Neue Chimäre Antikörper, deren Verwendung und Verfahren zu ihrer Herstellung

Beschreibung

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Immunologie und be- trifft Chimäre Antikörper und ihre Verwendung bei der Diagnostik. Inbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Chimäre Antikörper, welche aus einem ersten Antikörper bzw. Immunglobulin und einem zweiten Antikörper bzw. Immunglo¬ bulin zusammengesetzt sind, wobei die besagten Antikörper bzw. Immunglobuli- ne von einander verschiedenen Ursprungs sind. Derartige Chimäre Antikörper können als diagnostische Mittel in einem sehr breiten Bereich auf dem serologi¬ sch-immunologischen Gebiet eingesetzt werden. Die besagten Chimären Anti¬ körper per se und ihre Bereitstellung, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in immundiagnostischen Verfahren und Assays werden beschrie¬ ben.

Stand der Technik

Aus dem Stand der Technik sind verschiedene, aus Teilen unterschiedlicher Her- kunft zusammengesetzte, Chimäre oder über Linkermoleküle heterokonjugierte Chimäre Antikörper bekannt. Ferner sind immunologische Verfahren bekannt, um Antikörper zu bestimmen

In der Arbeit von MORRISON, S. L. et al. ₍ Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81_. 6851 - 6855, 1984, werden chimäre Maus-Human Antikörper beschrieben, bei denen Gene der variablen Region einer Maus mit Genen der konstanten Region vom menschlichen Immunglobulin verbunden wurden. Derartige, durch DNA Rekom¬ bination hergestellte chimäre Antikörper sollen klinische Anwendung finden und es wird vorgeschlagen, diese als immuntherapeutische und diagnostische Rea- gentien zu verwenden. Insbesondere sollen derartige humanisierte chimäre Anti¬ körper das Auftreten von Immunogenitäten von in vivo verwendeter Antikörper zu verringern.

SHARON J. et al., Nature 309. 364 - 367, 1984, offenbaren die Expression ei¬ nes Chimären Genes, welches für die variable (V) Region der schweren Kette der Maus und die konstante (C) Region einer K leichten Kette (VHC _K ) kodiert. Das chimäre Gen konnte in einer Mäuse Myeloma Zellinie zu Expression gebracht werden

In der Publikation von SHIN U.-S., Biotherapy 3, 43 - 53, 1991 , werden Strate¬ gien für die Herstellung von Chimären Antikörpern beschrieben, wobei von ge¬ nomischen, cDNA oder PCR amplifizierten Klonen ausgegangen wird. Die gene- tisch veränderten Immunglobuline werden nach Gentransfektion in Immunglobu¬ lin nicht-produzierenden Myelomazellen oder Transfektomas exprimiert.

Von MOCIKAT R. et al., Biotechniques 12(3), 355 - 356, 1992, wird ein PCR Verfahren offenbart für die Herstellung von Chimären Antikörpern, welches die Klonierung von V - Gensegmenten umfaßt

In dem jüngst erschienenen Übersichtsartikel von LEON J. A. et al., Pharmac. Ther. 61, 237 - 278, 1994, werden monoklonalen Antikörpern eine hohe Bedeu¬ tung als wichtige Reagentien inter alia in der Diagnose eingeräumt. Hinsichtlich der in dieser Arbeit offenbarten Chimären Antikörper werden ausschließlich sol¬ che beschrieben, die eine Kombination muriner VDJ Regionen der schweren Kette und VD Regionen der leichten Kette mit Humanen H und L konstanten Ketten umfassen. Oder solche, die mittels "complementarity determining regions (CDR) grafting" humanisiert worden sind, indem H und L hypervariable Regionen (CDR) der Maus mit konstanten Regionen des Menschen kombiniert wurden.

In der Publikation von BRENNAN, M. et al., Science 229. 81 - 83, 1985, wird die Herstellung bispezifischer Antikörper durch chemische Rekombination monoklonaler Immunglobulin G-| Fragmente offenbart, wonach von zwei ver- schiedenen F(ab'>2 Fragmenten mit 2-Mercaptoethylamin in Gegenwart von Na- triumarsenit und Ellman's Reagenz Fab'-TNB Derivate hergestellt und von diesen durch Reduktion Fab'-Thiole gebildet werden und anschließend die entsprechen¬ den Hybrid-Dimeren durch Reoxidation gewonnen werden.

PEREZ, P. et al, Nature 316. 354 - 356, 1985, offenbaren über den Linker N- succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat verbundene Antikörperheterokonju- gate, wobei verschiedene OKT3 (anti-T3) enthaltende Antikörperheterokonjugate humanem Ursprungs verbunden wurden mit dem Effekt einer besseren Zielwir-

kung auf Zelloberflächenantigene, indem die T _c Zeil Spezifitäten durch Behand¬ lung mit derartigen Antikörperheteroaggregaten verändert werden.

Ähnliche Antikörperheteroaggregate werden von TITUS, J. A., J. Immunology, 138, 4018 - 4022, 1987, beschrieben. In diesem Fall wurden humane periphere Blut T Zellen gecoated mit einem Heteroaggregat, bestehend aus einen anti- T3(Fab) verbunden mit einem humanen antitumor monoklonalen Antikörper, wobei eine erhöhte Antitumorwirkung festgestellt wurde.

Die Verwendung von heterokonjugierten Antikörpern, CD3-spezifische oder FcR- spezifische monoklonale Antikörper kovalent verbunden mit Herpes Simplex Vi¬ rus (HSV) spezifischen monoklonalen Antikörper zur Induktion von T Lympho- zyten und NK Zellen zur spezifischen Lyse von HSV-infizierten Zellen wird von PAYA, C. V. et al., J. Immunol. 142. 666- 671 , 1989, beschrieben.

CHARPIE, J. R. et al., Biochemistry 29, 6374 - 8378, 1990, beschreiben einen bispezifischen Antikörper bestehend aus einem monoklonalen Antikörper gegen einen Teil der ß-Kette von humanem Fibrin kovalent über einen Linker verbunden mit einem monoklonalen Antikörper gegen die zweikettige Urokinase des Men- sehen.

Von GÖRÖG, G. et al., J. Immunol. Methods 123. 131 - 140, 1989, ist ein homogener Enzymimmunoassay bekannt, welcher chemisch hybridisierte Antikörperhälften nach der Methode von BRENNAN, 1985, loc. cit., verwendet.

Von MARTINEK, K. & TORCHILIN, V. P„ Methods in Enzymology 137, 615 - 626, 1988, ist bekannt, daß intramolekulares Cross-Linking mittels bifunktioneller Reagentien die Thermostabilität von Enzymen erhöhen. Die Auto¬ ren spekulieren, daß ein solches Cross-Linking den ersten Schritt eines Thermo- inaktivierungsprozesses, die Dissoziation oligomerer Enzyme in ihre Untereinhei¬ ten, verhindern könnte.

MAN, N. et al., J. Immunol Methods 125, 251 - 259, 1989, beschreiben die Herstellung von polykonalen und monoklonalen Antikörper durch Verwendung eines Glutaraldehyd-aggregierten Immunogens. Es wird unter anderem speku¬ liert, ob durch dieses Crosslinking eine stabilisierende Wirkung auf die native Konformation des betreffenden Immunogens hervorgerufen wird.

MILSTEIN, C. und CUELLO, A. C, Nature 305, 537 - 540, 1983, offenbaren Hybridimmunoglobuline bzw. bispezifische monoklonale Antikörper, welche durch Fusion von zwei Antikörper produzierenden Zellen (Hybrid-Hybridomas) erzeugt wurden.

In den letzten zehn Jahren ist eine Anzahl an Patentliteratur auf dem Gebiet chimärer Antikörper erschienen, die sich molekularbiologischer Methoden be¬ dient, um über die Technik der DNA Rekombination und Produktion heterologer Proteine chimäre Antikörper mit veränderten Domänen bereitzustellen.

Aus der WO86/01 533 sind chimäre Antikörper bekannt, bei denen die konstan¬ ten Domänen eines nicht-humanen Antikörpers (beispielsweise von Maus oder von der Ratte) durch konstante Domänen des Menschen ersetzt worden sind.

In der WO92/05274 werden Antikörper beschrieben, bei denen die CDRs (complementarity determining regions) der variablen Domäne der Antikörperket¬ te von einer ersten Säugetierspezies stammen und der "framework"-Bereich der variablen und der konstanten Domäne von einem zweiten unterschiedlichen Säugetierspezies. Ein derartig veränderter Antikörper soll entweder die Struktur eines natürlichen Antikörper oder eines Fragments davon haben oder er kann auch chimär sein, indem er eine Antigenbindungsstelle und eine nicht-immuno- globulin Region enthält.

Der EP-A 0 125 023 ist die Herstellung eines Chimären Immunglobulins zu ent- nehmen, dessen konstante Region aus einem ersten Säugetier stammt und des¬ sen variable Region homolog zu einer zweiten, differenten Säugetierspecies ist.

Die Europäische Patentanmeldung EP-A 0 247 091 schlägt zur Herstellung ge¬ netisch veränderter chimärer Antikörper mit einer konstanten Region des Men- sehen und einer variablen nicht-Human Region vor, eine cDNA, die für die voll¬ ständige variable nicht-Human Domäne kodiert mit einem Vektor, der die geneti¬ sche Information für die konstante Region enthält, zu verbinden.

Die EP-A 0 378 175 offenbart die Verwendung von Chimären monoklonalen An- tikörpern oder Fragmenten davon, die aus humanen Antikörpern bestehen, bei denen die variable Region ganz oder teilweise durch die entsprechenden Teile eines nicht-humanen monoklonalen Antikörpers der gewünschten Spezifität er¬ setzt sind. Derartige chimäre Antikörper sollen für diagnostische Tests zur quantitativen immunologischen Bestimmung von Substanzen im Blut oder Serum

Verwendung finden. Dies soll insbesondere dadurch erfolgen, daß zwei gegen die zu untersuchende Substanz gerichtete monoklonale Antikörper Ri und R2 verwendet werden, wobei R-j an eine feste Phase gebunden ist und R2 eine Markierung trägt, und mindestens einer der besagten Antikörper ein chimärer Antikörper ist.

Von FOMSGAARD, A. & DINESEN B., J. Immunoassay 8, 333 - 350, 1987, wurde ein kombinierter, aus verschiedenen Schritten aufgebauter ELISA vorge¬ schlagen, um Antikörper nachzuweisen.

Darstellung der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen

Ein typischer Antikörper, beispielsweise vom IgG Typ, besteht aus zwei leichten Polypeptidketten (L-Ketten) und zwei schweren Polypeptidketten (H-Ketten). Diese beiden Ketten sind durch Disulfidbrücken miteinander verbunden. Sowohl die L-Ketten als auch die H-Ketten bestehen aus einer variablen Domäne (VL und VH> am jeweiligen NH3 - Terminus. Die L-Ketten besitzen eine konstante Domä¬ ne (CL), die H-Ketten dagegen weisen drei konstante Domänen auf (C|-|1 bis C|-|3) und zusätzlich eine Gelenkregion, welche Cystein Reste haben. Die SH Gruppen dieser Cystein Reste bilden die -S-S- Bindungen aus, welche die beiden einzelnen Monomere des kompletten Antikörperdimers verbinden. Die Spezifität solch eines Antikörpers liegt grundsätzlich in den hγpervariablen Regionen der variablen Domäne. Dort befindet sich der sogenannte "antigen - binding site". Kommt ein menschlicher oder allgemein tierischer Organismus in Kontakt mit ei- nem für den jeweiligen Organismus als fremd erkannten Angens, beispielsweise einem infektiösen Erreger, werden spezifische Antikörper bzw. Immunglobuline (IgG, IgM, IgA, IgD und/oder IgE) gegen solch ein Agens gebildet.

Neben den direkten Nachweismethoden, die ein Erfassen des jeweiligen infektiö- sen Erregers in Blut, Geweben, Exkrementen oder Sekreten nach Auftreten der ersten Krankheitssymptome voraussetzen, spielt die Diagnose über den verläßli¬ chen Antikörpernachweis eine entscheidende Rolle. In vielen Fällen dürfte der Antikörpernachweis die einzige Möglichkeit einer Infektionsbestimmung oder ei¬ nes Infektionsnachweises darstellen. Dies dürfte insbesondere dann von Bedeu- tung sein, wenn bei der ersten klinischen Manifestationen die Erreger entweder nur kurzfristig oder gar nicht mehr nachweisbar, okkult oder inapparent sind oder die dafür notwendigen Verfahren sich technisch als sehr schwierig oder differentialdiagnostisch als problematisch erweisen. Beispielsweise kann dies der Fall sein bei Borreliosen, Legionellosen, Lues, Treponematosen, Hepatitis A, Ma-

sernviren, Rubellaviren, Meningoenzephalitis, Arboviren, Toxoplasmose, Echino- kokkose, Toxocariasis (Spulwurminfektionen bei Tieren) oder manche Endomy- kosen, um nur einige Beispiele zu nennen.

Es ist von weiterer erheblicher Bedeutung, Infektionen innerhalb eines möglichst kurzen Zeitintervalls zwischen dem Infektionsereignis und dem ersten Auftreten spezifischer Antikörper diagnostisch sicher zu erfassen. Da das Auftreten von insbesondere IgM und IgA auf eine vor kurzer Zeit eingetretenes Infektionser¬ eignis und auf eine akute Infektion hinweisen, kommt insbesondere der Dia- gnostik von Antikörpern der IgM- und der IgA-lsotypen eine besondere Bedeu¬ tung zu.

IgM wird typischerweise unmittelbar dann synthetisiert, wenn der betreffende Organismus einem Antigenstimulus ausgesetzt wird (z.B. durch infektiöse Agen- tien oder Erreger oder Teilen davon). Daher zeigen erhöhte IgM-Spiegel oder IgM-Titer in der Regel eine kurz vorher eingetretene Infektion, eine erfolgte Antigenexposition oder eine Reaktivierung bei Erregerpersistenz (beispielsweise bei Lues oder Toxoplasmose) an. Somit, da IgM Antikörper schon in frühen Infektionsstadien auftreten, folgt notwendigerweise, daß die Identifizierung oder der verläßliche Nachweis über das Vorhandensein von IgM von wesentlicher diagnostischer Bedeutung für das Früherkennen eines Infektionsereignisses oder einer bereits manifesten Infektionskrankheit oder irgendeiner Antigenexposition ist.

Das Auftreten von IgA läßt ebenfalls auf eine akute, wenn auch mehr lokale In¬ fektion schließen. Das meiste IgA kommt in Sekreten (z.B. Tränenflüssigkeit, Speichel, Schweiß, Schleim, Kolostrum) vor und wird in den entsprechenden Orten synthetisiert (Tränendrüsen, Speicheldrüsen, Gastrointestinaltrakt, Mu- kosa, Milchdrüsen der laktierenden Brust). Insofern wird dem IgA eine beson- dere Bedeutung bei der primären immunologischen Abwehr gegen lokale Infek¬ tionen zugesprochen, beispielsweise bei Infektionen des Respirations- und Gastrointestinaltrakts oder allgemein bei lokalen Infektionsereignissen.

Trotz der herausragenden Bedeutung dieser beiden genannten Immunglobulin Isotypen für die rasche und frühe Diagnose von insbesondere akuten Infektions¬ vorgängen, haben die restlichen Immunglobulin Isotypen (insbesondere IgG und IgE) selbstverständlich ebenfalls ihren bekannten Platz in der serologisch¬ immunologischen Diagnostik. Auch in diesen Fällen ist ein verläßlicher Nachweis über das Vorhandensein oder Fehlen der Antikörper von elementarer Bedeutung.

Betreffend bakterielle Infektionen und die daraufhin synthetisierten Antikörper werden zu deren Nachweis hauptsächlich Bakterienagglutination (WIDAL- Reaktion), Komplement-Bindungsreaktion, indirekte Hämagglutination, Latex- Agglutination, Immunfluoreszenz-Test oder Enzymimmunoassay eingesetzt. Je nach dem gewählten Verfahren können diese Tests zwar erregerspezifische An¬ tikörper der Klassen IgG und IgM erkennen (bei einigen Erregern auch IgA, wenn eine systemische Immunantwort in Gang gesetzt wird), zum Teil können sie jedoch nicht sicher oder überhaupt nicht zwischen IgG- und IgM-Antikörpern differenzieren. Bei manchen Erregern, wie beispielsweise solchen der Gattung Treponema (Treponematosen), nämlich Treponema pallidum pallidum (venerische Syphillis), Treponema pallidum endemicum (endemische Syphillis), Treponema pallidum pertenue (Frambiöse) und Treponema carateum (Pinta) ist noch nicht einmal eine serologische Differenzierung untereinander möglich.

Hinsichtlich Virusinfektionen und der aufgrund solcher Infektionen gebildeten Antikörper werden zu deren serologischen Nachweis u. a. die Komplementbin¬ dungsreaktion, der Haemagglutinationshemmtest, der Neutralisationstest, der indirekte Immunfluoreszenztest, die passive Haemagglutination, der Enzym- linked Immunoassay (ELISA, EIA), der Radioimmunassay oder der Immunoblot benutzt. Auch in diesem Fall, wie schon für die bakteriellen Infektionen beschrie¬ ben, spielt der Nachweis von IgM (aber auch von IgA) die entscheidende Rolle zur serologisch-immunologischen Diagnose akuter Infektionen (DOERR, H. W. et al., Infection 15, 93 - 98, 1987; LINDE, G. A. et al. Infect. Immun. 42., 237 - 244, 1983) oder Rubella Infektionen (LINDE, G. A., J. Clin. Microbiol. 21, 117 - 121 , 1985). Die Verläßlichkeit der IgM - Antikörpertests kann von ganz besonderer Bedeutung sein. Beispielsweise kann dies bei Rubella-Infektionen in Betracht kommen, da im Falle positiver Befunde meist eine Interruptio indiziert sein dürfte.

Auch beispielsweise bei retroviralen Infektionen, insbesondere bei solchen, die durch HIV (Human Immunodeficiency Virus) verursacht werden und schwere Erkrankungen mit Schädigungen des Immunsystems hervorrufen, wie insbesondere AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) oder ARC (AIDS - Related Complex), und mit spezifischen Erkrankungen (Tumore und/oder opportunistische Infektionen wie beispielsweise Karposisarkome, Lymphome und/oder Pneumocystis Infektionen) einhergehen, ist die sichere IgM - Diagnostik gleichfalls von großer Bedeutung. Das trifft offenbar insbesondere für solche IgM - Antikörper zu, die niedrigaffin sind (low affinity antibodies) und

beispielsweise Epitope auf dem HIV Tat Protein erkennen. In diesem Zusammenhang sei insbesondere auf die dafür relevante Offenbarung in der WO 93/22349 hingewiesen.

Als weiteres Beispiel spielt der Nachweis von spezifischen IgM-Antikörpern gleichfalls eine wichtige Rolle bei der Diagnose der akuten Cytomegalievirus- Infektion. Zum Nachweis von Cytomegalievirus-spezifischen IgM-Antikörpern wurden bekannte und kommerziell erhältliche IgM-ELISA-Techniken miteinander verglichen (WOLFF, M. H. et al., Ärztl. Lab. 30, 357 - 360, 1984). Hierbei hat es sich gezeigt, daß große Diskrepanzen zwischen den erhaltenen Ergebnissen auftraten, sodaß nicht von einer zuverlässigen IgM-Diagπostik bei Cytomegalievirus-Infektionen gesprochen werden kann.

Auch bei manchen Parasitosen, insbesondere bei Toxoplasmose (z.B. Infektio- nen mit Toxoplasma gondii), kommt dem Nachweis von IgM Antikörpern eine besondere Bedeutung zu, gleichwohl innerhalb der serologischen Diagnostik zu¬ nächst auf spezifische Gesamtimmunglobuline untersucht wird. Bei den meisten Parasiteninfektionen sind zirkulierende Antikörper festzustellen, vornehmlich bei solchen Parasiten, die in einen intensiven Kontakt mit dem Immunsystem treten. In vielen Fällen steht der direkte Nachweis des betreffenden Erregers im Vorder¬ grund einer Parasitendiagnostik. Dies gelingt jedoch nicht immer. So ist es bei Toxoplasma-Infektionen unmöglich, die Erreger direkt nachzuweisen, sodaß in solchen Fällen der serologisch-immunologischen Diagnostik eine entscheidende Bedeutung zukommt.

Insbesondere kommt den quantitativen Enzymimmunoassays auf spezifisches IgG und IgM eine wichtige Funktion zu und wegen seiner diagnostischen Sensi- tivität und Spezifität ist der Enzγmimmunoassay auf spezifisches IgM anderen Testsystemen (z.B. indirekter Immunfluoreszenztest) vorzuziehen. Zum Nach- weis von spezifischen IgM ist auch der Immunsorbent Agglutination Assay (ISAGA) geeignet (SAATHOFF, M.; SEITZ, H.M., Z. Geburtsh. Perinat. 189, 73 - 78, 1985).

Bei Endomykosen, die synonym u.a. auch als systemische Mykosen, Paren- chymmykosen oder tiefe bzw. viszerale Mykosen bezeichnet werden, kommt der Immundiagnostik insofern eine besondere Bedeutung zu, als eine über die Kulti¬ vierung erstrebte Absicherung der Diagnose nicht immer möglich ist, da der In¬ fektionsherd nicht sicher lokalisierbar oder einer Exzision nicht zugänglich ist. Somit kann der Nachweis einer immunologischen Auseinandersetzung des infi-

zierten Organismus mit dem Erreger oftmals das früheste und auch einzige labordiagnostische Anzeichen einer Endomykose sein.

Hinsichtlich ihrer Epidemiologie lassen sich die in Frage kommenden Erreger in zwei Gruppen einteilen: i) in die weltweit verbreitete und auch in Europa häufig vorkommenden Erreger der Gruppe der Candida- Arten, Aspergi/Ius-Arten und Cryptococcus neoformans und ii) in die zweite Gruppe bestehend aus Coccidoi- des immitis, Histop/asma capsu/atum, Blastomyces dermatitis, Paracoccidioides brasiliensis. Obwohl die zweite Gruppe vorwiegend auf den amerikanischen Kontinent beschränkt ist und die durch sie verursachten Endomykosen in Europa relativ selten vorkommen, finden sie in letzter Zeit wegen des intensiveren Fern¬ reiseverkehrs verstärkt Beachtung.

Zur Differenzierung von beispielsweise latenten Candida-Infektionen (transiente Fungämie) von manifesten Candida-Mykosen, ist der Verlauf der IgM-Antikörper im indirekten Immunfluoreszenztest bedeutsam.

Bei Aspergillus-Infektionen ist der Nachweis von entsprechenden Antikörpern in Präzipiationsreaktionen von Bedeutung. Zur Überwachung mykosegefährdeter Patienten erscheint der indirekte Hämagglutinationstest als besonders geeignet, da er empfindlich auf IgM-Antikörper reagiert.

Obwohl demzufolge seit Jahren die serologisch-immunologische Diagnostik mit Nachweis der jeweiligen Antikörper eine breite Anwendung insbesondere bei infektiösen Erkrankungen der verschiedensten Art findet und dafür eine Anzahl Assays und serologische Testkits entwickelt und zur Verfügung stehen, sind diese vielfach wegen ihrer niedrigen Spezifität und ihres geringen Vorhersage¬ wertes nicht sehr zuverlässig (HOEK, F.J. et al., J. Clin. Microbiol. 30, 1525 - 1528, 1992). Auf der anderen Seite wurden eine Reihe an Verfahren entwickelt, die viele Schritte umfassen, technisch und zeitlich sehr aufwendig und zudem teuer sind. Dies gilt sowohl für diagnostische Verfahren bei bakteriellen Infektionen (HOEK, F. J. et al. 1992, loc. cit.; LIM, P. L. & KO, K. H., J. Immunol. Methods 135. 9 - 14, 1990) als auch bei Virusinfektionen (MAYO, D. R., et al., J. Clin. Micro¬ biol. 29, 2865 - 2867, 1991 ).

Bis in jüngster Zeit wurden Verfahren vorgeschlagen, mit dem Ziel, eine zuver¬ lässige Diagnostik auf Basis eines Antikörpernachweises bereitzustellen. Solche Verfahren dürften jedoch aufgrund ihres technischen, materiellen und/oder zeit¬ lichen Aufwandes wenig praktikabel sein oder sie machen eine schnelle und un-

komplizierte Handhabung unmöglich. Es wurde beispielsweise ein kombinierter ELISA vorgeschlagen, der jedoch aus verschiedenen Schritten aufgebaut ist (Coating, Waschen, Plasmainkubation, Inkubation Peroxidase-markierter Anti¬ körper, erneutes Waschen, Messung der Enzymaktivität) und zudem einen ver- gleichsweise aufwendigen technischen und apparativen Aufwand benötigt (FOMSGAARD, A. & DINESEN, B., 1987, loc. cit.). Für eine schnelle diagnosti¬ sche Verwendung ist ein solches Verfahren nicht geeignet und das bestehende Problem einer fehlenden Immunglobulin-Kontrolle wird dadurch ebenfalls nicht gelöst, wie auch nicht durch die anderen oben beschriebenen diagnostischen Verfahren.

Aber selbst die Verwendung modernerer und aufwendigerer Enzym-Immunoas- says für Antikörper konnten die Probleme der Standardisierung bei der Antikör¬ perbestimmung bisher nicht lösen. So wird es allgemein als großer Nachteil be- schrieben, daß nur sehr begrenzt Referenzpräparationen zur Verfügung stehen, die eine Kontrolle und ein Vergleich der erhaltenen Resultate, insbesondere zwi¬ schen verschiedenen Laboratorien, schwierig oder unmöglich gestalten und eher zur Konfusion beitragen (MALVANO, R. et al., In: Methods of enzymatic analy- sis, Bergmeyer, H. U., ed., VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1986, S. 2 - 10)

Als ein jedoch sehr gravierender Nachteil bei allen bisher bekannten Verfahren zur Immundiagnostik stellt sich häufig das Fehlen eines Kontrollserums oder eines spezifischen standardisierten Produkts (IgX - Kontrolle) heraus. Die daraus entstehende Hauptproblematik eines mangelhaft sicheren Nachweises von bei¬ spielsweise IgG oder IgM Antikörpern und völlig unzureichenden, da nicht ver¬ gleichbaren, quantitativen Ergebnissen (MALVANO, R. et al. In: Bergmeyer, H.U., Ed., Methods of enzymatic analysis. Vol X, 2 - 10, 1986), läßt keine zuverlässige Immundiagnostik bei Infektionen, beispielsweise bakterieller Art, zu (HILL, H. R. & MATSEN, J. M., J. Infect. Dis. 147, 258 - 263, 1983).

Ein ganz besonderer Nachteil liegt allen bekannten serologisch-immunologischen Diagnoseverfahren insofern zugrunde, als daß es nicht oder nur sehr unzurei¬ chend möglich ist, das jeweils verwendete Testsystem hinsichtlich seiner tat¬ sächlichen Zuverlässigkeit und seines Funktionierens zu überprüfen, wenn ins- besondere ein negatives Ergebnis erhalten wurde. Ein negatives Ergebnis wäre in diesem Sinne, wenn kein IgX, beispielsweise ein IgM, nachgewiesen werden konnte, mit dem daraus gezogenen - möglicherweise falschen und daraufhin fatalen - diagnostischen Schlußfolgerungen. In den meisten Fällen steht zu wenig oder gar kein als positives Kontrollserum geeignetes Patientenserum zur

Verfügung, insbesondere bei akuten Infektionsereignissen, sodaß zu Kontrollzwecken nicht auf Patientenseren zurückgegriffen werden kann.

Ein weiterer Nachteil bei den bisher benutzen und verfügbaren Verfahren ist die relative Instabilität der für die immundiagnostischen Tests zu verwendeten Anti¬ körper bzw. Antikörperpräparationen, insbesondere von solchen, die IgM Anti¬ körper betreffen. Dieser allgemein bekannte Nachteil der Instabilität von Antikörperpräparationen liegt insbesondere darin, daß beispielsweise IgM bei niedrigen Temparaturen ( + 4°C) und selbst in gefrorenem Zustand rasch abgebaut wird.

Sowohl die aus je einem Antikörpermolekül bestehenden und insbesondere durch gentechnische Maßnahmen veränderte und hergestellte Chimären Antikörper als auch die bisher beschriebenen durch Linkermolekülen verbundenen Antikörperkonjugate sind nicht in der Lage, die bestehenden und oben beschriebenen Nachteile zu beseitigen

Demzufolge besteht ein dringendes und nach wie vor unbefriedigtes Bedürfnis an einem Mittel für die zuverlässige serologisch-immunologische Diagnostik, welches ein sicheres und schnelles Diagnostizieren und Nachprüfen von durch die bekannten Diagnoseassays erhaltenen Resultaten. Insbesondere von solchen diagnostisch wertvollen Resultaten, die auf der Grundlage des Nachweises von Immunglobulinen bzw. Antikörpern beruhen, welche von infektiösen Agentien viralen, prokaryotischen und eukarγotischen Ursprungs abstammen, sowohl im Rahmen von Routinebestimmungen als auch bei komplexeren und technisch aufwendigen Immunoassaγs.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die im Stand der Technik auftreten¬ den Probleme bei der serologisch-immunologischen Diagnostik zu lösen und die dargelegten Nachteile zu beseitigen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch chimäre Antikörper gemäß Anspruch 1 , die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie aus einem ersten nicht¬ humanen Immunglobulin und einem zweiten humanen Immunglobulin bestehen, wobei beide Immunglobuline kovalent miteinander verbunden sind und in diesem Sinn ein Heterodimer bilden gemäß der allgemeinen Formel Y1-Z-Y2, worin Y- _| ein erstes Immunglobulin der allgemeinen Formel IgX ist und nicht-humanen Ur¬ sprungs ist und worin X für G, M, A, E oder D und deren Isotypen steht, Z eine direkte oder indirekte kovalente Bindung bedeutet und Y2 ein zweites

Immunglobulin der allgemeinen Formel IgX und humanen Ursprungs ist, wobei X die oben beschriebenen Bedeutung hat.

Demzufolge werden in der vorliegenden Erfindung chimäre Antikörper beschrie- ben und bereitgestellt, bestehend aus einem ersten Immunglobulin, welches aus einem nicht-humanem Säugetierorganismus stammt und einem zweiten Immunglobulin, welches menschlichen Ursprungs ist, wobei das erste Immunglobulin mit dem zweiten Immunglobulin kovalent, direkt oder indirekt, gemäß der allgemeinen Formel Y-|-Z-Y ₂ , worin Y-| das besagte erste Immunglo- bulin und Y ₂ das besagte zweite Immunglobulin bedeutet und Z für eine kova¬ lente Bindung steht, miteinander verbunden sind. Die betreffenden ersten und zweiten Immunglobuline Y- _| und Y ₂ sind Immunglobuline der IgX-Klasse, in der X die Bedeutung von G, M, A, D, oder E hat. Die erfindungsgemäßen Chimären Antikörper finden in der Diagnostik Verwendung und eignen sich in vorteilhafter Weise als diagnostisches Mittel und zur Absicherung von Ergebnissen bei der serologisch-immunologischen Bestimmung oder Diagnose von durch apathogene und pathogene Agentien hervorgerufene Infektionen, insbesondere bei der dia¬ gnostischen Bestimmung von infektiösen Erkrankungen bzw. beim Nachweis von Antikörpern in Seren oder anderen Körperflüssigkeiten oder Geweben eines Säugetierorganisnπus', die aufgrund einer immunogenen oder antigenen Stimula¬ tion in dem betroffenen Säugetierorganismus einschließlich des Menschen gebil¬ det werden.

In seiner allgemeinsten Ausführungsform lassen sich die erfindungsgemäßen Chimären Antikörper in vorteilhafter Weise zur Absicherung von Resultaten bei der Diagnose oder Bestimmung bzw. beim Nachweis von solchen Immunglobuli¬ nen bzw. Antikörpern verwenden, die aufgrund einer Reaktion eines Säugetier- organismus' mit einem Immunogen oder Antigen gebildet werden. Die erfin¬ dungsgemäßen Chimären Antikörper können auch selbst in vorteilhafter Weise zur serologisch-immunologischen Diagnostik zum Zwecke der Bestimmung und des Nachweises der genannten Immunglobuline bzw. Antikörper verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen Chimären Antikörper lassen sich somit in vorteilhafter Weise bei der serologisch-immunologischen Diagnostik von solchen Infektionen verwenden, die durch virale, prokaryotische oder eukaryotische Strukturen, Zel¬ len oder Organismen, insbesondere durch Bakterien, Viren, Mykosen (Endomykosen) oder Parasiten (Parasitosen), verursacht werden.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Chimären Antikörper kann nach den be¬ kannten Methoden zur Gewinnung von hybriden Proteinen erfolgen, welche proteinchemische oder gentechnische Methoden oder linkertechnologische Ver¬ fahren umfassen. Bevorzugt wird die Verwendung von Linkermolekülen.

Speziellere Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Antikörper, deren Verwen¬ dung und Verfahren zu deren Herstellung sind gemäß den weiteren Unteran¬ sprüchen und den verschiedenen Anspruchskategorien aufgezeigt.

Vorteilhafterweise wird die Aufgabe durch einen Chimären Antikörper der allgemeinen Formel Y-|-Z-Y ₂ gelöst, in dem Y< _| ein hochaffines IgX mit bekannter Spezifität ist und Y ₂ ein IgX mit unbekannter und von Y- _j verschiedener Spezifität ist, wobei X und Z die oben angegebene Bedeutung hat.

Bevorzugt werden jedoch solche chimäre Antikörper, worin gemäß der allgemeinen Formel Y-|-Z-Y ₂ mit der vorgenannten Definition der Term Z die Bedeutung einer indirekten kovalenten Bindung hat.

Noch bevorzugter werden solche chimäre Antikörper gemäß der allgemeinen Formel Y-ι-Z-Y ₂ mit der vorgenannten Definition, bei denen Z ein Linkermolekül ist, sodaß das besagte erste Immunglobulin Y- _j mit dem besagten zweiten Immunglobulin Y über Linkermoleküle miteinander kovalent verbunden ist.

Ganz bevorzugt sind solche chimäre Antikörper gemäß der allgemeinen Formel Y Z-Y ₂ mit der vorgenannten Definition, bei denen das humane Immunglobulin Y ₂ ein IgM ist, welches über das Linkermolekül Z kovalent mit dem spezifischen nicht-humanen Immunglobulin Y- _| mit der Bedeutung IgX, verbunden ist.

Ganz besonders bevorzugt sind solche chimäre Antikörper gemäß der allgemeinen Formel Y-|-Z-Y ₂ mit der vorgenannten Definition, bei denen Y- _| Spezifität gegen Spirochaeten, insbesondere der Gattungen Borrelia oder Treponema besitzt.

Überraschenderweise hat es sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Chimären Antikörper bei der serologisch-immunologischen Diagnostik als wertvolles Mittel zum zuverlässigen Überprüfen von negativen Ergebnissen bzw. zum Ausschluß von falsch-negativen Ergebnissen bei beliebigen Diagnoseassays, die zum Zweck eines Antikörpernachweises angewandt werden, besonders geeignet sind. Ein mit diesen Vorteil eng verbundene Eigenschaft der erfindungsgemäßen Chimären

Antikörper gemäß der allgemeinen Formel Y Z-Y liegt offensichtlich darin, daß Y- _j als Antigen-spezifisches IgX wirkt, da es aus einem mit einer interessierenden spezifischen immunogenen Sustanz immunisierten Tier abstammt und somit diese immunogene Substanz als Reaktionspartner erkennt, während Y ₂ ein aus dem Menschen stammendes IgX ist und von einem anti-lgX erkannt wird, wobei X für Y- _| und Y ₂ die oben angegebene Bedeutung bzw. die weiter unten dargelegte Definition für "Immunglobuline" bzw. "Antikörper" hat. Insofern können die erfindungsgemäßen Chimären Antikörper als Ersatz für ein spezifisches humanes IgX, beispielsweise IgM, wenn Y ₂ = IgM ist, angesehen werden, wonach Yi[i _g G]"Z-Y2[lgM] einen spezifischen humanen IgM-Antikörper simuliert mit den genannten unerwarteten Eigenschaften. Demzufolge kann mit einem erfingungsgemäßen Chimären Antikörper der allgemeinen Formel Y- _| -Z-Y ₂ ein Immunoassay überprüft werden, in dem beispielsweise ein mit einem Enzym oder einem Fluoreszenzmarker verbundenes anti-lgX, beispielsweise anti-lgM, woran das zu diagnostizierende IgX, beispielsweise IgM, binden soll, durch ei¬ nen der erfindungsgemäßen Antikörper der allgemeinen Formel Y- _| -Z-Y ₂ , bei¬ spielsweise Yi[i ₈ G]-Z-Y2[igM]- ersetzt wird.

Als weiterer Vorteil hat es sich herausgestellt, daß die erfindungsgemäßen chi- mären Antikörper stabiler sind als die herkömmlichen Immunglobulin-Präparatio- nen, insofern sie eine höhere Haltbarkeit aufweisen und noch nach monatelan¬ ger Lagerung in der Kälte keine Beeinträchtigung in ihrer Funktion als diagnosti¬ sches Mittel zeigen. In der Regel sind Immunglobuline, insbesondere IgM, trotz Aufbewahrung in der Kälte einem proteolytischen Abbau ausgesetzt, der keine Aufbewahrung über einen längeren Zeitraum als ein bis zwei Wochen gestattet. Die Ursache dieses festgestellten Vorteils, insbesondere bei solchen Chimären Antikörpern, bei denen Z in der allgemeinen Formel Y- _| -Z-Y ₂ die Bedeutung eines Linkermoleküls hat, ist nicht genau bekannt.

Ferner liegt ein zusätzlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Chimären Antikörper darin, daß große Mengen an einem für die serologisch-immunologische Diagno¬ stik wichtigen Mittel im homogener Form zur Verfügung gestellt werden kann, welches nunmehr in vergleichbarer Qualität und mit vergleichbaren Eigenschaf¬ ten vorliegt.

Neben diesen vorteilhaften und überraschenden Effekten besitzen die erfin¬ dungsgemäßen Chimären Antikörper außerdem eine bessere Bindungsfähigkeit. Diese Bindungsfähigkeit der erfindungsgemäßen Chimären Antikörper wird hauptsächlich dadurch bedingt, weil sie aus einem hoch affinen IgX, entsprechend Y- _j in der allgemeinen Formel Y- _| -Z-Y ₂ , bestehen.

Die erfindungsgemäßen Chimären Antikörper können bei allen bekannten sero¬ logisch-immunologischen diagnostischen Verfahren verwendet werden. Eine be¬ vorzugte Verwendung liegt bei solchen immundiagnostischen Verfahren, bei de- nen die gewünschten Reaktionen auf Basis von IgM beruhen, da in diesen Fällen eine vor kurzem eingetretene Antigenexposition oder ein akutes Infektionsereig¬ nis angezeigt wird und weil hierbei ganz besonders deutlich die Nachteile des Fehlens einer Immunglobulin-Kontrolle (kein IgM-Kontrollserum, kein standardi¬ siertes Produkt) bzw. das Auftreten fehlerhafter, nicht vergleichbarer Tester- gebnisse und Befunde zu Tage treten und falsch-negative Ergebnisse besonders schwerwiegende Folgen für den betreffenden Patienten haben können.

Insbesondere eignen sich die erfindungsgemäßen Chimären Antikörper bei Im¬ munfluoreszenztests, beispielsweise direkter OFT) oder indirekter Immunfluores- zenztest (IIFT); Enzymimmunoassays (EIA); Agglutinationstests, wie beispiels¬ weise Agglutinationshemmtest, Immunsorbent Agglutination Assay (ISAGA); Radioimmunassays (RIA); Immunoradiometrischer Assay (IRMA), Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), μ-capture-Assay; Enzym Membran Immuno As¬ say (EMIA); Immuno Enzymo-Metric-Assay (IEMA); Double Antibody Liquid Phase- Assay (DALP-Technik):; Fluoreszenzimmunoassay (FIA), beispielsweise homogener Fluoreszenzimunoassay, Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay, Fluoreszenz-Enhancement-Immunoassay, Fluoreszenz Quenching Immunoassay, Fluoreszenz Excitation Transfer Immunoassay (FETIA), Substrate Labelled Fluo- rescent Immunoassay (SLIFA), Heterogener Fluoreszenz Immunoassay, Im- munofluorometrischer Assay (IFMA), Time Resolved Fluorescence Immunoassay (TR-FIA); Lumineszenzimmunoassay, beispielsweise Chemilumineszenz Immuno Assay (CELIA), Solid Phase Antigen Luminescence Technique (SPALT), Immuno- luminometrischer Assay (ILMA), Immunoluminometric Labelled Second-antibody Assay (ILSA); Immunoblot bzw. Western blotting oder Dot-blot Techniken. Es soll an dieser Stelle hervorgehoben werden, daß die oben beispielhaft aufge¬ zählten und für die Verwendung der erfindungsgemäßen Chimären Antikörper geeigneten Verfahren nicht vollständig sind und auch nicht sein müssen, da der¬ artige Verfahren, die der serologisch-immunologischen Diagnostik zur Verfügung stehen und die auf Basis von Immunglobulinen bzw. Antikörpern beiten, dem Fachmann bekannt sind. Überdies sind derartige Verfahren und Techniken in der Literatur vielfältig beschrieben, beispielsweise von BAUER, S., Lab. Med. 3, 50, 1979 (Immunfluoreszenztechniken); DWENGER, A., J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22, 883 - 894, 1984 (RIA); ADDISON, G. M. & HALES, C. N., In: Kirkham, K .E., Hunts, W.M. eds., Radioimmunoassay methods, Livingstone,

Edinburgh, 595, 1971 (IRMA); OELLERICH, M., J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22, 895 - 904, 1984 und MIYAI, K., Adv. Clin. Chem. 24, 61 - 1 10, 1985 und LINKE, R., Mitt. Dt. Ges. Klin. Chem., 1986, 291 (EIA); HEMMILÄ, I., Clin. Chem. 31, 359 - 370, 1985 und WISSER, H., GIT-Labormedizin 1985, 89 (FIA); WEEKS, I. et al. Clin. Science 70, 403 - .408, 1986 und GADOW, A. et al., J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22, 337 - 347, 1984 und WOOD, W.G. et al., J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22, 349 - 356, 1984 (Lumineszenzimmunoassay); BURNETTE, W.N., Anal. Biochem. 112, 195 - 203, 1981 , (Western blotting), DESMONTS, G. et al., J. Clin. Microbiol. 14, 486 - 491 , 1981 (ISAGA).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform finden die erfingungsgemäßen Chimären Antikörper Verwendung bei Immunoassays auf Basis von ELISA und Western blotting.

In einer ganz bevorzugten Ausführungsform finden die erfindungsgemäßen Chi¬ mären Antikörper Verwendung beim indirekten Immunfluoreszenztest (IIFT).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher nicht nur die erfindungsge¬ mäßen Chimären Antikörper gemäß Anspruch 1 und seinen näheren Ausgestal- tungen gemäß der weiteren Ansprüche dieser Kategorie, sondern auch die Ver¬ wendung dieser Chimären Antikörper in immundiagnostischen Verfahren und Assays, daß heißt im Rahmen der beschriebenen und dem Fachmann bekannten serologisch-immunologischen Testsysteme, Verfahren und Assays, sowie Ver¬ fahren zu ihrer Herstellung. Darüberhinaus umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Überprüfung eines immundiagnostischen Verfahrens oder eines Immunoassays unter Verwendung eines der erfindungsgemäßen Chimären Anti¬ körpers, wobei nicht nur einzelne Antikörper verwendet werden können, son¬ dern auch in Kombination miteinander, sowie diagnostische Mittel, enthaltend mindestens einen der erfindungsgemäßen Chimären Antikörper.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung sind unter dem Begriff "Immunglobuline" oder synonym dafür "Antikörper", die für Y-j und Y2 stehen, mono- und zumin¬ dest bispezifische bivalente bzw. polyvalente, poly- und monoklonale Antikörper zu verstehen, insbesondere der Isotypen IgG (lgG _{1 r} lgG ₂ , lgG ₃ , lgG ₄ ), IgM, IgA, IgE und IgD und deren Unterklassen und Derivate davon, aber auch solche, die Fragmente davon darstellen und Derivate davon, einschließlich solcher, die die idiotypische Region des Antikörpermoleküls enthalten, insbesondere solche, die die Fv-Region enthalten, beispielsweise die F(ab>2 und Fab Fragmente, aber auch a priori chimäre Antikörper oder Hybridantikörper mit mindestens zwei

Antigen- bzw. Epitopbindungsstellen, oder bispezifische rekombinante Antikörper (beispielsweise Quadrome, Triome), anti-idiotypische Antikörper und solche davon, die chemisch modifiziert wurden und als Derivate dieser Antikörper zu verstehen sind und die entweder über DNA-Rekombination, mittels Hybridomatechnik oder Antikörper-Engineering oder synthetisch oder semisynthetisch nach an sich bekannten Verfahren herstellbar sind und die be¬ kannten und beschriebenen Neutralisations-, Agglutinations-, Bindungs- und Re¬ aktionseigenschaften hinsichtlich der dem Fachmann bekannten und beschrie¬ benen Methoden der serologisch-immunologischen Diagnostik aufweisen. Aus der vielfältigen Literatur über die Gewinnung von Antikörpern und Derivaten davon sei nur beispielhaft hingewiesen auf Arbeiten von KÖHLER, G. & MILSTEIN, C, Nature 256, 495 - 497,1975; BIOCCA, S. et al., EMBO J. 9, 101

- 108, 1990; BIRD, R. E. et al. Science 242, 423 - 426, 1988; BOSS, M. A. et al. Nucl. Acids Res. 12, 3791 - 3806, 1984; BOULIANNE, G. L. et al., Nature 3_1_2, 643 - 646, 1984; BUKOVSKY, J. & KENNETT, R. H., Hybridoma 6, 219 - 228, 1987; DIANO, M. et al., Anal. Biochem. 166, 223 - 229, 1987; HUSTON, J. S. et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 5879 - 5883, 1988; JONES, P. T. et al., Nature 321, 522 - 525, 1986; LANGONE, J. J. & VUKANIS, H. V. (Hrsg), Methods Enzymol. 121 . Academic Press, London, 1987; MORRISON, S. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 6851 - 6855, 1984; OI, V. T. & MORRISON, S. L., BioTechniques 4, 214 - 221 , 1986; RIECHMANN, L. et al., Nature 332. 323

- 327, 1988; TRAMONTANO, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 6736 - 6740, 1986; WOOD, C. R. et al., Nature 314, 446 - 449, 1985; BRILES, D. E. & KEARNEY, J. F., Methods in Enzymology 1 16. 174 - 189, 1985. Mitumfaßt sind auch humanisierte Antikörper oder CDR-grafted Antikörper, bei¬ spielsweise gemäß GÜSSOW, D. & SEEMANN, G., Methods in Enzymology 203, 99 - 121 , 1991 , oder gemäß EP-A 0239 400, WO 92/05274 oder WO 92/15683.

Hinsichtlich der Herstellung von vorzugsweise solchen polyklonalen Antikörpern, die die Komponente Y- _| in der allgemeinen Formel Y- _| -Z-Y ₂ darstellen, stehen ebenfalls eine Anzahl bekannter Verfahren zur Verfügung. Es können z.B. für diesen Zweck in an sich bekannter Weise verschiedene Tiere durch Injektion mit einem geeigneten bzw. gewünschten Antigen, weiches natürlichen Ursprungs, über DNA-Rekombination oder synthetisch bzw. semisynthetisch hergestellt sein kann, oder Teilen davon, immunisiert werden und aus den danach gewonnenen Seren bzw. Blutproben die gewünschten polyklonalen Antikörper nach an sich bekannten Methoden gewonnen und gereinigt werden. Bevorzugte Antigene sind solche, die von Viren, Prokaryonten und Eukaryonten abstammen bzw.

solche darstellen. Die Methoden der Herstellung polyklonaler Antikörper beispielsweise über Immunisierung eines Tieres sind dem Fachmann bekannt und sind beispielsweise beschrieben in "Practical Immunology", Hudson, L. & Hay F. C. (eds.), Third Edition, Blackwell Scientific Publications, 1989. Als Alternative können auch intakte Zellen benutzt werden. Verschiedene Adju- vantien zur Erhöhung der gewünschten Immunantwort auf die Antigen Exposi¬ tion können, abhängig von dem für die Immunisierung ausgewählten Tier, ebenfalls verwendet werden - beispielsweise Freund's Adjuvant, Mineralgele wie z.B. Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie z.B. Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Hemocyanine, Dinitrophenol oder Lysolecthin.

Die monoklonalen Antikörper, aus denen die erfindungsgemäßen Chimären Anti¬ körper zusammengesetzt sein können, können durch jede beliebige, bekannte Technik erhalten werden, die für die Herstellung von Antikörpern über Kultivie- rung von Zellinien zur Verfügung stehen. Zu derartigen bekannten Techniken zählen beispielsweise die von KÖHLER, G. & MILSTEIN C, 1975, Joe. dt., oder TAGGART & SAMLOF, Science 219. 1228 - 1230, 1983, beschriebenen Ver¬ fahren mit Hybridomazellen oder solche mit B Zeil Hybridomen (KOZBOR et al. Immunology Today 4, 72 - 79, 1983) oder mittels Hybrid Hybridoma (TAKAHASHI, M et al., Methods in Enzymology, 203, 312 - 327, 1991 ).

Aber auch über DNA-Rekombination hergestellte Antikörper (sog. Engineered Antibodies) werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung mitumfaßt, bei¬ spielsweise solche, die nach den beschriebenen Verfahren gemäß COLOMA, M. J. et al., J. Immunol. Methods 152. 89 - 104, 1992; "Methods in Enzymology" 178. 1989 oder EP-A 0 125 023 produziert werden können.

Die nach den bekannten Verfahren herstellbaren und für die erfindungsgemäßen Chimären Antikörper verwendbaren Antikörper können nach bekannten Metho¬ den gereinigt werden, beispielsweise über Fällung, Gelfiltration, ionenaustausch- Chromatographie, Immunoabsorptionschromatographie, Immunoaffinitätschro- matographie, HPLC (High Performance Liquid Chromatography) oder Kombina¬ tionen davon. Antikörperfragmente, welche den Idiotyp des Moleküls enthalten, können gleichermaßen nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispiels¬ weise können F(ab')2 Fragmente durch Pepsin Verdauung des vollständigen poly- oder monoklonalen Antikörpers erhalten werden. Fab Fragmente können erhalten werden, indem beispielsweise die Disulfidbrücken des betreffenden F(ab')2 Fragments reduziert werden und Fab Fragmente können gewonnen wer¬ den beispielsweise durch Behandlung der Antikörpermoleküle mit Papain und

gegebenenfalls einem Reduktionsmittel. Derartige Verfahren sind dem Fachmann bekannt und gehören zum Stand der Technik.

Unter dem Begriff "chimäre Antikörper" wird im Rahmen der vorliegenden Erfin- düng gemäß der allgemeinen Formel Y- _| -Z-Y eine Konstruktion verstanden, die aus mindestens zwei intakten Antikörpern besteht, die genuinen Ursprungs sein können oder durch technische Maßnahmen, wie oben beschrieben, manipuliert oder verändert sein können, durch kovalente Bindungen gemäß der allgemeinen Formel Y- _| -Z-Y ₂ miteinander verbunden sind und ein Hybrid oder Konjugat bzw. Heterodimer bilden, worin ein erster Antikörper Y- _| nicht-humanem Ursprungs und mit bekannter Spezifität und ein anderer zweiter Antikörper Y ₂ humanem Ursprungs mit unbekannter oder mit einer von Y- _| verschiedenen Spezifität ist. Darunter fallen aber auch solche Konstruktionen, worin in der allgemeinen For¬ mel Y _r Z-Y ₂ die Symbole Y< _| und Y ₂ auch Antikörperfragmente, einschließlich solcher, die die idiotγpische Region eines Antikörpermoleküls enthalten, insbesondere die Fv-Region, wie beispielsweise F(ab'>2 oder Fab, bedeuten können, wenn Z ein Linkermolekül oder eine S-S - Bindung ist.

Unter "indirekt" oder "direkt" "kovalent" miteinander verbundenen ersten und zweiten Antikörpern bzw. unter "indirekter" oder "direkter" "kovalenter Bin¬ dung" gemäß der Definition von Z in der allgemeinen Formel Y- _| -Z-Y ₂ ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verstehen, daß zwei Antikörper über in¬ termolekulare Bindungen direkt, beispielsweise über S-S - Bindungen, oder indi¬ rekt, beispielsweise über Linkermoleküle, miteinander verbunden sind.

Hinsichtlich der bevorzugten erfindungsgemäßen Chimären Antikörper, die durch ein Linkermolekül miteinander kovalent verbunden sind, sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle dem Fachmann bekannten Moleküle oder "Crosslinkers" oder "Cross-Linking-Reagents" zu verstehen, mit denen minde- stens zwei gleiche oder verschiedene Proteine oder Peptide nach an sich be¬ kannten Methoden miteinander kovalent verbunden werden können, wobei unter dem Begriff "Crosslinkers" oder "Cross-Linking-Reagents" solche Moleküle mit den genannten Eigenschaften verstanden werden, welche funktioneile Gruppen enthalten, die an Aminosäureresten in Proteinen und Peptiden binden. Demzu- folge werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle Crosslinker bzw. Cross- Linking-Reagentien umfaßt, die intermolekulare kovalente Bindungen zwischen zwei Proteinen oder Teilen davon erzeugen können. Im weiteren wird daher nur noch von "Verbindungsmolekülen" gesprochen, wenn von derartigen Crosslin- kern oder Cross-Linking-Reagentien die Rede ist.

Erfindungsgemäß bevorzugt werden insbesondere solche Verbindungsmoleküle, deren reaktive Gruppen gleich (homobifunktionelle Verbindungsmoleküle) oder verschieden (heterobifunktionelle Verbindungsmoleküle) sind.

Aus der Gruppe der homobifunktionellen Verbindungsmoleküle kommen solche in Betracht, die vorzugsweise mit primären Aminen (aminreaktiv) oder mit Sulf- hydrylgruppen (thiolreaktiv) reagieren, beispielsweise Imidoester bzw. Malei- mide, Alkylhalide, Arylhalide, α-Haloacyle, Pyridyldisulfide.

Bei den heterobifunktionellen Verbindungsmolekülen, die mindestens zwei ver¬ schiedene reaktive Gruppen besitzen, sind insbesondere solche geeignet, die ei¬ ne aminoreaktive funktionelle Gruppe an einem Ende und eine sulfhydrylreaktive Gruppe am anderen Ende besitzen, beispielsweise solche, die als eine erste Gruppe eine N-hydroxysuccinimidester Gruppe und als eine zweite funktionelle Gruppe eine Maleimidgruppe besitzen.

Aber auch solche heterobifunktionelle Verbindungsmoleküle kommen in Be¬ tracht, die mit Carboxylgruppen reagieren, beispielsweise mit Glutaminsäure¬ oder Asparaginsäureresten als Reaktanten. Beispielsweise seien Carbodiimide genannt.

Darüberhinaus sind aber auch die bekannten photoreaktiven Verbindungsmoleküle geeignet, welche eine funktionelle photoaffine Gruppe aufweisen, die erst durch Exposition mit UV-Licht oder anderer sichbarer Strah¬ lung (Photonen) reaktiv werden, beispielsweise aromatische Azide (Arylazide) oder Benzophenone, welche mit Aminen, Sulfhydrylen, Carbohydraten und Car- bonylen reagieren.

Beispielsweise eignen sich für die Herstellung der erfindungsgemäßen Chimären

Antikörper die folgenden Verbindungsmoleküle: Dithiθ-t ⁾ ts(succinimidylpropionat),

3,3'-Dithio_->/s(sulfosuccinimidylpropionat),

Bis(sulfosuccinimidyl)suberat,

Disuccinimidylsuberat,

Disuccinimidyltartrat, Disulfosuccinimidyltartrat,

Ethylenglycol-t>/s(sulfosuccinimidylsuccinat),

-9/s[2-(succinimidooxycarbonyloxy)ethyl]sulfon,

-3/s[2-(sulfosuccinimidooxycarbonyloxy)ethyl]sulfon,

Ethylenglycolά/s(succinimidylsuccinat),

-S/smaleimidohexan,

1 ,5-Difluoro-2,4-dinitrobenzol,

Dimethyladipimidat,

Dimethylpimelimidat, Dimethylsuberimidat,

Dimethyl 3,3'-dithio£/spropionimidat,

/V-Hydroxysulfosuccinimid,

1 -Etyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimid,

4-succinimidyloxycarbonyl-α-methyl-α(2-pyridyldithio)-t oluol, ΛΛsuccinimiyl3-(2-pyridyldithio)propionat,

Sulfosuccinimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoat,

Succinimidyl6-[3-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoat,

Sulfosuccinimidyl4-(Λ -maleimidomethyl)cyclohexan-1 -carboxylat,

Succinimidyl4-(/V-maleimidomethyl)cyclohexan- 1 -carboxylat, Sulfosuccinimidyl 2-(7-azido-4-methylcoumarin-3-acetamid)ethyl-1 ,3'-dithioprop- ionat,

Sulfosuccinimidyl7-azido-4-methylcoumarin-3-acetat,

Sulfosuccinimidyl6-[α-methyl-α-(2-pyridyldithio)toluami do]hexanoat,

1 ,4-Di-[3'-(2'-pyridyldithio)propionamido]butan, *77-Maleimidobenzoyl-/v'-hydroxysuccinimidester, 77-Maleimidobenzoyl- V-hydroxysuldosuccinimidester,

/V-Succinimidyl(4-iodoecetyl)aminobenzoat,

Sulfosuccinimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoat,

Succinimidyl4-( -maleimidophenyl)butyrat, Sulfosuccinimidyl4-(p-maleimidophenyl)butγrat,

Azidobenzoyl Hydrazid,

/V-Hydroxysuccinimidyl-4-azidosalicylsäure,

Sulfosuccinimidyl 2-(p-azidosalicylamido)ethyl-1 ,3'-dithiopropionat,

/V-[4-( ₍ o-azidosalicylamido)butyl]-3 ^, (2 ^, -pyridyldithio)propionamid, -5/s-[ß-(4-azidosalicylamido)ethyl]disulfid,

Λ -hydroxysuccinimidyl-4-azidobenzoat,

/V-Succinimidyl-6(4'-azido-2'-nitrophenyl-amino)hexanoat,

Sulfosuccinimidyl-6(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoat , p-Azidophenylglyoxalmonohydrat, Λ/-5-Azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimid,

Sulfosuccinimidγl2-(/77-azido-o-nitrobenzamido)-ethyl-1 ,3'dithiopropionat, p-Nitrophenyl-2-diazo-3-3-3-trifluoropropionat,

Sulfosuccinimidyl(4-azidophenyldithio)propionat),

/V-Succinimidyl(4-azidophenyl) 1 ,3'-dithiopropionate,

/V-Hydroxysulfosuccinimidyl4-azidobenzoat,

Sulfosuccinimidyl4-(p-azidophenyl)butyrat,

1 -(p-Azidosalicylamido)-4-(iodoacetamido)butan,

4-( -Azidosalicylamido)butylamin, Sulfosuccinimidyl 7-azido-4-methylcoumarin-3-acetat,

Sulfosuccinimidyl2-(7-azido-4-methylcoumarin-3-acetamid)e thyl-1 ,3'dithiopropio- nat,

/V-(4-azidobenzoylglycyl)-S-(2-thiopyridyl)cystein,

N,/v"-bis(4-azidobenzoyl)cystine, 2-lminothiolan,

1 -[/v ^, -(2-hydroxy-5-azidobenzoyl)-2-aminoethyl]-4-(Λ/-hydro xysuccinimidyl)- succinat,

/V-[-4-( -azidophenylazo)benzoyl]-3-aminopropyl- v"-oxysulphosuccinimidester,

Ethyl-4-azidophenyl- 1 ,4-dithiobutyrimidat, Λ -(4-azidophenyl)phthalimid,

Glutaraldehyd,

Glutardialdehyd,

Tartryldiazide,

Tartryldi(glycylazide), Tartryldi(ε-aminocaproylazid) oder

/V,/v"-Bis(3-succinimidyloxycarbonyl)tartaramid.

Die Verwendung solcher Verbindungsmoleküle zur Herstellung der erfindungs- gemäßen Chimären Antikörper gestatten somit auch vielfache Markierungsmög¬ lichkeiten der erhaltenen Produkte, wie beispielsweise Radiomarkierungen mit radioaktiven Isotopen zum Beispiel über entsprechende lodierung von beispiels¬ weise 1-(p-Azidosalycylamido)-4-(iodoacetamido)butan oder beispielsweise Fluo¬ reszenzmarkierungen durch Verwendung geeigneter Verbindungsmoleküle, zum Beispiel von Sulfosuccinimidyl7-azido-4-methylcoumarin-3-acetat. Insofern sind auch solche chimäre Antikörper mitumfaßt, die eine Markersubstanz enthalten oder tragen.

Die genannten Verbindungsmoleküle lassen sich nach an sich bekannten Metho- den herstellen und sind kommerziell erhältlich (z.B. bei Pierce Europe B.V., Oud- Beijerland, Holland). Die genannten und weitere für die vorliegende Erfindung geeignete und zu verwendende homo- und heterobifunktionelle Verbindungsmo¬ leküle und deren Anwendungen und Reaktionen mit den reaktiven Gruppen der betreffenden Proteine bzw. Immunglobuline sind ferner individuell beschrieben

von BRINKLEY, M., Bioconjugate Chem., 3, 2 - 13, 1992 und von MATTSON, G. et al., Mol. Biol. Rep. 17, 167 - 183, 1993. Weitere zum Zweck der Herstel¬ lung der erfindungsgemäßen Chimären Antikörper geeignete Verbindungsmolekü¬ le sind individuell beschrieben von SCHEIDTMANN; K. H. In: Protein structure, a practical approach, Creighton, T. E. (Ed.), IRL Press at Oxford University Press, Chapter 4, 93 - 1 15, 1989; TRAUT, R. R. et al. In: Protein function, a practical approach, Creighton, T. E. (Ed.), IRL Press at Oxford University Press, Chapter 5, 101 - 133, 1989; TAE, H., Methods in Enzymology 91, 580 - 609, 1983; BAUMERT, H. G. & FASOLD, H., Methods in Enzymology 172, 584 - 609, 1989.

Die Herstellung der über die oben beschriebenen Verbindungsmoleküle kovalent verbundenen erfindungsgemäßen Antikörper kann nach literaturbekannten Methoden erfolgen, wie sie zum Beispiel in den schon genannten Veröffentlichungen über die Verbindungsmoleküle beschrieben sind, einschließlich der dort angegebenen weiteren Literatur (beispielsweise BRINKLEY, M., 1992, loc. cit.; MATTSON, G. et al., 1993, loc. cit.; Katalog von Pierce). Beispielsweise kann die Herstellung eines erfindungsgemäßen Chimären Antikörpers durch kovalente Bindung zwischen Y-j und Y2, wobei dafür IgX steht und X die oben genannte Bedeutung hat, gemäß der allgemeinen Formel Y-J-X-Y2 mit der genannten Definition von Z dadurch erfolgen, daß geeignete Immunglobuline nach an sich bekannter Methode gewonnen und gereinigt werden. Anschließend werden diese Immunglobuline, beispielsweise ein spezifisches nicht-humanes IgG und ein unspezifisches human IgM, gleichbedeutend mit Yi beziehungsweise Y2 in der allgemeinen Formel Y1 -Z-Y2, mit einem geeigneten Verbindungsmolekül, vorzugsweise ein homobifunktionelles Verbindungsmolekül, insbesondere ein Imidoester, ganz besonders ein Bisimidat, beispielsweise Dimethylsuberimidat, unter geeigneten Bedingungen in Reaktion gebracht. Die Reaktionsprodukte können dann nach bekannten Verfahren von den übrigen Bestandteilen der Reaktionslösung getrennt und gereinigt werden, beispielsweise durch Dialyse, Zentrifugation und/oder Chromatographie.

Bevorzugte Verbindungsmoleküle, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Chimären Antikörper der allgemeinen Formel Y- _| -Z-Y ₂ , mit den genannten Bedeutungen für Y-- und Y ₂ , geeignet sind und die als Bestandteil Z in den erfindungsgemäßen Chimären Antikörpern vorliegen, sind solche aus der Gruppe der homobifunktionellen Verbindungsmoleküle. Ein chimärer Antikörper, der ein

solches Verbindungsmoleküle enthält, ist daher bevorzugt. Gleichsam bevorzugt ist die Verwendung derartiger Antikörper für die serologisch-immunologische Diagnostik im oben beschriebenen Sinn.

Ganz bevorzugt ist ein chimärer Antikörper der allgemeinen Formel Y- _| -Z-Y ₂ , bei dem ein erster nicht-humaner Antikörper Y- _j und ein zweiter humaner Antikörper Y ₂ , mit den genannten Bedeutungen von Y- _j und Y ₂ , durch Reaktion mit einem Amin-spezifischen homobifunktionellen Verbindungsmolekül, bevorzugt mit einem Imidoester, insbesondere mit einem Bisimidat, ganz besonders mit Dimethylsuberimidat konjugiert bzw. kovalent verbunden ist. Ganz bevorzugt ist dementsprechend die Verwendung derartiger Antikörper für die serologisch¬ immunologische Diagnostik im oben beschriebenen Sinn.

Ganz besonders bevorzugt ist ein chimärer Antikörper der allgemeinen Formel Y- _| -Z-Y ₂ , bei dem der erste nicht-humane Antikörper Y- _| ein IgG Antikörper ist und der zweite humane Antikörper Y ₂ ein IgM Antikörper ist, mit den genannten jeweiligen Spezifitäten, wobei beide über Z, das als Verbindungsmolekül die Bedeutung von Dimethylsuberimidat hat, miteinander kovalent verbunden sind. Daher ist auch die Verwendung eines solchen Chimären Antikörpers gemäß der Formel Yi [i _g G]"Z-Y2[igM] für die serologisch-immunologische Diagnostik im oben beschriebenen Sinn ganz besonders bevorzugt.

Die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Chimären Antikörper kann aber auch dadurch erfolgen, daß, wie oben schon erwähnt, eine direkte kovalente Bindung Z gemäß der allgemeinen Formel Y1-Z-Y2 gewählt werden kann. Dies kann ins¬ besondere durch genetische Manipulation bzw. DNA-Rekombination erreicht werden. Beispielsweise dadurch, daß die Eigenschaft zweier Sulfhydryl Gruppen von Cysteinresten genutzt wird, intermolekulare Disulfidbindungen auszubilden. Die dem Fachmann bekannten Methoden der DNA-Rekombination können bei- spielsweise dazu benutzt werden, neue Cysteinreste an zwei Immunglobulinmo- lekülen von Interesse derart einzufügen, daß die beiden entsprechenden Mono- mere zu einem Dimer gemäß der allgemeinen Formel Y1-Z-Y2 verbunden wer¬ den, worin in diesem Fall Z eine kovalente Bindung im Sinne einer S-S - Bindung wäre (TRAUT, R. R. et al. In: Protein function, a practical approach, Creighton, T. E. (Ed.), IRL Press at Oxford University Press, Chapter 5, 101 - 133, 1989). In der WO89/01782 werden beispielsweise veränderte rekombinante Antikörper offenbart, bei denen eine Aminosäure im Antikörpermolekül durch ein Cystein- rest ersetzt ist.

Die Herstellung eines nicht-humanen Antikörpers für die erfindungsgemäßen Chimären Antikörper der allgemeinen Formel Y-|-Z-Y ₂ kann nach an sich be¬ kannten Methoden erfolgen. Beispielsweise kann ein für die Immunisierung und die darauffolgende Gewinnung und Reinigung eines nicht-humanen Antikörpers geeignetes Tier (beispielsweise Maus, Ratte, Meerschweinchen, Kaninchen, Schaf, Schwein, Huhn) dadurch immunisiert werden, daß es über die bekannten Applikationswege, beispielsweise die intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravaskuläre, intracraniale oder subcutane Route die für die diagnostische Untersuchung entsprechend interessante immunogene Substanz per injectionem appliziert bekommt. Als immunogene Substanzen kommen jene in Frage, die in dem betreffenden Organismus eine Immunantwort auslösen bzw. immunogen sind und die mit den Produkten einer Immunantwort, den Antikörpern, reagieren. Insofern werden im weiteren die Begriffe Immunogen und Antigen synonym verwendet. Der Fachmann weiß, wie und auf welche Weise er die Immunisierung durch Applikation des entsprechenden Antigens durchführt.

Die Herstellung eines Antikörpers einer gewünschten Immunglobulinklasse, beispielsweise IgG, in einem geeigneten Tier, beispielsweise einem Kaninchen, kann dadurch erfolgen, daß eine entsprechende Antigenpräparation, beispielsweise eine Bakteriensuspension, gegebenenfalls zusammen mit einem Adjuvans, beispielsweise komplettes Freund-Adjuvans, nach bekannter Methode injiziert wird. Derartige Injektionen können mehrmals hintereinander in im allgemeinen täglichen, wöchentlichen oder monatlichen Intervallen erfolgen. Die Anzahl der Immunisierungen und die Menge des zu applizierenden Antigens bestimmt maßgeblich die Ausbeute der gewünschten Antikörper im Serum des betreffenden Tieres. Im allgemeinen kann davon ausgegangen werden, daß bei¬ spielsweise bei der Immunisierung eines ausgewachsenen Kaninchens eine Ge¬ samtdosis von 0.1 - 5.0 mg Bakterien in Suspension intraperitoneal oder intra¬ venös in einem Volumen von jeweils 0.5 bis 2.0 ml pro Injektion gegeben wird, wobei jede Einzeldosis 0.01 bis 0.1 mg an Bakterienmasse enthalten kann. Auch bei der Aufeinanderfolge der einzelnen Injektionen gibt es keine strengen Regeln, sondern der Fachmann weiß, wie oft und innerhalb welcher Zeitintervalle er die Antigene, die entweder als Proteinlösungen oder als Zeil- bzw. Partikelsuspen¬ sionen vorliegen können, dem Tier verabfolgen muß. Bewährt hat sich sowohl bei Proteinlösungen als auch bei Partikel- oder Zellsus¬ pensionen (beispielsweise Bakterien) eine mehrmalige Injektion mit beispielsweise kompletten Freund-Adjuvans unter Verwendung eines Einzelvolumens von ungefähr 0.5 - 2.0 ml, vorzugsweise 0.5 - 1.0 ml pro Tier (beispielsweise Kaninchen). Beim Kaninchen kann beispielsweise davon

ausgegangen werden, daß 0.1 bis 1.0 mg an Bakterien, insbesondere 0.5 mg, als Gesamtdosis verabreicht werden, wobei die Einzeldosen in einem Volumen von 0.5 bis 2.0 ml, vorzugsweise 1.0 ml, intracutan, subcutan, intramuskulär oder intravenös, beispielsweise in die Ohrvene, gegeben werden kann. Aber auch andere Verfahren zur Herstellung von nicht-humanen Antikörpern mit oder ohne Zusätze bzw. Immunverstärker, wie z.B. Aluminiumhydroxid, sind dem Fachman bekannt (HUDSON, L. & HAY, F. C, Eds., Practical Immunology, Blackwell Scientific Publications, 3. Edition, 1989).

Die Herstellung eines humanen Antikörpers als zweites Immunglobulin Y ₂ als Bestandteil des erfindungsgemäßen Chimären Antikörpers gemäß der Formel Y ₂ - Z-Y ₂ kann nach an sich bekannten Standardverfahren erfolgen. Im allgemeinen wird davon ausgegangen, daß aus dem Blutserum von einem Menschen, der ei¬ ne besonders hohe und pathologische Immunglobulinsyntheserate eines be- stimmten Antikörpers IgX aufweist, nach bekannten Verfahren ein gewünschter humaner Antikörper gewonnen werden kann. Insbesondere kommen dafür Pati¬ enten in Frage, die an Makroglobulinämie leiden.

Insbesondere kann von einem Menschen, der einen besonders hohen IgM-Spie¬ gel aufweist, beispielsweise von einem Patienten mit Morbus Waldenström bzw. IgM-Plasmozytom, von dem bekannt ist, daß das Blut eines solchen Menschen eine IgM-Konzentration bis zu 100 mg/ml haben kann, das in seinem Blut enthaltene IgM nach Standardmethoden oder beispielsweise über Plasmapherese gewonnen werden.

Die Reinigung des nicht-humanen und des humanen Immunglobulins kann nach den bekannten Verfahren der Salzfällung (beispielsweise mit Ammoniumsulfat) oder der Chromatographie, beispielsweise über Anion-Austauscher (beispielsweise DEAE-DE52, Serva) oder Gel-Chromatographie (beispielsweise Sephacryl, Pharmacia) erfolgen.

Hinsichtlich des der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Begriffs Immuno¬ gen bzw. Antigen werden alle diejenigen Substanzen umfaßt, die in einem Säu¬ getierorganismus eine Immunantwort und somit eine Immunglobulin- (Anti- körper-)synthese induzieren können. Insofern kann ein solches Antigen natürli- chen Ursprungs sein, über DNA-Rekombination oder synthetisch oder se¬ misynthetisch hergestellt worden sein oder Teile von diesen darstellen. Derartige Antigene können in biologischen Flüssigkeiten eines Säugetierorganismus einschließlich des Menschen extrazellulär, intrazellulär, transzellulär (third space) oder interstitiell vorkommen, wie beispielsweise Blut, Serum und Fraktionen da-

von, Exkremente (wie z.B. Urin, Faeces), Tränenflüssigkeit, Speichel, Amnion- fiüssigkeit, Gewebeflüssigkeit, Aszites, Samenflüssigkeit, Pleuraflüssigkeit, Cystenflüssigkeit, Cerebralflüssigkeit, Eiter, Sekrete des Magen-Darm-Trakts, Li- quor, Augenkammerflüssigkeit, Ödemflüssigkeit, pathologisch auftretende Flüs- sigkeiten bei beispielsweise Heus oder Peritonitis, Sekrete, Zerebrospinalflüssig- keit, Plasma, Lymphe oder Flüssigkeiten, die aus Gewebeextrakten erhalten werden, Gewebe- und Zellkulturen.

Insbesondere kommen solche Antigene in Betracht, die Viren, Prokaryonten und Eukaryonten oder Teile davon sind. Insbesondere Mikroorganismen wie Bakte- rien (beispielsweise Enterobacterien, Corynebacterien, Spirochaeten insbeson¬ dere die Gattungen Treponema und Borrelia, Pseudomonaden, Mycoplasmen, Coccen, Chlamydien, Bacillen), Pilze und Sporen davon (beispielsweise Candida, Cryptococcus, Blastomyces, Paracoccidoides, Coccidoides, Aspergillus, Histoplasma) , auf DNA- und RNA-Viren beruhende Antigene, beispielsweise virale Capsidantigene oder Hüllproteine (zum Beispiel Hepatitis Viren und verwandte Antigene, wie zum Beispiel HBe, HBc, HBs, Pockenviren, Coxsackieviren, Echoviren, Myxoviren, Rhabdoviren, Togaviren, Reoviren, beispielsweise HIV, Tumorviren, Picomaviren, Herpesviren, Paramyxoviren, Rubellaviren, Mumpsviren, RS-Viren, Coronaviren), Protozoen (wie bespielsweise Leishmania, Trichomonas, Trypanosoma, Sarcocystidae mit Toxoplasma, Eimeriidiae, Plasmodium, Cryptosporiidae), Tumor-spezifische Proteine infizierter oder transformierter Zellen, die im entsprechenden Wirt eine Immunantwort induzieren. Mitumfaßt sind auch über die bekannten Methoden der DNA- Rekombination hergestellten Antigene, beispielsweise wie sie für Toxoplasma gondii in der EP-A 0431541 beschrieben sind, und über die bekannten synthetischen und semisynthetischen Verfahren herstellbaren Antigene. Aber auch Allergene sind hiervon mitumfaßt, da sie ebenso wie die beschriebenen Antigene die Antikörpersynthese in Gang setzen, insbesondere IgE, beispielsweise Milben oder Hausstaub.

Die erfindungsgemäßen Chimären Antikörper können in flüssiger oder fester Form vorliegen und in Flaschen, Ampullen oder anderen dazu äquivalenten Behältern, vorzugsweise in solchen aus Glas oder Kunststoffen, gefüllt und verpackt werden. Hinsichtlich des Voriiegens der Antikörper in flüssiger Form sind die dem Fachmann bekannten Puffer und Medien verwendbar, gegebenenfalls zusammen mit einem Stabilisierungsmittel. Entsprechend eignen sich zum Beispiel Tris-, Phosphat- (beispielsweise Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, PBS) oder Carbonat-Puffer, steriles Wasser, einfach- oder bidestilliertes Wasser oder

physiologische Kochsalzlösungen. Als Stabilisierungsmittel eignen sich die bekannten und üblichen Zusätze, wie beispielsweise Albumine oder Serumalbumine (Rinderserumalbumin [RSA], Humanserumalbumin [HSA]) oder andere inerte Proteine, aber auch Biozide. Die erfindungsgemäßen Chimären Antikörper können aber auch in lyophilisierter Form vorliegen, wenn sie als festes Produkt bestehen. In solchen Fällen können die dem Fachmann bekannten Techniken der Lγophilisation und der vor der Verwendung der entsprechenden Antikörper durchzuführenden Rekonstitution (beispielsweise mit einem der genannten Puffer und Medien) angewandt werden.

Die erfindungsgemäßen Chimären Antikörper liegen entweder in gebrauchsfertiger Verdünnung oder Konzentration vor oder sie können nach Belieben weiter verdünnt oder ankonzentriert werden, wobei der Fachmann weiß, welche individuelle Konzentration oder Verdünnung er abhängig von seinem Verwendungszweck einsetzen möchte. Beispielsweise können die Antikörper in einem Titerbereich von 1 : 20 bis 1 : 640, vorzugsweise 1 : 80 bis 1 : 160 oder um den Bereich von 1 : 100 vorliegen. Zur Verdünnung der Antikörperkonzentration können die oben genannten Puffer und Medien oder sterilen wässrigen Lösungen verwendet werden, beispielsweise PBS, Kochsalzlösungen oder Wasser.

Die erfindungsgemäßen Chimären Antikörper können einzeln vorliegen, daß heißt als einziger Bestandteil eines diagnostischen Mittels in Form einer Verpackungseinheit oder sie können als ein Bestandteil unter anderen Bestandteilen in einer Verpackungseinheit vorliegen, zum Beispiel als Kit oder Kit-of-parts.

Ein Kit kann aus einem Chimären Antikörper der vorliegenden Erfindung als positive Kontrolle und mindestens einem mit einem bestimmten Antigen beschichteten Objekträger bestehen. Als Objektträger, auf den die gewünschten Antigene fixiert sind, kommen alle den Fachmann bekannten gebräuchlichen Formen in Frage, insbesondere solche aus transparenten und flächig ausgestalteten Materialien wie zum Beispiel aus Glas oder Kunstoffen (Poly inyle, Polystyrole, Acrylate).

Ein solcher Kit kann zusätzlich zu diesen beiden Teilen ein IgM spezifisches Antihumanglobulin enthalten, welches gegebenenfalls mit einem Marker, beispielsweise einem Fluoreszenzmarker, wie zum Beispiel

Fluoresceinisothiocyanat, verbunden oder konjugiert ist, und/oder ein wie oben schon genannter Puffer (beispielsweise PBS), der als Waschpuffer und/oder zur Serumverdünnung verwendet werden kann.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 : Immunfluoreszenz: das IgG/lgM Borrelia burgdorferi (Bb) Hybrid zeigt eine starke spezifische Anfärbung der Borrelien (Verdünnung de Hybrides 1 :100), Vergrößerung x400. Fig. 2: Immunfluoreszenz: Anfärbung der Borrelien mit einem IgM

Antikörper haltigen human Serum (Verdünnung des Serums 1 :20), Vergrößerung x400.

Fig. 3: Immunfluoreszenz: wie in Fig. 2, jedoch liegt in diesem Fall ein IgM negatives human Serum vor (Kontrolle), Verdünnung des Serums 1 :20. Im Fall der Verwendung eines IgG/lgM Hybrids (wie in Fig. 1 ), ohne Spezifität für Bb, ist keine Fluoreszenz mehr zu erkennen. Vergrößerung x 400.

Fig. 4: Werte einer ELISA Platte: Ordinate - Extinktionswerte der einzelnen

Vertiefungen, Abzisse - Verdünnungsreihen verschiedener Proben, A = 1 :100 bis H = 1 : 12.800 in 2er Verdünnungsstufen. Spalten: S1 = Leerwert, S2 = IgG/lgM Bb Hybrid, S3 = IgG/lgM Treponema pallidum (T.pa) Hybrid (zum Vergleich), S4 = negatives human Serum, S5 = IgG/lgM negativ Hybrid, S6 = Probe eines positiven human Serums (IgM), S7 = weitere Probe eines positiven human Serums (IgM). Fig. 5: Westernblotstreifen: A = Molekulargewichtsmarker, B = Amidoschwarz gefärbtes Antigen (Gesamtlysat aus Bb), C =

Patienten Serum (enthält IgM Ak gegen 34kD "outer surface protein" [Osp] von Bb), D = nicht Bb spezifisches IgG/lgM Hybrid, E = Bb spezifisches IgG/lgM Hybrid (mehrere Antigene werden erkannt). Antigen: Borrelia burgdorferi Stamm B31 , Antiserum: IgG/lgM Hybrid Anti Bb.B31 ( ardünnung 1 :500), Verdünnung der positiv Kontrolle, negativ Kontrolle 1 : 100, Verdünnung des Zweitantikörpers Anti-Human-lgM 1 :3000.

Bester Weg zur Ausführung der Erfindung

Beispiel 1 : Herstellung eines lgG:lgM Chimären Antikörpers

1 .1 . Gewinnung von spezifischen nicht-humanem IgG

1.1 .1 . Immunisierung

Borrelia burgdorferi Stamm B31 ATCC 35270 wurde nach bekannten Methoden (KRAMPITZ, H. & BARK, S., In: Lyme Borreliosis II, Zbl. Bakt. Suppl. 18 (Stanek, Ed.), Gustav Fischer, Stuttgart, New York, 21 - 25, 1980 und PELZ, K. et al., In: Lyme Borreliosis II, Zbl. Bakt. Suppl. 18 (Stanek, Ed.), Gustav Fischer, Stuttgart, New York, 35 - 39, 1980) isoliert und in 10ml modifiziertes Barbour- Stoenner-Kelly (BSK IIHBarbour, Yale J. Biol. Med. 57, 71 , 1984) Medium bei 35°C für 3-4 Tage vermehrt. Adequates Wachstum wurde im Dunkelfeldmikroskop kontrolliert. Die Spirochaeten wurden bei 5.000g abzentrifugiert, 2 Mal in PBS (Phosphat gepuffertes Kochsalz) gewaschen und in 0,5ml PBS resuspendiert. Dieses Suspension wurde mit Freundschen Komplettes Adjuvanz (Sigma, F-5881 ), Gesamtvolumen 1ml, gemischt und einem Kaninchen intramuskulär verabreicht. Zwei weitere Immunisierungen in 3-4 wöchigen Abständen wurden durchgeführt. 2 Wochen nach der letzten Gabe von Borrelien zeigte das Tier ein Titer von 1 :1280 in der Indirekten Immunfluoreszenz (Einzelheiten, siehe 2.1.1 . und 2.2.1.) und von 1 :20.000 in dem Borrelia burgdorferi Haemagglutinations (BbHA) Test (LD Labordiagnostika, Heiden, Deutschland).

1.1.2. Reinigung des aus 1 .1.1. gewonnenen IgG

10ml des aus 1.1.1. gewonnenen Antiserums wurden mit 10ml gesättigtem Ammoniumsulfat (pH 7,3) gemischt, inkubiert bei 20°C für 30min. und dann bei 4.000g für 10min. abzentifugiert. Der Überstand wurde verworfen, der Niederschlag in 20ml 50% gesättigtem Ammoniumsulfat resuspendiert (gewaschen) und wieder abzentrifugiert. Der Niederschlag wurde in 10ml PBS aufgenommen und die gesamten Reinigungsschritte wurden wiederholt. Danach wurde das gereinigte Protein gegen PBS bei 4°C über 48Std. mit 2 maligen Wechseln des PBS dialysiert. Durch Röhrchengelelektrophorese im SDS-PAGE (6,5% Gel) und anschließender Färbung mit Amidoschwarz, konnte der

Reinheitsgrad der gewonnenen Immunglobulinfraktion festgestellt werden. Aus 10ml Vollserum wurde 40mg Immunglobulin (überwiegend IgG) erhalten, durch Einengung mit Hilfe einer Amicon Ultrafiltrationszelle (XM50 Membran) wurde die Proteinkonzentration auf 20mg/ml gebracht.

1.2. I . Isolierung des humanem IgM

Als IgM Quelle wurde ein Plasmafiltrat (Plasmapherese) eines Patienten mit IgM Paraproteinämie (Morbus Waldenström) benutzt. Dieses Material bestand bereits zu über 80% aus IgM. Eine einmalige Fällung mit 50% Ammoniumsulfat (wie in 1.1.2. beschrieben) wurde vorgenommen. Die Proteine wurden dann durch Gelchromatographie mit Hilfe einer S.300 Sephacryl Säule (Pharmacia) weitergereinigt (Laufpuffer PBS, Säule 3x65cm, Durchflußrate 13ml/Std., 5ml Fraktionen, Auftragsmenge: 30mg). Die IgM haltigen Fraktionen wurden durch SDS-Page in einem 6% Gel nachgewiesen, gepoolt und eingeengt wie oben (1.1.2.) beschrieben. Nach Dialyse gegen PBS wies das IgM Präparat eine Proteinkonzentration von 10mg/ml auf, es wurde sterilfiltriert und bei 4°C aufbewahrt.

1.3. Kovalentes Verbinden von IgG und IgM mittels Dimethylsuberimidat

Die Herstellung des Heterodimers, bestehend aus dem gemäss Beispiel 1.1.2. gereinigten, spezifisch gegen Borrelia burgdorferi aus Kaninchen reaktiven IgG und dem gemäss Beispiel 1.2.1. gereinigten humanem IgM erfolgte im wesentlichen nach der von GONDOLF; K. B. et al. Virchows Archiv B Cell Pathol. 60, 353 - 363, 1991 beschriebenen Methode, die sich auf die Originalbeschreibung von DUTTON, A. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 23, 730 - 739, 1966 und von LUDWIG, M. L. und HUNTER, M. J., Methods of Enzymology Vol. XKHirs, C.H.W., Ed), Academic Press, 595 - 604, 1967, bezieht. Es wurden 20mg des Kaninchen IgG und 5mg des menschlichen IgM in einem Gesamtvolumen von 1 ,5ml in PBS mit 1 N NaOH auf pH 10 eingestellt. Anschließend wurden 5mg Dimethylsuberimidat (Pierce, Holland) bei Raumtemperatur unter Rühren portionsweise, innerhalb von 30 Minuten, hinzugegeben. Der pH Wert wurde mit 0,1 N NaOH konstant bei pH10 gehalten, nach weiteren 30min. bei Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung in der Kälte bei 4-8 °C gegen PBS für 48 Stunden (2xwechseln) dialysiert. Nach der Dialyse betrug der pH Wert 7.2. Die Reaktionslösung wurde danach bei 9.000g für 3min. zentrifugiert. Eine weitere Reinigung über Gelchromatographie wurde

ausprobiert, dieser Schritt erwies sich als nicht vorteilhaft und wurde danach nicht mehr angewendet.

Beispiel 2: Funktionsnachweis des lgG:lgM Chimären Antikörpers

2.1 Testsysteme und Durchführung der Teste.

2.1 .1. Indirekte Immunfluoreszenz:

1 ) Borrelia burgdorferi B31 (ATCC 35270) wurde angezüchtet und aufbereitet wie in 1 .1 .1. beschrieben. Die in 0,5ml PBS resuspendierten

Borrelien wurden 1 :40 bis 1 : 160 in PBS weiter verdünnt (die im Test optimale Verdünnung mußte ermittelt werden).

2) Objektträger (OT's) (4mm Felder, 12 Felder/OT) wurden mit 10μl/Feld der Bakterien Suspension beschichtet, bei 37°C für 45min. staubfrei getrocknet und anschliessend in Aceton bei -20°C für 10min. fixiert.

3) Vom Testserum wurde eine geometrische Verdünnungsreihe (ab 1 :20) in PBS (enthält 5% normales Kaninchenserum) angesetzt und 10μl jeder Verdünnung pro Feld (Spot) aufgetragen und 30min. bei 37°C inkubiert.

4) Danach wurden die OT's 10min. in PBS-Tween (0,1 % Tween 20) und 10min. in PBS gewaschen.

5) 10μl Anti-Human IgM FITC (1 :80 verdünnt, Fa. Behring) pro Spot wurde aufgetropft und 30min. bei 37°C inkubiert.

6) Danach wurden die OT's 2x10min. in PBS gewaschen.

7) Nach dem Abtrocknen der OT's wurde 5μl Eindeckmedium (PBS/Glycerol, 9: 1 ) pro Spot aufgetragen und einen Deckglas aufgelegt. Die Auswertung erfolgte mit einem Zeiss Axiomat Fluoreszenz Mikroskop bei 400 facher Vergrößerung (Filterkombination 10, BP450-490, FT510, BP515-565).

2.1.2. ELISA: 1 ) Für die Beschichtung der Mikrotiterplatten wurden 100μl Antigen-

Verdünnung pro Vertiefung eingegeben und 12Std. bei 40°C in einer feuchten Kammer absorbieren gelassen. Als Antigenpräparat wurde ein Ultrasonikat von Borrelia burgdorferi auf 1 μg/ml eingestellt. Als Kopplungspuffer wurde Na-Carbonat, 0,05M, pH9.6 verwendet. 2) Die Platten wurden 5 Mal in PBS-Tween 20 (2%) gewaschen.

3) Danach wurde 100μl der in PBS verdünnten Seren pro Vertiefung eingegeben und 1 Std. bei 37°C inkubiert.

4) Anschließend wurde 5 Mal in PBS-Tween gewaschen.

5) Es wurden 50μl Peroxidase markierte Anti-Human IgM-Ak zugegeben (Verdünnung 1 :3.000) und 1 Std. bei 37°C inkubiert.

6) Es wurde wieder 5 Mal in PBS-Tween waschen.

7) 100μl Substrat pro Vertiefung wurden eingegeben und 10min. bei 37°C inkubiert. Substratlösung: Na2HPÜ4, 3.61 g, Citronensäure-1 -Hydrat 2.07g, o-Phenylendiamin 0,04g in 100ml H2O, direkt vor Gebrauch 2μl H2O2/IO1T.I dazugegeben. Die Reaktion wurde mit 50μl/Vertiefung 2M H2SO4 gestoppt und die Extinktion bei 492 nm in einem ELISA Reader gemessen (Fa. SLT, 74564 Crailsheim, Deutschland).

2.1.3. Westernblot:

1 ) Das Antigen wurde in der Sodium-Dodecyl-Sulfat Polyacrylamidgel-

Elektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt (12,6% Gel, Antigen - Borrelia burgdorferi Ultrasonicat, 2μg/Spur). 2) Das Gel wurde herausgenommen und die aufgetrennte Proteine auf

Immobilon (PVDF) Membran transferiert (Elektrotransfer 20mA, 12Std. ), danach wurde die Membran in 6mm Streifen geschnitten. 3) Die Testseren wurden in 1ml PBS + 10% Milch verdünnt und bei 4°C über Nacht mit der Streifen inkubiert (Verdünnung z.B.1 :100). 4) Die Streifen wurden 3 Mal für 5min. in PBS-Tween 20 (0,1 %) gewaschen.

5) Danach wurde 1 ml zweiter Peroxidase markierte Anti-Human-lgM Antikörper in Arbeitsverdünnung (1 :3.000) pro Streifen zugegeben.

6) Es wurde wie in 4) gewaschen 7) Anschließend wurden die Streifen in Diaminobenzidin (DAB) (Sigma,

Deisenhofen, Deutschland) entwickelt (20mg DAB in 30ml PBS + 24μl H ₂ O ₂ ).

2.2 Ergebnisse

2.2.1. Indirekte Immunfluoreszenz: Das IgG/lgM Borrelia burgdorferi (Bb) Hybrid (IgG = Anti-Bb B31 ) zeigte eine starke Fluoreszenz der Borrelien (Fig. 1 ), der Endtiter war 1 :800 (das Ausgangsserum von Kaninchen hatte einen Titer von 1 :1280). Ein IgM Antikörper positives Patienten Serum zeigte einen Titer von 1 : 128 (Fig.2). Ein negatives Resultat (negatives Patienten Serum, bzw. IgG/lgM Hybrid ohne Borrelienspezifität) zeigte ab einer Verdünnug von 1 :20 keine spezifische Fluoreszenz.

2.2.2. ELISA: Die Extinktionswerte einer Mikro titerplatte sind in Fig.4 gezeigt. Ausgangsverdünnung bei allen Proben war 1 :100. Auswahl der negativen und positiven Seren anhand der Immunfluoreszenz (IF) Ergebnisse.

Die nachstehende Tabelle zeigt die erhaltenen Einzelwerte der Mikrotiterplatte (Verdünnungen A bis H und Spalten 1 bis 7 wie in der Legende zu Fig.4 beschrieben).

1 2 3 4 5 6 7

A -0.002 2.524 0.930 0.328 0.032 0.733 1.072

B 0.001 2.623 1.052 0.192 0.025 0.461 0.855

C 0.000 2.435 0.754 0.078 0.012 0.253 0.692

D 0.001 2.114 0.419 0.048 0.007 0.164 0.621

E -0.001 1.374 0.203 0.017 0.005 0.086 0.369

F -0.002 1.258 0.114 0.010 -0.001 0.050 0.421

G -0.002 0.586 0.056 0.004 -0.001 0.030 0.297

H 0.001 0.396 0.031 0.012 0.004 0.023 0.173

2.2.3. Westernblot: Die Proben wurden alle bei einer Verdünnung von 1 : 100 bis 1 :500 getestet. Das IgG/lgM Bb Hybrid war stark positiv, ein positives Patientenserum (IgM pos. in IF) war ebenfalls positiv. Dahingegen zeigen sowohl das negative IgG/lgM Kontrollhybrid als auch ein negatives Patientenserum keinerlei Reaktionen (Fig.5).

2.2.4. Stabilitätsuntersuchungen: verglichen wurden IgG/lgM Bb Hybrid mit einem positiven humanem IgM Serum in IF, sowohl bei Lagerung bei 4°C als auch in gefrorenem Zustand. Nach 30 Wochen bei 4°C war der Titer des Hybrids gleich geblieben, wobei der Titer des Patientenserums stark zurückgegangen war (Grenzwertig). Nach 30 Wochen bei -20°C zeigte das

Hybrid ebenfalls keine Abnahme des Titers, der Titer des Patientenserums nahm um etwa 2 Titerstufen ab.