L'invention a pour objet de nouveaux déri¬ vés d ' amino acides, leur procédé de préparation et leur application thérapeutique.

On sait que les peptides opioïdes naturels, ou enképhalines, sont essentiellement dégradés par deux enzymes appartenant à la classe des métallopep- tidases, 1 ' endopeptidase neutre EC 3.4 24.11 (enké- phalinase) qui coupe la liaison Gly-Phe (Malefroy et al., Nature, 276, 523, (1978)) et principalement 1 ' aminopeptidase N EC 3.4 11.2 qui coupe la liaison

Tyri-Gly ^{2 (} Waks an et al. Eur. J. Pharm. , 117 ,- 233 (1985)). On connait des dérivés de dipeptides ayant une activité sur 1 ' enképhalinase (Roques et al.), Nature, 288286 (1980), Brevet français 80.08601) ainsi que des composés inhibant 1 ' aminopeptidase N(Chan., Biochem. Biophys. Res. Commun. 116 (1983) 297; Chan et al., J.Biol.Chem. 257 (1982) 7955). De même des inhibiteurs mixtes des différentes activités enképhalinasiques ont été décrits (Fournié-Zaluski) et al. J. Med. Chem. 28 (1989) 1158; Brevet français 86.13413). Par rapport . aux molécules inhibant sélectivement 1 ' endopeptidase neutre ou 1 ' aminopeptidase, ces inhibiteurs mixtes présentent des propriétés pharmacologiques plus puissantes. Cependant, ces composés qui possèdent une fonction hydroxamate , franchissent très mal la barrière hématoencépha ligue et ne présentent donc des propriétés analgésiques importantes qu'après injection intracérébro- ventriculaire (i.c.v.). L'un des objets de l'invention est de fournir de nouveaux composés capables d'inhiber conjointement les deux activités enzymatiques responsables de la dégradation des enképhalines et de manifester leurs propriétés pharmacolo¬ giques après injection intraveineuse (i.v.) sous cutanée (s.c.) ou par voie orale (per os).

On autre objet de l'invention est de fournir de nouveaux composés, dérivés d ' mino-acides , qui présentent

FEUILLE DE REMPLACEMENT

des propriétés des substances morphiniques en particulier l'analgésie, les effets bénéfiques sur le comportement (sédation, euphorie, récompense), et les effets périphériques (antidiarréi ue, antitusif, hypotenseur, anti- inflammatoire...) sans en avoir les inconvénients majeurs (tolérance, dépendance...).

Les nouveaux composés selon la présente invention ne possèdent pas de fonction hydroxamate mais sont caracté¬ risés par une liaison disulfure. D'autre part, les nouveaux composés sont suscep¬ tibles d'inhiber conjointement les deux enzymes de dégrada¬ tion des enképhalines endogènes ou de potentialiser l'action d'analogues administrés de manière exogène.

L'invention a plus particulièrement pour objet des composés répondant à la formule (I).

H ₂ N-CH(R ₁ )-CH(R ₂ )- ^s -S- ^CH (R ₃ )- ^c H(î*- ₄ )-A-B-Z (I) dans laquelle : R*l_ représente :

- une chaîne hydrocarbonée saturée ou insaturée linéaire ou ramifiée comportant de 1 à 6 atomes de carbone, substituée ou non par un groupe OR dans laquelle R est un hydrogène, une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée de Cl à C4, ou un reste phényle (Phe) ou benzyle ; un groupe thioéther SR, R ayant la même définition que ci-dessus ou un groupe thioéther oxydé S(0)R, R ayant la même définition que ci-dessus,

- un groupe méthyl cycloalkyle à 5 à 6 atomes de carbone, un groupe benzyl ou phényl, éventuellement substi¬ tué : • par 1 à 5 atomes d'halogène notamment de fluor,

. ou par un groupe OR' ou SR' , R' étant un groupement alkylé de 1 à 4 atomes de carbone, le thioéther SR' étant oxydé ou non sur l'atome de soufre,

. ou par un groupe amino éventuellement mono- ou di- substitué par un groupe alkyle aliphatique de 1 à 6 atomes

FEUILLE DE REMPLACEMENT

de carbone, oxydé ou non sur la fonction aminé,

- un groupe méthylène substitué par un hétérocycle à 5 ou 6 atomes de carbone, aromatique ou saturé, possédant comme hétéroatome, un atome d'azote, un atome d'oxygène ou un atome de soufre, les atomes d'azote et de soufre étant éventuellement oxydés sous forme de N-oxyde ou de S-oxyde. 2 représente indépendamment un atome d'hydrogène ou un groupement méthyle.

R3 représente un atome d'hydrogène ou une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée. R4 représente :

- une chaîne hydrocarbonée saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée comportant de 1 à 6 atomes de carbone, substitué ou non par un groupe hydroxy, éther OR dans lequel le groupe R a la même signification que précédemment, un groupe thiol SH, thioéther SR (R ayant la même signi ication que précédemment) ou un groupe thioéther oxydé en suifoxyde,

- un groupe méthylcycloalkyle de 5 à 6 atomes de carbone, un groupe benzyl ou phényl, éventuellement substi¬ tué par 1 à 5 atomes d'halogène notamment de fluor, par un hydroxyle ou un thiol, un éther ou un thioéther OR' ou SR' , R' ayant de 1 à 4 atomes de carbone, le thioéther étant oxydé ou non sur l'atome de soufre, par un groupe amino éventuellement mono ou disubstitué par un groupe alkyle- aliphatique de 1 à 6 atomes de carbone, oxydé ou non sur la fonction aminé,

- un groupe méthylène substitué par un hétérocycle à 5 ou 6 atomes de carbone, aromatique ou saturé, possédant comme hétéroatome, un atome d'azote, un atome d'oxygène ou un atome de soufre, les atomes d'azote et de soufre étant éventuellement oxydés sous forme de N-oxyde ou de S-oxyde. Z peut représenter: * un groupement -CH(R ₅ )-[CH(R ₆ ) ] _n -COO(R ₇ ) dans leαuel

FEUILLE DE REMPLACEMENT

R5 et R5 peuvent représenter indépendamment l'un de l'autre :

. un hydrogène,

. un groupement alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 6 atomes de carbone substitué ou non par des groupements hydroxy ou éther OR, thiol SH ou thioéther, SR (R ayant la définition précisée précédemment), un groupement phényl (Phe) ou benzyl substitué ou non par 1 à 5 atomes d'halogène ; un groupement OR' ou SR' , R' ayant la définition précisée ci-dessus.

R5 et Rg peuvent également représenter chacun des chaînes hydrocarbonées saturées ou insaturées contenant de 1 à 6 atomes de carbone dans lesσuels 1 à 2 atomes de carbone peuvent être substitués par un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote pouvant former un ou plusieurs cycles d'hydrocarbones saturés ou aromatiσues de 5 à 6 maillons ou d'hétérocycles saturés ou aromatiσues de 5 à 6 maillons, n peut être égal à 0 ou à 1. ₇ représente : . un hydrogène,

. ou un groupement hydrocarboné linéaire ou ramifié de 1 à 6 atomes de carbone saturé ou insaturé,

. ou un groupement benzyle. * un groupement morpholinyle - -C4H8O * ^~ - _~ - groupement piperidinyle - -C5H10, éventuellement substitué par un reste -OH, un reste -CO2H, un reste COOR ¹ , dans lequel R ¹ représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée contenant 1 à 6 atomes de carbone, un reste phényle ou un reste benzyle. * un groupement pyralozinyle-N-C^g-NH, un groupement pyralozinyle substitué -NC4Hg-N-R^ dans lequel R^ représente une chaîne alkylée contenant de 1 à 6 atomes de carbone, un reste benzyle ou un reste phényle. A-B représente un groupement amide CONK ou rétro amide NHCO. Les composés de formule (I) ont de 2 à 6 atomes de

carbones asymétriques. Ils existent donc sous forme de mélanges racémiques, sous formes d'énantiomètreε, ce diastéréoisomères ou de stéréoisomères . L'invention a égale¬ ment pour objet les sels d'addition des composés de formule (!) , obtenus avec des acides organiques ou minéraux phar a- cologiquement acceptables tels que le chlorhydrate, le bromhydrate, les sulfates, les nitrates, les borates, les phosphates, le méthane sulfonate, l'acétate, le fumarate, le succinate, l'ascorbate, l'oxalate, le lactate, le pyruvate, le citrate, le tartrate, le maléate, le malonate, le benzoate, le salicylate, le dichloro-2,6 benzoate, le triméthoxy benzoate, le diaminobenzène sulfonate, le chromoglycate, le benzène sulfonate, le cyclohexane sulfonate, le toluène sulfonate, le dipropyl acétate, le glucose-1 phosphate, le pamoate et le palmitate.

De manière préférentielle, les composés selon l'invention sont tels que dans la formule (I) si Z repré¬ sente un groupement -CH(R5)-[CH(Rg) ] _n -C00-(R7) .

R2 et R3 représentent des atomes d'hydrogène, AB représente une liaison amide CONH,

Ri représente un groupement - CH2 CH2 S(O) CH3 et R7 représente un groupement - CH2Phe, auquel cas ils peuvent répondre aux formules : H ₂ -CH(CH2CH2S(0)CH3)-CH2S-S-CH2-CH(CH2PHe)CO HCH2COOCH ₂ Phe ou

H ₂ N-CH (CH ₂ CH ₂ S (0) CH ₃ ) -CH ₂ -S-S-CH ₂ -CH- CH ₂ Phe CONH-CH (Cl^Phe) COOCH^he ou

H ₂ NCH ( CH ₂ CH ₂ S ( 0 ) CH3 ) -CH ₂ -S-S-CH ₂ -CH ( CH ₂ PHe ) COOCH Phe

et si R4 représente un groupement -CH2CH2S ( 0 ) CH3 , ils peu¬ vent répondre aux formules :

H2 -CH ( CH2CH2S ( 0 ) CH ₃ ) -CH2ε-S-CH2-CH ( CH2CH ₂ S ( 0 ) CH3 ) - CONHCH ( CH3 ) - COOCH ₂ Phe ou

H ₂ N-CH ( CH ₂ CH ₂ S ( 0 ) CH ₃ ) -CH ₂ -S-S-CH ₂ -CH ( CH ₂ CH ₂ S ( 0 ) CH ₃ ) CONH¬ CH ( CH ₂ Phe ) CH ₂ COOCH ₂ Phe ou

H ₂ N-CH ( CH ₂ CH ₂ S ( 0 ) CH ₃ ) -CH ₂ -S-S-CH ₂ -CH ( CH ₂ CH ₂ S ( O ) CH ₃ ) CONH- CH ( Phe )CH ₂ COOCH ₂ Phe ou H ₂ N-CH ( CH ₂ CH ₂ S ( 0 ) CH ₃ ) -CH ₂ -S-S-CH ₂ -CH ( CH ₂ CH ₂ S ( 0 ) CH ₃ ) CONH-

CH-CH -COOCH ₂ Phe / \

Les composés selon l ' invention peuvent aussi répondre de manière préférentielle aux formules :

H ₂ NCH ( CH ₂ CH ₂ SCH ₃ ) CH ₂ -S-S-CH ₂ CH ( CH ₂ CH ( CH ₃ ) ₂ ) CONHCH ( CH ₃ ) CO0CH ₂ Phe ou

H ₂ N-CH ( CH ₂ CH ₂ SCH ₃ ) CH ₂ -S-S-CH ₂ -CH ( CH ₂ Phe ) CONHCH ( CH ₃ ) COOCH ₂ Phe ou H ₂ NCH ( CH ₂ CH ₂ SCH ₃ ) CH ₂ -S-S-CH ₂ CH ( CH ₂ CH ₂ SCH ₃ ) CONHCH ( CH ₃ ) COOCH ₂ Phe ou

H ₂ N-CH ( CH ₂ CH ₂ SCH ₃ ) CH ₂ -S-S-CH ₂ -CH ( CH ₂ Phe ) CONHCH ( CH ₂ Phe ) COOCH ₂ Phe ou

H ₂ N-CH ( CH ₂ CH ( CH ₃ ) ₂ ) -CH ₂ -S-S-CH ₂ -CH ( CH ₂ Phe ) CONH-CH ₂ COOCH ₂ Phe ou

H ₂ N-CH ( CH ₂ CH ( CH ₃ ) ₂ ) -CH ₂ -S-S-CH ₂ -CH ( CH ₂ Phe ) CONH ( CH ₂ Phe ) COOCH ₂ Phe ou

H ₂ N-CH ( CH ₂ CH ₂ SCH ₃ ) -CH ₂ -S-S-CH ₂ -CH ( CH ₂ Phe ) CONH-CH ₂ -COOCH ₂ Phe ou H ₂ N-CH ( CH ₂ CH ( CH ₃ ) ₂ ) -CH ₂ -S-S-CH ₂ -CH ( CH ₂ Phe ) CONH-CH ( CH ₃ ) COOCH ₂ Phe

H ₂ N-CH ( CH ₂ CH ₂ S ( 0 ) CH ₃ ) CH ₂ -S-S-CH ₂ -CH ( CH ₂ CH ( CH ₃ ) ₂ ) -CH ₂ -CONH-N 0 Ces derniers composés sont particulièrement intéres¬ sants du fait de leurs propriétés de biodisponibilité ( actif per os ) .

L ' invention a d ' autre part pour objet un procédé de préparation des composés de formule ( I ) précédemment définis dans laquelle Z représente un groupement -CH (R ₅ ) - [ CH ( R ₆ ) ] _n -CO (R ₇ )

FEUILLE DE REMPLACEMENT

comprenant les étapes suivantes :

- des composés de formule (II) :

R ₈ NH-CH(R ₁ )-CH(R ₂ )SH dans laquelle Rg représente un groupement protecteur de la fonction aminé sont condensés sur la dithiodiϋyridine (III)

pour conduire aux composés de formule générale (IV)

R ₈ NHCH(R ₁ )-CH

(IV) - puis le composé (IV) est -condensé sur les composés de formule (V) :

HS-CH(R3)-CH(R4)-A-B-CH(R ₅ )-[CH(R ₆ )) _n -COO(R ₇ ) (V) pour conduire aux composés de formule (VI) :

R ₈ NH-CH(R ₁ )-CH(R2)-S-S-CH{R3)-CH(R4)-A-B-CH(R ₅ )-[CH(R ₆ )] _n -

COO(R ₇ )

- puis la fonction aminé du composé (VI) est déprotégée pour conduire au composé de formule (I).

De manière préférentielle, la condensation du composé de formule (II) sur la dithiopyridine (III) s'effectue à température ambiante en présence d'acide acétique dans l'éthanol.

La condensation du composé intermédiaire (IV) sur le composé (V) est effectuée dans l'éthanol à température ambiante.

Les produits intermédiaires (II) et (V) sont synthétisés en suivant les modes opératoires décrits dans la littérature (Chan, Biochem. Biophys. Res. Commun., 116 , 297, (1983) et Cush an et al., Bioche istry, 1 , 5484, (1977)).

Le groupe protecteur R ₈ est préférentiellement le t-Butylocarboxyl (t.Boc). Ce groupe peut être éliminé à l'aide d'acide trifluoroacétiσue dans du chlorure de

FEUILLE DE REMPLACEMENT

méthylène.

Si R ₂ représente un atome d'hydrogène, le produit de formule (II) peut être obtenu à partir d'un bêta-amino alcool de formule : ___ H ₂ N-CH-(R ₁ )-CH ₂ OH (VII)

- par protection de la fonction aminé à l'aide d'un groupe Rg, résultant en la formation du produit de formule :

RgNH-CH(R ₁ ) - CH ₂ 0H (VIII) - puis par activation de la fonction alcool, notamment sous la forme de tosylate, résultant en la formation d'un produit de formule :

RgHN-CH(R ₁ ) CH ₂ 0T _S (IX) dans laquelle Tg représente un groupement tosylate, - puis par transformation du groupement tosylate en groupement acétylthio résultant en la formation du produit de formule :

RgNH - CH(R ₁ )-CH ₂ -S-C0CH ₃ (X)

- puis par hydrolyse alcaline en atmosphère réductrice du produit (X) résultant en la formation du composé de formule (II).

Les produits béta-amino alcools de formule (VII) sont obtenus par un protocole décrit dans la littérature [(Chan. Biochem. Biophys. Res. Commun. 116 297 (1983)]. Si R ₂ représente un atome d'hydrogène, le produit de formule (X) peut être obtenu à partir du produit de formule (VIII), dans les conditions de la réaction de Mitsunobu, (Synthesis (1981), 1-28) c'est à dire en présence de triphényl phosphine et d'un azodicarboxylate de dialkyle. Si R ₂ représente un groupe -CH3 et si R*^ et R ₄ ont la même signification, le composé de formule (II) peut être préparé par réarrangement selon Curtius (Pataï, The Che istry of Azids groups, 397, (1971)), à partir d'un composé de formule : CH ₃ -C0-SCH(CH ₃ )CHR ₁ -C0 ₂ H (XI)

- par traitement audit composé à l'azoture de sodium a 3 en présence de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) résultant en la formation du produit de formule :

CH ₃ -CO-SCH(CH ₃ )CHR ₁ -CON ₃ (XII) - puis par chauffage en présence d'un alcool résultant en la formation du produit de formule : CH ₃ -CO-SCH(CH ₃ )CHR ₁ -NKR ₈ (XIII)

- puis par hydrolyse acide du groupement acétylthio, dans des conditions réductrices. De manière préférentielle, la fonction a iné du composé (XIII) est protégée sous forme de carba ate.

Si R3 représente un atome d'hydrogène ou un groupe -CH3, et AB un groupement amide CONH, le composé de formule (V) peut être obtenu à partir d'un composé de formule : CH3-CO S CK(R ₃ )CH(R ₄ )-C0 H (XIV) qui sont des acides acétylthyo-propanoïques substituées en 2, (Cush an et al. (1977), Biochemistry JL£.5484).

- par hydrolyse alcaline préférentiellement dans des conditions oxydantes dudit composé, résultant en la formation du composé de formule :

(SCH(R ₃ )CH(R4)-C0 ₂ H) ₂ (XV)

- puis condensation dans les conditions classiques de couplage peptidique avec un amino-ester de formule :

H ₂ N-CH(R ₅ )- [CH(R ₆ ) ] _n -CO-OR ₇ (XVI ) résultant en la formation d'un composé de formule :

( S CH(R ₃ )CH(R ₄ )CONH CH(R ₅ ) [CH(R ₅ ) _n ] -COOR ₇ ) ₂ (XVII )

- puis traitement en milieu réducteur (zinc et acide chlorydrique) .

Les béta-amino acides de formule (XVI) sont synthétisés par des méthodes classiques (Xie et col., J. Med. Chem. (1989), .32., 1497).

Le composé de formule XI peut être obtenu à partir de l'ylure de phosphore de formule :

(Phe) ₃ P-CK(R ₁ )-COO-CH ₃ (XVIII) - car condensation de Wittiσ avec de l'acétal-

déhyde résultant en la formation du composé de formule : CH3CH = C(R*ι)-C0-CH3 (XIX)

- puis par hydrolyse alcaline résultant en la formation du composé de formule : CH3CH=C(R C0 ₂ H (XX)

- puis par addition d'acide thioacétique.

Si R3 représente un atome d'hydrogène ou un groupe

-CH3 et si R _} _ et R4 ont la même signification et si AB représente un groupe rétro-amide NHCO, le composé de formule (V) peut être préparé respectivement à partir des composés

(X) et (XIII) répondant à la formule générale :

CH ₃ CO-S-CH(R ₂ )CH(R ₁ )NHRg (XXI)

- par hydrolyse alcaline dans des conditions oxy¬ dantes résultant en la formation du composé de formule : [SCH(R ₂ )CH(R ₁ )NHR ₈ ] ₂ (XXII)

- puis par déprotection de la fonction aminé conduisant au composé de formule :

[SCH(R ₂ )CH(R ₁ )NH ₂ ] ₂ (XXIII)

- puis par condensation dans les conditions clas- siques de couplage peptidique avec des monoacides esters aloniques ou succiniques de formule :

C0 H-CH( ₅ )-[CH(R ₆ ) ] _n -C00R ₇ (XXIV) résultant en la formation d'un composé de formule : [SCH(R ₂ JCHRi-NHCO-CH s-(CHRg) _n -COOR ₇ ] ₂ - puis par traitement en milieu réducteur.

Les monoacides monoesters maloniques ou succiniques de formule (XXIV) sont synthétisés par des méthodes classiques (Fournie-Zaluski et coll., Int. J.

Pept. Prot. Res., 3_3_, (1989), 146). L'invention a de plus pour objet un procédé de préparation des composés de formule I dans laquelle le groupement Z représente :

* un groupement orpholinyle - -C4H ₈ 0

* un groupement piperidinyle -N C5H1O' éventuellement substitué par un reste -OH, un reste -C0 ₂ H, un reste

FEUILLE DE REMPLACEMENT

COOR ¹ , dans lequel R ¹ représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée contenant 1 à 6 atomes de carbone, un reste phényle ou un reste benzyle. * un groupement pyralozinyle-N-C4Hg-NH, un groupement pyralozinyle substitué - C4H ₈ - -R^ dans lequel R ^** - représente une chaîne alkylée contenant de 1 à 6 atomes de carbone, un reste benzyle ou un reste phényle. caractérisé en ce que des composés de formule (SCH(R ₃ )CH(R ₄ )-C0 ₂ H) ₂ (XV) sont condensés avec une hydrazine de formule H ₂ N-Z (XXV) résultant en la formation d'un composé de formule

(SCH(R ₃ )CH(R ₄ )-CONH-Z)2 (XXVI) qui est condensé sur un composé de formule

(IV) pour conduire au composé de formule (I).

Un autre objet de l'invention est une composition pharmaceutique contenant au moins un composé tel que défini précédemment, ou obtenu par le procédé tel que défini précé¬ demment en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles ou pharmaceutiquement acceptables.

Ces compositions peuvent être utilisées en parti- culier comme analgésique majeur, comme antalgique, et comme anti-dépresseur. Ces composés sont pratiquement dénués des effets secondaires des- morphiniques (tolérance et dépen¬ dance). Leur principale application est donc dans le domaine de l'analgésie et des antidépresseurs. Un autre objet de l'invention est l'application comme médicaments des composés tels que définis précédemment ou obtenus par un procédé tel que défini précédemment.

L'invention sera encore illustrée sans être aucu¬ nement limitée par les exemples ci-après : La liste des composés préparés selon les exemples

FEUILLE DE REMPLACEMENT

1 à 32 est donnée dans le Tableau I.

Pour tous les composés décrits dans ce tableau, R ₂ et R ₃ représentent tous deux des atomes d'hydrogène, R ₇ re¬ présente un groupement -CH ₂ Phe et AB une liaison amide CONH.

Exemple 1 Préparation de H ₂ N-CHfCH ₂ CKfCH _{3 2} -CH ₂ -S-S-CH ₂ - CH (CHoPhe)CONK-CH- _j COOCH Phe

Etape 1 Préparation de Boc-NH-CHrCH2-CHfCH ₃ ) ₂ 1CK ₂ -S-S-<T T A une solution de 3 g de 2,2' dithioddpyridine dans 5 ml d'éthanol cégazé et 0,35 ml d'acide acétique, on ajoute une solution de 1,6 g de Boc-NH-CH[ (CH -CH(CH3) ₂ ]- CH ₂ -SH dans 5 ml d'éthanol dégazé, on agite 24h à tempéra¬ ture ambiante. On évapore à sec. On obtient une huile jaune que l'on chromatographie sur gel de silice dans un mélange cyclohéxane/acétate d'éthyle/acide acétique : 9/1,25/0,25. On obtient 1,62 g du produit attendu. Rdt 72 % ; Rf (cyclohéxane/acétate d'éthyle = 8/2) = 0,25

Etape 2 Préparation de Boc-NH-CH-rCH ₂ CH(CH3 ) ₂ 1CH ₂ -S-S-CH ₂ - CH (CH Phe)-CONH-CH ₂ -COO-CH ₂ Phe A une solution de 1,6 g du composé précédent dans

10 ml d'éthanol déσazé, on ajoute une solution de 1,7 g de N(mercaptométhyl-2-phényl-3-oxo-l-propylglycine benzyl ester dans 10 ml d'éthanol dégazé. On agite 24h à température ambiante. On évapore à sec. On obtient une huile jaune, chromatographiée sur gel de silice avec un mélange cyclohexane /EtOAc/AcOH = 7/3/0,5 comme éluant.

On obtient 2,42 g (Rdt 86 %) du produit attendu. Rf (cyclohéxane/acétate d'éthyle/acide acétique = 8/2/0,5) = 0,38. Etape 3 Préparation du produit final

On dissout 2,4 g du composé précédent dans 4 ml de CH ₂ C1 ₂ . On ajoute à 0°C 6 ml d'acide trifluoroacétique (TFA) . On agite 2 h à 0°C, et 2 h à température ambiante. On évapore à sec. On chromatographie sur gel de silice en utilisant le mélange CH ₂ Cl ₂ /MeOH ≈ 20/1 comme éluant. On obtient 1,63 g du produit attendu (Rdt 80 %). Rf (CH ₂ Cl ₂ /MeOH = 9/1) = 0,46.

Exemple 2

Préparation de H,N-CH(CH,CH(CH,^CH7-S-S-CH,-CHfCH,Phe^CONH¬ CH (CH-* )COOCH,Phe

A partir de 0,685 g de boc amino-2 méthyl-4 pentane- 1 dithio-l'-piperidine préparé dans l'exemple 1, étape 1, et 0,715 g de N[mercapto méthyl-2 phényl-3 oxo-1 propane]- alanine benzyl ester, on obtient selon les conditions de l'exemple 1, étape 2, l'inhibiteur protégé (0,88 g, 75 %). Après déprotection, on obtient le composé attendu (0,57 g, 80 %), sous forme d'un produit huileux, Rf (cyclohexane/ EtoAc/AcOH = 8/2/0,5) = 0,39. Spectre de masse IC, NH ₃ (M+l) = 489. Exemple 3 Préparation de H,N-CH(CH,CH(CH-* ^CH,-S-S-CH-.-CHfCH,Phe^CONH- CH (CH,Phe )COO-CH,Phe.

A partir de 0,685 g de boc amino-2 méthyl-4 pentane- 1 dithio-l'-pyridine préparé dans l'exemple 1, étape 1, et 0,870 g de N[mercapto méthyl-2 phényl-3 oxo-1 propane]- phénylalanine benzyl ester, selon les conditions de l'exemple 1, étape 2, on obtient l'inhibiteur protégé (0,90 g, 60 %). Après déprotection, on obtient le composé attendu (0,554 g, 72 %), Rf (cyclohexane/EtoAc/AcOH = 8/2/0,5) = 0,41. Spectre de masse IC, NH ₃ (M+l) = 565. Exemple 4 Préparation de H,N-CH(CH,Phe^CH,-S-S-CH,-CH(CH,Phe^-CONH-CH,- COOCH,Phe Etape 1 Préparation de t.Boc-NH-CH(CH ₂ Phe)-CH ₂ _--s-s^O>

A partir de 410 mg de dipyridine-2-2'-disulfure et 250 mg de t-Boc-amino-2 phényl-3-propane thiol-1, on obtient en suivant les conditions opératoires de l'exemple 1, 170 mg

(Rdt 42 %) du produit attendu sous forme d'une huile. Rf

(cyclohexane/EtoAc/AcOH = 9/10/0,5) = 0,26.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

Etape 2 Préparation de t-Boc-NH-CH(CH ₂ Phe)-CH ₂ S-S-CH ₂ CH-

(CH ₂ Phe)-CONH-COO-CH ₂ Phe

A partir de 170 mg du composé précédent et 160 mg de

N(mercapto-méthyl-2-ρhényl-3-oxo-l-propane)-glycine benzyl ester, on obtient en suivant les conditions expérimentales de l'exemple 1, 174 mg (61 %) du produit attendu sous forme d'une huile : Rf (cyclohexane/EtoAc/AcOH = 7/3/0,5) = 0,54.

Etape 3 Préparation du produit final

A partir de 170 mg du composé précédent, on obtient en suivant les conditions expérimentales de l'exemple 1, 80 mg (Rdt 55 %) du produit attendu sous forme huileuse. Rf

(CH ₂ Cl ₂ /MeOH = 9/1) = 0,56.

Exemple 5

Préparation de H,N-CH(CH,CH _? SCH -CH-.-S-S-CH,-CHfCH,Phe^-CONH- CH,COOCH,Phe

Eta ^p e 1 Préparation de

A partir de 0,82 g de t-Boc-amino-2 mercaptométhyl- 4 butane thiol-1 et 1,43 g de dipyridine 2,2' disulfure, on obtient en suivant le mode opératoire de l'exemple 1, 0,77 g (Rdt 68 %) du produit attendu sous forme d'une huile. Rf (cyclohexane/Et/OAc/AcOH = 8/2/0,5) = 0,32.

Etape 2 Préparation de t-Boc-NH-CH(CH ₂ -CH ₂ -S-CH ₃ )-CH ₂ -S-S- CH ₂ CH(CH ₂ Phe)CONH-CH ₂ -COO-CH ₂ Phe A partir de 0,75 g du composé précédent et 0,76 g de

N(mercapto/méthyl-2 phényl-3 oxo-1-propane)-glycine benzyl ester, on obtient en suivant les conditions expérimentales de l'exemple 1, 1,18 g (Rdt 87 %) du produit attendu sous forme d'une huile. Rf (cyclohexane/EtoAc/AcOH = 0,46. Etape 3 Préparation du produit final

A partir de 0,4g du composé précédent, on obtient en utilisant les conditions expérimentales de l'exemple 1, 0,35 g du produit attendu (Rdt 85 %) sous forme d'une huile. Rf (CH ₂ Cl ₂ /MeOH = 9/1) = 0,50.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

Exemple 6

Préparation du H,N-CHfCH,CH,SCH-*'ιCH-.-S-S-CH7-CHfCH,Phe^CONH¬ CHfCH, )COOCHïPhe

A partir de 0,9 g de boc amino-2 mercapto méthyl-4 butane-1 dithio-l'-pyridine préparé dans l'exemple 3, étape 1, et 0,88 g de N[mercapto méthyl-2 phényl-4 oxo-1 propane]- alanine benzyl ester, selon les conditions de l'exemple 1, étape 2, on obtient l'inhibiteur protégé (1,07 g, Rdt 70 %). Après déprotection selon le procédé de l'exemple 1, étape 3, on obtient 0,66 g (75 %) du produit attendu. Rf (CH ₃ / MeOH/ AcOH = 9/1/0,5) ≈ 0,62. Spectre de masse IC, NH ₃ (M+l) = 507. Exemple 7

Préparation du H,N-CHfCH,CH,SCH CH,-S-S-CH,-CHfCH,Phe')CONH¬ CH (CH,Phe )COOCH,Phe. A partir de 0,7 g de boc amino-2 mercapto méthyl-4 butane-1 dithio-l'-pyridine préparé dans l'exemple 3, étape 1, et 0,9 g de N[mercapto méthyl-2 phényl-3 oxo-1 propane]- phénylalanine benzyl ester, selon les conditions de l'exemple 1, étape 2, on obtient l'inhibiteur protégé (0,8 g, Rdt 60 %). Après déprotection selon le procédé de l'exemple 1, étape 3, on obtient 0,616 g (72 %) du produit attendu. Rf (CHCl ₃ /MeOH/AcOH = 9/1/0,5) ≈ 0,65 et 0,75. Spectre de masse IC, NH ₃ (M+l) = 583. Exemple 8 Préparation du H,N-CH(CH-*CH-*S(0^CH- -CH,S-S-CH-.-CH(CH,Phe^-CONH- CH,COOCH,Phe

Ce composé est obtenu à partir du composé de l'exemple 5, protégé sur la fonction aminé (étape 2). L'oxydation de 0,5 g de ce composé par le périoda e de sodium (1 eq) en milieu hydroalcoolique permet d'obtenir 0,380 g du suifoxyde correspondant qui est un produit huileux. Rf (cyclohexane/EtoAc/AcOH = 7/3/0,5) = 0,20 (Rdt 78 %).

Le traitement par l'acide trifluoroacétique de la même manière que dans l'étape 3 de l'exemple 1 permet de libérer le composé final attendu. P = 0,289 g (Rdt 85 %) Rf

FEUILLE DE REMPLACEMENT

(CH ₂ Cl ₂ MeOH = 9/1) = 0,25.

Exemple 9

Préparation du H,N-CH/CH*,SCH-*)CH,-S-S-CH,-CH(CH-,Phe)-CONHCH-.-

COOCH,Phe

Etape 1 Préparation du

A partir de 2,2 g de N-t-Boc amino-2-mercapto-l- méthylthio-3-propane, on obtient dans les conditions de 1'exemple 1, étape 1, 2,3 g du produit attendu (70 %) Rf (cyclohexane) EtOAc ≈ 8/2) ≈ 0,28.

Etape 2 Préparation du t-Boc NHCH(CH ₂ SCH ₃ )CH ₂ -S-S-CH ₂ -CH (CH ₂ Phe) CONHCH ₂ COOCH ₂ Phe

A partir de 2,2 g du composé précédent, on obtient dans les conditions de l'exemple 1, étape 2, 3,07 g (82 %) du produit attendu. Rf (cyclohexane/EtOAc/AcOH = 7/3/0,5) =0,52. Etape 3 Préparation du produit final

A partir de 3 g du composé précédent, on obtient dans les conditions de l'exemple 1, étape 3, 1,99 g du composé attendu (Rdt 78 %) - Rf (CH ₂ Cl ₂ /MeOH = 9/1) = 0,38. Exemple 10

Préparation de H,N-CHfCH,CH,SfO^CH^-CH*.-S-S-CH,-CHfCH,Phe)- CONHCH-*-COOCH->Phe

Ce composé est obtenu à partir du composé final de l'exemple 9, protégé sur la fonction a iné (étape 2). L'oxydation dans les conditions de l'exemple 9 conduit au suifoxyde correspondant (Rdt 45 %) Rf (cyclohexane/EtoAc/ =

AcOH = 7/3/0,5) = 0,30.

Le traitement par TFA (conditions de l'exemple 1, étape 3) libère le composé attendu. Rf (CH ₂ Cl ₂ /MeOH = 7/3) 0,35 ( Rdt 80 %) . Exemple 11

Préparation du H,N-CH(CH,SCH,Phe^CH,S-S-CH,CHfCH,Phe^-CONHCH,- COOCH,Phe

Etape 1 Préparation du t-Boc-NHCH( CH ₂ SCH ₂ Phe

A partir de 1 , 48 g de N-t-Boc amino-2-mercapto-l- benzylthio-3 propane, on obtient dans les conditions de l'exemple 1, étape 18, 1,3 g (Rdt 68 %) du produit attendu.

Rf (cyclohexane/Et OAc : 7/3) = 0,31.

Etape 2 Préparation de t-Boc NH-CH(CH ₂ SCH ₂ Phe)CH ₂ -S-S-CH ₂ -CH

(CH ₂ Phe)CONH-CH ₂ -COO-CH ₂ Phe

A partir de 1,38 g du composé précédent, on obtient les conditions de l'exemple 1 étape 2 1,73 g (Rdt 80 %) du composé attendu. Rf (cyclohexane/EtOAc/AcOH = 7/3/0,5) =

0,55.

Etape 3 Préparation du composé final

A partir de 1,7 g du composé précédent, on obtient, dans les conditions de l'exemple 1, étape 3, 1,04 g (70 %) du produit attendu. Rdt (CH ₂ Cl ₂ /MeOH ≈ 8/2) ^~~ 0,43.

Exemple 12

Préparation du H,N-CH(CH,SfO^CH,Phe^CH,-S-S-CH-*CHfCH,Phe^-

CONHCH,COOCH,Phe Ce composé est obtenu à partir du composé de l'exemple 11 protégé sur la fonction aminé (étape 2).

L'oxydation dans les conditions de l'exemple 8 conduit au suifoxyde correspondant Rdt (70 %) Rf (cyclohexane/EtOAc/

AcOH = 7/3/0,5) = 0,32 Le traitement par le TFA (exemple 1, étape 3) libère le composé attendu Rf (CH ₂ Cl ₂ /MeOH = 7/3) = 0,48 (Rdt 82 %).

Exemple 13

Préparation du H,NCHfCH,CH,SCH- _< )CH- _> S-S-CH,CH(CH,CHfCH, 1-

CONHCH (CH-* \COOCH,Phe 1,7 g du disulfure mixte pyridine -NBoc méthionine obtenu à l'exemple 5 étape 1, est condensé dans les condi¬ tions de l'exemple 1, étape 2, avec 1,6 g de N(mercap- tométhyl-2-méthyl-4 oxo-1 pentyl) alaninate de benzyle. On obtient 1,94 g (Rdt 70 %) du composé final protégé sur la fonction aminé. Rf (cyclohexane/EtOAc/AcOH = 7/3/0,5) = 0,41.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

Le traitement par le TFA (exemple 1, étape 3) libère le composé final attendu (1,35 g) (Rdt 83 %) Rf (CH ₂ Cl ₂ /MeOH = 8/2) 0,51. Exemple 14 Préparation du H ₇ NCHfCH?CH,Sf0 CH-* CH*>SSCH*.CHfCH,CH( CH* ) -, ) - CONHCH (CH-, )COOCH-.Phe

Le composé de l'exemple 13 protégé sur la fonction aminé est oxydé dans les conditions décrites pour 1'exemple 8. Après déprotection par le TFA (exemple 1, étape 3), on obtient l'inhibiteur attendu. Rdt global 60 %. Rf (CH ₂ C1 ₂ / MeOH = 8/2) = 0,36. Exemple 15

Préparation du H,N-CHfCH,SCH CH,S-S-CH,CH-fCH,CHfCH -, -CONH¬ CH (CH-* ^* )CO0CH,Phe 1,65 g du disulfure mixte pyridine/NBoc S-méthylcys- téine thiol (exemple 9, étape 1) est condensé dans les condi¬ tions de l'exemple 1 étape 2 avec 1,6 g de N(mercapto-méthyl- 2-méthyl-4 oxo-1 pentyl) alaninate de benzyle. On obtient 1,89 g (Rdt 70 %) du composé protégé sur la fonction aminé. Rf (cyclohexane/EtOAc/AcOH = 7/3/0,5) = 0,45.

Le traitement par le TFA (exemple 3 étape 1) libère le composé final (1,32 g) (Rdt 82 %) Rf (CH ₂ Cl ₂ /MeOH : 8/2) = 0,60. Exemple 16 Préparation du H->N-CH(CH-S(O^CH CH-.S-S-CH,CH-fCH,CH(CH, ^* ι•>~ι- CONHCH (CH-* λCOOCHiPhe

Le composé de l'exemple 15 protégé sur la fonction aminé est oxydé dans les conditions décrites pour l'exemple 8. Après déprotection par le TFA (exemple 1, étape 3) on obtient le composé final attendu. Rdt global 55 %. Rf (CH ₂ Cl ₂ /MeOH : 8/2) = 0,38 Exemple 17

Préparation du H,NCHfCH,SCH,PheTCH,S-S-CH,CH-fCH,CHfCHO,t-CONH¬ CH(CH-. COOCHiPhe Le disulfure mixte pyridine / tBoc (S - benzyl)

FEUILLE DE REMPLACEMENT

cystéinethiol (exemple 11, étape 7) (1 g) est condensé dans les conditions de l'exemple 1, étape 2, avec 1,07 g de (mercapto méthyl-2 méthyl-4 oxo-1-pentyl)-alaninate de benzyle. On obtient 1,34 g (Rdt 65 %) du composé final protégé sur la fonction aminé. Rf (cyclohexane/EtOAc/AcOH = 7/3/0,5) = 0,42. Le traitement par le TFA (exemple étape 3) libère le composé final (0,99 g) (Rdt 86 %) Rf (CH ₂ C1 ₂ / MeOH = 8/2) = 0,35. Exemple 18 Préparation du H-.N-CHfCH,Sf0 )CH,Phe )CH,S-S-CH,CH- (CH,CH (CH,), ) - CONHCH (CH, )COOCH,Phe

Le composé final de l'exemple 17 protégé sur la fonction aminé est oxydé dans les conditions décrites pour l'exemple 8. Après déprotection par le TFA (exemple 1, étape 3), on obtient le composé final attendu. Rdt global (73 %) Rf (CH ₂ Cl ₂ /MeOH = 7/3) ≈ 0,52. Exemple 19

Préparation du H,N-CHfCH7StBu1CH,S-S-CH,CH-(CH,CHfCH-* , -CONH¬ CH (CH COOCH,Phe A partir de 0,93 g de t Boc-S-t.butyl cystéine¬ thiol, on obtient dans les conditions de l'exemple 1, étape 1, 1,06 g (Rdt 80 %) de disulfure mixte pyridine, tBoc(StBu) cystéinethiol. Ce composé est ensuite condensé dans les conditions de l'exemple 1 étape 2 avec 0,86 g de N(mercapto- méthyl-2 méthyl-4 oxo-1 pentyl) alaninate de benzyle. On obtient 1,19 g du composé final protégé (Rdt 75 %). Rf (cyclohexane/EtOAc/AcOH = 7/3/0,5) ≈ 0,31. Le traitement par le TFA libère le composé final (0,84 g) (Rdt 85 %) Rf (CH ₂ Cl ₂ /MeOH = 7/3) = 0,38. Exemple 20

Préparation du H,N-CH(CH,SfQ^tBu^CH,S-S-CH,CH-fCH,CH(CH-* ^* )-* ) - CONHCHfCH-- )COOCHïPhe

Le composé de l'exemple 19 protégé sur la fonction aminé est oxydé dans les conditions décrites pour l'exemple 8. Après déprotection par le TFA (exemple 1 étape 3) on

FEUILLE DE REMPLACEMENT

obtient le composé final attendu. (Rdt global 68 %) Rf (CH ₂ Cl ₂ /MeOH = 7/3) = 0,30. Exemple 21

Préparation du H,NCHfCH-*CH,SŒ CH,-S-S-CH ₇ -CH-(CH,CH,SCHι)- CONHCHfCH, )COOCH,Phe

1,71 g du disulfure mixte pyridine/tBoc méthionine- thiol (exemple 5, étape 1) est condensé dans les conditions de l'exemple 1 étape 2 avec 1,70 g de N(mercapto-méthyl-2- méthylmercaρto-4 oxo-1 butyl) alaninate de benzyle. On obtient 2,1 g (72 %) du composé final protégé sur la fonction aminé. Rf (cyclohexane/EtOAc/AcOH = 7/3/0,5) 0,58. Le traitement par le TFA. (exemple 1, étape 3) libère le composé final (1,18 g) (Rdt 68 %) Rf (CH ₂ Cl ₂ /MeOH : 7/3) :0,42. Exemple 22 Préparation du H,N-CH(CH,CH,S(O^CH CH _? -S-S-CH--CHfCH--CH-*SfO - CH, )CONHCH (CH, 'COOCH,Phe

Le composé final de l'exemple 21 protégé sur la fonction aminé est oxydé dans les conditions décrites pour l'exemple 8. Après déprotection par le TFA (exemple 1, étape 3), on obtient le composé final attendu. Rdt global 56 %. Exemple 23

Préparation du H,NCH(CH,CH,SCH- CH,-S-S-CH*.-CH(CH,Phe^CONH-CH- (Phe )CH,COOCH,Phe

1,19 g du disulfure mixte pyridine N-Boc méthionine- thiol (exemple 5, étape 1) est condensé dans les conditions de l'exemple 1 étape 2 avec 1,44 g de N(mercaptométhyl-2 phényl-3 oxo-1 propyl)-3-phényl béta-alaninate de benzyle. On obtient 1,59 g (Rdt 70 %) du composé final protégé sur la fonction aminé. Rf (cyclohexane/EtOAc/AcOH = 7/3/0,5) : 0,28. Le traitement par le TFA (exemple 1, étape 3) libère le composé final (1,15 g) (Rdt 85 %) Rf (CH ₂ Cl ₂ /MeOH : 7/3) = 0,60.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

Exemple 24

Préparation du H-*NCHrCH,CH?S(Q^CH^CH,-S-S-CH--CHtCH,Phe)CONH

CH (Phe )CH ₇ COQCH,Phe

Le composé final de l'exemple 23 protégé sur la fonction aminé est oxydé dans les conditions décrites pour 1'exemple 8. Après déprotection par le TFA (exemple 1, étape 3), on obtient le composé final attendu. (Rdt global 58 %). Rf (CH ₂ Cl ₂ /MeOH : 7/3) = 0,25. Exemple 25 Préparation du H,NCHfCH,CH,SCH, CH,-S-S-CH,-CHfCH,Phe^ CONH-pH CH COOCHïPhe

0,895 g du disulfure mixte pyridine N-Boc méthioni- ne thiol (exemple 5 étape 1) est condensé dans les conditions de l'exemple 1 étape 2 avec 1,027 g de N(mercapto-méthyl-2- phényl-3-oxo-l-propyl)-amino-2-cyclohexyl-carbo-xylate de benzyle. On obtient 1,12 g (Rdt 68 %) du composé final protégé sur la fonction aminé. Rf (cyclohexane/EtOAc/AcOH = 7/3/0,5) = 0,32. Le traitement par le TFA (exemple 1, étape 3) libère le composé final (0,78 g) (Rdt 82 %) Rf (CH ₂ C1 ₂ /- MeOH : 7/3) : 0,63. Exemple 26

Préparation du H,NCHfCH,CH,S(O^CH,'ιCH.-S-S-CH,CHfCH,Phe^

l'exemple 25 protégé sur la fonction aminé est oxydé dans les conditions décrites dans l'exemple 8. Après déprotection par le TFA (exemple 1, étape

3), on obtient le composé attendu. Rdt global 62 %. Rf

(CH ₂ Cl ₂ /MeOH : 8/2) : 0,28.

Exemple 27 Préparation du H,N-CHfCH,CH,SCH -CH,-S-S-CH,-CH(CH,CH,SCH,)

CONH-CHfPhe )-CH,-COOCH,Phe

1,1 g du disul ure mixte pyridine N-Boc méthionine thiol (exemple 5, étape 1) sont condensés dans les conditions

FEUILLE DE REMPLACEMENT

de l'exemple 1 étape 2 avec 1,39 g de N(mercaptométhyl-2- méthyl mercapto-4-oxo-l-butyl)-amino-3-phényl-3 propanoate de benzyle. On obtient 1,44 g (Rdt 65 %) du composé final protégé sur la fonction aminé. Rf (cyclohexane/EtOAc/AcOH = 7/3/0,5) = 0,42. Le traitement par le TFA (exemple 1, étape 3) libère le composé final (1,01 g) (Rdt 85 %) Rf (CH ₂ C1 ₂ / MeOH : 7/3) : 0,72. Exemple 28

Préparation du H,N-CHfCH,CH,S(0)CH CH,-S-S-CH,-CHfCH,CH,- Sf0 )CH, )CONH-CH (Phe )-CH ₇ -C00CH,Phe

Le composé final de l'exemple 27 protégé sur la fonction a iné est oxydé dans les conditions de 1'exemple 4. Après déprotection par le TFA (exemple 1, étape 3), on obtient le composé attendu. Rdt global 53 %. Rf (CH ₂ C1 ₂ / MeOH : 8/2) : 0,35. Exemple 29

Préparation de H,N-CH(CH,CH,SCH,)CH-,-S-S-CH,-CHfCH,CH,SCH, CONH-CHfCH,Phe )CH,-COOCH,Phe

0,83 g du disulfure mixte pyridine N-Boc méthionine- thiol (exemple 5 étape 1) est condensé dans les conditions de l'exemple 1 étape 2 avec 1,07 g de N(mercaptométhyl-2- éthyl mercapto-4-oxo-l-butyl)-amino-3-phényl-4 butanoate de benzyle. On obtient 1,22 g (72 %) du composé final protégé sur la fonction aminé. Rf (cyclohexane/EtOAc/AcOH = 7/3/0,5) = 0,41. Le traitement par le TFA (exemple 1, étape 3) libère le composé final (0,79 g) (Rdt 72 %) Rf (CH ₂ Cl ₂ /MeOH : 7/3): 0,70.

Exemple 30

Préparation de H,N-CH(CH _? Sf0 CH -CH,-S-S-CH7-CH(CH ₇ CH,Sf0 CH,) CONH-CH (CH,Phe )-CH,-C00CH,Phe

Le composé final de l'exemple 29 protégé sur la fonction a iné est oxydé dans les conditions de l'exemple 8.

Après déprotection par le TFA (exemple 1 étape 3)on obtient le composé attendu. Rdt global 68 %. Rf (CH ₂ C1 ₂ / MeOH : 8/2) : 0,33.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

Exemple 31

Préparation de H?N-CH f CH,CH,SCHQ CH7-S-S-CH,-CH f CH7CH7SCH

CONH t-CHZJ CH - CQOCH,Phe

0,95 g du disulfure mixte pyridine N-Boc méthionine- thiol (exemple 5 étape 1) est condensé dans les conditions de l'exemple 1 étape 2 avec 1,13 g de N(mercaptométhyl-2- méthyl mercapto-4-oxo-l-butyl)-amino-2-cyclohexyle carboxyla- te de benzyle. On obtient 1,43 g (78 %) du composé final protégé sur la fonction a iné. Rf (cyclohexane/EtOAc/AcOH = 7/3/0,5) = 0,39. Le traitement par le TFA (exemple 1, étape 3) libère le composé final (0,88 g) (Rdt 75 %) Rf (CH ₂ C1 ₂ / MeOH : 7/3) : 0,65. Exemple 32 Préparation du H7N-CH(CH,CH,Sf0 CH CH7-S-S-CH,-CH(CH7CH7-

Le composé protégé sur la fonction aminé de l'exem¬ ple 31 est oxydé dans les conditions de l'exemple 8. Après déprotection par le TFA (exemple 1 étape 3) on obtient le composé attendu. Rdt global 58 %. Rf (CH ₂ C1 ₂ / MeOH : 8/2) : 0,30.

Exemple 33

Le composé protégé sur la fonction aminé de l'exe - pie 5, étape 1, est condensé sur le N-morpholinyl (isopropyl- méthyl)-3-mercapto-propanamide dans les conditions de l'exemple 5, étape 2. Le composé obtenu est alors oxydé par le périodate de sodium puis est déprotégé par l'acide trifluoro-acétique dans les conditions de l'exemple 8 pour conduire au composé final. Rendement global: 62 %. Rf

(CH ₂ Cl ₂ /MeOH = 8/2) = 0,12.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

Exemple 34 Activité bioloσiσue des composés selon 1'invention L'activité biologique concerne l'inhibition de 1'aminopeptidase M et de l'endopeptidase neutre purifiées. 1°) Inhibition in vitro des activités enkephalinasi- ques. a) pouvoir inhibiteur sur 1'endopeptidase neutre Le pouvoir inhibiteur est déterminé sur de l'endo¬ peptidase neutre purifiée du rein de lapin en suivant le protocole décrit dans la littérature (Blumberg et al. Life Sci. (1981) 2JB_, 301). Après une préincubation de 15 minutes à 25°C, un aliquot de protéines est incubé pendant 20 minutes à 25°C en présence de 20 nmoles de ( ³ H)D-Ala ² -Leu ⁵ -enkephaline et du composé à tester en solution dans le tampon tris HC1 (pH 7,4) en présence de dithiothreitol DTT (100 équivalents par rapport à l'inhibiteur). On arrête la réaction par addition d'HCl 0,2 N. Le métabolite tritié ( ³ H)-Tyr-D-Ala- Gly est séparé de la D-Ala ² -Leu ⁵ -enkephaline par chromatogra¬ phie sur colonne de Porapak et la quantité formée mesurée à l'aide d'un compteur à scintillation liquide. b) Pouvoir inhibiteur sur l'aminopeptidase N

Le pouvoir inhibiteur est mesuré sur 1' minopepti¬ dase purifié du rein de porc (Boehringer, France). Le dosage est conduit de manière identique au précédent en utilisant la ( ³ H)-Leu ⁵ -enképhaline comme substrat. Le métabolite formé ( ³ H) Tyr est séparé par chromatographie sur colonne de Porapak et la quantité formée mesurée à l'aide d'un compteur à scintil¬ lation liquide.

L'activité des différents composés est exprimée en concentrations inhibitrices à 50 % (IC ₅₀ ) et les résultats sont résumés dans le Tableau II.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

Des pouvoirs inhibiteurs identiques sont obtenus sur ces deux enzymes après incubation des composés avec des fractions membranaires de cerveau de rat, à la place du Dithiothreitol.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

2°) Inhibition "in vivo" de la NEP cérébrale On compare l'activité enzymatique de la NEP céré¬ brale chez la souris traitée ou non traitée par une dose donnée de composé (environ 2,5 mg/kg injecté par voir iv). Les animaux sont sacrifiés à des temps variables après l'injection de l'inhibiteur et l'activité NEP est déterminée dans le cerveau par mesure de la dégradation de la ( H) DAla - Leu ⁵ enképhaline.

Pour le composé final de l'exemple 1, injecté à la dose de 2,7 ,umole/kg (47,6 μg dans 100 μl) , on obtient les résultats suivants : temps % inhibition NEP cérébrale

15' (n = 4) 96 ± 9

60' (n = 4) 68 ± 4 120' (n = 4) 63 + 2

180' (n = 4) 42 ± 16

Pour le composé final de l'exemple 7, on obtient dans les mêmes conditions : temps % inhibition NEP cérébrale 60' (n = 4) 96 + 5

120' (n = 5) 96 ± 4

180' (n = 5) 92 ± 4

Exemple 35 Etude pharmacoloσiσue des composés a) Toxicité aiguë La détermination de la mortalité chez la souris est observée à la suite de l'administration unique par voie intraveineuse de doses croissantes des composés à tester. La DL50 pour tous les composés étudiés est supérieure à 100 mg/kg i.v. b) Activité antalgique

1°) Test de la plaque chaude : Il concerne le réflexe de léchement et de saut de la souris sur une plaque chauffée à 55°C selon la méthode de Jacob et al. (Arch. Int. Pharmacodyn. 122 287. 1959 ; 1961).

FEUILLE DE REMPLACEMENT

1.1. Administrée par voie i.v. (100 μl dans la veine de la queue) chez la souris, les composés testés présentent un effet propre à la fois sur le temps de latence du saut et sur celui des léchements. Ces effets sont antagonisés par la naloxone (0,5 mg/kg s.c).

Les résultats sont exprimés dans le Tableau III en % d'analgésie. Le pourcentage d'analgésie s'exprime pour chaque dose de composé testé par la relation :

(temps de latence - temps de latence mesuré témoin) % analgésie =

(temps de latence temps de latence maximum témoi )

TABLEAU III Composés 50 % analgésie 50 % analgésie

Composé final de l'exemple 1 4 mg/kg 20 mg/kg Composé final de l'exemple 5 2,5 mg/kg 10 mg/kg Composé final de l'exemple 7 5 mg/kg 15 mg/kg Composé final de l'exemple 8 2,5 mg/kg 10 mg/kg Composé final de l'exemple 22 4,5 mg/kg 25 mg/kg

Composé final de l'exemple 26 8 mg/kg 30 mg/kg Composé final de l'exemple 28 4 mg/kg 15 mg/kg Composé final de l'exemple 30 3 mg/kg 15 mg/kg Composé final de l'exemple 32 2 mg/kg 10 mg/kg

FEUILLE DE REMPLACEMENT

1.2 Administrés par voie i.p. chez la souris, les composés testés présentent un effet propre sur les temps de retenue du saut et des léchements. Ces effets sont antagoni¬ sés par la naloxone (0,5 mg/kg). Les résultats sont exprimés en ED 50

Composé de l'exemple 1 10 mg/kg

Composé de l'exemple 5 7 mg/kg

Composé de l'exemple 7 8 mg/kg

Composé de l'exemple 22 6 mg/kg Composé de l'exemple 32 5,5 mg/kg

2°) Essai sur les crampes abdominales

(Hendershot et Forsaith. J. Pharmacol. (1975), 125, 237) : Ce test mesure le nombre de crampes induites par injection de 100 μl d'une solution à 0,02 % de phénylbenzoquinone par voie i.p. Le nombre de crampes est compté pendant 10 minutes, 10 minutes après l'injection. Administrés par voie i.v. les composés diminuent le nombre de crampes. dose % analgésie Composé final de l'exemple 1 1 mg/kg 24,6 % +.8 Composé final de l'exemple 1 3 mg/kg 46,9 % ± 7,9 Composé final de l'exemple 1 9 mg/kg 73,1 % +_ 8,2 Composé final de l'exemple 7 2,5 mg/kg 32 % ± 4 Composé final de l'exemple 7 5 mg/kg 68 % ± 9 Composé final de l'exemple 7 10 mg/kg 95 % ± 4

3°) Essai sur le retrait de la σueue chez le rat :

(tail flick test) : Administrés par voie i.v. chez le rat, les composés selon l'invention produisent un allongement significatif du temps de retrait de la queue. Ces effets sont antagonisés par la naloxone (0,5 mg/kg s.c).

Les résultats sont exprimés en % d'analgésie pour une même dose (10 mg/kg) de tous les composés testés.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

% d'analgésie

Composé de l'exemple 1 20 %

Composé de l'exemple 5 25 %

Composé de l'exemple 7 42 % Composé de l'exemple 32 36 %

c) Potentialisation des effets comportementaux fhvperactivité locomotriceT induits par les composés selon l'invention après traitement chronigue aux antidépresseurs : Les composés selon l'invention induisent, 1 h après administration i.v. ou p.o. chez le rat, une augmentation de l'activité locomotrice. Cet effet est considérablement augmenté après traitement chronique par des neuroleptiques tel le sulpiride (100 mg/kg) i.p. chaque jour). Cette potentialisation n'apparaît que trois semaines après le début du traitement par les neuroleptiques. Les résultats montrent une augmentation de la concentration en enképhalines endogè¬ nes, en accord avec les résultats obtenus avec la morphine par Stinus et Coll. (psychoparmacology, J35., 323, (1985).

Résultats* Activité locomotrice** rat témoin*** 100 % rat traité par le composé de l'exemple 5 i.v. (5 mg/kg) 400 % rat traité par le composé de l'exemple 7 i.v. (3 mg/kg) 400 % rat traité par le composé de l'exemple 30 i.v. (2 mg/kg) 350 % rat traité par le composé de l'exemple 30 i.v. (20 mg/kg) 370 %

* après trois semaines de traitement chronique au sulpiride ** mesurée par le nombre de redressements

*** correspond aux animaux traités chroniquement par le sulpiride, mais n'ayant pas reçu d'inhibiteur.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

d) Test du "désespoir" chez la souris Ce test décrit par Porsolt et call. (Arch. Int. Pharmacodyn. Ther, 229, 327, (1977), permet d'évaluer les propriétés antidépressives des composés revendiqués. Les souris sont traitées par des doses croissantes de composés trente minutes avant le test et l'immobilité des animaux est mesurée par rapport à des témoins qui perçoivent seulement le véhicule. Le temps d'immobilité est diminué par les composés selon l'invention et cet effet est antagonisé par la naxolone (0,5 mg/kg s.c).

Résultats Temps d'immobilité (s) témoins 165 ± 15 souris traitée par composé ex. 5

( 5 mg/kg i.p.) 108 +_ 12* souris traitée par composé ex. 30

( 2 mg/kg i.p. ) 96 + 8*

(20 mg/kg p.o.) 101 + 10*

* p < 0,01. e) Etude des effets de tolérance et de dépendance induits par administration chronique du composé de l'exemple 8 : 1) Le composé 8 est administré quatre fois par 24 heures à la dose de 5 mg/kg par voie s.c. durant 6 jours à des souris et à 10 mg/kg à des rats. La morphine (chlorhydrate) est administrée dans les mêmes conditions (0,5 mg/kg chez la souris, 2 mg/kg chez le rat). Les animaux témoins reçoivent uniquement le véhi¬ cule.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

souris/morphine 100 ± 10 60 + 10 0 rat/morphine 70 + 12 20 + 3 0 souris/composé 8 100 ± 10 100 + 8 70 ± 15 rat/composé 8 40 + 5 40 ± 5 30 + 7 rat/composé 7 100 + 10 100 + 8 80 + 10

2) Après traitement chronique durant 6 jours, dans les conditions décrites précédemment, les rats subissent une injection de 2 mg/kg de naxolone par voie s.c. Les signes du syndrome d'abstinence sont mesurés selon Cowan et al. (J.

Pharmacol. Exp. Ther. (1988) 246, 950).

Par rapport à la morphine, le traitement chronique avec le composé 8 engendre des effets de dépendance très faibles illustrés par l'absence de sauts, l'absence de baisse de température, l'absence de perte de poils qui sont les signes les plus sévères de la crise d'assuétude.

3) L'injection i.v. du composé 7 à un animal (souris ou rat) tolérant à la morphine conduit à une réponse analgé¬ sique identique à celle obtenue chez un animal témoin. Ceci démontre l'absence de tolérance croisée entre la morphine et le composé 7.

L'invention a d'autre part pour objet des procédés de traitement de la dépression et de la douleur dans lesquels on administre des quantités efficaces d'au moins un des composés précédemment décrits au sujet à traiter. Les voies d'administration convenant auxdits procédés sont celles usuelles pour ces types de traitement, en particulier intraveineuse, per os, sous-cutanée ou intrapéritonéale.

FEUILLE DE REMPLACEMENT