« Nouveau produit biologique d'origine marine, son procédé d'obtention et ses utilisations »

L'invention se rapporte au domaine de la chimie et plus particulièrement à celui de la biologie.

Elle a plus particulièrement pour objet un moyen de valorisation et/ ou de récupération de déchets d'origine animale à des fins alimentaires notamment pour les animaux.

Elle a spécifiquement pour objet un procédé d'ensilage ou de liquéfaction des organes digestifs d'un céphalopode sous l'influence des enzymes endogènes au cours de l'ensilage.

La seiche, est un céphalopode (Sepia officinalis ou Sepia esculenta ou Sepia pharaonis, et surtout Sepia officinalis), qui est abondante dans les mers entourant notre pays et est principalement pêchée dans les bassins du Cotentin.

Ainsi qu'il a été précédemment exposé, (E. Le Bihan, A. Perrin et N. Koueta, Vie et Milieu 2006 ; 139- 145), les animaux marins sont commercialisés principalement sous forme éviscérée après congélation et cette production constitue un motif de développement important pour beaucoup d'entreprises côtières. Ces entreprises produisent un volume important de déchets, notamment la peau et les viscères.

La peau des céphalopodes a déjà trouvé une possibilité d'utilisation car elle contient une forte proportion d'acides gras poly- insaturés. Selon le document EP 1.027.833, il est possible de traiter des fragments de peau avec des enzymes protéolytique pour former une émulsion du type émulsion O/ W qui contient les composants solubles dans Peau et surtout les acides gras poly-insaturés insolubles dans l'eau. Parmi les composants solubles dans l'eau, on citera les aminoacides, les oligoprotéines de poids moléculaire inférieur à 30.000 et des protéines.

Ce procédé permet déjà de valoriser un déchet important et de supprimer un risque permanent de pollution de l'environnement en hydrolysant de cette façon la peau de seiche.

Cependant, ceci n'est pas encore suffisant pour réaliser l'élimination des déchets de seiche et d'autres céphalopodes tels que calamars, poulpes et autres animaux marins.

Des études ont montré que le tube digestif de la seiche (golden Cuttlefish) contient de nombreux enzymes et iso enzymes (Zeng X et al. J Océan Univ. of China (Chem. Abst. 142 173513 (1997) ; Perrin A., 2004) qui contribuent au processus d'autolyse.

On a montré aussi que les enzymes présents dans la glande digestive de la seiche [Sepia officinalis) contenaient des formes activées par différents métaux tels que Cu, Zn ou Ag qui les rendaient sensiblement plus actifs (Le Bihan E. et al. J Exp. Mar. Biol Ecol 2004 ; 309, 47-66).

On a également montré que l'alimentation des seiches en élevage expérimental joue un rôle important sur la sécrétion d'en∑ymes digestifs et sur la croissance des jeunes seiches (Perrin A et al., J Exp. Mar. Biol Ecol 2004 ; 311, 267-285)

Parmi les enzymes trouvés dans le tube digestif et notamment dans la glande digestive des seiches et des calamars, on trouve principalement des protéases (Hatate H. Suisan Daigakko Kenkyu Hokuku (1999) 47, 121-127 ; Perrin A., (2004), loc. cit).

Parallèlement, on a identifié dans les viscères de seiche des acides gras insaturés comme l'acide éicosapentaénoïque et l'acide docosahexaénoique, mis en évidence par chromatographie en phase stationnaire et purification par passage sur gel de silice et alumine puis caractérisation par du nitrate d'argent (Ikushim Y et al. Brevet japonais JP 9008298 du 11/ 10/ 1990).

En définitive, E. Le Bihan et al, Food Chemistry 98 (2006) 39-51 ont montré que les céphalopodes constituent une ressource économique importante pour des pêcheries globales. La Basse Normandie

est la région productrice de céphalopodes la plus importante en France. La seiche ainsi produite est destinée à être exportée sous forme congelée vers les pays du Bassin Méditerranéen et vers le Japon. Traditionnellement, les viscères ont été considérés comme un déchet sans utilisation pratique, sauf pour une faible part. Cependant, les viscères de seiche représentent une partie importante de la masse de seiche (15 à 25 %). De ce fait, ce type de résidu représente une perte commerciale importante du fait de l'absence de valorisation d'un tel résidu.

L'utilisation des lipides, qui représentent 10 % des viscères, fait que les viscères des céphalopodes peuvent être la base d'autolysats de produits d'origine marine destinés à produire des lipides et aussi des peptides facilement digestibles, que l'on pourra utiliser comme ingrédient en aquaculture.

Le processus d'autolyse post-mortem des viscères entraîne la libération des enzymes endogènes de telle sorte que le degré d'autolyse et le degré d'hydrolyse des fonctions amide, déterminent le degré d'hydrolyse des liaisons peptidiques et en définitive le poids moléculaire des protéines et des peptides dont dépend la durée de la réaction enzymatique. On a déterminé également le niveau d'activité enzymatique, l'évolution du pH au cours de l'autolyse, l'influence de l'acide Trichloro acétique sur le niveau de protéines solubles (Le Bihan E. et al., 2006, Food Chemistry, 98, 39-51).

L'invention consiste donc à soumettre les viscères de seiche et notamment de Sepia officinalis à une autolyse partielle ou complète par les enzymes endogènes pour former des lysats contenant des protéines solubles, des agrégats d'huiles riches en acides gras poly-insaturés, des protéines, des hydrates de carbone.

Ce procédé d'autolyse est également caractérisé par le fait que le pH du milieu est maintenu en dessous de 6 en cours de processus par addition d'un acide aliphatique carboxylique comme l'acide propionique.

Le procédé d'autolyse est également défini par le fait que le taux de protéines solubles dans l'acide trichloroacétique varie. Il se

produit une rupture des lysosomes et de ce fait la quantité de protéines solubles dans l'acide trichloroacétique est augmentée.

L'invention est encore caractérisée par une diminution du taux de protéines de haut poids moléculaire et notamment de poids moléculaire supérieur à 20 kDa alors que le taux de protéines de bas poids moléculaire (< 6,5 kDa) demeure inchangé durant le stockage.

En outre, on a déterminé qu'au cours de l'autolyse des viscères, l'activité spécifique de l'amylase augmente significativement (p < 0,05) pour ensuite diminuer, par suite de la dégradation de l'enzyme et de son instabilité dans les conditions de stockage.

L'activité des carboxypeptidases A' et B' présentes dans les viscères augmente d'une manière significative (p < 0,05) par rapport aux viscères des animaux vivants. Ainsi, dans les conditions d'autolyse, les carboxypeptidases doivent être considérés comme très stables dans les conditions expérimentales utilisées.

L'activité spécifique de la chymotrypsine a été trouvée significativement plus élevée par rapport à l'activité déterminée chez la seiche vivante. Cependant, cette augmentation a tendance à baisser par suite de la dégradation survenant pendant la transformation en usine.

L'autolyse est due principalement aux taux élevés de protéases acides (cathépsines), de chymotrypsine et de trypsine dans le système digestif des animaux carnivores.

Un phénomène important au cours de l'autolyse est la libération de protéases digestives par suite de la rupture des vésicules à zymogène présents dans les cellules, ce qui induit une activité protéasique alcaline nettement augmentée.

Pendant l'ensilage, la teneur en acides gras C22 : 6 - 3 augmente alors que le taux d'acides gras en C20 : 5 - 3 diminue. Néanmoins, la teneur globale en acides gras poly- insaturés reste élevée.

En définitive, les viscères de seiche après autolyse contiennent en moyenne :

86-87g - pour 100 g de poids sec de protéines 12 g pour 100 g de poids sec de lipides et 2, 1 g I 100 g de poids sec de glucides

La congélation de la seiche induit un abaissement important de la teneur en protéines, en lipides et en hydrates de carbone dans les viscères. Cependant, les proportions relatives en ces différents constituants demeurent similaires pendant la conservation à -2O ⁰ C.

Les tableaux I et II suivants montrent les différences de compositions des viscères de seiche après différents traitements en cours de stockage.

Les ensilages de viscères de seiche sont ensuite lyophilisés pour assurer une meilleure conservation et faciliter leur utilisation. L'addition d'un acide organique aliphatique à l'ensilage (comme l'acide propionique) et l'addition d'un antioxydant (comme la vitamine E, le p. terbutylparacresol ou l'éthoxiquine) facilitent également l'autolyse et la conservation.

Après analyse biochimique des différents constituants, les ensilages lyophilisés selon l'invention ont été testés in vivo afin de déterminer leur aptitude à être utilisés en aquaculture.

Des élevages expérimentaux de juvéniles de mollusques [Sepia officinalis), de poissons [Dicentrarchus labrax) et de larves de crustacés (Penaeus japonicus) ont été réalisés afin de tester l'impact de ces enrichissements sur les larves et sur les juvéniles. Les animaux sont placés en élevage expérimental pendant 40 jours dans le cas des seiches, 4 mois pour les bars et 60 jours pour les crevettes. Ils ont reçu des aliments enrichis en ensilage (1 à 10 % de l'alimentation). Les essais d'enrichissement de l'alimentation avec les ensilages ainsi préparés ont montré une forte amélioration du taux de croissance des juvéniles de

seiches, de bars et de crevettes japonaises. La survie n'a pas été affectée par l'enrichissement de l'alimentation au cours des expériences.

L'utilisation des ensilages peut aussi s'avérer utile dans le cadre de la fabrication de supplément de milieux de culture (cellules isolées de mollusques marins ou de bactéries) et la régulation de phénomènes physiologiques. Pour cette raison, l'effet des ensilages sur la viabilité et l'activité physiologique cellulaire, a été testé sur cellules isolées de la glande digestive de seiche. Les expériences ont montré que l'ajout d'ensilage dans le milieu de culture permet une augmentation significative de la viabilité cellulaire et provoque une stimulation de leur activité physiologique (sécrétion d'enzymes digestives). La comparaison des effets des ensilages avec ceux de facteurs de croissance (IGF, EGF, Insuline) sur des cellules isolées de la glande digestive de seiche montre des similitudes.

De plus, l'ajout d'ensilage au milieu de culture d'hémocytes d'ormeau permet d'augmenter l'adhésion des cellules et le nombre de prolongements cytoplasmiques de celles-ci. Les ensilages stimulent les défenses immunitaires au niveau d'hémocytes d'ormeaux en culture primaire. Ainsi, les ensilages LBBMA4 et LBBMA25 montrent une stimulation des activités lysosomales (stimulation de 176 % et 329 % respectivement), de phénoloxydase (stimulation de 110 % et 120 % respectivement) et anti-protéasique (inhibition de 35 % et 35 % respectivement contre 19 pour le témoin) en comparaison avec celle dosée dans le milieu de culture des hémocytes témoin.

Enfin, l'utilisation des ensilages, en tant que milieu de culture seul, pour micro-organismes montre que les bactéries et levures peuvent se développer davantage sur ce type de milieu de culture. Ceci permet d'envisager la possibilité de remplacer les peptones actuellement utilisées par des ensilages de viscères de seiches avec un résultat au moins comparable. Les ensilages par suite de leur teneur élevée en protéines trouvent encore un emploi en alimentation.

Les exemples suivants explicitent l'invention sans toutefois la limiter. Les chiffres fournis ci-après sont susceptibles de subir des variations en fonction de la saisonnalité.

Exemple I

Ensilage fabriqué à 4 ⁰ C

On broyé dans un broyeur à galets 25 litres de viscères mélangées (viscères et yeux de seiche). On met le broyât dans un bac en plastique résistant à l'acide (polypropylène). On ajoute au jus 1,5 % en poids/ vol. d'acide propionique puis 250 mg/1 d'un agent anti-oxydant. On mélange jusqu'à homogénéité puis on laisse incuber à 4 ⁰ C pendant 50 jours. On lyophilise le jus d'ensilage et on répartit le lyophilsat dans des récipients bouchés à l'abri de l'humidité.

Composition de l'ensilage après lyophilisation :

Ensilage fabriqué à 4 ⁰ C :

(LBBMA4)

pH : 5.29 ± 0.05

Protéines TCA solubles (mg/ml) 399.5 + 16

Protéines totales (g/ 10C ) g de poids sec) 84,61 ± 3

HMW glucides (g/ 100 g de poids sec) 1,45 + 0.01

LMW glucides (g/ 100 g de poids sec) 1, 19 + 0.005

Glucides totaux (g/ 100 g de poids sec) 2.63 + 0.016

Lipides totaux (g/ 100 g de poids sec) 8,5 + 0.4

Peptides <6.5 kDa (%) : 80.7 ± 0.4

Digestibilité (%) : 89.53 ± 2.15

Composition en acides aminés (mg/g de 240 ± 9 poids sec)

TABLEAU I : Composition de l'ensilage après lyophilisation

Exemple II

Ensilage fabriqué à 25 ⁰ C

Le même mode opératoire a été utilisé qu'à l'exemple I mais les viscères de seiche ont été mises en incubation à 25°C pendant 50 jours. Le jus d'ensilage est séché par lyophilisation dans les mêmes conditions qu'à l'exemple I.

La composition de l'ensilage après lyophilisation obtenu dans ces conditions a été déterminée. On notera que le produit d'ensilage obtenu dans ces conditions présente une teneur en acides aminés sensiblement supérieure et un coefficient de digestibilité statistiquement plus élevé (95,59 ± 3, 11 contre 89,53 ± 2, 15). La teneur en peptides de faible poids moléculaire (<6, 5 kDa) et en lipides totaux est également statistiquement plus élevée. Il apparaît donc que l'ensilage fabriqué à 25°C présente une valeur nutritive sensiblement supérieure.

Les ensilages fabriqués selon la technique de l'exemple I et de l'exemple II trouvent un emploi comme complément alimentaire en nutrition animale, pour la stimulation de la croissance pour les jeunes animaux, pour la stimulation et la maturation du système digestif des juvéniles ou de larves, pour l'augmentation de la digestibilité de tels aliments et encore comme immunostimulant.

TABLEAU II

Composition de l'ensilage après lyophilisation

TABLEAU III

Stabilité des produits d'ensilage Depuis 0 à 12 mois après la production

Ensilage fabriqué à 4°C Ensilage fabriqué à 25°C :

Temps (mois): 12 8 12 12 8 12 Salmonelles : Absence Absence Entero-bactéries : Absence Absence

Dioxine (OMS- 2,57 pg/g 2,27 pg/g ToxiqueEQuivalent de matrice sèche

PCB (OMS- 2,56 pg/g 2,32 pg/g ToxiqueEQuivalent de matrice sèche

HAP (OMS- 1,88 μg/kg 2,62 μg/kg ToxiqueEQuivalent de matrice sèche

Dioxine + PCB 5,13 pg/g 4,59 pg/g (OMS-

ToxiqueEQuivalent de matrice sèche

Benzo-pyrène (OMS- 0,09 μg/kg 0,15 μg/ki ToxiqueEQuivalent de matrice sèche

Peptides <6.5kDa (%) : 80.7 84.8 85.6 86.4 89.3 91.4 90.91 91.5 pH : 5.29 5.18 5.14 5.12 5.94 5.61 5.56 5.5

± 0,05 ± 0.2 ± 0.1 ± 0.2 ± 0.05 ± 0.1 ± 0.06 ± 0.1

Protéines solubles 399,5 374 383 374 404 379 367 367 dans l'acide ± 16 ± 18 ± 11 ± 8,7 ± 13 ± 9 ± 14 ± 12 Trichloracétique (en mg/rnl)

TABLEAU IV

Composition en acides gras de produits d'ensilage à 4 et à 25°C

Tableau IV : Composition en acides gras des viscères issus de l'ensilage (%

La composition de l'ensilage correspond aux dosages effectués sur un seul ensilage.