本发明涉及一种新的编码木糖异构酶的核酸分 子及其编码的木糖异构酶。 本发明涉及木 糖异构酶酶学性质的研究。 本发明涉及木糖异构酶在酶基因工程技术领域 的应用。 本发明还 涉及用编码木糖异构酶的核酸序列转化的宿主 细胞。

背景技术

石油价格的持续上涨和温室效应引起的全球变 暖， 使得人们越来越重视可再生能源的开 发和利用。 生物质能便是一种重要的可再生能源， 以生物质为原料生产燃料乙醇具有广阔的 发展空间。 长期以来， 人们利用淀粉和糖类发酵生产乙醇。 这些原料成本较高， 大大限制了 生物质燃料乙醇产业的发展。在全球每年光合 作用生产的高达 1500亿吨〜 2000亿吨的生物 质中 80%以上为木质纤维素类物质， 它十分廉价且容易获得， 因此以木质纤维素为原料生产 燃料乙醇， 具有重要的实践意义。 木质纤维素是纤维素、 半纤维素和木质素等的聚合物。 利 用酸解或酶解的方法可将木质纤维素转化为大 量的五碳糖 (木糖和阿拉伯糖） 和六碳糖 (葡萄 糖、 半乳糖和甘露糖）。 木糖在大多数木质纤维素水解物中是含量仅次 于葡萄糖的一种单糖， 可达 30%。分析表明， 充分利用木质纤维素原料中的木糖发酵生产乙 醇能使乙醇产量在原有 基础上提高 25% (Nigam et al.， J Appl Microbiol, 2001， 90 (2)： 208-215)。 但是， 大部 分能够进行乙醇发酵的酿酒酵母（■fecc ^/O/zy^e cere^sise)不能够以木糖作为碳源。 所以， 如何通过对已有菌株进行改造使其能高效利用 木糖产乙醇己成为使木质纤维素资源得以充分 利用的关键问题之一。

自然界利用木糖的酵母菌同化木糖的最初两步 反应是在木糖还原酶 (xylose reductase, XR)及木糖醇脱氢酶（xylitoldehydrogenase, XDH)催化下完成的。 木糖首先在 XR的催化下， 还原成木糖醇， 随后由 XDH氧化成木酮糖（Tr f f et al. , Appl Environ Microbiol, 2001, 67: 5668-5674)。 在大多数细菌， 如 £ coli和 Bacillus等中, 木糖通过木糖异构酶 (XI)直接 转化为木酮糖（Tr¾ff et al. , Appl Environ Microbiol, 2001, 67: 5668-5674)。 然后， 木 酮糖在木酮糖激酶（XK)的作用下转变成 5-磷酸木酮糖，进入磷酸戊糖途径。 酿酒酵母 {Saccharomyce cerevisise)具有高的酒精产量和产率，对抑制因� ��以及发酵过程中的不利因 素的高耐受性,对高浓度酒精的耐受以及非致� �性等优良特性。但由于缺乏木糖代谢的最初� � 个酶 XR和 XDH而不能代谢木糖。为了使酿酒酵母具有发酵 木糖的能力， 将依赖 NAD(P) H 的 XR 及依赖 NAD+的毕赤酵母 XDH 克隆到其中，得到能够发酵木糖生产酒精的重 组菌

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确认本 (Walfridsson et al. , Appl Environ Microbiol, 1995， 61 : 4184-4190； Sedlak et al. , Appl Biochem Biotechnol, 2004, 113-116: 403-416)。 但同时带来的问题是： XR对 NADPH 的亲 和性远远大于 NADH, 这就导致在 XDH催化的木糖醇氧化成木酮糖的过程中， 辅因子的不平 衡，其直接后果就是副产物木糖醇的积累和甘 油等的生成，从而影响终产物酒精的产量。 木糖 异构酶因不需要辅助因子， 因此它再次受到研究者们的注意（Kuyper et al. , FEMS Yeast Research, 2004, 4 : 655—664)。

木糖异构酶 (Xylose isomerase, XI) ( EC5. 3. 1. 5)可以催化五碳糖 D-木糖转化为 D-木 酮糖，微生物体内的糖代谢工程起着重要的作 用；在体外亦能催化 D-葡萄糖到 D-果糖的异构 化反应， 所以又称为葡萄糖异构酶。 在基础研究方面， 由于该酶的结构非常稳定， 是研究蛋 白质结构与功能关系较好的模型之一（Bhosale et al. , Protein Eng Des Sel, 12004, 17 ( 12) ： 861- 869)。 更重要的是， 木糖异构酶所具有的极其重要的工业应用价值 ， 使它和蛋白酶及淀 粉酶并称为重要的工业用酶（田沈等微生物学 通报， 2007, 34 ( 2 ) : 355- 358； Bhosale et al. , Microbiol Rev, 1996, 60 ( 2 ) :280 - 300)而引起科学家们的关注， 并对其开展了较为 广泛的研宄。从上个世纪 70年代以来， 木糖异构酶的应用主要集中在高果糖浆生产和 燃料乙 醇产生两个方面。 然而， 近几年， 科学家研究发现， 在一定条件下木糖异构酶可以转化生产 许多制药工业重要的原料稀有糖， 如核糖、 甘露糖、 阿拉伯糖、 来苏糖等 (Karimaki et al. , Protein Eng Des Se, 12004, 17 ( 12) ： 861- 869)。 这些发现为木糖异构酶的研究注入 新的活力。

据报道,虽然多种细菌来源的木糖异构酶基因� �曾被插入到酿酒酵母中，但是常见嗜温性 原核生物的 XI在酿酒酵母中不能表达有活性的 XI。 在目前已公布的约 450个木糖异构酶氨 基酸序列中， 两种来自啫热细菌的 XI在酿酒酵母中表达产物在 85Ό下具有 lU/mg的木糖异 构酶特异活性， 但是， 在酿酒酵母的生理温度 （30 ^D C)仅仅保留这种活性的极少部分。 其他 来源的能够在酿酒酵母中活性表达的木糖异构 酶基因来源包括真菌 Piromyces sp~E2, Orpinomyces 5p-Ukkl, Cyllamyces aberensis和细菌 Clostridium phytofermen tans , Clostridium difficile， Bacteroides fragilis, Fusobac terium-mortiferum 及 Ciona intestinaliso 其中， 仅仅有真菌 Piromyces sp~E2, 细菌 lostridium phytofermen tans 来源的木糖异构酶在酿酒酵母中得到较高活性 表达， 尤其是前者的活性更高。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种新来源 的嗜温性木糖异构酶，及编码该酶的基因， 以及表达该酶的宿主细胞。 本发明是通过以下技术方案实现的- 一种编码木糖异构酶的核酸分子， 其序列为以下核苷酸序列之一-

( 1 ) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；

(2) SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列添加、 取代、 缺失或插入一个或多个核苷酸的具 有至少 40%序列一致性的同源序列；

(3)在严格条件下， 与（1)或（2) 的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

(4) 由于遗传密码子的简并性区别于（3) 的核苷酸序列的核苷酸序列。

一种木糖异构酶， 其序列为以下氨基酸序列之一：

( 1 ) SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列；

(2) SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列添加、 取代、 缺失或插入一个或多个氨基酸的具 有至少 40%序列一致性的同源序列。

本发明的编码木糖异构酶的核苷酸编码的氨基 酸不包括选自以下各组的氨基酸序列：

( 1 ) Piromyces ·¾?~Ε2木糖异构酶在 W0 03/062340中公开的序列；

(2) Bacteroides t/wta otaomicron木糖异构鵜在 W0 04/099381和 W0 06/009434中 公开的序列；

(3) Cyllamyces abereyw s木糖异构酶在 W0 04/099381中公开的序列；

(4) Orpinomyces sp- Μϋ 木糖异构酶在 Madhavan et al. (2008, supra) 中公开的序 列；

(5) Clostridium difficile, Fusobacterium-mortiferum ~ Ciona intestinal is β¾ 木糖异构酶在 W0 2010/074577中公开的序列。

本发明的编码木糖异构酶的核苷酸编码的氨基 酸序列,其序列不包括选自以下各组的氨 基酸序列 ： 序列 一致性高于选 自 以 下各组的氨基酸序列 的 99， 98, 97, 96, 95, 94， 93, 92, 91， 90, 89， 88, 87， 86， 85, 84, 83， 82, 81, 80, 79, 78， 77， 76, 75， 74， 73, 7 2， 71或 70%的氨基酸序列。

( 1 ) Piromyces ·5/τ£2木糖异构酶在 W0 03/062340中公开的序列；

(2) Bacteroides i ?eia oiaoM'c W7木糖异构酶在 W0 04/099381和 W0 06/009434中 公开的序列；

(3) Cyllamyces aber s s木糖异构酶在 W0 04/099381中公开的序列；

(4) Orpinomyces s KJkkl 木糖异构酶在 Madhavan et al. (2008, supra) 中公开的序 (5) Clostridium difficile, Fusobacterium-mortiferum Ciona intestinal is β¾ 木糖异构酶在 WO 2010/074577中公开的序列。

所述木糖异构酶在化工、 食品和医疗等领域的应用。

本发明的木糖异构酶具有的极其重要的工业应 用价值，其应用主要集中在高果糖浆生产 和燃料乙醇产生两个方面。 在一定条件下木糖异构酶还可以转化生产许多 制药工业重要的原 料稀有糖， 如核糖、 甘露糖、 阿拉伯糖、 来苏糖等。 在基础研宄方面， 由于该酶的结构非常 稳定， 是研究蛋白质结构与功能关系较好的模型之一 。

一种重组载体， 其含上述的编码木糖异构酶的核酸分子的完整 编码阅读框序列。

一种重组细胞， 其宿主细胞为细菌、 酵母或丝状真菌， 优选具有厌氧乙醇发酵能力的酵 母； 宿主细胞内含有上述的重组载体， 编码木糖异构酶的核苷酸序列被可操作地连接 于宿主 细胞中引起木糖异构酶充分表达的启动子， 从而赋予了宿主胞将木糖异构化木酮糖的能力 。

所述宿主细胞优选含有主动糖酵解、 戊糖磷酸途径和含有木酮糖激酶活性使得从木 糖异 构得到的木酮糖可以被代谢为丙酮酸的宿主细 胞。

所述宿主细胞优选含有将丙酮酸转化为期望的 分解代谢物如乙醇、 乙烯或乳酸的酶的宿 主细胞。

所述宿主细胞优选具有厌氧乙醇发酵能力的酵 母；

所述宿主细胞还优选对乙醇和有机酸如乙酸、 乳酸或蚁酸及糖分解代谢物如糠醛和羟甲 基糠醛具有耐受能力的宿主细胞。

上述宿主细胞的这些特征或活性之一可以是天 然存在于宿主细胞或通过遗传修饰被引入 或改进。

所述宿主细胞包含一种遗传修饰， 该遗传修饰降低非特异性醛糖还原酶活性。

所述宿主细胞具有将 L-阿拉伯糖转化为 D-木酮糖 5-磷酸的能力。

所述宿主细胞包含一种或多种遗传修饰， 该遗传修饰产生选自如下一组的特征：

( 1 )增加木糖转运到宿主细胞内；

(2)木酮糖激酶活性增强；

(3)戊糖磷酸途径的流量增加；

(4)对分解代谢物阻遏的敏感性降低；

(5)对乙醇、 渗透性或有机酸的耐受力增强；

(6)副产物生成下降；

(7)细胞电子链传递和氧化呼吸链阻断。 所述副产物被理解为是指含碳分子而不是期望 的发酵产物，包括如木糖醇、甘油或乙酸。 所述遗传修饰由过度表达内源基因、 表达异源基因或其组合组成， 且所述基因选自下列 基因： 己糖或戊糖转运蛋白基因、 木酮糖激酶基因、 来自戊糖磷酸途径的酶的基因、 糖酵解 酶的基因或 /和乙醇发酵相关的酶的基因。

所述宿主细胞表达一种或多种酶， 所述的酶赋予宿主细胞产生乳酸、 乙酸、 琥珀酸、 氨 基酸、 1，3-丙二醇、 乙烯、 甘油、 β -内酰胺抗生素或 /和头孢菌素等系列代谢产物的能力。

一种利用上述重组细胞生产发酵产物的方法： 宿主细胞发酵含有木糖原料或 /和葡萄糖原 料的培养基， 然后分离纯化发酵产物， 所述发酵产物为乳酸、 乙酸、 琥珀酸、 氨基酸、 1, 3 - 丙二醇、 乙烯、 甘油、 内酰胺抗生素或 /和头孢菌素。

上述被转化的宿主细胞异构木糖为木酮糖的能 力是直接将木糖异构化为木酮糖， 不同于 木糖通过木糖醇过度两步转化为木酮糖， 其分别由木糖还原酶和木糖醇脱氢酶催化。

本发明的编码木糖异构酶的核苷酸序列以活性 形式在被转化的宿主细胞中表达， 因此， 核苷酸序列在宿主细胞中表达生成具有特定活 性的木糖异构酶。 在被转化的宿主细胞中表达 的木糖异构酶特异性活性在此定义为宿主细胞 的无细胞溶解产物如酵母的无细胞溶解产物中 的每 mg蛋白的木糖异构酶活性单位量。木糖异构酶� ��性的确定、蛋白含量和无细胞溶解产物 的制备在下述实施例 2中描述。新木糖异构酶在酿酒酵母中高活性� �达。 30°C下，采用 XI-SDH 一步法测定木糖异构酶酶活（Kuyper et al. , FEMS Yeast Research, 2003, 4 :69-78)， 该酶酶 活为 1. 3U/mg,高于 Piromyces 来源的木糖异构酶酶活 1. lU/rag (Kuyper et al. , FEMS

Yeast Research, 2003, 4:69-78) 。 但是新来源的木糖异构酶是一种嗜温性木糖异 构酶， 最 适酶活温度在 60 C (图 3) 。

附图说明

图 1 : 验证重组细胞中含有木糖异构酶基因 RuXI。 以反提重组酵母质粒为模板， 特异性 引物 BaraHI- GXI-F, Sbfl- GXI- R (表 1 )扩增 RuXI。 M： Marker, lkbDNA ladder 1 : RuXI; 图 2: 验证重组细胞中含有木糖异构酶基因 RuXI。将反提质粒反转到大肠杆菌 DH5 CI中， 提取质粒， fe zHI和 ¾/1双酶切验证结果。 M: Marker, lkbDNA ladder 1 :约1. 31^为 RuXI, 约 6kb的为线性载体 pJFE3;

图 3: 酿酒酵母转化子的新木糖异构酶最适酶活温度 测定；

图 4: 酿酒酵母转化子在含有 20g/L葡萄糖、 20g/L木糖作为碳源的培养基中的生长曲 线；

图 5: 酿酒酵母转化子在含有 20g/L木糖作为唯一碳源的培养基中的生长曲线� �� 图 6: 酿酒酵母转化子在含有 20g/L木糖作为唯一碳源的培养基中的限氧乙醇� ��酵结果 分析。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例 1 克隆来自牛瘤胃液宏基因组文库的木糖异构酶 的 DNA序列

木糖异构酶保守区域间的部分糖异构酶的 DNA序列的克隆：

以构建好的牛瘤胃液宏基因组文库为模板， 以简并引物 XIcF和 XIcR (表 1 )为引物， PCR扩增， 得到大约 400bp的片段， 将清晰的条带纯化并连接到 T载体上， 任意挑取 22 个釆用通用引物验证的克隆送去测序。测序结 果表明： 22个克隆的 DNA插入片段的序列 全属于木糖异构酶的特有序列。其中 21个克隆的 DNA插入片段的序列为大肠杆菌的木糖 异构酶基因保守序列， 只有一个克隆的 DNA插入片段属于新来源的木糖异构酶基因保守 序列。 该片段命名为 2PXI- 3， 374bp。

表 1 所用的引物序列

Primer Sequence (5'-* 3' )

XIcF(18bp) TGGGG (A/T/C/G) GG (A/T/C/G) CG (A/T/C/G) GA (G/A) GG (A/T/C/G)

XIcR(23bp) GG (A/G) AA (T/C) TG (A/G) TC (A/T/C/G) GT (A/G) TCCCA (A/T/C/G) CC pBK-F GCCGCTCTAGAAGTACTCTCGAGA

pBK-R ATGACCTTGATTACGCCAAGCTCG

pBK-Rl ATTAGGCACCCCAGGCTTTACACT

2PX I-F CAGAAGCGTGAGAAGGAGCACATG

2PX I-R GTGACCAGCCAATGTAGCGTGGTT

2PX I-F2 GATGCTGGGTATGGCTCGTGACTA

2PX I-R2 CAGCATACCAGCGTCAACAGCACA

BamHI-GXI-F GCTCGGATCCATGGCAAAAGAATATTTTCCG

Sbfl-GXI-R CATACCTGCAGGTTATTTGCAGTGGAGGGCGA 木糖异构酶的 5'和 3' DNA序列的克隆：

根据载体 pBK-CMV序列和 2PXI-3序列，设计七个特异性引物： pBK F, pBK-R, pBK-Rl, 2PXI-F, 2PXI-R, 2PXI-F2, 2PXI-R2 (表 1)。 以牛瘤胃液宏基因组文库为模板， 沿目的 片段两侧分别进行 PCR扩增。 由引物 pBK- Rl, 2PXI-F扩增得到基因的 3' 0 片段1^1 _; 由引物 pBK - F, 2PXI-R扩增得到基因的 5' DNA片段 PR。

木糖异构酶全长 DNA序列的克隆：

将 xyl 基因 5'序列和 3'序列拼接，设计特异性引物 BamHI- GXI-F, Sbfl- GXI- R (表 1 )。 以牛瘤胃液宏基因组文库为模板， PCR扩增得到 1320bp xylA基因，命名为 RuXI， 如 SEQ ID NO. 1所示。

实施例 2 在酵母中表达新来源的木糖异构酶 RuXI

构建酵母表达载体：

木糖异构酶 RuXI的 DNA和 聚合酶用于 PCR反应中。用木糖异构酶基因的 5'和 3' 的序列设计引物， 还含有 SbH和 BamHi限制性酶切位点。 PCR产物被克隆到 pJFE3载体 中， 得到重组质粒 pJFE3- RuXI。

构建含有木糖异构酶基因的重组酿酒酵母：

将具有木糖异构酶基因的质粒 pJFE3-RuXI转化到酿酒酵母中。 宿主酿酒酵母菌主要特征 为： 超表达 ¾31和 PPP途径的 RKR TALI ΤΚΙλ 敲除醛糖还原酶基因 Ώ¾3; 且经过 特殊修饰， 宿主酿酒酵母的呼吸途径被阻断。转化子在 SC-URA平板上筛选， 未被转化的细胞 不能在这些平板上生长。

从重组酿酒酵母转化子中提取质粒验证重组细 胞中表达的木糖异构酶为 SEQ ID NO. 2所 示的氨基酸序列：

采用试剂盒提取重组酵母菌中质粒，可以通过 两方面验证重组细胞中表达的木糖异构酶为 SEQ ID NO. 2 所示的氨基酸序列： （1 ) 以所提质粒为模板， 特异性引物 BaraHI-GXI - F, Sbfl-GXI-R (表 1 )扩增 RuXI, ( 2 )用所提质粒转化大肠杆菌 DH5 α中， 提取质粒， Ba iHI和 5¾ 1双酶切。 同时将提取的质粒进行测序， 确定目的基因的序列。

结果- 从重组酿酒酵母中提取的质粒测序结果表明： 目的基因序列与 SEQ ID NO. 1所示的核苷 酸序列一致， 该质粒 PCR (图 1 )及酶切验证（图 2 ) 的结果也表明： SEQ ID N0. 1所示的核 苷酸序列已被转入到酿酒酵母中， 即重组细胞中表达的木糖异构酶为 SEQ ID NO. 2所示的氨 基酸序列。

表达：

被转化的酵母细胞在 30'C下， 初始 0D =0. 2左右， 在葡萄糖培养基中生长 12h。 回收 细胞。 用玻璃珠 （0. 10- 0. 1 Iran)和裂解缓冲液 （lOOmM Tris-HCl+蛋白酶抑制剂）溶解 细胞。 用机械震荡细胞破碎仪裂解细胞， 破胞后， 离心混合物 （l l, 000xg，4°C, 10mi _n )。

澄清的上清液采用 XI- SDH (木糖异构酶偶联山梨醇脱氢酶)一步法测定木� ��异构酶活 性（100mM， pH7. 5Tri s- HC1, 500 mM xylose, 10 mMMgCl ₂ ,粗酶液 10 μ 1， 1U SDH, 0. 15 mM NADH， 在 340nm下检测 NADH被氧化的量，即在 340nm下做时间扫描） （Kuyper et al. , FE S Yeast Research, 2003, 4 : 69-78) 。 由于木糖异构酶酶活测定方法中用到的山梨醇 脱氢酶（SDH) 需要合适的反应温度， 因此， 对木糖异构酶最适酶活温度的研究釆用 XI-SDH (木糖异构酶偶联山梨醇脱氢酶)两 步法测定 (Lonn et al.， European Journal of Biochemistry, 2002， 269 ( 1 )： 157 - 163)。 第一步反应： lOOmM, pH7. 5Tris- HCl, 500 raM xylose, 10 mMMgCl ₂ ,粗酶液 10 μ 1。 50%三 氯乙酸终止反应， 2Μ碳酸钠中和反应。第二步反应：取上一步反 应液 100 μ 1， lOOmM pH7. 5 Tris- HCl, 1U SDH, 0. 3 mM NADH,在 340nm下检测 NADH被氧化的量， 即在 340nm下做时 间扫描） 。在 lOOmM pH7. 5 Tris- HCl, 10 mMMgCl ₂ 条件下，测定木糖异构酶在 20°C, 25 °C, 30°C, 35V, 40 °C, 50 °C, 60 °C, 70 °C, 80°C下的酶活变化 （图 3) 。 蛋白含量的测定参 照 Bradford (1976)的考马斯亮兰 （Comassie Blue)法。

结论： 本发明的木糖异构酶在酿酒酵母中高活性表达 。本发明的木糖异构酶是一种嗜 温性木糖异构酶， 最适酶活温度在 60°C (图 3) 。 30°C下， 采用 XI- SDH—步法测定木糖 异构酶酶活（Kuyper et al. , FEMS Yeast Research, 2003, 4: 69-78)，该酶酶活为 1. 3U/mg, 高于 Piromyces sp^2来源的木糖异构酶酶活 1. lU/mg (这一数据来自于本发明筛选的木 糖异构酶同一批次的测定实验， 同时， 该数据与文献 Kuyper et al. , FEMS Yeast Research, 2003, 4 : 69- 78报道的一致） 。

实施例 3 被转化的酵母菌株在木糖上生长和发酵实验

培养基成分- 酿酒酵母在具有下列成分的 SC培养基中生长： 0. 67 (w/v) %酵母氮源（yeast nitrogen base); 除尿嘧啶以外的氨基酸及嘌呤、 嘧啶混合物 （CSM-URA)。 对于平板， 培养基中 添加 1. 8%琼脂， 调节 pH至 6. 5-7. 0。

生长实验：

宿主酵母菌株 BSPX042 (表型： ura3-251， 超表达 超表达 PPP途径的 RPEi RKR TALI TKL 敲除醛糖还原酶基因 G -、 且经过特殊修饰， 破坏呼吸途径， 并经过驯化 而得） ， 分别用空载体 PJFE3和插入新来源的木糖异构酶基因的载体 PJFE3- RuXI转化， 分别得到重组菌 BSGX000和 BSGX001。 将两重组菌株分别在 2%葡萄糖， 2%木糖为共同碳 源及 2%木糖为唯一碳源的 SC液体培养基中生长。 通过测定 600nra下在分光光度计中光 密度的升高来监控生长。

结果：

生长实验的结果在图 4和图 5中。 在 2%葡萄糖， 2%木糖为共同碳源的 SC液体培养基 中， 在葡萄糖消耗阶段， 重组菌 BSGX000和 BSGX001生长趋势差不多， μ π»χ均为 0. 31。 葡萄糖耗尽后， BSGX001较 BSGX000生长良好（图 4)。 在 2%木糖为唯一碳源的 SC液 体培养基中， 不含木糖异构酶基因的重组菌 BSGX000没有生长； 含有木糖异构酶基因 Ru 的重组菌 BSGX001生长较好， μ max为 0. 16 (图 5)。

实施例 4 被转化的酵母菌株以木糖为唯一碳源的限氧乙 醇发酵实验

培养基成分：

SC液体培养基： 0. 67 (w/v)%酵母氮源（yeast nitrogen base); 除尿嘧啶以外的氨基 酸及嘌呤、 嘧啶混合物（CSM-URA); 2%木糖。

重组菌 BSGX001在 2%木糖为唯一碳源的 SC液体培养基中限氧发酵实验。 在 lOOmL限 氧瓶内进行发酵， 发酵时间为 72h， HPLC分析发酵底物木糖及产物乙醇的变化。

结果：

含有本发明的木糖异构酶的重组菌 BSGX001 , 在 2%木糖为唯一碳源的 SC液体培养基 中限氧发酵， 乙醇产率达到 0. 24克每克生物量每小时， 糖醇转化率达到 44%， 基本没有 副产物木糖醇生成（图 6)。