingesetzt werden.

Dabei bietet die Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel den Vorteil, das etablierte Verfahren für die Bioaktivitätsbestimmung verwendet werden können und somit ein schnelles Materialscreening durchgeführt werden kann.

Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können bei- spielsweise in vitro eingesetzt werden, um die Wir- kungsweise membranständiger Moleküle, insbesondere bei der Signaltransduktion, zu untersuchen. Gegen- über der direkten Zell-Zell-Interaktion bieten die erfindungsgemäßen Nanopartikel den Vorteil, dass einzelne Effekte isoliert untersucht werden können.

Die erfindungsgemäßen Nanopartikel lassen sich da- her auch für die in vitro-Diagnostik einsetzen, um beispielsweise bestimmte Zellen, insbesondere Tu- morzellen, zu erkennen und/oder zu markieren. Dar- über hinaus können unter Verwendung der erfindungs- gemäßen Nanopartikel gezielt Zellen in"einen er- t wünschten Zustand überführt werden beziehungsweise besteht die Möglichkeit, zwischen verschiedenen Zell-Zuständen hin-und herzuschalten.

Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können auch dazu verwendet werden, bestimmte Zellen aus komplexen biologischen Medien oder Flüssigkeiten, wie Blut, zu isolieren oder direkt in diesen Flüssigkeiten oder Medien bei diesen Zellen entsprechende Reakti- onen auszulösen, wie beispielsweise Differenzie- rung, Proliferation oder auch Apoptose. Darüber hinaus können auf der Basis der erfindungsgemäßen Nanopartikel auch technische Systeme konstruiert

werden, die eine gezielte und kontinuierliche Sepa- ration bestimmter Zellen erlauben.

Die erfindungsgemä#en Nanopartikel, insbesondere solche mit biologisch verträglichen oder biologisch abbaubaren Trägersystemen, können in vivo für die Therapie verschiedener Krankheiten eingesetzt wer- den. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nano- partikel können prinzipiell alle Krankheiten thera- piert werden, bei denen die normale Zell-Zell- Interaktion gestört ist, also insbesondere Tumorer- krankungen, Wundheilungsprozesse und ähnliche. Er- findungsgemäße Nanopartikel können aber auch für Aufgaben, die normalerweise Zellen des Immunsystems übernehmen, verwendet werden. Vorteilhafterweise können die erfindungsgemäßen Nanopartikel, insbe- sondere solche auf der Basis biologisch verträgli- cher oder biologisch abbaubarer Trägersysteme, di- rekt in vivo appliziert werden. Die erfindungsgemä- ßen Nanopartikel können auch in Form poröser Filme abgeschieden werden. Mikroporöse Systeme besitzen ein großes Potential für extrakorporale therapeuti- sche Anwendungen, beispielsweise auf dem Gebiet der Tumortherapie, um frei zirkulierende maligne Zellen selektiv zu erkennen und gegebenenfalls abzutöten.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem"Protein"ein Molekül verstanden, das mindestens zwei über eine Amidbindung miteinander verbundene Aminosäuren umfasst. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann ein Protein, insbe- sondere TNF, also auch ein Peptid, zum Beispiel ein Oligopeptid, ein Polypeptid oder ein Teil davon, beispielsweise eine Domäne oder eine Bindungsta-

sche, sein. Das Protein, insbesondere TNF, kann na- türlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Es kann durch gentechnische Verfahren gegenüber dem Wildtyp-Protein modifiziert sein und/oder unnatür- liche und/oder ungewöhnliche Aminosäuren enthalten.

Ein Protein, insbesondere ein TNF-Molekül, kann ge- genüber der Wildtyp-Form derivatisiert sein, bei- spielsweise Glykosylierungen aufweisen, es kann verkürzt sein, es kann mit anderen Proteinen fusio- niert sein oder mit Molekülen anderer Art, bei- spielsweise Kohlenhydraten, verbunden sein.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer- den unter"Nanopartikeln"Bindematrices verstanden, die einen Träger mit einer Oberfläche umfassen, an dem chemisch reaktive funktionelle Gruppen angeord- net sind, die mit komplementären funktionellen Gruppen von zu bindenden Molekülen, insbesondere TNF-Molekülen, affine Bindungen, also kovalente und/oder nicht-kovalente Bindungen, eingehen und auf diese Weise die Moleküle an ihren Oberflächen stabil fixieren können. Die Träger der Nanopartikel bestehen aus chemisch inerten anorganischen oder organischen Materialien und besitzen eine Größe von weniger als 1 pm, vorzugsweise von 5 bis 500 nm.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer"ersten funktionellen Gruppe 1 A"eine auf der Oberfläche des Nanopartikel-Trägers aufge- brachte chemische Gruppe verstanden, die in der La- ge ist, mit einer komplementären funktionellen Gruppe 2 A, die beispielsweise auf dem zu immobili- sierenden TNF-Molekül vorhanden ist, derart zu interagieren, dass eine affine, bevorzugt kovalente

Bindung zwischen den beiden Bindungspartnern statt- finden kann.

In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist die erste funktionelle Gruppe 1 A der Trägerober- fläche ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ami- nogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimi- dogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydra- zingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe und Thi- oestergruppe.

Erfindungsgemäß sind die funktionellen Gruppen 2 A der zu immobilisierenden TNF-Moleküle ausgewählt aus einer Gruppe, die die gleichen Spezies wie für die funktionelle Gruppe 1 A der Trägeroberfläche enthält. Ein erfindungsgemäßer Nanopartikel weist also in seiner Oberfläche eine erste funktionelle Gruppe 1 A auf, die kovalent mit einer funktionel- len Gruppe 2 A des zu immobilisierenden TNF- Moleküls verknüpft ist, wobei die funktionelle O- berflächen-Gruppe 1 A eine andere Gruppe als die t. funktionelle Protein-Gruppe 2 A ist. Die beiden miteinander in Bindung tretenden Gruppen 1 A und 2 A müssen dabei komplementär zueinander sein, das heißt in der Lage sein, eine kovalente Bindung mit- einander einzugehen.

Wird erfindungsgemäß als funktionelle Gruppe 1 A beispielsweise eine Aminogruppe verwendet, ist die funktionelle Gruppe 2 A des zu immobilisierenden Proteines eine Carboxygruppe. Wird erfindungsgemäß umgekehrt eine Carboxygruppe als funktionelle Ober- flächen-Gruppe 1 A verwendet, ist erfindungsgemäß die funktionelle komplementäre Protein-Gruppe 2 A

eine Aminogruppe. Wird erfindungsgemäß als funktio- nelle Oberflächen-Gruppe 1 A eine Thiolgruppe ge- wählt, ist erfindungsgemäß die komplementäre Prote- in-Gruppe eine Maleinimidogruppe. Wird umgekehrt eine Maleinimidogruppe als funktionelle Oberflä- chen-Gruppe 1 A ausgewählt, ist erfindungsgemäß die komplementäre funktionelle Protein-Gruppe 2 A eine Thiolgruppe. Wird erfindungsgemäß als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1 A eine Alkylketongruppe, ins- besondere Methylketon-oder Aldehydgruppe verwen- det, ist die funktionelle komplementäre Protein- Gruppe 2 A eine Hydrazin-oder Hydrazidgruppe. Wird erfindungsgemäß umgekehrt eine Hydrazin-oder Hydrazidgruppe als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1 A verwendet, ist erfindungsgemäß die funktionelle komplementäre Protein-Gruppe 2 A eine Alkylketon-, insbesondere Methylketon-oder Aldehydgruppe.

Erfindungsgemäß besonders bevorzugt handelt es sich bei der funktionellen Gruppe 1 A auf der Träger- oberfläche des Nanopartikels um eine Maleinimido- Gruppe und bei der funktionellen Gruppe 2 A von TNF um eine Thiol-Gruppe.

In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass TNF als Trimer gerichtet und unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität auf der Oberfläche der erfindungsgemäßen Nanopartikel immo- bilisiert vorliegt.

Erfindungsgemäß handelt es sich bei immobilisiertem TNF um synthetisches, natürlicherweise vorkommendes oder rekombinant hergestelltes TNF mit Wildtyp- Sequenz oder mit mutierter Sequenz. Erfindungsgemäß

ist es auch möglich, dass TNF chemisch modifiziert vorliegt.

Im zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung be- deutet der Begriff #gerichtet immobilisiert" oder "gerichtete Immobilisierung", dass ein Molekül, insbesondere TNF, an definierten Positionen inner- halb des TNF-Moleküls dergestalt an einem Träger immobilisiert ist, dass die dreidimensionale Struk- tur der für die biologische Aktivität erforderli- chen TNF-Domäne (n) gegenüber dem nicht- immobilisierten Zustand nicht verändert ist und dass diese TNF-Domäne (n), beispielsweise Bindungs- taschen für zelluläre Reaktionspartner, bei Kontakt mit zellulären Reaktionspartnern für diese frei zu- gänglich ist/sind."Gerichtet immobilisiert"bedeu- tet auch, dass die Fixierung von TNF auf der Trä- geroberfläche so erfolgt, dass das immobilisierte Protein bei einer späteren Verwendung in einer zel- lulären beziehungsweise zellähnlichen Umgebung durch Protein-degradierende Enzyme nicht oder nur sehr langsam degradiert werden kann. Das heißt, das immobilisierte TNF-Molekül ist auf der Trägerober- fläche so ausgerichtet, das es so wenig wie möglich Angriffspunkte für Proteasen bietet.

"Beibehaltung der biologischen Aktivität"bedeutet, dass TNF, insbesondere das TNF-Trimer, nach Immobi- lisierung an der Oberfläche eines Nanopartikels die gleichen oder nahezu gleichen biologischen Funktio- nen in zumindest ähnlichem Ausmaß ausüben kann wie die gleichen TNF-Moleküle im nicht-immobilisierten Zustand unter geeigneten in vitro-Bedingungen be-

ziehungsweise die gleichen TNF-Moleküle in ihrer natürlichen zellulären Umgebung.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird 4 unter einem"Trimer"oder"TNF-Trimer"eine Verbin- dung verstanden, die durch Verknüpfung von drei Un- tereinheiten, insbesondere drei TNF-Monomeren, ge- bildet wird, wobei die Verknüpfung der Monomere un- tereinander vorzugsweise durch Disulfid- Brückenbildung zwischen Cystein-Resten erfolgt. Die Trimerisierung von TNF führt gegenüber dem TNF- Monomer zu einer Stabilisierung der Moleküle. Bei den drei zu einem Trimer verknüpften TNF- Untereinheiten kann es sich um identische TNF- Monomere handeln, das heisst das Trimer kann als Homotrimer vorliegen. Das Trimer kann erfindungsge- mäß aber auch unterschiedliche TNF-Monomere umfas- sen, wobei sich diese sowohl bezüglich ihrer Zusam- mensetzung, beispielsweise Aminosäuresequenz, als auch bezüglich ihrer Länge unterscheiden können.

Ferner muss bei dem immobilisierten TNF-Trimer nicht jede TNF-Untereinheit an der Oberfläche des Nanopartikel-Trägers gebunden sein. Das TNF-Trimer kann auch dadurch an Nanopartikeln fixiert sein, das nur eine TNF-Untereinheit des Trimers über eine kovalente Bindung zwischen seiner funktionellen Gruppe 2 A und der funktionellen Gruppe 1 A am Trä- ger fixiert ist.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Trimer- Bildung entweder vor oder während der Immobilisie- rung durch hochaffine Bindung nicht-kovalenter Art, aber auch insbesondere durch kovalente Disulfid- Brückenbildung zwischen Cystein-Resten spontan er--

folgt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungs- form der Erfindung ist vorgesehen, dass die zu im- mobilisierenden TNF-Moleküle ein natürliches oder synthetisch hergestelltes Multimerisierungmodul enthalten, das die Trimererisierung von TNF durch hochaffine Bindung nicht-kovalenter Art, aber ins- besondere durch Ausbildung von kovalenten Disul- fidbrücken, und damit eine regelmäßige und stabile Trimerisierung von TNF bewirkt. Erfindungsgemäß be- sonders bevorzugt wird das Tenascin C- Multimerisierungsmodul in die zu immobilisierenden TNF-Moleküle auf gentechnischem Wege oder unter Verwendung chemischer Syntheseverfahren eingeführt.

Die so modifizierten TNF-Moleküle werden dann ent- weder vor oder während der Immobilisierung an den erfindungsgemäßen Nanopartikeln trimerisiert.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Oberfläche des erfindungsgemäßen Nanopartikels weitere funktionel- le Gruppen 1 B und TNF weitere, die funktionellen Gruppen 1 B bindende komplementäre Gruppen 2 B auf- weist, wobei die funktionellen Gruppen 1 B und 2 B erfindungsgemäß insbesondere eine nicht-kovalente Bindung eingehen können.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer"zweiten funktionellen Gruppe 1 B"eine chemische Gruppe verstanden, die in der Lage ist, mit einer komplementären funktionellen Gruppe 2 B, die in einem zu immobilisierenden TNF-Molekül vor- handen ist, derart zu interagieren, dass eine nicht-kovalente Bindung zwischen den beiden Bin- dungspartnern stattfinden kann.

In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist die zweite funktionelle Gruppe 1 B der Trägerober- fläche ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oli- gohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chi- tinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Strepta- vidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin.

Erfindungsgemäß ist die funktionelle Gruppe 2 B des zu immobilisierenden TNF-Moleküls ausgewählt aus einer Gruppe, die die gleichen Spezies wie für die funktionelle Gruppe 1 B der Trägeroberfläche ent- hält. Ein erfindungsgemäßes Nanopartikel weist also in seiner Oberfläche eine funktionelle Gruppe 1 B auf, die nicht-kovalent mit einer funktionellen Gruppe 2 B von TNF verknüpft ist, wobei die funkti- onelle Oberflächen-Gruppe 1 B eine andere Gruppe als die funktionelle TNF-Gruppe 2 B ist. Die beiden miteinander in nicht-kovalente Bindung tretenden Gruppen müssen komplementär zueinander sein, das heißt in der Lage sein, eine nicht-kovalente Bin- dung miteinander einzugehen.

Wird erfindungsgemäß als funktionelle Oberflächen- Gruppe 1 B ein Metallionenchelatkomplex verwendet, ist die funktionelle komplementäre TNF-Gruppe 2 B eine Oligohistidingruppe. Wird als funktionelle O- berflächengruppe 1 B eine Oligohistidingruppe ver- wendet, ist die funktionelle komplementäre TNF- Gruppe 2 B ein Metallchelatkomplex.

Wird als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1 B Strep- Tag I, Strep-Tag II, Biotin oder Desthiobiotin ver- wendet, wird als komplementäre funktionelle TNF-

Gruppe 2 B Streptavidin, Streptactin, Avidin oder Neutravidin eingesetzt. Wird als funktionelle Ober- flächen-Gruppe 1 B Streptavidin, Streptactin, Avi- din oder Neutravidin eingesetzt, wird als komple- mentäre funktionelle TNF-Gruppe 2 B Strep-Tag I, Strep-Tag II, Biotin oder Desthiobiotin eingesetzt.

Wird in einer weiteren Ausführungsform Chitin oder ein Chitinderivat als funktionelle Oberflächen- Gruppe 1 B eingesetzt, wird als funktionelle kom- plementäre TNF-Gruppe 2 B eine Chitinbindungsdomäne eingesetzt. Wird als funktionelle Oberflächen- Gruppe 1 B eine Chitinbindungsdomäne eingesetzt, wird als funktionelle komplementäre TNF-Gruppe 2 B Chitin oder ein Chitinderivat eingesetzt.

Die vorstehend genannten funktionellen Gruppen der Trägeroberfläche und/oder von TNF werden erfin- dungsgemäß vorzugsweise mittels eines Spacers mit dem zu immobilisierenden TNF-Molekül beziehungswei- se der Trägeroberfläche verbunden beziehungsweise !' unter Verwendung eines Spacers an den Träger oder in das TNF-Molekül eingeführt. Der Spacer dient so- mit einerseits als Abstandshalter der funktionellen Gruppen zu dem Träger beziehungsweise dem TNF- Molekül, andererseits aber auch als Träger für die funktionelle Gruppe. Ein derartiger Spacer kann er- findungsgemäß ein Alkylen oder Ethylenglykol-Spacer mit 2 bis 50 C-Atomen sein, der in bevorzugter Aus- führungsform substituiert ist und Heteroatome auf- weist. Erfindungsgemäß kann der Spacer flexibel und/oder linear sein. Bei Verwendung eines Spacers im Zusammenhang mit der ersten funktionellen Gruppe 1 A der Oberfläche bindet der Spacer kovalent an

eine Seitenkette einer Aminosäure von TNF, wobei die Aminosäure, an die die Bindung erfolgt, eine natürliche oder unnatürliche Aminosäure sein kann.

Sofern die Aminosäure eine natürliche Aminosäure ist, wird sie durch Bindung an den Spacer und die damit verbundene funktionelle erste Oberflächen- Gruppe 1 A zu einer unnatürlichen Aminosäure im Sinne der Erfindung.

Sofern der Spacer eine funktionelle TNF-Gruppe 2 A mit einem Träger verbindet, geschieht dies vorzug- weise über eine auf dem Träger angeordnete Anker- gruppe, die vorzugsweise als Silan mit reaktiven Gruppen ausgeführt ist, beispielsweise die mit Si- OH-Gruppen der Oberfläche des vorzugsweise oxidi- schen Si-Trägers kovalente Si-O-Si-Bindungen (Si- lox-Anbindungen) ausbilden kann.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung verbindet der Spacer entweder eine funktionelle Gruppe der Trä- geroberfläche mit TNF oder eine funktionelle Gruppe t des Proteins mit dem Träger, wobei die funktionelle Gruppe auch als Bestandteil des Spacers, das heißt eine seiner funktionellen Gruppen, angesehen werden kann.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden als erste funktionelle Oberflä- chen-Gruppe 1 A die Aminogruppe, Carboxygruppe, E- poxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgrupe, Thi- olgruppe oder Thioestergruppe verwendet, die mit- tels eines Spacers, beispielsweise im Falle einer Alkylketongruppe mittels Lävulinsäure, mit einer

Seitenkette einer in dem zu immobilisierenden TNF- Molekül vorhandenen natürlichen oder unnatürlichen Aminosäure verbunden werden beziehungsweise durch den Spacer in das TNF-Molekül eingeführt werden.

Sofern die Verbindung zu einer natürlichen Amino- säure erfolgt, wird diese durch die Bindung mit dem die funktionelle Gruppe aufweisenden Spacer zu ei- ner unnatürlichen Aminosäure.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem"Träger"ein chemisch inerter Stoff verstanden, der als Gerüst für das zu immobilisie- rende TNF-Molekül dient. In bevorzugter Ausfüh- rungsform der Erfindung besteht der Träger aus ei- nem biologisch verträglichen Material. Erfindungs- gemäß ist der Träger ein kompaktes oder hohles Par- tikel mit einer Größe von 5 nm bis 500 nm. Im Zu- sammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff biologisch verträglich", dass der Trä- ger beziehungsweise die Oberfläche des Nanoparti- kels sowohl hinsichtlich seiner Materialzusammen- setzung als auch hinsichtlich seiner Struktur weder im Körper eines Rezipienten noch in isolierten bio- logischen Geweben oder Flüssigkeiten eine immunolo- gische, toxische oder sonstige Reaktion hervorruft und zelluläre oder molekulare Prozesse nicht oder kaum stört. Wenn ein biologisch verträglicher Trä- ger"biologisch abbaubar"ist, bedeutet dies, dass ein Träger im Körper eines Rezipienten beziehungs- weise in biologischen Geweben oder Flüssigkeiten langsam abgebaut beziehungsweise metabolisiert wer- den kann, vorzugsweise, nachdem das am Träger immo- bilisierte TNF-Molekül seine biologische Aktivität

entfaltet hat, wobei die Produkte des Abbaus bezie- hungsweise der Metabolisierung keine immunologi- schen, toxischen oder sonstigen Reaktionen hervor- rufen und darüber hinaus im Körper des Rezipienten gut resorbierbar sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass der Träger des erfindungsgemä- ßen Nanopartikels ein biologisch verträgliches, vorzugsweise ein anorganisches oder ein organi- sches, Material enthält oder aus diesem besteht. In bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfin- dung besteht der erfindungsgemäße Nanopartikel aus einem anorganischen Trägermaterial wie Silicium, Si02, SiO, einem Silikat, Al203, Si02-A1203, Zr02, Fe203, Ag2O, Zr203, Ta205, Zeolith, TiO2, Glas, Indi- umzinnoxid, Hydroxylapatit, Calciumphosphat, Calci- umcarbonat, Au, Fe304, ZnS, CdSe oder ein Gemisch davon. Bei einem organischen, biologisch verträgli- chen Trägermaterial kann es sich um Stoffe wie Po- lypropylen, Polystyrol, Polyacrylate oder ein Ge- misch davon handeln.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform be- steht der Träger des erfindungsgemäßen Nanoparti- kels aus einem biologisch abbaubaren Material oder enthält dieses. Die biologisch abbaubaren Materia- lien müssen für den Zeitraum der Anwendung stabil sein, können danach jedoch so abgebaut werden, dass ausscheidbare Bruchstücke erhalten werden. Insbe- sondere handelt es sich dabei um Polyester der Po- lymilchsäure, die durch Quervernetzung zusätzlich stabilisiert wurden und dadurch in besonderer Weise kontrolliert biologisch abbaubar sind. Besonders

bevorzugt ist die Verwendung eines Polyesters von Polymilchsäure, insbesondere Poly (D, L-milchsäure- co-glykolsäure) (PLGA).

Die Herstellung der Träger der erfindungsgemäßen Nanopartikel kann unter Verwendung üblicher, auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren, wie Sol-Gel- Synthese-Verfahren, Emulsionspolymerisation, Sus- pensionspolymerisation erfolgen.

Die Oberflächen des Nanopartikel-Trägers werden durch chemische Modifizierungsreaktionen mit spezi- fischen funktionellen Gruppen ausgebildet. Diese funktionellen Gruppen weisen dabei eine chemische Reaktivität auf, die geeignet ist, mit spezifischen in TNF-Moleküle eingebrachten funktionellen Gruppen zu reagieren. Die Bindung von TNF erfolgt dabei so- wohl kovalent als auch nicht-kovalent über eine chemische Reaktion zwischen TNF und Oberfläche. Die Träger, insbesondere deren Oberflächen, werden da- her nach ihrer Herstellung unter Verwendung übli- ! cher Verfahren, beispielsweise Propfpolymerisation, Silanisierung, chemischer Derivatisierung etc. mit geeigneten funktionellen Gruppen 1 A beziehungweise funktionellen Gruppen 1 A und 1 B versehen. Die Dichte der funktionellen Gruppen und der Abstand dieser Gruppen zueinander können optimiert werden.

Auch die Umgebung der funktionellen Gruppen kann hinsichtlich einer möglichst effizienten gerichte- ten Immobilisierung vorbereitet werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der anorganische Träger, beispiels- weise der in Form von Quarz, Kieselerde, Kieselgur,

Silikagel und/oder SiO2-Pulver vorliegende Träger vor Ausbringen der funktionellen Gruppen 1 A und 1 B silanisiert, vorzugsweise nach vorhergehender Hydrophilisierung.

In besonders bevorzugter Ausführungsform kann vor- gesehen sein, dass die Anzahl der funktionellen Gruppen 1 A und 1 B der Oberfläche durch Zugabe von Verdünnersilanen bei der vorzugsweise vorgesehenen Silanisierung variiert werden kann. Unter dem Beg- riff Verdünnersilan wird ein Organosilan, das bio- chemisch inerte funktionelle Gruppen trägt, ver- standen, das überdies nicht in der Lage ist, einen die funktionellen Oberflächen-Gruppen tragenden Spacer zu binden. Vorzugsweise wird das Verdünner- silan eingesetzt, um neben dem Verdünnungseffekt auch die unspezifische Bindung von Proteinen an die Oberfläche des Trägers zu reduzieren. In einer be- vorzugten Ausführungsform weist das Verdünnersilan von der Silankopfgruppe ausgehend 2 bis 20 Alky- lengruppen auf, an die sich vorzugsweise 2 bis 6 Oxoethylengruppen anschließen und durch beispiels- weise eine Hydroxygruppe oder Methylethergruppe terminiert sind.

In besonders bevorzugter Ausführungsform ist vorge- sehen, dass die Verdünnersilane der Trägeroberflä- che durch entsprechende Alkylkettenlänge den Self- Assembly-Effekt begünstigen. Zudem kann vorgesehen sein, dass diese Verdünnersilane, die bei der Sila- nisierung des Trägers verwendet werden, die unspe- zifische Adsorption von Proteinen an der Nanoparti- kel-Oberfläche durch zugefügte entsprechende funk- tionelle Einheiten, wie zum Beispiel Oligoethy-

lenglykol-Einheiten, verringern. Erfindungsgemäß können auch andere chemische Verbindungen einge- setzt werden, sofern sie bezüglich ihres unspezifi- schen Bindungsverhaltens Protein-abweisend wirken.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Nanoparti- kel, insbesondere die Oberfläche, zusätzliche Funk- tionalitäten aufweisen. Erfindungsgemäß kann der Träger insbesondere Fluoreszenzmarkierungen, UV/Vis-Markierungen, superparamagnetische Funktio- nen, ferromagnetische Funktionen und/oder radioak- tive Markierungen aufweisen. Aufgrund der erfin- dungsgemäß eingesetzten Funktionalitäten können entsprechend ausgestattete Nanopartikel unter Ver- wendung geeigneter Vorrichtungen leicht detektiert und/oder isoliert werden.

Die Oberfläche des Nanopartikelträgers kann erfin- dungsgemäß aber auch zusätzliche chemische Verbin- dungen aufweisen. Diese zusätzlich aufgebrachten chemischen Funktionalitäten richten sich unter an- zu derem nach der späteren Verwendung der erfindungs- gemäßen Nanocytes. Sollen diese beispielsweise zur Therapie und/oder Diagnose von Krankheiten verwen- det werden, können die Nanopartikel geeignete che- mische Verbindungen mit therapeutischer und/oder diagnostischer Wirkung enthalten. In besonders be- vorzugter Ausführungsform ist vorgesehen, dass die erfindungsgemäßen Nanopartikel zusätzlich Arznei- stoffe wie Cytostatika enthalten. Sie sind dement- sprechend besonders zur Therapie von Tumorerkran- kungen geeignet.

Erfindungsgemäß kann aber auch vorgesehen sein, dass die Funktionalisierung des Trägers unter Ver- wendung einer oder mehrerer chemischer Verbindungen erfolgt, die zur sterischen Stabilisierung und/oder zur Verhinderung einer Konformationsänderung von immobilisiertem TNF und/oder zur Verhinderung der Anlagerung einer weiteren biologisch aktiven Ver- bindung an den Träger dient. Erfindungsgemäß beson- ders bevorzugt ist, dass es sich bei dieser chemi- schen Verbindung um ein Polyethylenglykol, ein Oli- goethylenglykol, Dextran oder ein Gemisch davon handelt.

Der Träger kann neben zusätzlichen chemischen Funk- tionen auch weitere biologische Funktionen enthal- ten. Diese weitere bevorzugte Ausführungsform trägt Liganden, zum Beispiel Peptide oder Proteine, an ihrer Oberfläche, die ausgesuchte Gewebe oder Zel- len spezifisch binden.

Erfindungsgemäß kann das zu immobilisierende TNF- Molekül natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Es kann auch durch gentechnische Verfahren gegenüber dem Wildtyp-Protein modifiziert sein und/oder unnatürliche und/oder ungewöhnliche Amino- säuren enthalten.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorlie- genden Erfindung wird das zu immobilisierende TNF- Molekül nach peptidsynthetischen Verfahren oder durch in vitro-Translation hergestellt. Dabei wer- den in bevorzugter Ausführungsform bei der Herstel- lung unnatürliche, vorzugsweise Linker-Spacer- tragende Aminosäuren gezielt eingebaut, so dass

nachfolgend eine gerichtete und mit dem Erhalt der biologischen TNF-Aktivität kompatible TNF- Immobilisierung an den Träger möglich ist. Die An- wendung des Prinzip des Einbaus unnatürlicher Ami- nosäuren ermöglicht darüber hinaus den gezielten und selektiven Einbau von Fluorophoren oder anderen Markern an diesen unnatürlichen Aminosäuren.

In besonders bevorzugter Weise können diese Modifi- kationen darin bestehen, dass in dem TNF-Molekül natürlicherweise vorkommende Aminosäuren durch un- natürliche Aminosäuren ausgetauscht sind, das heißt, in einer bestimmten Position eine natürli- cherweise vorkommende Aminosäure entfernt und an gleicher Stelle eine unnatürliche Aminosäure inser- tiert wird. Das Einfügen einer unnatürlichen Amino- säure kann durch das Einfügen eines Stop-Codons an der gewünschten Stelle, durch das Verwenden bezie- hungsweise den Einsatz einer mit der entsprechenden unnatürlichen Aminosäure beladenen Supressor-tRNA und eines damit durchgeführten in vitro- Translationsansatzes erfolgen. Solche unnatürlichen Aminosäuren sind Verbindungen, die eine Aminosäure- funktion und einen Rest R aufweisen und nicht über einen natürlich vorkommenden genetischen Code defi- niert sind, zum Beispiel L- (6, 7-Dimethyloxy- coumaryl) -Alanin. In bevorzugter Weise weisen diese Aminosäuren eine Alkylketongruppe oder eine Alde- hydgruppe, Thioestergruppe, Thiolgruppe, Hydra- zingruppe oder Hydrazidgruppe auf. Diese unnatürli- chen Aminosäuren können durch gentechnologische Verfahren oder während einer chemischen Synthese

von TNF in das Molekül eingefügt werden, vorzugs- weise zusammen mit einem Spacer oder Linker.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist also zumindest eine Aminosäure von TNF derivatisiert, insbesondere durch Einführung einer Alkylketongruppe, Thiolgruppe, Aldehydgruppe, Thioestergruppe, Hydrazingruppe und/oder Hydra- zidgruppe. Insbesondere wird eine der vorhergehen- den Funktionen über einen Spacer mit der Seitenket- te einer unnatürlichen oder natürlichen Aminosäure verbunden beziehungsweise der Spacer weist eine solche Funktion auf. Der Spacer kann in bevorzugter Ausführungsform flexibel oder linear sein und bei- spielsweise eine Kettenlänge von 2 bis 50 Atomen aufweisen. Der Spacer ist in weiterer bevorzugter Ausführungsform durch gegebenenfalls substituierte und/oder Heteroatome enthaltende Alkylengruppen ge- bildet.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Spacer durch die Bindung einer Seitenkette ei- ner Aminosäure von TNF, beispielsweise Lysin, an Lävulinsäure (4-Oxopentansäure) gebildet, wobei gleichzeitig eine Methylketongruppe eingeführt wird und der Spacer dem gemäß aus Seitenkette und Lävulinsäure gebildet wird.

Sofern die einzusetzende unnatürliche Aminosäure bereits eine Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Thi- olgruppe, Thioestergruppe, Hydrazidgruppe oder Hydrazingruppe aufweist, ist eine vorgenannte Deri- vatisierung nicht mehr nötig. Es kann also vorgese- hen sein, eine natürlicherweise vorkommende Amino-

säure, beispielsweise Lysin, zu modifizieren, bei- spielsweise durch Derivatisierung von deren Seiten- kette, insbesondere. deren primärer Aminogruppe, mit der Carbonsäurefunktion der Lävulinsäure. TNF- Molekmle, die eine solche natürlicherweise vorkom- mende Aminosäure mit unnatürlicher Derivatisierung aufweisen, sind im Sinne der vorliegenden Lehre mo- difiziert. Der Einbau von beispielsweise Lävulin- säure in eine unnatürliche oder natürliche Amino- säure ermöglicht es, an definierter Stelle der Se- quenz eine Ketofunktion einzubauen, die dann selek- tiv beispielsweise mit einem Hydrazin oder Hydrazid zu Hydrazon reagieren kann.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Modifikation von TNF dadurch, dass Tags, also Markierungen, insbe- sondere mindestens drei Histidin-Reste, vorzugswei- se Oligohistidine, in das TNF-Molekül eingeführt werden, vorzugsweise am C-Terminus oder N-Terminus.

Solche Tags können jedoch auch intramolekular ange- ordnet sein. In einer derartigen Ausführungsform ist vorgesehen, die Oberfläche des Trägers, bei- spielsweise die silanisierte Oberfläche des Trä- gers, durch Aufbringen von Metallchelatkomplexen mit funktionellen Gruppen zu versehen. Auf diese Weise wird eine nicht-kovalente Bindung der Metall- chelatkomplexe mit dem Oligohistidin-Rest des zu immobilisierenden TNF-Moleküls erreicht. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt die Metallkomponente des Metallchelatkomple- xes ein zweiwertiges Metallkation, insbesondere Ni- ckel2+, dar. In einer besonders bevorzugten Ausfüh-

rungsform ist der Metallchelatkomplex Nickel-NTA (NTA : Nitrilotriessigsäure), insbesondere ein Deri- vat davon. Der Metallchelatkomplex, insbesondere Ni-NTA oder ein Derivat davon, ist in bevorzugter Ausführungsform an der Oberfläche des Trägers ge- bunden, beispielsweise mittels einer Bindung zwi- schen einer primären Aminogruppe des NTA-Derivats und einer Oberflächen-gebundenen Epoxygruppe.

Erfindungsgemäß kann auch vorgesehen sein, die Mo- difizierung von TNF dadurch vorzunehmen, dass die- sem, vorzugsweise am C-Terminus oder N-Terminus, mindestens ein Strep-Tag, beispielsweise Strep-Tag I oder Strep-Tag II oder Biotin oder Desthiobiotin hinzugefügt wird. Im Zusammenhang mit der vorlie- genden Erfindung werden unter einem"Strep-Tag" auch funktionelle und/oder strukturelle Äquivalente verstanden, sofern Streptavidin und/oder dessen Ä- quivalente binden können. Der Begriff"Streptavi- din"erfasst im Sinne der vorliegenden Erfindung also auch dessen funktionelle und/oder, strukturelle Äquivalente. In dieser Ausführungsform ist vorgese- hen, die Oberfläche des Trägers, vorzugsweise eines anorganischen Trägers, insbesondere die silanisier- te Oberfläche des Trägers, mit Streptactin, Avidin, Neutravidin oder Streptavidin zu versehen. Die er- findungsgemäß vorgesehene Bindung zwischen zu immo- bilisierenden TNF-Molekülen und Oberfläche des Trä- gers erfolgt also durch eine Affinitätsbindung zwi- schen beispielsweise Strep-Tag und beispielsweise Streptavidin. Es ist auch möglich, dass beispiels- weise Streptavidin am TNF-Molekül und beispielswei- se das Strep-Tag als funktionelle Gruppe des Trä-

gers vorgesehen ist. Selbstverständlich ist es er- findungsgemäß auch möglich, mehrere der genannten Modifikationen an dem zu immobilisierenden TNF- Molekül vorzunehmen, zum Beispiel eine unnatürliche Aminosäure, die Oligohistidin-und/oder Strep-Tags enthält, einzuführen.

Die Erfindung sieht also vor, beispielsweise mit unnatürlichen Aminosäuren, natürlichen, jedoch un- natürlich derivatisierten Aminosäuren, spezifischen Histidin-und/oder Strep-Tags modifizierte TNF- Moleküle mit dazu komplementär reaktiven Oberflä- chen derart zur Bindung zu bringen, dass eine ge- eignete Anbindung der TNF-Moleküle und damit eine Immobilisierung dieser erfolgt.

Wie vorstehend beschrieben modifizierte TNF- Moleküle selbst sind auch Gegenstand der vorliegen- den Erfindung.

In vorteilhafter Weise behält gebundenes TNF dabei vollständig seine biologische Funktionen bei. Durch die bereitgestellten Linker beziehungsweise Spacer zwischen Träger-und TNF-Oberfläche wird den steri- schen Anforderungen für eine Immobilisierung von TNF unter Erhalt seiner Aktivität Genüge getan. Zu- dem ermöglicht die Erfindung auch den ortsspezifi- schen Einbau von Reporter-oder Markergruppen, zum Beispiel Fluorophoren, Spin-Labeln, Goldpartikeln für Lichtstreuung etc. in Positionen, die die funk- tionellen Eigenschaften von TNF nicht beeinträchti- gen. Die Vorteile der erfindungsgemäßen Nanoparti- kel und des erfindungsgemäßen Verfahrens zur spezi- fischen und gerichteten Immobilisierung und Markie-

rung von TNF im Vergleich zum Stand der Technik re- sultieren aus den spezifischen chemischen Reaktio- nen zwischen TNF-Molekülen, die mit unnatürlichen Aminosäuren oder spezifischen Gruppen modifiziert wurden und komplementär reaktiven Festphasen sowie aus der selektiven Modifikation des zu immobilisie- renden TNF-Moleküls. Die immobilisierten und gege- benenfalls auch markierten TNF-Moleküle sind durch den Erhalt ihrer nativen Konformation stabiler ge- gen enzymatischen oder chemischen Abbau und behal- ten ihre biologischen Funktionen bei. Dabei werden insbesondere die biologischen Aktivitäten, die auf Protein-Protein-Wechselwirkung beruhen, durch die immobilisierten TNF-Moleküle weitervermittelt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass das TNF-Molekül mit Markern, die seinen Nachweis erlauben, markiert ist. Dabei kann es sich beispielsweise um Fluo- rophore, Spin-Label, Goldpartikel, radioaktive Mar- ker oder ähnliches handeln. In besondersbevorzug- t ter Weise sind diese Marker, beispielsweise die Fluorophore, in der Lage, bei der Bindung eines in einem Test nachzuweisenden Bindungspartners an das gebundene TNF-Molekül eine spezifische Änderung der Fluoreszenzemission zu zeigen. Die Fluorophore kön- nen in das zu immobilisierende TNF mittels Amino- säuren, insbesondere unnatürlicher Aminosäuren, eingefügt werden. Erfindungsgemäß geeignet Fluor- marker sind beispielsweise N-Methyl-Aza-Tryptophan oder Coumarinderivate, wie DCA (6,7-Dimethoxy-4- coumaryl) oder NBD (N-ß-7-nitro-benzofurazan-L-N- diaminopropionsäure). Erfindungsgemäß kann das zu

immobilisierende TNF-Molekül auch mit Fluorophoren markiert sein, die eine Einzelmoleküldetektion er- möglichen, zum Beispiel die Fluoreszenzfarbstoffe CyDye (Ammersham Pharmacia Freiburg) oder Alexa (Molecular Probes, Eugene, USA).

Die erfindungsgemäß ermöglichte Detektion von ober- flächengebundenen Liganden des immobilisierten TNF- Moleküls, also zum Beispiel der Nachweis eines Zelloberflächen-Rezeptors, kann zum Beispiel durch Matrix-unterstützte Laser-Desorptions/Ionisations- Massenspektrometrie (MALDI-TOF) erfolgen. Der mas- senspektroskopische Nachweis umfasst die Identifi- zierung und Charakterisierung der gebundenen Ligan- den in situ sowie die ortsaufgelöste Analytik. Der Nachweis der oberflächengebundenen Liganden kann durch Fluoreszenzspektroskopie erfolgen. Die Bin- dung des Liganden an den erfindungsgemäß immobili- sierten Festphasen-Liganden, also TNF, ruft eine Änderung der Fluoreszenzeigenschaften der erfin- dungsgemäß eingesetzten Fluoreszenzmarker hervor, die eine Quantifizierung der Bindungsereignisse er- möglicht.

Die vorliegende Erfindung betrifft also auch Ver- fahren zum Nachweis einer Interaktion von immobili- siertem TNF mit beispielsweise Liganden wie Rezep- toren, funktionellen oder strukturellen Äquivalen- ten, Analoga, Agonisten, Antagonisten oder ähnli- chen, insbesondere zum Zweck der medizinischen For- schung und Diagnostik, wobei die erfindungsgemäßen Nanopartikel eingesetzt werden, um die vorgenannten Bindungspartner von immobilisiertem TNF zu identi- fizieren. Gemäß diesem Verfahren werden erfindungs-

gemäße Nanopartikel mit daran immobilisiertem TNF mit einer zu untersuchenden Lösung, die potentielle Bindungspartner enthält, in Kontakt gebracht und eine Wechselwirkung oder eine Hemmung dieser Wech- selwirkung nachgewiesen. Das vorgenannte Verfahren stellt also auch ein Verfahren zum Identifizieren oder Screenen von potentiellen Bindungspartnern, beispielsweise potentiellen Liganden, des erfin- dungsgemäß immobilisierten TNF dar.

Ebenso betrifft die Erfindung Verfahren zum quanti- tativen Isolieren von Substanzen, die mit dem er- findungsgemäß immobilisierten TNF-Molekül reagie- ren, das heißt binden. Bei solchen Substanzen han- delt es sich insbesondere um Proteine.

In besonders bevorzugter Weise können die erfin- dungsgemäßen Verfahren und die erfindungsgemäßen Nanopartikel auch eingesetzt werden, um Stoffe zu identifizieren, die beispielsweise als Modulatoren, das heißt Verstärker, Induktoren oder Hemmstoffe t für die, insbesondere physiologischen, Interaktio- nen von TNF mit anderen Proteinen fungieren. Derar- tige nachzuweisende Hemmstoffe können beispielswei- se gentechnisch veränderte, körpereigene Proteine, chemische synthetisierte Verbindungen aus Substanz- bibliotheken oder andere auch unbekannte Substanzen sein, die gegebenenfalls therapeutischen Nutzen mit sich bringen können.

In einer weiteren Ausführungsform kann vorgesehen sein, TNF zu immobilisieren, das einen ersten von zwei Reaktanten trägt oder diesen darstellt und die Wechselwirkung des zweiten Reaktanten mit dem ers-

ten Reaktanten durch eine geeignete Nachweismethode nachweist. Dabei kann vorzugsweise auch vorgesehen sein, dass die Wechselwirkung des zweiten Reaktan- ten mit dem ersten Reaktanten in Gegenwart oder Ab- wesenheit eines potentiellen Modulators, zum Bei- spiel Induktors oder Inhibitors durch geeignete Nachweisverfahren nachgewiesen wird und so poten- tielle Induktoren oder Inhibitoren in ihrer Wirk- samkeit, beispielsweise als Arzneimittel, überprüft werden können. Die zu überprüfenden potentiellen Induktoren oder Inhibitoren können beispielsweise aus Substanzbibliotheken stammen. In besonders be- vorzugter Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass der Inhibitor oder der zweite Reaktant, also zum Beispiel ein Protein, eine in Genom-Sequenzier- Projekten identifiziertes Protein ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft also auch Ver- fahren zur Identifizierung und/oder Detektion einer Substanz, die die Interaktion zwischen immobili- , siertem TNF und dessen Interaktionspartner modifi- zieren, insbesondere fördern oder hemmen kann, wo- bei das an Nanopartikeln immobilisierte TNF zusam- men mit einem, vorzugsweise aufgereinigten und iso- lierten, Interaktionspartner, in Gegenwart oder Ab- wesenheit der zu testenden Substanz inkubiert und eine Auswirkung dieser Substanz auf die Interaktion zwischen immobilisiertem TNF und dessen Bindungs- partner nachgewiesen wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur gerichteten Immobilisierung von TNF an einem Nanopartikel unter Beibehaltung der biologischen TNF-Aktivität, wobei die Oberfläche eines anorgani-

schen oder organischen Trägers durch Aufbringen ei- ner ersten funktionellen Gruppe 1 A und gegebenen- falls einer zweiten. funktionellen Gruppe 1 B modi- fiziert und komplementäre funktionelle Gruppen 2 A und gegebenenfalls funktionelle Gruppen 2 B aufwei- sende modifizierte TNF-Moleküle mit der modifizier- ten Nanopartikel-Oberfläche derart in Kontakt ge- bracht, dass eine kovalente Bindung zwischen den funktionellen Gruppen 1 A und 2 A und gegebenen- falls eine nicht-kovalente Bindung zwischen den Gruppen 1 B und 2 B dergestalt stattfindet, dass das Protein gerichtet und unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität an das Nanopartikel bindet.

Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass die funktionellen Gruppen 1 A und 2 A ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Car- boxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkyl- ketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydra- zidgruppe, Thiolgruppe und Thioestergruppe. Die funktionellen Gruppen 1 B und 2 B sind erfindungs- gemäß ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oli- gohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chi- tinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Strepta- vidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin. Erfin- dungsgemäß können die funktionellen Gruppen 1 A, 1 B, 2 A und/oder 2 B unter Verwendung eines Spacers mit dem Träger und/oder Protein verbunden sein.

In bevorzugter Ausführungsform werden die funktio- nellen Gruppen 1 A und 1 B mittels Propfpolymerisa- tion, Silanisierung oder chemischer Derivatisierung auf die Trägeroberfläche aufgebracht. Beispielswei-

se kann der Träger nach seiner Herstellung zunächst hydrophylisiert und dann silanisiert werden. Die Silanisierung der Trägeroberfläche erfolgt bei- spielsweise mit einem Organosilan, insbesondere SiR1R2R3R4, wobei Ri bis R3 hydrolisierbare Gruppen wie Alkoxygruppen oder Halogenide, bevorzugt Chlo- ride, und R4 ein organischer Rest ist, der als Spacer mit einer ersten funktionellen Gruppe 1 A oder als Bindestelle für einen die erste funktio- nelle Gruppe 1 A tragenden Spacer ausgeführt sein kann. Sofern in einer anderen Ausführungsform der Erfindung R4 als Bindestelle, zum Beispiel als Epo- xygruppe, für den die funktionelle Gruppe aufwei- senden Spacer ausgeführt ist, werden im Anschluss an die Silanisierung die funktionellen Gruppen auf die Oberfläche aufgebracht, das heißt zum Beispiel die Maleinimidogruppe usw..

Die Dichte der funktionellen Gruppen oder der Ab- stand der funktionellen Gruppen von der Oberfläche und damit die Flexibilität können gegebenenfalls optimiert werden. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Umgebung der funktionellen Gruppen auf der Trägeroberfläche bezüglich elektrostatischer und sterischer Ausstattung für eine möglichst effizien- te, gerichtete Immobilisierung vorbereitet wird.

Darüber hinaus können die Trägeroberflächen zusätz- lich mit Molekülen wie Polyethylenglykolen, Oli- goethylenglykolen, Dextranen und ähnlichen ausges- tattet werden, um eine unerwünschte Konformation- sänderung der immobilisierten TNF-Moleküle zu ver- hindern, die unspezifische Adsorption anderer bio-

logischer Verbindungen zu minimieren und/oder die Trägersysteme sterisch zu stabilisieren.

In einem weiteren Schritt wird TNF an der modifi- zierten Oberfläche des Nanopartikelträgers immobi- lisiert, wobei je nach Oberflächenmodifikation die entsprechende Proteinmodifikation zu wählen ist.

Dabei wird das zu immobilisierende TNF-Molekül er- findungsgemäß mit der modifizierten Oberfläche un- ter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht, dass ein Abbau des Proteins minimiert oder verhindert wird.

Nach der TNF-Immobilisierung an der Trägeroberflä- che ist erfindungsgemäß vorgesehen, die erfindungs- gemäßen Nanopartikel gegebenenfalls mit Hilfe eines Stealth-Verfahrens, insbesondere durch Verpacken in beispielsweise Liposomen, zu maskieren, um bei spä- terer Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel eine ausreichende biologische Zirkulation zu errei- chen.

Erfindungsgemä# besteht auch die Möglichkeit, die Nanopartikel mit dem daran immobilisierten TNF auf einer Membran abzuscheiden, wobei der entstehende Film durch Quervernetzung mechanisch und/oder che- misch stabilisiert wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwen- dung der erfindungsgemäßen Nanopartikel zur Her- stellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere zur Tumortherapie. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer"phar- mazeutischen Zusammensetzung"ein zu diagnosti-

schen, therapeutischen und/oder prophylaktischen Zwecken verwendetes Gemisch verstanden, das natür- liche oder synthetisch hergestellte Wirkstoffe in einer beim Patienten gut applizierbaren Form ent- hält. Erfindungsgemäß ist also vorgesehen, dass die herzustellende pharmazeutische Zusammensetzung den Wirkstoff, insbesondere TNF, in einer an einem Na- nopartikel immobilisierten Form enthält. Die phar- mazeutische Zusammensetzung kann ein festes oder flüssiges Gemisch sein. Eine pharmazeutische Zusam- mensetzung kann gegebenenfalls einen oder mehrere pharmazeutische Träger sowie weitere Zusatzstoffe wie Stabilisatoren, Verdickungsmittel, Trennmittel, Gleitmittel, Farbstoffe, Geruchsstoffe, Geschmacks- stoffe, Gerüststoffe, Emulgatoren oder ähnliche enthalten.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die erfin- dungsgemäßen Nanopartikel enthält, das heißt also, die TNF in immobilisierter Form an einem erfin- dungsgemäßen Nanopartikel enthält.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der vorliegen- den Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Die Erfindung wird anhand der Figuren und der fol- genden Beispiele näher erläutert.

Sequenzprotokoll : SEQ ID Nr.. 1 zeigt die kodierende DNA-Sequenz eines TNF-Fusionsproteins am Beispiel von CysHisTNF (Kon- strukt 1) mit den Nukleotiden 1 bis 546 ;

SEQ ID Nr. 2 zeigt die von SEQ ID Nr. 1 abgeleitete translatierte Aminosäuresequenz der Aminosäuren 1 bis 181; SEQ ID Nr. 3 zeigt die kodierende DNA-Sequenz eines TNF-Fusionsproteins am Beispiel von TNC-TNF (Kon- strukt 2) mit den Nucleotiden 1 bis 705, und SEQ ID Nr. 4 zeigt die von SEQ ID Nr. 3 abgeleitete translatiere Aminosäuresequenz mit den Aminosäuren 1 bis 234.

Die Figuren zeigen : Figur 1 zeigt die Ergebnisse eines Biotests mit der Zielzelle KYM-1.

Figur 2 zeigt die Ergebnisse einer Elektrophorese.

Figur 3 zeigt die Ergebnisse eines weiteren Bio- tests mit der Zielzelle KYM-1.

Figur 4 zeigt die Ergebnisse eines Biotests, wobei die Wirkung erfindungsgemäßer Nanopartikel auf KYM- 1-Tumorzellen im Vergleich zu der von löslichem hu- manem rekombinanten TNF als Kontrolle untersucht wurde.

Figur 5 zeigt die Ergebnisse eines Biotests, wobei die Wirkung erfindungsgemäßer Nanopartikel auf Co- lo205-Tumorzellen im Vergleich zu der von löslichem humanem rekombinanten TNF als Kontrolle untersucht wurde. Kontrollen wurden mit löslichem humanem TNF mit oder ohne Coinkubation mit dem monoclonalen An-

tikörper 80M2, der selbst keine agonistische Akti- vität besitzt, durchgeführt.

Figur 6 zeigt die Ergebnisse eines weiteren Bio- tests mit der Zielzelle KYM-1, wobei die Wirkung erfindungsgemäßer Nanopartikel im Vergleich zu der von löslichem humanem rekombinanten TNF als Posi- tiv-Kontrolle sowie nicht mit TNF belädenen Nano- partikeln als Negativkontrolle untersucht wurde.

Figur 7 zeigt die Ergebnisse eines weiteren Bio- tests mit Mausfibroblasten, die humanen TNFR2 exprimieren und damit ein Zellmodell zur Erfassung membranTNF ähnlicher Bioaktivität sind. Die Figur zeigt die dem natürlichen Membran-TNF vergleichba- ren Eigenschaften der TNF-Nanocytes (Konjugat) im Vergleich zu positiv (80M2 plus TNF) und negativ (hu-TNF, 80M2, unbeladene Partikel) Kontrollen.

Figur 8 zeigt die Ergebnisse von Wellenleiterspekt- roskopie-Resonanz-Analysen, wobei der modifizierte Tumornekrosefaktor-Rezeptor 1 (TNFR1-Fc) über a- Aminogruppen auf eine Carboxymethyldextran-Matrix (CMD-Matrix) immobilisiert und danach Bindungsstu- dien mit CyHISTNF durchgeführt wurden. Die Auftra- gung des Ausmaßes an Bindung von CysHisTNF (extent) gegen die eingesetzte Konzentration (ligate) resul- tiert in einer Bindungskurve, die im Sättigungsbe- reich die maximal mögliche Bindung beschreibt (Bmax). Durch die Auftragung des Quotienten aus dem Ausmaß der Bindung und der CysHisTNF-Konzentration (extent/ligate) gegen das Ausmaß der Bindung (ex- tent) wird eine Geradengleichung erhalten, deren Steigung der negativen Affinitätskonstanten KD ent-

spricht (Scatchard Plot). Die Auftragung der Asso- ziationsraten-Konstante (kon) gegen die CysHisTNF- Konzentration ist eine weitere Methode, den KD-Wert zu bestimmen und dient zur Bestimmung des ermittel- ten KD-Wertes. Der Schnittpunkt der Geraden mit der Y-Achse entspricht der Halbwertzeit ti/z des Ligand- Rezeptor-Komplexes und ist somit ein Maß der Stabi- lität des CysHisTNF-Rezeptor-Komplexes.

Figur 9 zeigt die Ergebnisse von Wellenleiterspekt- roskopie-Resonanz-Analysen, wobei der modifizierte Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2 (TNFR2-Fc) über a- Aminogruppen auf eine CMD-Matrix immobilisiert und danach Bindungsstudien mit CyHISTNF durchgeführt wurden. Die Auftragung des Ausmaßes an Bindung von CysHisTNF (extent) gegen die eingesetzte Konzentra- tion (ligate) resultiert in einer Bindungskurve, die im Sättigungsbereich die maximal mögliche Bin- dung beschreibt (Bmax). Der Schnittpunkt der Gera- den mit der Y-Achse entspricht der Halbwertzeit tri/2 des Ligand-Rezeptor-Komplexes und ist somit ein Maß der Stabilität des CysHisTNF-Rezeptor-Komplexese Figur 10 zeigt die Ergebnisse von Wellenleiter- spektroskopie-Resonanz-Analysen, wobei der modifi- zierte Tumornekrosefaktor-Rezeptor 1 (TNFR1-Fc) ü- ber a-Aminogruppen auf eine CMD-Matrix immobili- siert und danach Bindungsstudien mit TNF durchge- führt wurden. Die Auftragung des Ausmaßes an Bin- dung von TNF (extent) gegen die eingesetzte Kon- zentration (ligate) resultiert in einer Bindungs- kurve, die im Sättigungsbereich die maximal mögli- che Bindung beschreibt (Bmax). Der Schnittpunkt der Geraden mit der Y-Achse entspricht der Halbwertzeit

ti/2 des Ligand-Rezeptor-Komplexes und ist somit ein Maß der Stabilität des TNF-Rezeptor-Komplexes.

Figur 11 zeigt die ERgebnisse von Wellenleiter- spektroskopie-Resonanz-Analysen, wobei der modifi- zierte Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2 (TNFR2-Fc) ü- ber a-Aminogruppen auf eine CMD-Matrix immobili- siert und danach Bindungsstudien mit TNF durchge- führt wurden. Die Auftragung des Ausmaßes an Bin- dung von TNF (extent) gegen die eingesetzte Kon- zentration (ligate) resultiert in einer Bindungs- kurve, die im Sättigungsbereich die maximal mögli- che Bindung beschreibt (Bmax). Der Schnittpunkt der Geraden mit der Y-Achse entspricht der Halbwertzeit tl/2 des Ligand-Rezeptor-Komplexes und ist somit ein Maß der Stabilität des TNF-Rezeptor-Komplexes.

Figur 12 zeigt die Ergebnisse von Zetapotentialun- tersuchungen.

Beispiel 1 Herstellung eines Trägers 1.1 Silica-Träger Zu 200 ml Ethanol wurden 12 mMol Tetraethoxysilan und 90 mMol NH3 gegeben. Das Gemisch wurde 24 Stun- den bei Raumtemperatur gerührt und anschließend wurden die gebildeten Partikel durch mehrfaches Zentrifugieren gereinigt. Dabei wurden 650 mg Sili- ca-Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 125 nm erhalten.

1.2 Magnetische Eisenoxid-Träger

200 ml einer 1 M FeC13-Lösung und 5 ml einer 2 M FeS04-Lösung in 2 M HCl wurden unter kräftigem Rüh- ren zu 250 ml einer 0,7 M NH3-Lösung gegeben. An- schließend wurde 30 Minuten gerührt und der gebil- dete schwarze Feststoff wurde mit 200 ml Wasser ge- waschen. Anschließend wurde der Niederschlag 30 Mi- nuten mit 100 ml 2 M HN03 gerührt und dreimal mit jeweils 100 ml Wasser gewaschen. Die superparamag- netischen Eisenoxid-Träger wurden in 50 ml einer 0,1 M Tetramethylammoniumhydroxid-Lösung resuspen- diert. Dabei wurden 2 g Eisenoxid-Partikel mit ei- ner mittleren Partikelgröße von 10 nm erhalten.

1.3 Magnetische Komposit-Träger 50 mg der in Beispiel 1.2 erhaltenen magnetischen Eisenoxid-Partikel wurden zweimal mit 5 ml Ethanol gewaschen und anschließend in 200 ml Ethanol aufge- nommen. Zu der Lösung wurden 12 mMol Tetraethoxysi- lan und 90 mMol NH3 gegeben. Anschließend wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurden die Partikel durch mehrfache Zentrifugation gerei- nigt. Dabei wurden 600 mg magnetische Komposit- Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 150 nm erhalten.

1.4 Fluoreszierende Träger 190 uMol Fluoresceinamin und 170 uMol Isocyana- topropyltriethoxysilan in 50 ml Ethanol wurden 3 Stunden unter Rückfluss gekocht. Zu 50 ml Ethanol wurden 3 mMol Tetraethoxysilan und 880 ul einer Si- lan-Farbstoff-Lösung gegeben. Nach Zugabe von 22,5 mMol NH3 wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur ge-

rührt. Anschließend wurden die erhaltenen Partikel durch mehrfache Zentrifugation aufgereinigt. Dabei wurden 160 mg Silica-Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 110 nm erhalten.

1. 5 Organische Polymer-Träger 50 mg des Emulgators p- (11=Acrylamido)- <BR> <BR> <BR> undecenoyloxyphenyl-dimethylsulfonium-methylsulfat wurden in 30 ml Wasser unter Rühren gelöst. An- schließend wurde eine Stunde lang Argon durch die Lösung geleitet. Unter Rühren erfolgte dann die Zu- gabe von 1,8 ml ml Methylmethacrylat. Die entstan- dene Emulsion wurde auf 60°C erwärmt. Durch Zugabe von 10 mg 2, 2'-Azobis- (2-Amidinopropan) dihydrochlo- rid wurde die Polymerisation gestartet. Nach 5 Stunden wurde die Partikelsuspension abgekühlt und die Partikel wurden durch Zentrifugation gereinigt.

Dabei wurden 1,6 g Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 145 nm erhalten. Die erhaltenen Partikel tragen kovalent verknüpfte Sulfoniumgrup- pen auf ihrer Oberfläche (Zetapotential im Phos- phat-Puffer, pH 7,0 : +22 mV) und sind zur Anbindung von Nukleophilen befähigt.

Beispiel 2 Oberflächenmodifizierung der Träger 2.1 Aminiofunktionalisierte Oberfläche Eine 1 Gew.-% wässrige Suspension der in den Bei- spielen 1.1 bis 1.4 erhaltenen Träger wurde mit 10 Vol.-% 25 % Ammoniak versetzt. 20 Gew. -% Aminopro-

pyltriethoxysilan, bezogen auf die Träger, wurden zugegeben und es wurde eine Stunde bei Raumtempera- tur gerührt. Die Partikel wurden durch mehrfaches Zentrifugieren gereinigt. Die erhaltenen Partikel tragen funktionelle Aminogruppen auf ihrer Oberflä- che (Zetapotential im 0,1 M Acetat-Puffer : +35 mV).

2.2 Aminofunktionalisierte organische Polymerträ- ger 10 mg der in Beispiel 1.5 erhaltenen Träger wurden in 50 ul eines 10 mMol Phosphatpuffers (pH 7,8) ge- geben. Anschließend wurden 950 ul einer 1 M Ethy- lendiamin-Lösung in 10 mMol Phosphatpuffer (pH 7,8) zugegeben. Dann wurde zwei Stunden bei Raumtempera- tur geschüttelt. Die Partikel wurden dann durch Zentrifugation aufgereinigt. Die so erhaltenen Trä- ger tragen kovalent gebundene Amino-Gruppen auf ih- rer Oberfläche.

2.3 Carboxy-funktionalisierte Oberfläche '.

Zunächst wurde eine 2 Gew.-% Suspension aminofunk- tionalisierter Träger in Tetrahydrofuran herge- stellt. Zu 10 ml dieser Lösung wurden 260 mg Bernsteinsäureanhydrid gegeben. Nach einer 5- minütigen Behandlung mittels Ultraschall wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurden die Träger durch mehrfaches Zentrifugieren gerei- nigt. Die erhaltenen Silica-Träger tragen funktio- nelle Carboxygruppen (Zetapotential im 0,1 M Ace- tat-Puffer : -35 mV) auf ihrer Oberfläche und besit- zen eine mittlere Partikelgröße von 170 nm.

2.4 Carboxydextran-modifizierte Träger 10 mg aminofunktionalisierte Nanopartikel und 1 mg Carboxydextran (Sigma, >55 cps) wurden zu 1 ml 0,1 M Morpholinoethansulfonsäure-Puffer (MES, pH 5,0) gegeben. Dazu wurden 30 ul einer N-Ethyl-N'- (3- dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC)-Lösung mit einer Konzentration von 500 uMol/ml zugegeben. An- schließend wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur ge- schüttelt. Die Träger wurden abwechselnd mit MES- und TBE-Puffer (89 mM Tris- (hydroxy- methyl) aminomethan, 89 mM Borsäure, 2 mM Ethylendi- amintetraessigsäure, pH 8,3) gewaschen. Anschlie- ßend wurden die gewaschenen Partikel in 1 ml MES- Puffer aufgenommen. Die erhaltenen Silica-Partikel tragen funktionelle Carboxygruppen (Zetapotential im 0,1 M Acetat-Puffer : -25 mV) auf ihrer Oberflä- che und weisen eine mittlere Partikelgröße von 160 nM auf. Diese Dextran-Oberfläche ist insbesondere zur Immobilisierung von Proteinen geeignet, deren Tertiärstruktur durch Adsorptionsproz, esse auf der Trägeroberfläche gestört wird.

2.5 Aminofunktionalisierung von Carboxy- (Dextran)- Trägern Zunächst wurde eine 1 M Ethylendiamin-Lösung in 0, 1 M MES-Puffer (pH 5,0) hergestellt. Dazu wurden 500 pg der Carboxy- (Dextran)-modifizierten Träger und 30 ul einer 500 uMol/ml EDC-Lösung in MES-Puffer gegeben. Anschließend wurde drei Stunden bei Raum- temperatur geschüttelt. Die Träger wurden danach mehrmals mit MES-Puffer gewaschen. Dabei wurden Träger mit einer mittleren Partikelgröße von 160 nm

und einem Zetapotential von + 25 mV im 0,1 M Ace- tat-Puffer erhalten.

Zur Variation der Spacerlänge beziehungsweise der Dichte der funktionellen Gruppen können auch andere Amine in analoger Weise eingesetzt werden, bei- spielsweise 4,7, 10-Trioxa-1, 13-tridecandiamin (oder höhere Homologe) oder Tris (2-aminoethyl)-amin.

2.6 Nitrilotriessigsäure (NTA) -Oberfläche 10 mg Carboxy-modifizierte Träger wurden zweimal mit 1 ml Acetonitril (MeCN) gewaschen und anschlie- ßend in 1 ml MeCN aufgenommen. Dazu wurden 10 uMol Dicyclohexylcarbodiimid und 10 uMol N-Hydroxy- succinimid gegeben. Anschließend wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurde einmal mit 1 ml Cyclohexan und einmal mit 1 ml MeCN gewa- schen. Die Partikel wurden anschließend in 1 ml MeCN aufgenommen. Dazu wurden 4 uMol N, N-Bis- Carboxymethyl-L-Lysin gegeben und drei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurde einmal mit 1 ml Acetonitril und zweimal mit 1 ml 10 mM Phos- phatpuffer (pH 7,0) gewaschen.

Durch diese Umsetzung wird einerseits die Dichte der funktionellen Carboxy-Gruppen erhöht und ande- rerseits können mit dieser Oberfläche Ni2+-Ionen durch Komplexierung gebunden werden. Diese Oberflä- che ist dann zur Bindung von His-Tag-modifizierten Proteinen befähigt.

2.7 Pegylierte Partikel 1 mg aminofunktionälisierte Partikel (Bsp. : 2.1, 2.2, 2.5) werden in 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH : 7.0) suspendiert. Anschließend werden bis zu 1 mg heterofunktionelle Polyethylenglykole (wie mPEG- succinimidyl-propionat, t-Boc-NH-PEG-succinimidyl- propionat, Maleinimido-PEG-succinimidyl-propionat oder deren Gemische) zugegeben und 3 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Sind Schutzgruppen auf der Oberfläche vorhanden, werden diese durch eine 2 stündige Behandlung mit 1 % Trifluoressigsäure ent- fernt. Die Partikel werden zweimal mit 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH : 7.0) gewaschen.

Diese Oberflächen sind zur Vermeidung einer unspe- zifischen Anlagerung von Proteinen geeignet.

Falls diese Oberflächen nach der Deblockierung der Schutzgruppen Aminogruppen tragen, können sie in Bsp. 2.9 weiterverwendet werden.

2.8 Thiol-Oberfläche 10 mg Carboxy-modifizierte Träger wurden zweimal mit 1 ml Acetonitril (MeCN) gewaschen und dann in 1 ml MeCN aufgenommen. Dazu wurden 10 uMol Dicyc- lophexylcarbodiimid und lO. uMol N-Hydroxysuccinimid gegeben und anschließend wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Dann wurde einmal mit 1 ml Cyclohexan und einmal mit 1 ml MeCN gewaschen.

Die Träger wurden dann in 1 ml MeCN aufgenommen.

Dazu wurden 500 ug Cystein gegeben und drei Stunden

bei Raumtemperatur geschüttelt. Im Anschluss daran wurde einmal mit 1 ml Acetonitril und zweimal mit 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen.

Diese Oberfläche ist insbesondere zur Immobilisie- rung von Proteinen über Disulfid-Brücken geeignet.

2.9 Maleimido-aktivierte Oberfläche 500 ug aminofunktionalisierte Träger wurden in 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) resuspendiert. Dazu wurden 1, 25 uMol Sulfo-Succinimidyl-4- (N- maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat gegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Da- nach wurde einmal mit kaltem 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und die Träger wurden in 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7, 0) aufgenommen.

2.10 Iodacetyl-aktivierte Oberfläche 500 ug aminofunktionalisierte Träger wurden in 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) resuspendiert. Dazu wurden 1. 25 uMol Succinimidyl- (4-iodoacetyl)- aminobenzoat gegeben und eine Stunde bei Raumtempe- ratur geschüttelt. Danach wurde einmal mit kaltem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und die Träger wurden in 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) aufgenommen.

Diese Oberflächen sind zur Ankopplung von Proteinen geeignet, die freie Thiol-Gruppen tragen.

2.11 Oberfläche mit NH2-und COOH-Gruppen Die Belegung mit funktionellen Gruppen ist in den Beispielen 2.1 bis 2.9 so beschrieben, dass sie quantitativ verläuft. Diese Belegungen lassen sich üblicherweise aber auch durch die Wahl der Reakti- onsbedingungen, insbesondere über die Konzentration des Modifikationsmittels, so steuern, dass sie nur teilweise erfolgen. Durch eine entsprechende Wahl der Modifikationsmittel wird erreicht, dass ver- schiedene funktionelle Gruppen nebeneinander auf der Trägeroberfläche vorliegen.

Beispielsweise wird in Beispiel 2.3 die Konzentra- tion an Bernsteinsäureanhydrid verringert. Durch eine geeignete Wahl des Verhältnisses NH2/COOH va- riiert der isoelektrische Punkt des Trägersystems in einem weiten Bereich, beispielsweise zwischen 8 und 3. Dies ist bei der Umsetzung mit Proteinen ein entscheidender Parameter zur Steuerung der Reakti- vität, da sich gleichgeladene Systeme rabstoßen.

2.12 Clustering Im ersten Graph ist die Umsetzung unmodifizierter Silica Partikel mit Aminosilanen gezeigt (analog Beispiel 2.1.). Im zweiten Graph werden diese Ami- no-funktionalisierten Oberflächen mit Bernsteinsäu- reanhydrid umgesetzt (analog Beispiel 2.3.). Die daraus resultierenden Carboxy-Gruppen an der Parti- keloberfläche können z. B. mit Ethylendiamin weiter umgesetzt werden, wie in Graph 3 zu sehen ist (ana- log Beispiel 2.5.). Es resultieren wieder Amino-

funktionalisierte Oberflächen. Durch die Variation der Modifikatorkonzentration kann das Zetapotential und damit die Dichte der funktionellen Gruppen auf der Partikeloberfläche kontrolliert werden.

2.13 Trägeroberflächen mit SH- und NTA-Gruppen Die Reaktion wird wie in den Beispielen 2.6 oder 2.7 durchgeführt, wobei allerdings ein Gemisch der beiden Modifikationsmittel eingesetzt wird. Dadurch werden His-Tag-tragende Proteine in einem ersten Schritt nicht-kovalent ausgerichtet, wobei dieser Zustand durch Ausbildung einer kovalenten Disulfid- Brücke anschließend dauerhaft fixiert wird.

3. Immobilisierung von TNF an Nanopartikeln Die vorstehend hergestellten oberflächenmodifizier- ten Nanopartikel wurden zur Immobilisierung von TNF-Molekülen verwendet. Dabei wurden die TNF- Moleküle in gerichteter Weise unter Erhalt ihrer Signalfähigkeit an die inerten Träger gekoppelt, so dass bei Verwendung der Nanopartikel eine Wechsel- wirkung mit einem TNF-Rezeptor möglich und die Sig- nalantwort der Zelle in definierten Zellsystemene messbar war.

3.1 Konstruktion von TNF-Varianten 3.1. 1 TNF-Fusionsproteine mit N-terminalen Mo- difikationen (Konstrukt 1) Es wurde das Linker-modifizierte Fusionsprotein CysHisTNF konstruiert, das in der Nähe des N- Terminus über eine reaktive Thiolgruppe verfügt,.,.

die beispielsweise mit einer Maleinimido-Gruppe auf der Oberfläche von Nanopartikeln eine kovalente Bindung eingehen kann. Das Protein wurde zusätzlich mit einem Gly-reichen Linker mit einem His-Tag be- stehend aus zwei oder mehr Histidinresten versehen, wodurch das Protein einerseits an eine, mit Ni2+ beladene Affinitätsmatrix gebunden und mit Imidazol eluiert werden kann. Der His-Tag erlaübt anderer- seits eine nicht-kovalente Bindung von CysHisTNF an Metallionenchelatkomplexen, insbesondere Nickel- Nitrilotriessigsäure (NTA) -Gruppen auf der Oberflä- che von Nanopartikeln. Die Klonierung des Funkti- onsproteines erfolgte nach Standardverfahren, bei- spielsweise unter Verwendung von Verfahren zur site specific-Mutagenese und ist weiter unten detailiert aufgeführt. Die DNA-Sequenz ist in SEQ ID Nr. 1 mit den Nucleotiden 1 bis 546 dargestellt. Die dazuge- hörige Aminosäuresequenz mit den Aminosäuren 1 bis 181 ist in SEQ ID Nr. 2 dargestellt.

Von dem N-Terminus zum C-Terminus ergibt sich fol- t gender Aufbau : 1. Sequenz des Linkers 1 (L1) : poly-Gly-Linker mit einem Cys (NT 25-27, AA 9) und einem His-tag (NT 43-60, AA 15-20) : NT 1-78, AA 1-26 2. TNF-Modul : reife Form des humanen TNF-Proteins (17,5 kDa Form, rekombinantes TNF, Swissprot &num P01375, AA 1-157) mit Deletion der N-terminalen 2 AA (TNFdelta 1, 2) : NT 79-543, AA 27-181 3. Stop-Codon : NT 544-546

Im folgenden wird die Konstruktion des Linker- modifizierten Fusionsproteins, das am N-Terminus über eine reaktive Thiolgruppe sowie über einen (His) 6-tag für die Reinigung verfügt (SEQ ID Nr. 1) dargestellt.

Dieses Fusionsprotein (abgekürzt : CysHisTNF) wurde wie folgt hergestellt : Das TNF-Fragment (AA 3-181) wurde aus einem anderen Konstrukt PinPointHisTNF (prokaryotischer Vektor PinPoint Xa-3, beschrieben in"PinPoint Xa Prote- in Purification System", Promega) über eine Re- striktionsverdauung der Plasmid-DNA mit SacI und HindIII herausgeschnitten. Das nach präparativer Agarosegel-Elektrophorese nebst DNA-Elution iso- lierte Fragment wurde in einen modifizierten Vektor (pQE 5, QIAexpressO, Qiagen) insertiert. Dieser wurde zuvor mit BamHI und HindIII verdaut.

Das Konstrukt wurde zur Verifikation der cDNA- Sequenz sequenziert.

Das so erhaltene Konstrukt erlaubt die prokaryoti- sche Expression des Fusionsproteines CysHisTNF.

Diese wurde weitgehend nach den Angaben des Her- stellers durchgeführt (QIAexpressO System, Qiagen).

Eine Zugabe von IPTG zur Induktion der Expression erfolgte nicht (Basalinduktion).

Das bakterielle Lysat (cytoplasmatischer Extrakt) wurde für die Anreicherung eingesetzt. Die Reini- gung des TNF-Proteins erfolgte mittels Affini- tätschromatographie (IMAC, HiTrapO-Affinitätssäule,

Amershampharmacia biotech). Nach Angaben des Her- stellers wurde das Protein an eine mit Ni2+ belade- ne Affinitätsmatrix gebunden und mit Imidazol elu- iert.

In Figur 1 ist das Ergebnis der Untersuchung im Hinblick auf die Induktion von Apoptose auf TNF- sensitive Tumorzellinien dargestellt. Die Abbildung zeigt, dass das TNF-Fusionsprotein CysHisTNF über eine hohe Bioaktivität verfügt. Die Figur 1 zeigt Zellen der humanen Rhabdomyosarkomlinie KYM-1. Die- se wurden bei 37°C kultiviert, wie in Grell et al., 1995 sowie Grell et al., 1994, beschrieben. Für den Bio-Assay wurden 1 x 104 Zellen/well in 96-well Mikrotiterplatten ausgesät und unter Kulturbedin- gungen über Nacht inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für 16-20 h in Gegenwart titrierter Konzentrationen von humanem rekombinantem TNF-a bzw. CysHisTNF [bakterielles Lysat (s), gereinigtes Protein (T)] kultiviert und die metabolische Zell- aktivität über einen MTT-Test quantifiziert (Grell ! et al., 1995). Die Extinktion wurde bei 550 nm be- stimmt. Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte aus einem typischen Experiment SD.

3.1. 2 TNF-Fusionsproteine mit natürlichen Lin- kern (Multimerisierungsmodulen) (Kon- strukt 2) Es wurde ein Fusionsprotein mit der Multimerisie- rungsdomäne aus dem Tenascin-C-Molekül (TNC) kon- struiert. Die Multimerisierungsdomäne aus diesem Molekül erlaubt eine gezielte kovalente Trimerisie- rung des TNF-Fusionsproteins und enthält am N-

Terminus zwei Cysteinreste. Die Klonierung dieses Fusionsproteines erfolgte nach Standardverfahren, wie weiter unten (Beispiel 2) detailiert beschrie- ben. Die DNA-Sequenz ist in SEQ ID Nr. 3 mit den Nucleotiden 1 bis 705 dargestellt. Die dazugehörige Aminosäuresequenz mit den Aminosäuren 1 bis 234 ist in SEQ ID Nr. 4 dargestellt.

Vom N-Terminus zum C-Terminus ergibt sich folgender Aufbau : 1. Sequenz des Linkers 1 (L1) : NT 1-24, AA 1-8 2. Trimerisierungsdomäne des Tenascins (vom Huhn) : NT 25-114, AA 9-38 3. Sequenz des Linkers 2 (L2) : NT 115-132, AA 39- 44 4. TNF-Modul : mutierte Form des natürlichen, hu- manen TNF-Vorläuferproteins (26 kDA Membranform, Swissprot &num P01375, 233 AA) mit Deletionen der N- terminalen 56 AA und von AA 78-89 (TNFdelta 1-56, 78- 89), d. h. Deletion der cytoplasmatischen Domäne, der Transmembrandomäne und der TACE-Spaltstelle des TNF-Vorläuferpeptids : NT 133-627, AA 45-209 5. Sequenz des Linkers 3 (L3) : NT 628-645, AA 210-215 6. myc-tag : NT 646-684, AA 216-228 7. His-tag : NT 685-702, AA 229-234 8. Stop-Codon : NT 703-705

Das Fusionsprotein wurde unter anderem in prokary- ontischen Zellen, insbesondere in E. coli, Säuger- zellen und im Baculovirus-Expressionssystem expri- miert. TNF-Fusionsporteine lassen sich funktionell exprimieren in Säugerzellen, wie beschrieben in Wüest, T., 2001 ; Wüest et al., 2002, Patent 2002, sowie im Baculovirus-System.

Wie im folgenden gezeigt, wurde das TNF- Fusionsprotein TNC-TNF auch prokaryotisch expri- miert.

Beispiel 2 (Konstrukt 2) Konstruktion eines TNF-Fusionsproteins mit der Mul- timerisierungsdomäne aus dem Tenascin C-Molekül (AA 110-139, Swiss Prot. Accession No. P10039, Huhn ; oder Swiss Prot. Accession No. P24821, human) (be- schrieben in Wüest et al., 2002, Patent WO 02/22833).

Diese Domäne mit sogenannter"coiled-coil"-Struktur erlaubt eine gezielte kovalente Trimerisierung des TNF-Fusionsproteins und enthält N-terminal zwei Cysteinreste. Die genaue Position der Thiolgruppen innerhalb der Proteinsequenz ist abhängig vom ge- wählten Expressionssystem (unterschiedliche Linker- sequenzen). Das TNC-TNF enthält 2 Cys an Position 10 und 12 (SEQ ID Nr. 3).

Das Konstrukt 2 wurde wie folgt hergestellt : Das TNC-TNF-Fragment (AA 9-234, siehe Sequenz 2) wurde aus einem Konstrukt/Plasmid pGD105TNC-TNF

(eukaryotischer Expressionsvektor pGD105, beschrie- ben in EP 0 953 639) herausgeschnitten und in einen prokaryotischen Vektor subkloniert.

Hierzu wurde die Plasmid-DNA pGD105TNC-TNF mittels der Primer 1 und 2 und proof-reading PCR amplifi- ziert, wodurch die Schnittstellen Pst I und HindIII eingeführt wurden. Der für die Tenascin-und die TNF-Domäne kodierende Sequenzabschnitt wurde durch einen PstI/HindIII Verdau erhalten. Das isolierte Fragment wurde in die entsprechenden sites des mo- difizierten pQE-5 Vektors (Qiagen) eingesetzt. Der Vektor pQE-5 wurde zuvor mit PstI und HindIII ver- daut.

Alle Klonierungs-und PCR-Amplifikationsschritte erfolgten nach Standardmethoden mit den nachfolgen- den Primern. Das Konstrukt wurde zur Verifikation der cDNA-Sequenz sequenziert.

Primer 1 < 5'AAC TGC AGC CTG TGG CTG TGC GGC TGC CCC AGA CÄT CAA G 3' Primer 2 5'CCC AAG CTT GGG TTA ATG ATG ATG GTG ATG 3' Das so erhaltene Konstrukt wurde wie das Konstrukt 1 (Beispiel 1) exprimiert. Abweichend davon wurden die Bakterienzellen bei 30 °C kultiviert (ohne In- duktion der Expression).

In Fig. 2 ist das Ergebnis einer gelelektrophoreti- schen Auftrennung nach der Expression des TNF- Fusionsproteins dargestellt. Die Western-Blot- Analyse zeigt, dass unter nicht reduzierenden Be- dingungen auch bei prokaryotischer Expression tri- mer organisiertes TNC-TNF vorliegt. Unter reduzie- renden Bedingungen wandert das Protein entsprechend dem kalkulierten MW des monomeren TNC-TNF von ca.

29 kDa.

Die Reinigung des TNC-TNF erfolgt wie in 3. 1. 1 be- schrieben.

In Fig. 3 ist das Ergebnis der Untersuchung im Hin- blick auf die Induktion von Apoptose auf TNF- sensitive Tumorzellinien dargestellt. Die Abbildung zeigt, dass das TNC-TNF über eine hohe biologische Aktivität verfügt.

Für den Bio-Assay wurden die KYM-1 Zellen (1,1 x 104 Zellen/well) wie in Fig. 1 beschrieben kulti- viert. Die Zellen wurden mit seriellenVerdünnungen von löslichem humanem rekombinanten TNF-a (D) sowie TNC-TNF [bakterielles Lysat (s)] für 16 h bei 37 °C inkubiert. Der Anteil der lebenden Zellen wurde ü- ber einen MTT-Test quantifiziert (siehe Fig. 1).

Die Extinktion wurde bei 560 nm bestimmt. Darge- stellt sind jeweils die Mittelwerte SD.

3.2 Kovalente Immobilisierung von TNF-Fusionspro- teinen an oberflächenmodifizierten Trä- gerpartikeln Die neu hergestellten TNF-Fusionsproteine (siehe 3.1. 1 und 3.1. 2) wurden mit Nanopartikeln mit Ma- leinimido-aktivierter Oberfläche (vgl. Beispiel 2.9) umgesetzt (Endkonzentration der Nanopartikel zwischen 500 und 1000 pg/ml).

Die beiden Kopplungskomponenten wurden gemischt und für 30-45 min. bei Raumtemperatur in 2 ml 10 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,2 (Endvolumen) inku- biert. Die Abtrennung der Partikel von der lösli- chen Komponente erfolgte durch Zentrifugation bei 13 000 rpm (Eppendorf Kühlzentrifuge 5403) für 10 min. bei 4°C. Das Carrier-immobilisierte TNF- Fusionsprotein wurde zweimal mit 1-2 ml PBS gewa- schen und in RPMI 1640-Medium mit einem Anteil von 5 % FCS bzw. PBS aufgenommen (in Abhängigkeit von den weiteren Analysen).

3.3 Nachweis der Immobilisierung und der biologi- schen Aktivität von immobilisiertem TNF Anhand von Bio-Assays sowie ELISA-Tests wurde nach- gewiesen, dass eine Immobilisierung der TNF- Moleküle an den Nanopartikeln erfolgte. Die erhal- tenen Nanopartikel mit daran immobilisiertem TNF wurden bezüglich ihrer biologischen Aktivität unter Verwendung definierter zellulärer Testsysteme, ins- besondere Tumorzelllinien, charakterisiert. Diese Zellsysteme ermöglichen eine sensitive Erfassung

einer differentiellen biologischen Aktivität lösli- cher und Nanopartikel-gekoppelter TNF-Varianten.

Insbesondere wurde die cytotoxische Wirkung der er- findungsgemäßen Nanopartikel mit daran immobili- siertem TNF auf KYM-1-Zellen, Colo205-Zellen und MF-R2Fas-Zellen (Mausfibroblasten mit chimären TNF- Rezeptor 2) erfasst. Diese Zellsysteme'ermöglichen eine sensitive Erfassung einer differentiellen Bio- aktivität löslicher und Matrix-gekoppelter Varian- ten von TNF, wie beschrieben in Grell et al., 1995, Grell et al., 1993, Krippner-Heidenreich et al., 2002. Die Wirkung der erfindungsgemäßen Nanoparti- kel mit daran immobilisiertem TNF wurde mit der Wirkung von in Lösung befindlichem humanem rekombi- nanten TNF-a als Kontrolle verglichen. Die Tests bezüglich der Wirkung der erfindungsgemäßen Nano- partikel und löslichem TNF auf die vorstehend ge- nannten Zelllinien erfolgte nach Standardverfahren.

Dabei wurden die EC5o-Werte von immobilisiertem und in Lösung befindlichem TNF ermittelt und vergli- chen.

Induktion von Apoptose in TNF-sensitiven Tumorzel- linien (siehe Fig. 4-7) Für den Bio-Assay wurden die KYM-1 Zellen, wie in Fig. 1 beschrieben, kultiviert.

Die Zellen wurden in Gegenwart titrierter Konzent- rationen der Konjugate aus den Kopplungsansätzen A 1-A 3 (Träger vgl. 2.1) für 18 h bei 37°C inku- biert. Der Anteil der lebenden Zellen wurde durch die MTT-Methode bestimmt. Humaner rekombinanter

TNF-a (A) wurde als Standard eingesetzt (siehe Fig.

1). Die Beladung der Partikel mit CysHisTNF wurde mittels Sandwich-ELISA (OPTEIPM Human TNF-a Elisa Kit, BD PharMingen) bestimmt.

Die unter Verwendung der Tumorzellinie KYM 1 er- haltenen Ergebnisse sind in Figur 4 und Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 zeigt die EC50-Werte für die TNF-Konjugate im Vergleich zu menschlichem rekombi- nanten TNF-a.

Tabelle 1 Derivate S EC50 [ng/ml] Bereich Humaner rekomb. 0, 120 0, 096-0, 144 TNF-α Ansatz A 1 (c0 = 0,055 0,046 - 0,065 25 ug/ml) Ansatz A 2 (cl = ! 0, 0560',036 - 0, 089 17 µg/ml) Ansatz A 3 (c0 = 0,026 0,021 - 0,033 10 µg/ml)

Der Biotest zur Bestimmung der Wirkung von immobi- lisierten und nicht-immobilisierten TNF auf die Zielzellen Colo205 wurde nach Standardverfahren durchgeführt. Kontrollansätze wurden dabei mit lös- lichem TNF mit oder ohne Coinkubation mit dem mo- noclonalen Antikörper 80M2, der selbst über keine agonistische Aktivität verfügt, durchgeführt. Die

Ergebnisse bezüglich der Wirkung der erfindungsge- mäßen Nanopartikel auf diese Zielzellen im Ver- gleich zu der Wirkung von löslichem humanem rekom- binanten TNF auf die Zlelzellen Colo205 sind in Fi- gur 5 und Tabelle 2 zusammengefasst.

Für den Bio-Assay wurde die Colonkarzinom-Zellinie Colo205 in 96-well Mikrotiterplatten ausgesät (1,1 x 104 Zellen/well) und über Nacht inkubiert, wie beschrieben in Grell et al., 1995. Die Colo205- Zellen wurden mit seriellen Verdünnungen der Konju- gate aus den Kopplungsansätzen A 1-A 3 für 40 h bei 37°C inkubiert. Colo205-Zellen wurden zusätz- lich mit löslichem humanem rekombinantem TNF-a (V) in Ab-und Anwesenheit des TNF-Rezeptor R2 spezifi- schen Antikörpers 80M2 (0, A ; 1 ug/ml) kultiviert.

Dieser monoklonale Antikörper verfügt selbst über keine agonistische Aktivität, induziert aber zusam- men mit löslichem hu-TNF TNF-Rezeptor R2 spezifi- sche Signale (Grell et al., 1994). Der Anteil der lebenden Zellen wurde durch die MTT-Standardmethode t ; bestimmt (vgl. Fig. 1). Die Beladung der Partikel mit CysHisTNF wurde mittels Sandwich-ELISA (vgl.

Fig. 4) bestimmt.

Tabelle 2 Derivate EC50 [ng/ml] Bereich Ansatz A 1 (c0 = 0, 64 0,44-0, 93 25 pg/ml) Ansatz A 2 (po = 0, 45 0,33-0, 61 17 ug/ml) Ansatz A 3 (po = 0, 28 0,185-0, 411 10, ug/ml) Humaner rekom. > 100 TNF-a-

Die Ergebnisse der durchgeführten biologischen As- says sowie der ELISA-Tests belegen, dass eine Immo- bilisierung der verwendeten TNF-Varianten an die Nanopartikel erfolgte. Die an dem erfindungsgemäßen Nanopartikel immobilisierten TNF-Molek, üleweisen im Vergleich zum löslichen Protein eine veränderte, dem membranständigen TNF ähnliche Bioaktivität auf, wie aus der Figur 5 ersichtlich. Die Tumorzelllinie Colo205 ist gegen den cytotoxischen Effekt von lös- lichem TNF weitgehend resistent, während die Stimu- lation des TNF-R2-Rezeptors mit membranständigem TNF, der sogenannten Pro-Form von TNF, ebenso wie mit immobilisiertem TNF zur Induktion von Apoptose führt. Die Membran-TNF äquivalenten Eigenschaften der TNF-konjugierten Nanopartikel (Nanocytes) wer- den in Beispiel 4 in einem weiteren Zellmodell bes- tätigt.

Beispiel 4 Die nachfolgenden Figuren belegen weiter die durch Konjugate/NANOCYTES vermittelte Bioaktivität auf Tumorzellinien. In den dargestellten Beispielen wurden oberflächen-modifizierte Träger eingesetzt, die über eine Dextranschicht verfügen (CMD-Matrix, siehe 2. 4). Durch Testung der Konjugate auf geeig- neten Zellen, wurde die TNF-Rezeptor R2-Stimulation über die Induktion von Apoptose nachgewiesen (siehe Fig. 6+7) Die spezifische biologische Aktivi- tät/Funktionalität des Konjugates wurde zunächst in einem standardisierten Zytotoxizitätstest auf KYM-1 Zellen bestimmt (Durchführung vgl. Fig. 1 bzw. 4).

Für den Kopplungsansatz wurden die in 2.4 beschrie- benen Träger eingesetzt. Humaner rekombinanter TNF- a (D) wurde als Standard eingesetzt. Unbeladene Partikel bewirken keine Induktion von Apoptose (0).

Der Anteil der lebenden Zellen wurde durch die MTT- Standardmethode bestimmt. Die Beladung der Partikel mit CysHisTNF (() wurde mittels Sandwich-ELISA quantifiziert.

Die biologische Aktivität des in Fig. 6 beschriebe- nen Konjugates wurde in einem weiteren Bio-Assay auf Mausfibroblasten bestimmt (1,2 x 104 Zel- len/well) (Fig. 7).

Diese Zellinie exprimiert einen chimären TNF- Rezeptor TNF-R2-Fas, der die cytoplasma-tische Do- mäne des Todesrezeptors Fas- (CD95) und die extra-

zelluläre Domäne des humanen TNF-Rezeptors R2 ent- hält, wie beschrieben in Krippner-Heidenreich et al., 2002. Die Zellinie ist hochsensitiv gegenüber der Membranform von hu-TNF-a [membran-äquivalenter Stimulus (0), siehe Fig. 7], aber weitgehend resis- tent gegenüber löslichem hu-TNF-a (D). Der Anteil der lebenden Zellen wurde durch die Kristallvio- lett-Färbung/-Methode bestimmt. Die Beladung der Partikel mit CysHisTNF () wurde mittels Sandwich- ELISA bestimmt (vgl. Fig. 4).

Damit ist gezeigt, dass das Matrix-gekoppelte TNF äquivalente Eigenschaften von membranständigem TNF aufweist.

Beispiel 5 TNF-und CysHisTNF-Interaktion mit TNF-Rezeptor 1 und TNF-Rezeptor 2 Die nachstehenden Affinitäts-Messungen erfolgten mittels Wellenleiterspektroskopie-Resonanz-Analysen unter Verwendung einer IAsys-Vorrichtung (Thermo- Labsystem Camebridge, Großbritannien). Dabei wurden modifizierte Tumornekrosefaktor-Rezeptoren 1 (TNFRl-Fc) oder Tumornekrosefaktor-Rezeptoren 2 (TNFR2-Fc) über a-Aminogruppen auf eine Carboxy- methyldextran-Matrix (CMD-Matrix) immobilisiert.

Danach wurden Bindungsstudien durchgeführt. Für die Bindung wurden unterschiedliche Konzentrationen von TNF beziehungsweise Cys-TNF an die Rezeptoren über die Zeit online verfolgt. Nach jeder Bindung er- folgte eine Regeneration, das heißt, der gebundene Ligand wurde von der immobilisierten Matrix abgewa-

schen. Eine Rezeptor-beladene Matrix stand dadurch für mindestens 10 Bindungen zur Verfügung. Aus den so erhaltenen Rohdaten konnten nun folgende Parame- ter ermittelt werden: 1. Die auftragung des Ausma#es an Bindung von TNF beziehungsweis CysHisTNF (extent) gegen die eingesetzte Konzentration (ligate) resul- tiert in einer Bindungskurve, die im Sätti- gungsbereich die maximal mögliche Bindung be- schreibt (Bmax).

2. Durch die Auftragung des Quotienten aus dem Ausmaß der Bindung und der TNF beziehungswei- se CysHisTNF-Konzentration (extent/ligate) gegen das Ausmaß der Bindung (extent) wird eine Geradengleichung erhalten, deren Stei- gung der negativen Affinitätskonstanten KD entspricht (Scatchard Plot).

3. Die Auftragung der Assoziationsraten- Konstante (kon) gegen die TNF-beziehungswei- se CysHisTNF-Konzentration ist eine weitere Methode, den KD-Wert zu bestimmen und dient zur Bestimmung des unter Punkt 2 ermittelten Ko-Wertes. Außerdem entspricht der Schnitt- punkt der Geraden mit der Y-Achse der Halb- wertzeit t1/2 des Ligand-Rezeptor-Komplexes und ist somit ein Maß der Stabilität des TNF- beziehungsweise CysHisTNF-Rezeptor-Komplexes.

Diese drei. Auftragsformen wurden für CysHisTNF an immobilisiertem TNFR1-Fc (Figur 8), CysHisTNF an immobilisiertem TNFR2-Fc (Figur 9), TNF an immobi-

lisiertem TNFR2-Fc (Figur 10) und TNF an immobili- siertem TNFR1-Fc (Figur 11) gewählt. Es wurden min- destens jeweils zwei unabhängige Experimente durch- geführt. Wie in der Tabelle 4 zusammengefasst, zeigt sich, das TNf und CysHisTNF mit einer ähnli- chen Affinität an den modifizierten TNF-R1-Rezeptor binden (KD = 2-5 nM). Auch die Halbwertzeiten die- ser Liganden mit TNFR1-Fc mit 8-bis 14 Minuten ent- sprechen einander. Letzteres ist auch der Fall für die Halbwertzeiten an TNFR2-Fc, die für TNF ca. 8 Minuten und für CysHisTNF ca. 3 Minuten betragen.

Lediglich die Affinitätskonstanten von TNF und Cys- HisTNF an modifizierten TNFR2 sind für CysHisTNF ca. eine Größenordnung niedriger (KD = 10 nM für CysHisTNF und KD = 1 nM für TNF).

Diese Werte belegen die hochaffine und spezifische Bindung des CysHisTNF an beide bekannten Rezepto- ren. Obwohl die Zahlenwerte mit Hilfe von oberflä- chengekoppelten Rezeptoren (TNFR1-Fc und TNFR2-Fc) erhalten wurden, die künstlich dimerisiert wurden, erlauben sie dennoch Rückschlüsse auf die Situation der Bindung an Rezeptoren einer Zelle, bei der durch den trimeren Liganden eine Trimerisierung der Rezeptoren erfolgt Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammmengefasst.

Tabelle 4 Ligand Ligat Matrix kon/ligate Kd average [M] t1/2 [min] TNF-R1-Fc TNF CMD 6,8e-10 14,3 TNF CMD 0, 4e-10 99,3 TNF CMD 17, 0e-10 8, 0 Mittelwert 3, 61e-10 25,0 CysTNF CMD 4, le-10 22,4 CysTNF CMD 7, Oe-10 18,7 Mittelwert 5, 57e-10 20,6 TNF-R2-Fc TNF CMD 1, 24e-9 9,1 TNF CMD 1, 47e-9 7,3 Mittelwert 1, 35e-09 8,1 CysTNF CMD 4,06e-9 1,7 CysTNF CMD 3,47e-9. 4, 2 Mittelwert 3, 77e-09 2,4 Cys-TNF TNF-R1-Fc AS 5,8e-9 2,4 TNF-R1-Fc CMD 27,8e-9 1,7 TNF-R2-Fc AS 5,7e-9 8,1 TNF-R2-Fc CMD 5, 5e-9 3,0

Literaturhinweise : Grell, M., Krammer, P. H. and Scheurich, P. Segre- gation of APO-1/Fas antigen-and tumor necrosis factor receptor-mediated apoptosis. Eur. J. Immu- nol. 24,2563-2566 (1994) Grell et al., Cell 83,793-802 (1995) Grell, et al., Lymphokine Cytokine Res. 12,143-148 (1993) Krippner-Heidenreich et al., submitted to J. Biol.

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