NOUVEAUX COMPOSES SILANES PORTEURS D'UNE FONCTION

HYDRAZONE OU DIAZO POUR FONCTIONNALISER DES SUPPORTS

SOLIDES ET IMMOBILISER SUR CES SUPPORTS DES MOLECULES

BIOLOGIQUES

DESCRIPTION

DOMAINE TECHNIQUE

La présente invention a trait à de nouveaux composés silanes porteurs d'une fonction hydrazone ou diazo utilisables pour fonctionnaliser des supports solides, à des supports fonctionnalisés par lesdits composés silanes et à leurs utilisations pour l'immobilisation de molécules biologiques, en particulier d'acides nucléiques.

L'analyse de la structure, de l'organisation et de la séquence d'une molécule d'acide nucléique est d'une importance majeure dans la prévision, le diagnostic et le traitement de maladie, dans les médecines légales, dans l' épidémiologie et la santé publique et dans l' élucidation des facteurs qui commandent l'expression et le développement des gènes.

Des supports porteurs de molécules biologiques immobilisées, telles que des acides nucléiques, sont avantageusement utilisés pour la détection et la reconnaissance d'espèces biologiques, mais également d'autres applications, telles que la séparation et la purification de molécules biologiques.

Pour ce faire, il est essentiel de disposer de supports solides fonctionnalisés présentant les caractéristiques suivantes :

- permettre l'immobilisation reproductible des molécules biologiques d' intérêt ;

- permettre l'immobilisation des molécules biologiques d'intérêt de façon sensible, la sensibilité d'un support solide fonctionnalisé dépendant du taux d'immobilisation et de la méthode de détection d'un signal mais aussi du niveau du bruit fond ;

- être réutilisables.

L' immobilisation de molécules biologiques d'intérêt sur des supports solides s'effectue généralement en deux étapes :

- une première étape de fonctionnalisation des supports qui consiste en une modification chimique de leur surface par greffage d' agents de couplage qui vont assurer la fixation des molécules biologiques sur le support ; une deuxième étape d' immobilisation consistant à établir une interaction entre les molécules biologiques et les agents de couplage greffés sur le support, l'interaction pouvant consister en la formation d'une liaison covalente entre la molécule biologique et l'agent de couplage ou de liaisons plus faible (telles que des interactions électrostatiques, des liaisons datives) . Les agents de couplage se greffent à la surface des supports par réaction avec des fonctions - OH ou hydrure du support et des fonctions réactives de l'agent, pour former de fortes interactions ioniques ou covalentes entre l'agent de couplage et le support et s'organisent à la surface du support généralement sous forme d'une monocouche dense et organisée à la surface,

par exemple, par formation de liaisons du type Van der Waals entre les molécules d'agents de couplage greffées .

Généralement, pour fixer des molécules biologiques du type acide nucléique, il est nécessaire de modifier celles-ci préalablement par introduction d'un groupe réactif susceptible de réagir avec soit directement le support, soit l'agent de couplage. Toutefois, l'utilisation de telles molécules modifiées augmente considérablement le coût de mise en œuvre des procédés d'immobilisation de ces molécules.

Les inventeurs se sont ainsi fixé comme but de proposer de nouveaux composés silanes aptes à être greffés à la surface d'un support solide et comprenant des groupes permettant l'immobilisation directe de molécules biologiques par la formation de liaisons covalentes sans nécessiter de modification préalable desdites molécules.

EXPOSE DE L'INVENTION

Ainsi, l'invention a trait, selon un premier objet, à un composé silane répondant à la formule (I) suivante :

dans laquelle

- R ¹ représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle ou un groupe aryle;

- R ² et R ³ représentent, indépendamment l'un de l'autre, H, NO ₂ , Cl, Br, F, I, OR, SR, NR ₂ , R, NHCOR, CONHR, COOR avec R représentant un groupe alkyle ou aryle ;

Z représente une liaison simple ou un groupe espaceur organique comprenant au moins une double liaison apte à permettre la conjugaison de la double liaison portant le groupe Y et du cycle aromatique ;

X représente un groupe silylé apte à créer une liaison covalente après réaction avec les fonctions hydroxyle ou hydrure d'un support ; - E représente un groupe espaceur organique ;

A représente une liaison simple ou un groupe choisi parmi -CONH-, -NHCO-, -0-, -S- ;

- Y représente un groupe -N ₂ , -N-NH ₂ .

Selon l'invention, le groupe E est un groupe espaceur organique, sa fonction essentielle étant de conférer des propriétés particulières au film résultant du greffage des composés silanes à la surface d'un support.

Ce groupe E est généralement un groupe hydrocarboné, comprenant, par exemple, de 2 à 24 atomes de carbone, et comprenant éventuellement une ou plusieurs insaturations et/ou un ou plusieurs groupes aromatiques et/ou un ou plusieurs hétéroatomes .

A titres d'exemples, le groupe E peut être un groupe alkylène, c'est-à-dire un enchaînement du type -CH ₂ -, comprenant, par exemple, de 8 à 24 atomes de carbone. Ce type de groupe confère aux composés silanes, une fois greffés sur un support, une capacité à interagir entre eux, par création d' interactions interchaînes et ainsi contribue à l'obtention de monocouches organisées.

Le groupe E peut être un groupe fluoroalkylène comprenant de 3 à 24 atomes de carbone. Ces groupes contribuent à conférer au film résultant du greffage des composés silanes les comprenant, des propriétés permettant leur utilisation en chromatographie et en électrophorèse . Le groupe E peut être un groupe hydrocarboné comprenant une ou plusieurs insaturations, par exemple, du type acétylénique . Un exemple d'un tel groupe peut être un groupe alkylène tel que défini ci- dessus interrompu par une ou plusieurs insaturations acétyléniques . Lorsque le groupe E comporte au moins deux insaturations, il peut conférer aux composés silanes, une fois greffés sur un support, une capacité à se réticuler.

Le groupe E peut être également un groupe hydrocarboné comprenant un ou plusieurs groupes aromatiques .

On peut citer, par exemple, un groupe comprenant des groupes aromatiques conjugués avec des groupes linéaires insaturés, tel qu'un groupe résultant de l'enchaînement d'un motif phénylène-vinylène ou

phénylène-acétylène . Ces groupes contribuent à conférer au film résultant du greffage des composés silanes les comprenant, des propriétés optiques non linéaires.

On peut citer, par exemple, un groupe comprenant des motifs pyrrole, thiophène. Ces groupes contribuent à conférer au film résultant du greffage des composés silanes les comprenant, des propriétés de conduction électronique.

On peut citer, par exemple, un groupe comprenant un ou plusieurs aromatiques substitués par un ou plusieurs groupes hétéroatomiques, tel qu'un groupe comprenant un enchaînement de motifs quinones ou de motifs diazoïques. Ces groupes contribuent à conférer au film résultant du greffage des composés silanes les comprenant, des propriétés de photo/électroluminescence .

Selon l'invention, X représente un groupe silylé permettant la fixation covalente du composé silane sur les fonctions hydroxyle ou hydrure d'un support, lequel support peut être, par exemple, un support solide en silicium, en ITO (oxyde d' indium et d'étain) ou en titane.

Ce groupe X peut être par exemple un groupe trihalogénosilane (tel qu'un groupe trifluorosilane, un groupe trichlorosilane) ; un groupe trihydrogénosilane ; un groupe trialcoxysilane -Si (OR ⁴ ) 3 avec R ⁴ représentant un groupe alkyle saturé en Ci à Ce, linéaire ou ramifié, un groupe phényle (tel qu'un groupe triméthoxysilane, un groupe triéthoxysilane, un groupe triisopropoxysilane) ; un groupe

triaminoalcoxyamine -Si (NR ⁵ R ⁶ ) ₃ , avec les R ⁵ et R ⁶ représentant indépendamment un groupe alkyle saturé en Ci à Ce, linéaire ou ramifié, un groupe phényle ; ou un groupe organométallique (tel qu'un groupe organomagnésien, un groupe organolithien) ; un groupe hydrolysable .

Z peut être une liaison simple, auquel cas la fonction hydrazone ou diazo pourra se conjuguer directement avec le cycle aromatique adjacent, ou Z peut être un groupe organique comprenant au moins une double liaison permettant une conjugaison entre le cycle aromatique et la fonction hydrazone ou diazo. Par conjugaison, on entend la délocalisation électronique du cycle aromatique le long de la chaîne carbonée du groupe organique. Ce groupe organique peut être un groupe de formule :

n étant un entier correspondant au nombre de répétition du motif placé entre parenthèse, n pouvant être égale à 1 ou 2.

R ¹ peut être un groupe alkyle comprenant, par exemple, de 1 à 10 atomes de carbone, tel qu'un groupe méthyle ou un groupe aryle comprenant, par exemple, de 6 à 18 atomes de carbone, tel qu'un groupe phényle .

A peut être une liaison simple, auquel cas le cycle aromatique sera directement relié au groupe E. A peut être également un groupe -CONH-, -NHCO-, -S-, -0-.

Une première famille de composés conforme à l'invention est une famille pour laquelle Y est un groupe de formule -N-NH ₂ , auquel cas ces composés répondent à la formule (II) suivante :

Des composés particuliers entrant dans la définition de cette famille sont ceux pour lequel A correspond à -0- et E représente un groupe alkylène comprenant de 8 à 24 atomes de carbone et Z est une liaison simple, R ₂ , R ₃ , Ri et X étant tels que définis ci-dessus .

On peut citer, par exemple le composé de formule (III) suivante :

Une seconde famille de composés conforme à l'invention est une famille pour laquelle Y est un groupe de formule -N ₂ , auquel cas ces composés répondent à la formule (IV) suivante :

Des composés particuliers entrant dans la définition de cette famille sont ceux pour lequel A correspond à -O- et E représente un groupe alkylène comprenant de 8 à 24 atomes de carbone et Z est une liaison simple, R ₂ , R3, Ri et X étant tels que définis ci-dessus .

On peut citer, par exemple le composé de formule (V) suivante :

Les composés de l'invention peuvent être préparés par des méthodes classiques de synthèse accessibles à un technicien spécialisé en synthèse organique.

A titre d'exemple, pour obtenir des composés pour lesquels E est un groupe alkylène, A est -O- et X est un groupe -Si (OR ⁴ ) 3, la préparation peut

s'envisager en trois étapes selon le schéma réactionnel suivant .

1) Réaction d'un componé carbonylé phénolique avec un composé précurseur halogène vinylique

Cette réaction consiste en une substitution nucléophile de l'atome d'halogène HaI. La liaison ondulée entre HaI et = représente un groupe hydrocarboné reliant HaI et =, tel qu'un groupe alkylène.

2) Les composés obtenus à l'issue de l'étape 1 sont ensuite soumis à une réaction de formation de la fonction hydrazone par réaction avec une solution d'hydrazine selon le schéma réactionnel suivant :

3) Les composés obtenus à l'issue de l'étape 2 sont ensuite soumis à une réaction d' hydrosilylation avec un réactif du type HSi (OR ⁴ ) 3 en présence d'un catalyseur de Karstedt Pt [Si (CH ₃ ) ₂ HC=CH ₂ ] ₂ 0 selon le schéma réactionnel suivant :

Enfin, la fonction hydrazone obtenue ci- dessus peut être transformée en une fonction diazo par une réaction d'oxydation, par exemple avec de l'oxyde de manganèse Mnθ2.

L'homme du métier adaptera ces schémas réactionnels en fonction des composés silanes qu' il souhaite obtenir.

Comme mentionné précédemment, les composés silanes de l'invention sont susceptibles de se greffer à la surface d'un support, en raison de la présence du groupe X apte à réagir avec des fonctions hydroxyles ou hydrures (présentes sur le support) pour former des liaisons covalentes.

Ainsi, l'invention a trait selon un second objet, à un procédé de fonctionnalisation d'un support solide comportant en surface des fonctions hydroxyle ou hydrure, comprenant une étape de mise en contact d'une solution comprenant au moins un composé silane tel que défini ci-dessus avec ledit support.

Ce procédé peut comprendre préalablement un étape de traitement de la surface du support afin de créer sur ladite surface les fonctions hydroxyles ou hydrures nécessaires au greffage.

Ainsi, pour un support en silicium 1,0,0 (par exemple, du type wafer) , il est préférable, avant

fonctionnalisation, de traiter celui-ci en le mettant en contact avec une solution de soude afin de générer des fonctions silanols.

Les supports pouvant être fonctionnalisés selon le procédé de l'invention peuvent être des supports organiques (par exemple en matériaux plastiques) , des supports inorganiques, par exemple des supports en oxyde métallique (par exemple, silice et ses dérivés comme le verre, le quartz, oxyde d' indium et d'étain...), des supports métalliques (tels que des supports en titane) ou des supports en silicium, l'essentiel étant que ces supports soient susceptibles

(éventuellement avec l'étape de traitement préalable mentionnée ci-dessus) de présenter des fonctions hydroxyles ou hydrures pour le greffage des composés silanes de l'invention.

L'invention a également pour objet le support solide fonctionnalisé susceptible d'être obtenu par le procédé de l'invention.

De part la nature du groupe Y, les composés silanes greffés ont la capacité d' interagir avec des molécules biologiques pour les immobiliser.

La présente invention a donc également pour objet un procédé d'immobilisation de molécules biologiques sur support solide fonctionnalisé comprenant les étapes suivantes :

a) une étape de mise en œuvre du procédé de fonctionnalisation du support tel que défini ci- dessus ; b) une étape de mise en contact du support obtenu à l'étape a) avec une solution comprenant la (les) molécule (s) biologique (s) à immobiliser .

Les molécules à immobiliser peuvent être des oligonucléotides, des acides nucléiques, des polypeptides (protéines, enzymes) , des lipides, des carbohydrates ou des hormones, notamment des molécules comprenant des groupes phosphates susceptibles de réagir avec une fonction diazo pour former une liaison covalente . Au sens de la présente invention et dans ce qui suit, on entend par « acides nucléiques » aussi bien des oligonucléotides que des ADN ou des ARN.

L'invention a également pour objet les supports solides obtenus en mettant en œuvre le procédé d'immobilisation conforme à l'invention, c'est-à-dire les supports solides sur lesquels sont immobilisés par fixation covalente les molécules biologiques d'intérêt.

Ces supports solides peuvent ainsi être utilisés comme outils d'analyse (par exemple, pour un diagnostic, un séquençage) ou comme outils de synthèse pour réaliser par exemple des revêtements.

Les supports trouvent donc des applications dans de nombreux domaines, tels que la synthèse sur supports solides, la séparation et la purification de

molécules (électrophorèse et chromatographie) , les biocapteurs .

L'utilisation de supports solides fonctionnalisés selon la présente invention permet d' immobiliser différents types de molécules biologiques et donc de préparer différents types de puces comme des puces à acides nucléiques telles que des puces à ADN, des puces à polypeptides telles que des puces à protéines.

L'utilisation de supports solides modifiés selon la présente invention est particulièrement avantageuse pour la préparation de puces à ADN, à savoir de supports sur lesquels sont fixés, de façon covalente, des oligo- ou polynucléotides de séquences connues. De telles puces à ADN permettent, par hybridation des oligo- ou polynucléotides immobilisés sur le support avec des acides nucléiques ou des oligonucléotides cibles, de déterminer la séquence de ces molécules cibles et de suivre l'expression des gènes. On précise que par puce à ADN, on entend un support solide de dimension réduite où sont fixés une multitude de sondes de capture à des positions prédéterminées .

La présente invention a donc pour objet également une puce à acides nucléiques ou à polypeptides, obtenues par le procédé d'immobilisation de l'invention mentionné ci-dessus.

L' invention va maintenant être décrite en référence aux exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif.

EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS

EXEMPLE 1

Cet exemple illustre la préparation d'un composé silane conforme à l'invention : le 11- (p- phénylméthylhydrazone) undécyltriméthoxysilane selon le schéma réactionnel suivant :

(III)

La fonction acétophénone est incorporée par une réaction de type Williamson entre le 11 bromoundécène et le 4-hydroxyacétophénone . Le

groupement hydrazone est synthétisé par réaction dans de l'hydrazine à chaud. L'incorporation de la partie silylée est obtenue après une réaction d' hydrosilylation en présence de catalyseur de Karstedt .

a) Etape 1 : Synthèse du 11- (p-acétophénone) undéc-1- ène

A une solution de 4-hydroxyacétophénone (8,79g; 63 mmol; 1 éq) dissous dans 150 mL de DMF, sont additionnés du 11-bromoundécène (95%) (15,54g; 14,5 mL; 63 mmol) et du carbonate de potassium (8,74g; 63 mmol; 1 éq) . La réaction s'effectue à 50 ⁰ C durant 16 heures. Après évaporation du DMF et reprise à l'éther éthylique, le mélange réactionnel est lavé successivement avec de l'eau permutée (à trois reprises) et avec une solution saturée de chlorure de sodium, séché sur du sulfate de magnésium anhydre puis concentré. Le résidu est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (cyclohexane —» cyclohexane/acétate d' éthyle (75/25)) pour donner un solide blanc.

Les caractéristiques du produit obtenu sont les suivantes :

Masse obtenue : 14,46 g

Rendement : 79%

Point de fusion : 35-40 ⁰ C

RMN ¹ H (200 MHz; CDCl ₃ ) : 1,31 (12H; m; H ^11"16 ) ; 1,80 (2H; m; H ¹⁰ ) ; 2,04 (2H; m; H ¹⁷ ) ; 2,56 (3H; s; H ¹ ) ; 4,02 (2H; t; H ⁹ ; ³ J _H - _H = 6,5 Hz) ; 4, 97 (2H; m; H ¹⁹ ) ; 5,82 (IH; m; H Ti ¹ S ₁ 6, 92 (2H; d; H 5 + 7 . 3

J _H - _H = 9 Hz) ; 7, 93 (2H; d;

RMN 1 "3,C (200 MHz; CDCl ₃ ) : 26,38; 26,77 (H ¹ ) ; 29,33; 29,51 (2C) ; 29,75; 29,82; 29, 91; 34,23; 68, 67 (C ⁹ ) ;

114,55 (C 5+9+19% 130,5 (C ^z 131,01 (C ,4 ^q + ⁺ 8 ^a ) ; 139, 63 ( ; 163,55 (C ^f 197,29 (C ²

b) Etape Synthèse du H-(P- phénylméthylhydrazone) undéc-1-ène

A une solution de 4- (11-undéc-l- ène) acétophénone (14,46g; 69 mmol) dissous dans 200 mL d'éthanol, est additionné de l'hydrazine monohydrate (20,34g; 20,2 mL; 408 mmol; 8,1 éq.). La réaction s'effectue à reflux durant 12 heures puis la solution est refroidie à -20 ⁰ C. Le précipité formé est filtré pour donner un solide blanc.

Les caractéristiques du produit obtenu sont les suivantes :

Masse obtenue : 14,54 g Rendement : 96 %

RMN ¹ H (200 MHz; CDCl ₃ ) : 1,30 (12H; m; H ^11"16 ) ; 1,76

(2H; m; H ¹⁰ ) ; 2,04 (2H; m; H ¹⁷ ) ; 2,12 (3H; s; H ¹ ) ; 3, 96

(2H; t; H ⁹ ; ³ J _H - _H = 6, 6 Hz) ; 4, 97 (2H; m; H ¹⁹ ) ; 5,24 (IH; s; H ²⁰ ) ; 5,82 (IH; m; H ¹⁸ ) ; 6,87 (2H; d; H ⁵⁺⁷ ; ³ J _H _ _H = 9

Hz) ; 7, 57 (2H; d; H 4 + 8 . 3

J _H - _H = 9 HZ;

RMN ¹³ C (200 MHz; CDCl ₃ ) : 12,17 (H ¹ ) ; 26,44; 29,34; 29,54; 29, 66; 29,80; 29,84; 29, 93; 34,23; 68,42 (C ^ξ 1 11144,, 6622 ((CC ^55++77++1199 )) ;; 112277,,1199 (C ³ ) ; 132,23 (C ⁴⁺⁸ ) ; 139, 63 (C ¹⁸ ; 148,21 (C ² ) ; 159, 67 (C ^f

m/z (NBA) : 303 [M+H] ⁺

c) Etape 3 : Synthèse du 11- (p- phénylméthylhydrazone) undécyltriméthoxysilane (III)

Le 11 - (p-phénylméthylhydrazone) undéc-1-ène

(4g; 13 mmol) est mélangé avec du triméthoxysilane (90%) (2,62g; 2,7mL; 19 mmol; 1,5 éq.). Le catalyseur de Karstedt (0,31g; 0,03 mmol; 0,0025 éq.) est additionné très lentement. La réaction se déroule à température ambiante durant 16 heures. Après évaporation du triméthoxysilane en excès, le brut réactionnel est solubilisé dans du pentane anhydre et refroidie à -20 ⁰ C. L'ensemble est filtré pour donner un solide jaune.

Les caractéristiques du produit obtenu sont les suivantes :

Masse obtenue : 2,6 g Rendement : 46%

RMN ¹ H (IOO MHZ^DCI ₃ ) : 0,66 (2H, m, H ¹⁹ ) ; 1,28 (12H; m;

H ^11"18 ) ; 1,78 (2H; m; H ¹⁰ ) ; 2,32 (2H; m; H ¹ ) ; 3,57 (9H; s;

H ²⁰ ) ; 3,99 (2H; t; H ⁹ ; ³ J _H _ _H = 6,5 Hz) ; 6,92 (2H; d; H ⁵⁺⁷ ; ³ J _H - _H = 9 Hz) ; 7,86 (2H; d; H ⁴⁺⁸ ; ³ J _H - _H = 9 Hz)

RMN ¹³ C (200 MHz; CDCl ₃ ): 9,55 (H ¹⁹ ) ; 15,20 (H ¹ ) ; 23,02;

26,46; 29,68 (2C) ; 29,83; 29,94; 29,99; 30,02; 33,58;

50,93 (3C, C ²⁰ ) ; 68,49 (C ⁹ ) ; 114,58 (C ⁵⁺⁷ ) ; 128,45 (C ⁴⁺⁸ ) ; 131,51 (C ³ ) ; 158,27 (C ² ) ; 160,82 (C ⁶ )

m/z (NBA) : 425 [M + H] ⁺

d) Silanisation d' un support en silicium par le composé (III)

L' hydroxylation du substrat en silicium recouvert d'une couche d'oxyde thermique de 5000 â est réalisée dans une solution de soude 3,5M pendant 2 heures sous agitation. Le support est ensuite rincé successivement avec de l'eau désionisée et de l'éthanol sous ultrasons (4 minutes chacun) .

Une solution silanisante de concentration 10 ^~2 M dans du trichloroéthylène anhydre est utilisée, et la réaction de silanisation est effectuée à une température contrôlée de 2°C pendant 24h. Le support est ensuite rincé successivement avec du dichlorométhane, de l'éthanol et du chloroforme sous ultrasons (4 minutes chacun) .

La fonction diazo est obtenue lors d'une réaction post-silanisation du support modifié avec une solution de MnO ₂ activé dissous dans du diméthylformamide durant 30 minutes. Le support est ensuite rincé avec du diméthylformamide sous ultrasons (4 minutes chacun) .

R représentant CH ₃ .

EXEMPLE 2

Cet exemple illustre l'immobilisation d'un oligonucléotide sur le substrat modifié selon l'exemple 1 ci-dessus ainsi que l'hybridation de cet oligonucléotide avec une cible complémentaire.

a) Immobilisation de l' oligonucléotide sur le substrat modifié

Après activation du support solide par oxydation au MnO2, 2 pavés de 3 lignes, chacune comportant 3 plots d' acides nucléiques sont formés à partir des dépôts réalisés de façon manuelle à l'aide d'une micropipette, avec un volume déposé de 0,2μL pour chaque plot.

Le pavé supérieur correspond au PNA et l'inférieur à l'ODN (oligonucléotide) de même séquence en bases nucléiques (5'-GAT AAA CCC ACT CTA-3' ) , et de même concentration de lOμM dans le tampon citrate à 0,3 M avec un pH 9. La différence entre le PNA et l'ODN réside dans le fait que le PNA correspond à un enchaînement d'acides nucléiques, tel que défini ci- dessus, relié par un squelette peptidique tandis que l'ODN correspond au même enchaînement d'acides nucléiques mais relié par un squelette phosphodiester .

b) Traitement post-immobilisation

Après dépôt, le support solide est placé dans une chambre humide fermée hermétiquement et

laissée pendant environ 16 heures. Il est ensuite rincé à l'eau, puis au détergeant SDS (sulfate dodécyl de sodium) à 0,2% puis de nouveau à l'eau, avec une durée de 10 minutes pour chaque étape de lavage.

c) Hybridation

Ensuite, la révélation des plots d'acides nucléiques déposés sur le support solide est réalisée par l'étape d'hybridation en surface durant une heure à 40°C, avec une solution d'ADN de séquence complémentaire (5'-TAG AGT GGG TTT ATC-3' ) portant le groupe fluorophore CY3 dilué à 2OnM dans un tampon d'hybridation commercial (Hyb buffer solution Sigma Aldrich réf: H7140) à base de citrate de sodium. Le support solide est ensuite rincé au citrate de sodium à 0,2X (X représentant pour le citrate de sodium 15.10 mol . L ) durant 5 minutes.

d) Lecture et résultats

Les signaux de fluorescence sont obtenus sur un scanner vendu sous la dénomination GenePix® par la société AXON. Seuls les plots du pavé inférieur émettent une fluorescence, ce qui atteste de la spécificité de la réaction entre les fonctions phosphates du squelette phosphodiester de l' oligonucléotide ODN et de la fonction aryldiazométhane de surface. Les plots du pavé supérieur n'émettent pas de fluorescence, du fait que les PNA ne se sont pas immobilisés à la surface du

substrat, les groupements peptidiques de leur squelette ne pouvant réagir avec les fonctions aryldiazométhane de surface. Il a été constaté également une bonne homogénéité des résultats de fluorescence.