MEMORIA DESCRIPTIVA

1) CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una“Composición farmacéutica de acción antineoplásica y antitumoral y método de obtención de la misma”, aplicada en el campo de enfermedades producidas por tripanosomas, preferentemente para el tratamiento de la enfermedad de Chagas Mazza y para el tratamiento de tumores de origen neural, del sistema nervioso central tales como astrocitoma, retinoblastoma y neuroblastoma.

2) ESTADO DE LA TECNICA Y PROBLEMAS DETECTADOS

Actualmente la enfermedad de Chagas es endémica en América Latina y es un problema importante para la salud pública de toda la región. Se estima que esta enfermedad afecta a aproximadamente entre 15 a 20 millones de personas, desde el sur de California hasta Argentina y que más de 100 millones de individuos estarían expuestos al riesgo de contraer la infección. Así, se calcula que entre un 2 y un 3 por ciento de la población de América Latina estaría infectada. La morbilidad y la mortalidad del Chagas resultan diez veces superiores a las que exhiben las demás enfermedades parasitarias en el subcontinente ^{[1 , 2} ’ ³ ’ ^4] . El agente causal de la enfermedad de Chagas es el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi, el cual se transmite a los humanos a través de la picadura de la vinchuca ( Triatoma i nfestans ) y otros insectos hematófagos de la familia Reduviidae ^[5] . En la mayoría de los casos (> 80 %), la infección en el ser humano se relaciona con las heces de los insectos, la transfusión de sangre o trasplante de órganos (15 %) ^[6] . El hallazgo de una transmisión autóctona hace del Chagas una enfermedad potencialmente emergente en los Estados Unidos ^[7] . Además, la emigración latinoamericana ha llevado esta enfermedad a países desarrollados de Europa y Oceanía ^[8] .

El ciclo biológico del parásito se compone principalmente de tres formas celulares fundamentales:

a) los tripomastigotes, los cuales se encuentran en la sangre de los mamíferos, diseminando la infestación transmitida desde el intestino del hematófago;

b) los epimastigotes, que es la forma proliferativa presente en el intestino del insecto; y

c) los amastigotes, los cuales se multiplican por medio de fisión binaria dentro de las células huésped de mamífero, produciendo su lisis y liberando nuevos tripomastigotes en el torrente sanguíneo. (Ver Efectividad funcional de las nanoparticulas de nifurtimox en el tratamiento in vitro de la enfermedad de chagas). De esta manera, pueden invadir cualquier célula nucleada y comenzar un nuevo ciclo reproductivo ^[9] .

La infección transcurre en tres fases: aguda, indeterminada y crónica. La fase aguda de la enfermedad se caracteriza por presentar una parasitemia elevada, constituida por tripomastigotes. Después de un lapso que varía desde unas semanas hasta varios meses, la infección resulta usualmente bien controlada por la respuesta inmune del huésped. No obstante, los parásitos siguen su ciclo dentro y fuera de las células del mamífero y aparecen en la corriente sanguínea sólo ocasionalmente, lo que hace difícil su detección. Los síntomas a menudo no son evidentes por largo tiempo (quizá décadas), por lo que se denomina a este período como fase indeterminada. Alrededor del 40% de los pacientes infectados terminan desarrollando la fase crónica de la enfermedad, en donde los amastigotes intracelulares causan daños estructurales irreversibles en el esófago, el colon y el corazón ^[2] .

Los fármacos de primera elección autorizados para el tratamiento de la enfermedad de Chagas son el nifurtimox (3-metil-4-(5'-nitrofurfuriliden-amino)- tetrahidro-4H-1 ,4-tiazina-1 ,1 -dióxido, Bayer 2502) y el benznidazol (2-nitroimidazol (N-bencil- 2-nitroimidazol) acetamida, RO 7-1051 ). Se ha sugerido en distintos estudios que también podrían utilizarse el etanidazol, derivado de nitroimidazol, eflornitina, melarsoprol, pentamidina, surimin, fexinidazol. Estos dos fármacos (nifurtimox y benznidazol) han sido utilizados con este fin durante décadas ^[101 y, hasta la fecha, no han podido ser reemplazados, aun cuando ambos exhiben efectos secundarios graves y poseen una eficacia baja ^{[11 15]} . Ambos fármacos son eficaces en la fase aguda, las infecciones crónicas de los niños de hasta 12 años de edad y en las infecciones congénitas ^[2] , pero presentan una actividad mínima o nula durante la fase crónica de la enfermedad. En In vitro, el nifurtimox y el benznidazol logran matar la forma intracelular del parásito (amastigotes). Los parásitos circulantes (tripomastigotes) también son destruidos por estos agentes en vivo, pero no se verifica ningún beneficio cuando se utilizan estos medicamentos en humanos adultos durante las fases indeterminada y crónica de la enfermedad ^[19] . Después de la absorción intestinal, estas drogas alcanzan fácilmente los tejidos, pero se requieren dosis elevadas para eliminar los parásitos circulantes. Así, se ha propuesto que un aumento en la llegada de los fármacos a los tejidos afectados (reservorios) podría mejorar la eficacia terapéutica ^[2DI .

Hasta la fecha, no se encuentran disponibles en el mercado ni vacunas ni tratamientos eficaces para los adultos que padecen de la enfermedad de Chagas en su fase crónica ^[16] . Esto se debe, más que nada, a que el Chagas pertenece al grupo de las enfermedades llamadas "olvidadas", las cuales resultan endémicas en las poblaciones de bajos ingresos de las regiones en desarrollo de África, Asia y las Américas ^[17] . La falta de una mejor farmacoterapéutica se debe a la ausencia de políticas públicas efectivas en los países que sufren la endemia ^[18] . Las compañías farmacéuticas privadas tampoco han mostrado interés.

En 2007, la Asamblea Mundial de la Salud (WHA) proclamó el derecho del niño a tener acceso a medicamentos seguros, eficaces y comprobados. Pero los medicamentos ya existentes, nifurtimox y benznidazol, existen sólo en formas farmacéuticas sólidas. Las altas dosis y los horarios de administración complejos afectan el estilo de vida de los pacientes jóvenes y la disminución de los niveles de adherencia restringe drásticamente el éxito del tratamiento ^[21] .

Los niños pueden ser curados a través de formulaciones líquidas de nifurtimox o benznidazol, pero éstas no están disponibles comercialmente. Es por este motivo que las formas líquidas son denominadas "medicamentos huérfanos". En este contexto, el procesamiento oficinal de las formas farmacéuticas sólidas originales ^[22] , se convierte en la única alternativa para el tratamiento de los pacientes pediátricos de la enfermedad. Sin embargo, debido a la extrema insolubilidad de los principios activos, la biodisponibilidad errática de sus suspensiones y la grave falta de recursos en los países con frágiles sistemas de salud e infraestructura limitada, la calidad, la seguridad y la eficacia de estas formulaciones extemporáneas resultan dudosas ^[23

25]

Por estas razones, existe una necesidad urgente de obtener productos antichagásicos nuevos y eficaces. En la actualidad, existen principalmente dos estrategias posibles para llevar a cabo programas destinados a producir nuevos medicamentos para el tratamiento de los pacientes infectados: i) fomentar la búsqueda de nuevos candidatos a fármacos o ii) desarrollar medicamentos mejorados para la administración de drogas ya aprobadas y disponibles en el mercado ^[26] .

En este sentido, resulta indispensable el diseño y desarrollo de nuevos sistemas de liberación de drogas antiparasitarias que sean seguros, eficaces y eficientes. En particular, son necesarios nuevos sistemas para la liberación de nifurtimox, benznidazol, y el resto de los mencionados en la presente que permitan reducir la dosis a ser administrada, mejorando su absorción. Asimismo, existe una necesidad insatisfecha de desarrollar formulaciones líquidas de nifurtimox y benznidazol, en particular, formas farmacéuticas utilizables en pediatría. La preparación de formas farmacéuticas convencionales y estables basadas en nifurtimox o benznidazol resulta compleja, debido a sus propiedades fisico químicas y, en particular, a su baja solubilidad en agua. Durante los últimos años los objetos de tamaño nanométrico (nanopartículas, de diámetro de 0,1 nanómetros a 1000 nanómetros, preferiblemente de 1 nanómetro a 500 nanómetros) han sido propuestos como vehículos de drogas de difícil empleo en términos de biodisponibilidad, solubilidad, farmacocinética, etc. Los liposomas, conocidos desde hace varias décadas, contienen una cavidad interior apropiada para efectuar el mencionado transporte. No obstante, los liposomas cargados con benznidazol no mostraron actividad parasiticida. Además, los liposomas unilamelares padecen de fragilidad, por lo cual liberan la droga precozmente, mientras que los liposomas multilamelares fracasan en el “delivery” del principio activo, por resultar excesivamente resistentes y no liberar la droga. Otros intentos de utilizar nano objetos diferentes han chocado, hasta la presentación de la presente patente, con la propia toxicidad de los vehículos elegidos ^[37] .

Cierto tipo de nano objetos, las nanopartículas lipídicas sólidas (SLN, en inglés), presentan las siguientes ventajas cuando se destinan a la distribución controlada de fármacos: una gran tolerancia tisular, escasos requerimientos regulatorios si se utilizan lípidos fisiológicamente aceptables, la capacidad de transportar drogas lipofílicas e hidrofílicas, protección contra la degradación química de los principios activos, posibilidad de fijar el blanco y bajo costo de producción. Sin embargo, muestran algunas limitaciones intrínsecas, tales como su escasa capacidad de transporte y una tendencia a la expulsión de la droga durante el lapso de almacenamiento ^{[33 351} .

Una variedad de SLN, denominadas nanopartículas lipídicas estructuradas (NLC, en inglés, mencionadas más atrás), han mostrado compartir las características favorables mencionadas, mientras que no poseen las limitaciones arriba descriptas.

En un mismo orden conceptual, existen otras formas de tripanosomiasis, por ejemplo, la Tripanosomiasis Africana, también denominada enfermedad del sueño, que es provocada por el Tripanosoma brucei gambiensis. Este parásito también es sensible al nifurtimox y por consiguiente el mejoramiento de las propiedades farmacéuticas/farmacológicas del nifurtimox ha de beneficiar los esquemas terapéuticos para esta enfermedad.

Se sabe además que el nifurtimox ha sido utilizado para mitigar el crecimiento del tumor sólido extracraneal más frecuente en los niños, el Neuroblastoma, que presenta muy mal pronóstico. Se ha comprobado que el mecanismo de acción del nifurtimox sobre las células tumorales in vitro del neuroblastoma es la aceleración de la apoptosis ^{[38 391} . Este mecanismo de acción sobre determinadas células tumorales del huésped permitiría su uso en enfermedades no parasitarias. Los inventores han probado, con muy buen resultado, nanopartículas de nifurtimox en cultivos in vitro de Astrocitoma y, sorprendentemente en Retinoblastoma (ver Efectividad in vitro de nanopartículas de nifurtimox sobre la apoptosis de células tumorales del sistema nervioso central). En el caso del Astrocitoma en líneas celulares MSP12 esféricas y adherentes, MGG8 esféricas y adherentes y GL26 NT (de rata) y, de un modo hasta hoy inédito, en el caso del Retinoblastoma en la línea celular Y79. Por consiguiente, la aplicación farmacéutico-farmacológica de nanopartículas de nifurtimox beneficiará los esquemas terapéuticos habituales para estas enfermedades y/o posibilitarán indicaciones en variantes tumorales que hoy no tienen tratamientos racionales.

3) SOLUCION APORTADA

Se sabe que existen diversos tipos de partículas empleadas en la administración de medicamentos. En función de su tamaño, se pueden clasificar en micropartículas y nanopartículas.

Los inventores de la presente han desarrollado novedosas nanopartículas lipídicas estructuradas (NLC) que comprenden partículas de uno o más principios activos para el tratamiento de la tripanosomiasis con, al menos, un acoplamiento de dos ácidos grasos formado por un ácido graso saturado o un lípido semisólido a la temperatura de entre 19 grados centígrados y 21 grados centígrados, preferiblemente a 20 grados centígrados; y un ácido graso insaturado líquido o un lípido líquido a la temperatura de entre 19 grados centígrados y 21 grados centígrados, preferiblemente a 20 grados centígrados; en donde dichas nanopartículas tienen un tamaño efectivo medio de entre 0.1 nm y 100 nm, preferiblemente de 1 nanómetro a 10 nanómetros, particularmente 1 nm, donde el ácido graso saturado o lípido semisólido es seleccionado entre ácido palmítico o ácido esteárico, y el ácido graso insaturado o lípido liquido es seleccionado entre ácido oleico, ácido araquidónico, ácido palmitoleico, ácido alfa-linoleico, o ácido gama-linoleico. Con el objetivo de mejorar la suspensibilidad acuosa de sustancias terapéuticamente activas , disminuir su toxicidad, aumentar su eficacia, y prolongar la estabilidad de las formas farmacéuticas preparadas con ellas, los inventores de la presente han investigado la encapsulación de drogas dentro de nanopartículas lipídicas estructuradas (NLC) ^{[27 321} .

Así, los inventores han desarrollado una composición farmacéutica que incluyen novedosos nano objetos, útiles en la preparación de formas de dosificación líquidas estables de compuestos activos contra la tripanosomiasis, en particular nifurtimox y benznidazol, especialmente destinadas para su administración a pacientes pediátricos.

A partir de la estructura altamente ordenada presentada a temperatura ambiente por los lípidos sólidos como el ácido esteárico y el ácido palmítico, la incorporación de lípidos líquidos a los cristales de tales lípidos sólidos conduce a una perturbación masiva de la organización de los mismos. La matriz resultante de partículas lipídicas muestra grandes imperfecciones en la red cristalina y deja suficiente espacio para acomodar moléculas del principio activo, lo que mejora la capacidad de carga de fármaco por parte del vehículo nano estructurado ^[32] . Las NLC no tienen las limitaciones asociadas con las SLN, como una pequeña capacidad de carga y la expulsión del fármaco durante el almacenamiento.

En conclusión se han desarrollado una composición farmacéutica con

nanopartículas nanoestructuradas (NLC, Nano Lipidie Carriers, en inglés) novedosas que comprenden partículas de uno o más principios activos para el tratamiento de la tripanosomiasis y, al menos, un acoplamiento de dos ácidos grasos formado por un ácido graso saturado o un lípido semisólido a la temperatura de entre 19 grados centígrados y 21 grados centígrados, preferiblemente a 20 grados centígrados; y un ácido graso monoinsaturado líquido o un lípido líquido, a la temperatura de entre 19 grados centígrados y 21 grados centígrados, preferiblemente a 20 grados centígrados; en donde dichas nanopartículas tienen un tamaño efectivo medio de entre 0.1 nm y 100 nm, preferiblemente de 1 nanómetro a 10 nanómetros, donde el ácido graso saturado o lípido semisólido es seleccionado entre ácido esteárico y ácido palmítico, y el ácido graso insaturado o lípido liquido es seleccionado entre ácido oleico, ácido araquidónico, ácido palmitoleico, ácido alfa- linoleico, o ácido gama-linoleico. Así, estos nano objetos novedosos, útiles en la preparación de formas de dosificación líquidas estables de compuestos activos contra la tripanosomiasis, en particular nifurtimox y benznidazol, especialmente destinadas para su administración a pacientes pediátricos (intervención en agudo) y pacientes adultos (Intervención crónica).

Asimismo, se han desarrollado NLC portadoras de principios activos seleccionados, en diferentes formas farmacéuticas, de acción antineoplásica y antitumoral, especialmente eficaces para tumores de origen neural, preferentemente Retinoblastoma y Astrocitoma, tanto in vitro como in vivo.

El uso de nanopartículas como carríer de fármacos comenzó con los liposomas, los cuales fueron desarrollados por A. Bangham et al. en el año 1964. Su uso como carríer mi ero métrico de medicamentos fue ensayado por G Georgiadis et al. en el año 1971. Las primeras pruebas nanométricas son del mismo autor en 1972. Las nanopartículas lipídicas estructuradas (NLC) fueron desarrolladas por Kawashima et al. En el año 1998, usando el método de difusión de solventes. Las NLC preparadas en base al método de difusión de solventes con ácidos oleico y esteárico fueron desarrolladas por Wu et al. en el año 2004. La idea de usar nanopartículas como carriers de medicamentos antichagásicos (liposomas cargados con benznidazol) fue publicada por E Romero et al. en el año 2004. Nada de todo esto podría patentarse. Seguidamente se ofrece un cuadro comparativo de los métodos empleados por Hu et al. (2005) y los inventores de la presente invención para preparar NLC a través de la técnica de difusión de solventes:

Tabla 1 En esta tabla pueden observarse las similitudes y diferencias técnicas y de resultados. Los volúmenes de agua, acetona y alcohol, y el peso de ácidos grasos utilizados son los mismos, así como la temperatura de trabajo. Las diferencias técnicas residen en el pH empleado en el momento de la precipitación y el procedimiento de separación de las nanopartículas.

Una gran diferencia es que las mismas según Hu et al., se encontrarían en el precipitado obtenido por centrifugación, y en cambio en nuestra técnica se encuentran en el sobrenadante, donde pueden detectarse visualmente por su intenso color amarillo propio del nifurtimox que han incorporado, en suspensión coloidal, en un líquido límpido. Si copiáramos la técnica de Hu, no encontraríamos ni nanopartículas ni nifurtimox en el precipitado obtenido por centrifugación, prueba que efectivamente realizamos. Lo confirmamos experimentalmente también por identificación y titulación del precipitado que obtuvimos por filtración. Ambos precipitados prácticamente están formados por ácidos grasos, sin trazas de nifurtimox.

Algunas de las ventajas de las NLC se observan en los últimos renglones: la captura de la droga en la preparación de Hu es bastante buena, hasta del 70 %, pero en la preparación CIN-Nanof se eleva hasta casi la totalidad del nifurtimox (ello soluciona el problema de eliminar del líquido la droga no incorporada en las NLC). La alta suspensibilidad de las nuevas NLC también es muy interesante, teniendo en cuenta que sirve para resolver farmacotécnicamente el problema de la insolubilidad casi total del nifurtimox- droga en agua al realizar preparaciones farmacéuticas.

Tabla 2. Efectos del pH en la suspensión de 10 mg/100ml. Se observa en la presente tabla el amplio rango de pH (de 2,5 hasta 9) en que la suspensión de NLC preparada por el CIN-Nanof se muestra macroscópicamente estable.

Medida qranulométrica de las NLC

Se reproducen los resultados de la medida del tamaño promedio de las NLC utilizando Z- Sizer. Los resultados pueden observarse en la Tabla 3..

A su vez en la FIGURA 1 , se observa que las NLC portadoras de nifurtimox presentan una distribución trimodal a los diámetros promedios de 1 ,7 nm, 50 nm y 5580 nm (siendo esta última evidentemente no nanométrica). Sin embargo, sometiendo a la suspensión a un filtrado a través de filtro de teflón de 220 nm, la medida se vuelve bimodal, con una distribución de los diámetro promedio de 1 ,0 nm (muy predominante) con desviación standard de 0,05 nm, y una pequeña parte al diámetro promedio de 50 nm y desviación standard de 14,0 nm, habiendo desaparecido por completo el modo de 5,6 micrones.

En el filtro, mientras tanto, no queda resto amarillento alguno, ni grumos macroscópicos, circulando libremente y sin esfuerzo el agua de lavado. La interpretación de esta conducta es la siguiente: el tamaño de las partículas es de 1 nm y los picos de 50 y 5500 nm son producidos por aglomeraciones de las mismas (probablemente generadas termodinámicamente debido a la elevada razón superficie/volumen de los nano- objetos), que resultan desmenuzadas por el efecto mecánico del filtrado. Como confirmación de esta hipótesis, si se deja reposar el líquido filtrado durante 48 horas, vuelven a formarse espontáneamente aglomerados de aproximadamente 50 y 5000 nm, aunque en menor cantidad que en la suspensión original sin filtrar. Otra confirmación reside en la observación directa de las NLC aisladas (con un diámetro aproximado de 1 nm) y de sus aglomerados, a través de microscopía electrónica de transmisión y de fuerza atómica, cuyas imágenes se ofrecen más adelante.

Tabla 4: Solubilidad v suspensibilidad comparadas Se observa que las NLC preparadas por los inventores de la presente invención de nifurtimox, resultan muy suspensibles en agua, en comparación con el nifurtimox droga, favoreciendo, como se explicó, la realización de preparaciones farmacotécnicas.

Fotomicrografías de las NLC:

> . Fotomicrografía A) microscopio electrónico de transmisión (TEM).

Nanopartículas estructuradas cargadas con nifurtimox. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) realizada en la I Cátedra de Histología de la Facultad de Medicina de la UBA el 29 de octubre de 2012, con un contraste obtenido con una solución de Tetróxido de Osmio al 0,1 % en un “buffer” de fosfatos, según una técnica desarrollada ad hoc. Ampliación 400.000 X. Las nanopartículas miden aproximadamente 1 nm y pueden visualizarse como pequeños objetos redondeados muy abundantes (VER FIGURA 2).

> 2. Fotomicrografía B) microscopio electrónico de barrido (BEM) Microscopía Electrónica de Barrido (BEM) efectuada en la Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad de Buenos Aires en 2016. Pueden observarse aglomerados cilindricos de NLC de aproximadamente 20 nm de diámetro. La resolución de la técnica impide separar las nanopartículas individuales. ( VER FIGURA 3).

> 3. Fotomicrografía C) microscopio de fuerza atómica (AFM).

Microscopía de Fuerza Atómica que muestra la altura de las NLC preparadas en el CIN- Nanof. Se observa que las partículas resultan homogéneas, esferiformes y aparentan poseer alrededor de 2 nm de altura. Laboratorio de Microscopía de la Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad de Buenos Aires en 2016 .(VER FIGURA.4)

4) EJEMPLOS DE REALIZACIÓN

El método convencional para la preparación de NLC es la homogeneización a alta presión (HPH). La preparación de NLC con HPH incluye varias condiciones críticas del proceso, tales como alta temperatura, alta presión y alta concentración de surfactante. La alta concentración del agente tensioactivo resulta ser particularmente problemática ^[32] . Es por ello que se decidió utilizar el método de preparación de la “difusión de disolvente”. • Extracción del Nifurtimox (NFX) de los comprimidos e identificación espectrofotométrica

Se emplearon comprimidos de NFX con el nombre de fantasía de“Lampit”, preparados en la República de El Salvador y registrados en la República de Guatemala, del lote 09060093, con fecha de vencimiento en junio del año 2014, conteniendo 120 mg cada uno de NFX y de un peso promedio de 400 mg, fueron pulverizados y sometidos a la extracción del principio activo, a través de la inmersión en 10 mi de acetona por comprimido, filtrado y desecación a 60°C en cristalizador de porcelana, repitiendo la operación con etanol absoluto. Se obtuvo un polvo formado por cristales amarillos, aciculares, prácticamente insolubles en agua, con un rendimiento de aproximadamente 1 gramo cada 10 comprimidos. El polvo mencionado contenía 98,7% promedio de nifurtimox, en una medición espectrofotométrica contra un standard primario de NFX de Sigma-Ehrlich a 401 nm de longitud de onda.

• Preparación de las nanopartículas

Siguiendo la técnica de difusión de solventes ^[32] se disolvieron 10 mg de NFX en una mezcla en iguales proporciones de etanol absoluto y acetona, agregando ácido palmítico (PA) y ácido linoleico (LA) para formar una mezcla 30/70% de ambos lípidos. Cada muestra se calentó a baño de María a 70°C hasta disolución completa, para finalmente difundir bajo agitación mecánica en 120 mi de agua a 70°C. Seguidamente, la mitad de las muestras fueron sonicadas durante 15 minutos. Una vez obtenidas, las nanopartículas fueron floculadas por adición de ácido clorhídrico 1 N hasta pH 1 ,2 (alrededor de 13 mi por muestra).

• Tratamiento de la fase acuosa

La mezcla floculada, de intenso color amarillo y cierta turbidez, fue sometida a un filtrado por papel de grano medio, obteniéndose un líquido límpido, amarillo, de pH 1 ,2, estable a temperatura ambiente. Sometido a medición espectrofotométrica resultó contener la casi totalidad del NFX introducido en el sistema. Llevado a neutralidad con gotas de bicarbonato de sodio 1 N, fue desecado en cristalizador de porcelana a 40°C durante 48 hs. Se obtuvo un polvo amorfo, marrón amarillento, que se re-suspendía instantáneamente en presencia de agua destilada, generando un líquido límpido, no opalescente, intensamente amarillo, que absorbe la luz a 401 nm de longitud de onda. No hubo diferencias entre las muestras sonicadas y las no sonicadas.

• Estudio de la suspensión al Z- Sizer: potencial Z y diámetro promedio

El líquido macroscópicamente estable y límpido, filtrado por tamiz de teflón de poros de 220 nm de diámetro, fue sometido, utilizando el Z-sizer, al examen del potencial Z, el cual resultó ser de +8 mV. En la medición del tamaño promedio de las partículas suspendidas, se obtuvo una marcada distribución unimodal de las mismas en el tamaño aproximado de 0,95 nanómetros. No hubo diferencias entre las muestras sonicadas y las no sonicadas.

• Examen de las partículas por microscopía electrónica de transmisión (TEM)

Las imágenes obtenidas mediante TEM con una ampliación de 400.000 X, muestran partículas homogéneas, de alrededor de 1 nanómetro, aproximadamente esféricas. El contraste fue obtenido con una solución de Tetróxido de Osmio al 0,1 % en un“buffer” de fosfatos, técnica adaptada ad hoc. (Examen llevado a cabo en la I Cátedra de Histología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires). No hubo diferencias entre las muestras sonicadas y las no sonicadas.

• Examen de las partículas por microscopía de fuerza atómica

Las imágenes obtenidas muestran partículas esferoides de aproximadamente 1 a 2 nm de diámetro, aisladas o dispuestas en prismas de aproximadamente 200 nm de espesor y longitudes variadas. No hubo diferencias entre las muestras sonicadas y las no sonicadas. Titulación del NFX presente en la suspensión v en las partículas

El NFX presente en la suspensión coloidal y en las partículas fue titulado ^[37] disolviendo en acetona una muestra desecada de la suspensión y registrando la absorbancia a 401 nm en espectrofotómetro, frente a un testigo preparado con el patrón primario Sigma-Ehrlich, obteniéndose una concentración de 0,09 mg/ml de nifurtimox en la suspensión coloidal y de aproximadamente 4,7 % p/p en las partículas desecadas. No hubo diferencias entre las muestras sonicadas y las no sonicadas.

• Preparación de una suspensión concentrada de NFX

Con el objeto de mantener las condiciones experimentales, la etapa inicial de la preparación de la suspensión concentrada repitió la técnica descrita anteriormente utilizando cantidades 30 veces mayores de todos los reactivos. La suspensión a pH 1 ,2 fue filtrada directamente a través de papel de grano medio, neutralizada con bicarbonato de sodio 1 N, desecada a 40°C y dispersada nuevamente en agua destilada a una concentración de 6 mg/ml de NFX, confirmada espectrofotométricamente según lo descrito anteriormente.

• Preparación de la suspensión concentrada bebible

Se dispuso de 83,3 mi de la suspensión obtenida, 10 mi de glicerina, 0,6 gr de hidroxietil celulosa 10000 Cp, 3 mi de propilenglicol, 0,04 gr de sacarina, 0, 125 gr de metilparabeno, 0,2 mi de esencia de vainilla, 1 mi de solución al 1 % de colorante amarillo ocaso y 2,5 mi de agua destilada. En un erlenmeyer de capacidad adecuada se colocaron el metilparabeno y el propilenglicol y se calentaron hasta disolución total. En otro recipiente se incorporó la glicerina y se dispersó la hidroxietilcelulosa, mezclando hasta obtener una dispersión homogénea, con ausencia total de grumos; luego se agregaron a esta dispersión la esencia y el colorante, reservando éste preparado viscosante para la mezcla final. Luego, en una olla de acero inoxidable, se introdujo la totalidad de la dispersión coloidal de NFX de 6 mg/ml y se agregó la solución de metilparabeno/propilenglicol, agitándose constantemente hasta homogeneidad. La sacarina se disolvió en la totalidad del agua destilada y se le incorporó a esta mezcla homogénea. Finalmente, se agregó la dispersión de hidroxietilcelulosa en glicerina, esencia y colorante, y se procesó el conjunto durante media hora en un molino coloidal.

• Titulación de la suspensión bebible concentrada

En una ampolla de decantación se agitaron 8 mi de la suspensión concentrada bebible preparada con 12 mi de acetona, produciéndose la extracción del NFX que luego fue titulado según lo descrito en 1.6. La concentración obtenida fue de 4,8 mg/ml del principio activo.

• Descripción v Estabilidad

La suspensión obtenida es homogénea, límpida, levemente opalescente, de consistencia siruposa, aroma a vainilla, sabor dulce e intenso color amarillo. Se ha mantenido macroscópicamente estable, durante un año desde su preparación, tanto a temperatura ambiente como refrigerada a 4°C.

• Preparación de NLC con distintos ácidos grasos

Todas las NLC se prepararon por la técnica expuesta, generando en todos los casos, una suspensión coloidal acuosa de nanopartículas, con la concentración de 10 mg de NFX (droga al 98% de pureza) por 100 mi de agua (esto es, 10 % mg/ml de NFX equivalente).

• Ácidos grasos utilizados

Se utilizaron los siguientes ácidos grasos:

Lípidos sólidos a temperatura ambiente (entre 19 grados centígrados y 21 grados centígrados, preferiblemente a 20 grados centígrados): > Ácido esteárico

> Ácido palmítico

Lípidos líquidos a temperatura ambiente (entre 19 grados centígrados y 21 grados centígrados, preferiblemente a 20 grados centígrados):

> Ácido oleico

> Ácido linoleico

> Ácido palmitoleico

> Ácido araquidónico

Se realizaron las siguientes preparaciones de Nanopartículas portadoras de nifurtimox, combinando en todos los casos ácidos grasos sólidos con ácidos grasos líquidos:

> Esteárico/oleico

> Esteárico/linoleico

> Esteárico/palmitoleico

> Esteárico/araquidónico

> Palmítico/oleico

> Palmítico/linoleico

> Palmítico/palmitoleico

> Palmítico/araquidónico

• Resultado de las preparaciones

En todos los casos suspensiones amarillas sin turbidez que fueron llevadas a pH aproximado de 6.0 con NaOH 1 N y luego filtradas por filtro de teflón de 220 nanómetros de diámetro de poro.

• Medición del potencial zeta de las partículas

Este indicador mide la atracción o repulsión entre las partículas. En principio la presencia de una carga positiva o negativa superior a 30 milivoltios genera una fuerte repulsión entre las partículas y ello estabiliza la suspensión. Si la carga es más baja o nula, cercana al punto isoeléctrico, se supone que no favorece la estabilidad de la suspensión. Sin embargo, un potencial Z mayor a aproximadamente 30mV, no constituye el único factor de estabilidad. Existen otras variables que influyen en la potencial estabilidad de la suspensión, especialmente el tamaño de las partículas. Un tamaño grande genera inestabilidad, en tanto una granulometría pequeña tiende a estabilizar la suspensión. El resultado final depende del equilibrio entre las variables independientes.

Tabla 5: Resultados de la medición: Como se comprueba, las ocho muestras exhiben un potencial eléctrico mucho menor al (+ ó -) 30 mV que se considera indicador de estabilidad. La que más se aleja del punto isoeléctrico (0,0 mV) es la portadora de ácidos esteárico/linoleico, que sin embargo, con + 16,5 mV todavía se sitúa muy por debajo del límite que indicaría una predisposición a la estabilidad a partir de la carga eléctrica. Conclusiones: a) el potencial Z de las partículas estudiadas no puede ser considerado como criterio exclusivo de elección para ninguna de las muestras b) La inexistencia de turbidez por espacio de un año y la estabilidad macroscópica de las suspensiones no puede atribuirse a un elevado potencial Z, constituyendo una hipótesis explicativa el carácter extremadamente pequeño de las NLC cargadas de nifurtimox que se examinan.

Determinación del tamaño

La granulometría puede ser realizada por el criterio de volumen % y/o por la intensidad de la luz %.

Tabla 6: Tamaño por Volumen %. Se observa ante todo una granulometría muy baja, que oscila entre 0,69 y 3,14 nanómetros, lo cual es inusual en estas nanopartículas que en otros estudios exhiben frecuentemente más de 100 nm de diámetro promedio. Otro aspecto es el carácter unimodal de la distribución ya que solamente se observa un único pico para cada tipo de combinación de ácidos grasos, y ese pico concentra el 100 % de la población. El examen de la representación gráfica de Volumen % versus tamaño en nm (no mostrado aquí), muestra que en la combinación de los ácidos Palmítico/Oleico ÚNICAMENTE, de la que se realizaron 4 determinaciones sucesivas, se observa un sesgo dispersivo en los resultados que le quita precisión al dato de 3,14 nanómetros, ya que algunas mediciones dan picos de 1 y 8 nm aproximadamente. En el resto de las observaciones las lecturas para cada combinación de ácidos grasos, se realizaron de 4 a 6 repeticiones y mostraron alta precisión.

Se considera esta modalidad como más significativa que la del Volumen % y ofrece más cantidad de información.

Tabla 7: Estudio qranulométrico por % intensidad de la luz. Se observa que la distribución de tamaños es polimodal. En el caso de la combinación esteárico/oleico casi el 60 % de la granulometría supera los 10000 nanómetros. En el caso de la combinación esteárico/araquidónico casi el 80 % de la granulometría supera los 5000 nanómetros. En la combinación palmítico/araquidónico casi el 70 % de la granulometría supera los 7500 nanómetros. Estos segmentos particulados, obviamente, no son nanométricos. En la combinación esteárico/linoleico casi el 70 % de las partículas superan los 300 nanómetros. En la combinación palmítico/palmitoleico, más del 60 % de las partículas superan los 400 nanómetros. Dado que todas las suspensiones habían sido filtradas por poro menor a 220 nm 24 horas antes de la medición, se concluye que en pocas horas las partículas de las cinco suspensiones mencionadas sufrieron fuertes aglutinamientos de diámetro superior al poro mencionado, proceso que, de continuar en el tiempo, podría desestabilizar la suspensión.

La distribución de la combinación de ácidos esteárico y palmitoleico muestra una distribución bimodal, con una relación 20/80 % de los tamaños de algo más de 3 y algo más de 147 nanómetros. Dado que la distribución por % de volumen ofrece en esta combinación un único pico de algo más de 3 nanómetros, recordemos que con el bajo potencial Z de +5 (lo cual facilita el agrupamiento), es probable que las partículas de 147 nanómetros constituyan aglutinamientos de las partículas menores, facilitados termodinámicamente. El índice de polidispersión (PDI, no mostrado en el cuadro, ver abajo) es en esta combinación esteárico/palmitoleico superior a 0,8 (se considera que la estabilidad mejora por debajo de PDI < 0,5), lo cual predispone a la hipótesis mencionada de un aglutinamiento débil alrededor del pico de 147 nanómetros.

La combinación de ácidos palmítico/oleico es trimodal para la variable tamaño/intensidad%. La mitad de las nanopartículas se hallan concentradas en una granulometría de 205 nanómetros. Casi la tercera parte posee un diámetro promedio de 23 nanómetros. Algo menos de la quinta parte (18 %) muestra un tamaño de algo más de 3 nanómetros, prácticamente idéntico al dato obtenido con el método del “Volumen %”. El índice de polidispersión (PDI) de esta combinación es de 0,6 (no exhibido en el cuadro, ver abajo), mayor al índice PDI de 0,5 que se considera el límite de la estabilidad, como se dijo más atrás. Por lo expuesto, cabe aquí también la hipótesis del aglutinamiento de las partículas menores alrededor de dos tamaños de agrupamiento facilitados termodinámicamente, de 23 y 205 nanómetros aproximadamente.

Finalmente, la combinación de ácidos palmítico/linoleico también ofrece una configuración trimodal de tamaños. Más de la mitad de las partículas se agrupa en los 183 nanómetros; casi un tercio de los objetos es de menos de 0,7 nanómetros (igual que lo determinado por el método de volumen %) y el resto de las partículas posee algo más de 6 nanómetros. Un Indice de Polidispersión (PDI) mayor a 0,9 (no mostrado en la tabla, ver abajo) induce a pensar, más aún que en los dos casos anteriores, que las nanopartículas de los dos picos mayores se ven afectadas por una tendencia al aglutinamiento. Esto se ve facilitado por el potencial Z casi nulo, de - 0,23 (ver más atrás), que facilita este proceso pues no estorba en absoluto la adherencia entre sí de las nanopartículas.

Tabla 8 índice de Polidispersión (PDI) para Intensidad de la luz %

• Efectividad funcional de las nanoparticulas de nifurtimox en el tratamiento in vitro de la Enfermedad de Chaqas

Se observaron diferencias muy significativas de efectividad antiparasitaria entre el nifurtimox como tal y el nifurtimox en nanoparticulas nanoestructuradas en modelos in vitro. Las nanoparticulas de nifurtimox tienen un efecto tripanocida sobre tripomastigotes y sobre amastigotes El uso de nanoparticulas nanoestructuradas de Nifurtimox ha sido casi dos órdenes de magnitud más potente que el Nifurtimox como tal sobre tripanosomas y tres órdenes de magnitud más potente que el Nifurtimox como tal sobre amastigotes.

• Ensayos sobre tripomastigotes sanguíneos

Tripomastigotes sanguíneos de la cepa RA fueron purificados a partir de sangre de ratón durante el pico de parasitemia. El mantenimiento de la cepa se realiza habitualmente por pasajes sucesivos semanales en ratones CF1 , machos de 21 días, infectados con 10 ⁵ tripomastigotes por vía IP. • Purificación de tripomastigotes: Se agregaron 5 volúmenes de PBS 3% suero fetal bovino a la sangre obtenida de los ratones infectados. Se separaron los eritrocitos por sedimentación a baja velocidad y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Finalmente el sobrenadante fue centrifugado a 10.000 xg durante 30 minutos a fin de obtener una alta concentración de tripomastigotes sanguíneos para los ensayos in vitro

• Efecto tripanocida de drogas: Incubación de 2.4 x 10 ⁵ tripomastigotes/well (100 pL) en RPMI 5% SFB por triplicado en placas de 96 wells con 100 pl_ de las distintas concentraciones de nifurtimox y nanopartículas de nifurtimox en un rango final de 0.3125 a 10 pg/ml durante 24 hs a 37?C y 5% CO2.

• Medición de actividad tripanocida: recuento en cámara de Neubauer considerando 100% de viabilidad al recuento promedio obtenido para los controles sin droga

Del análisis de las figuras de abajo surge que se necesitaron dosis dos a tres veces menor de nanopartículas de nifurtimox para llegar al 50% de letalidad (0,57±0,01 vs 1 ,45±0,46).

> Nanopartículas de nifurtimox sobre tripomastigotes:

Se muestran curvas de dosis respuesta a nifurtimox droga como tal y nanopartículas de nifurtimox sobre la sobrevida de tripomastigotes (VER FIGURA 5).

• Ensayos sobre amastiqotes

Efectividad in vitro de nanopartículas de nifurtimox sobre la apoptosis de células tumorales del sistema nervioso central: astrocitomas y retinoblastomas (VER FIGURA 6).

Efecto de nanopartículas de nifurtimox sobre la viabilidad de células de astrocitoma en cultivo. Se puede observar el efecto citocida de las nanopartículas de nifurtimox sobre células de Astrocitoma en cultivo. Es interesante observar que las líneas celulares GL26 NT son de tumor neural de rata, mientras que las líneas MSP12 esféricas y adherentes, MGG8 esféricas y adherentes son humanas en cultivo. Desde 500 mM se puede observar actividad inhibitorioa en todas las células expuestas (VER FIGURA 6).

Infección de células: Se sembraron 5 x 104 células Vero/well sobre laminillas de vidrio en placas de 24 wells durante 24hs a 37C y 5% C02. Luego se incubaron con tripomastigotes sanguíneos de la cepa RA a razón de 5 parásitos/cel (MOI: 5) durante 3hs.

Efecto de nanopartículas con Nftx sobre amastigotes de T. cruzi : Completada la infección, las células fueron lavadas a fin de eliminar a los parásitos libres e incubadas con Nftx (0.02-10 pg/ml) y nano Nftx (0.02-2.5 pg/ml) por triplicado durante 72hs a 37ºC y 5% C02 .Finalmente fueron fijadas con metanol durante 5 minutos y teñidas con Giemsa. Con el propósito de medir la carga parasitaria por célula, se tomaron fotos al azar de 20 células infectadas para cada concentración de droga ensayada.

Se determinó el número de amastigotes/célula por análisis de imágenes mediante el empleo del software Image J.

Consideramos que el proceso de nanoparticulación de nifurtimox, permite un incremento del pasaje transmembrana y una biodisponibilidad intracelular aumentada de la droga, que confiere al nifurtimox una cualidad nueva y fundamental para los objetivos terapéuticos, a saber: alta eficacia sobre los nidos de amastigotes intracelulares lo que podría convertirse, eventualmente, en una terapéutica eficaz para la Enfermedad de Chagas en fase crónica, hoy intratable.

> Nanopartículas de nifurtimox sobre amastigotes:

Se muestran curvas de dosis respuesta a nifurtimox droga como tal y nanopartículas de nifurtimox sobre la sobrevida de amastigotes (VER FIGURAS 7 y 8).

En la FIGURA 9, se observa el efecto de nanopartículas de nifurtimox sobre la viabilidad de células de retinoblastoma en cultivo. Se observa la actividad antineoplásica in vitro de las nanopartículas de nifurtimox sobre células en cultivo de Retinoblastoma. El ensayo de citotoxicidad fue realizado en líneas celulares comerciales de retinoblastoma Y79. Las mismas fueron sembradas a razón de 20.000 células por pocilio en placas de 96 pocilios. La proliferación celular se midió por el método colorimétrico de MTT.

También, los inventores destacan que la composición de la invención tiene las siguientes características relevantes que merecen ser comentadas, ellas son:

• Su administración es oral, pulmonar, intravenosa, rectal, oftálmica, colónica, parenteral, intracisternal, intratecal, intravaginal, intraperitoneal, ótica, local, transdermal, bucal, nasal y tópica.

• Se utilizan mejoradores de la penetración transdermal (enhancers) de la familia de los sulfóxidos especialmente los denominados dimetilsufóxido (DMSO), dimetilacetamida (DMAC) y dimetilformamida (DMF), de la familia de las oxazolidonas de las ureas, de las azonas y de las pirrolidonas, de la familia de los aceites esenciales tales como los terpenos y terpenoides y de la familia de los ácidos grasos

• La forma de dosificación es seleccionada entre dispersiones liquidas, geles, aerosoles, ungüentos, cremas, formas liofilizadas, comprimidos, comprimidos bucodispersables, capsulas, suspensiones coloidales, papeles desleíbles y jet (needle free).

• La forma de dosificación es seleccionada entre formulaciones de liberación inmediata, de liberación controlada, de liberación retardada, de liberación prolongada, de liberación pulsátil, o combinaciones de estas. • Comprende uno o más excipientes, vehículos o combinación de los mismos farmacéuticamente estables..

• El principio activo adicional se selecciona del grupo de diuréticos, a- bloqueantes, b-bloqueantes, inhibidores de ACE, bloqueadores de canales de calcio, antagonista de angiotensina, inhibidores del sistema nervioso y vasodilatadores.

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