CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao campo da biologia molecular de plantas, transformação de plantas, e reprodução de plantas e controle de praga. Mais especificamente, a invenção relaciona-se a plantas de milho (Zea mays ) transgênicas resistentes a insetos-pragas lepidópteros compreendendo um novo genótipo transgênico, usos das mesmas, métodos de controle de insetos-pragas lepidópteros e detecção da presença de ácidos nucléicos únicos às plantas de milho transgênicas em um produto de planta e composições desta.

ANTECEDENTES

Avanços consistentes em técnicas de engenharia genética têm possibilitado o desenvolvimento de plantas transgênicas de importância comercial, contendo genes heterólogos de interesse, os quais conferem características desejáveis a tais plantas. Dentre os genes de interesse podem ser citados genes que conferem às plantas resistência a herbicidas, a estresses ambientais, doenças e a pragas invertebradas.

No contexto de genes que codificam proteínas que são úteis para o controle de pragas invertebradas, pode ser citado o gene cry, oriundo da bactéria Gram positiva Bacillus thuringiensis (Bt). Tal bactéria, de ocorrência natural em diversos habitats, incluindo solo, filoplano, resíduos de grãos, poeira, água, matéria vegetal e insetos, possui a característica inata de formar cristais proteicos durante a fase estacionária e/ou de esporulação. Os cristais proteicos ou delta- endotoxinas, representando de 20 a 30% da proteína total da célula (Boucias & Pendland, 1998), podem apresentar propriedades inseticidas específicas e ter várias formas, tais como: bipiramidal, esférica, retangular, cuboide e irregular. Os cristais bipiramidais apresentam uma maior frequência de toxicidade do que os cristais com outras formas, em particular contra lepidópteros.

O mecanismo de ação das proteínas Cry com efeito inseticida envolve, de forma geral, a solubilização dos cristais no intestino médio dos insetos alvo, a ação digestiva de proteases presentes no intestino desses insetos sobre as pro-toxinas, a aderência das toxinas ativas aos receptores do intestino médio e a inserção destas toxinas Cry ativas na membrana apical celular, criando canais de íons ou poros (citólise). Esses canais quando formados podem alterar a alimentação do inseto e disrupção da integridade do intestino levando a diminuição de crescimento e até a morte.

Uma vantagem do uso das proteínas Cry na agricultura é a toxicidade seletiva de cada uma dessas proteínas contra várias espécies de insetos praga, e sua natureza não tóxica a outros organismos vertebrados, tais como peixes, anfíbios, répteis, aves e mamíferos. Outra vantagem das proteínas Cry é sua relativa especificidade de toxicidade em relação aos insetos-praga das diferentes culturas. Atualmente são reconhecidos diversos genes cry. Os genes cry1, cry2 e cry9 são geralmente ativos contra lepidópteros; os genes cry2, cry4A, cry10, cry11, cry17, cry19, cry24, cry25, cry27, cry29, cry30, cry32, cry39 e cry40 são geralmente ativos contra dípteros; os genes cry3, cry7 e cry8 são geralmente ativos contra coleópteros; e os genes cry5, cry12, cry13 e cry14 são geralmente ativos contra nematódeos. Produtos comerciais contendo proteínas Cry de Bt com atividade inseticida são produzidos hoje e utilizadas como biopesticidas. Esses produtos apresentam alta porcentagem de venda no mercado e têm sido utilizados a mais de 60 anos para o controle principalmente de pragas das ordens Lepidoptera e Diptera. Outro uso dessas proteínas Cry é a sua expressão em plantas transgênicas.

Apesar do uso de proteínas Bt especificas em plantas transgênicas de milho para o controle de insetos pragas, o seu uso tem produzido populações de Lepidoptera e Coleoptera resistentes às algumas dessas proteínas Bt (Tabashnik, B.E.; Brévault, T; Carrière, Y. Insect resistance to genetically engineered crops: successes and failures. ISB News Report: Agricultural and Environmental Biotechnology, Jan. 2014.). Um caso especifico é o aparecimento de populações de Spodoptera frugiperda resistentes especificamente aos genes Cry1F e Cry1A mais encontrados em condições tropicais. Spodoptera é a principal praga em várias regiões do mundo que cultivam o milho e o desenvolvimento da resistência as proteínas Cry1F e Cry1A representa um desafio significante para a produção de milho nesses locais no mundo. Populações de Spodoptera encontradas no campo identificadas como resistentes a proteínas Cry1F foram registradas (1) em 2010, Porto Rico (Storer, N.P.; Babcock, J.M.; Schlenz, M.; Meade, T.; Thompson, G.D.; Bing, J.W.; Huckaba, R.M. Discovery and characterization of field resistance to Bt maize: S. frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in Puerto Rico. Journal of Economic Entomology, v.103, p.1031 -1038, 2010.), (2) nos Estados Unidos (Huang, F.; Qureshi, J.A.; Meagher JR, R.L.; Reisig, D. D.; Head, G.P.; Andow, D.A.; NI, X.; Kerns, D.; Buntin, G.D.; Niu, Y.; Yang, F.; Dangal, V. Cry1F resistance in fali armyworm S. frugiperda: single gene versus pyramided Bt maize.) e (3) no Brasil (Farias, J.R.; Andow, D.A.; Horiksoshi, R.J.; Sorgatto, R.J.; Fresia, P.; Santos, A.C.; Omoto, C. Field-evolved resistance to Cry1F maize by S. frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in Brazil. Crop Protection, v.64, p.150-158, 2014). No Brasil foram identificadas ainda populações de S. frugiperda resistentes a CrylAb (Omoto, C.; Berbardi, O. Salmeron, E.; Sorgatto, R. J.; Dourado, P. M.; Crivellari, A.; Carvalho, R. A.; Willse, A.; Martinelli, S.; Head, G. P. Field-evolved resistance to CrylAb maize by S. frugiperda in Brazil. Pest Management Science, Chichester, 2016). Algumas dessas populações de S. frugiperda resistentes ao Cry1F se desenvolvem rapidamente em função da pressão seletiva de produtos baseados em plantas transgênicas contendo apenas um gene cry1 ativo contra S. frugiperda.

Em função desse problema em larga escala do desenvolvimento de resistência a genes simples expressando Cry1 F em plantas de milho, cultivares comerciais são disponibilizadas contendo a combinação de dois ou mais genes inseticidas tais como crylAb, cry1F, vip3A, cry1A.105, cry2Ab, cry3Bb, cry34Ab, cry35Ab, mcry3A, ecry3.1Ab, e dvsnf7.

É critico portanto utilizar proteínas com diferentes modos de ação na chamada piramidização de proteínas que retardam a taxa de desenvolvimento da resistência. Consequentemente tem havido grande interesse na continuidade da descoberta de novas proteínas ativas contra S. frugiperda que não tenham resistência cruzada com aquelas que já apresentam resistência a, por exemplo, Cry1F.

O gene dvsnf7 é uma outra tecnologia de controle de insetos pragas que utiliza RNA de fita dupla para inibição de genes importantes para a sobrevivência do inseto. Contudo, tem baixo efeito sobre a ordem lepidóptera que é extremamente voraz causando desfoliamento em tempos muito curtos.

Existe, portanto, uma grande necessidade de desenvolvimento de novas proteínas alternativas, que são tóxicas tanto para populações de insetos do tipo selvagem como também as populações resistentes a Cry1 F/Cry1A. Essas novas proteínas devem ter alto valor para uso em estratégias de transgenia, serem passíveis de aplicação em tecnologia de transgênicos, e serem capazes de controlar pragas de insetos lepidópteros em plantações transgênicas.

Uma dessas proteínas é CrylDa, produzida por algumas cepas de Bt e conhecidas por serem tóxicas para S. frugiperda (Costa, ML, Lana, UG, Barros, EC, Paiva, LV and Valicente, FH, J of Agricultural Science, 2014, vol 6, ppi 28-136). Entretanto, a proteína CrylDa é descrita em artigos anteriores como tendo um espectro limitado de toxicidade contra pragas de lepidópteros (von Frankenhuyzen, 2009) e toxicidade variável para populações diferentes dentro de uma espécie de lepidópteros, como S. frugiperda. Por exemplo, Monnerat et al (2006). descobriram que a proteína CrylDa era tóxica para S. frugiperda coletada na Colômbia e no México, mas que foram não tóxicas para uma população coletada no Brasil (Applied and Environmental Microbiology, 2006, vol 72, p. 7029-7035).

O espectro relativamente pequeno de atividade contra pragas de lepidópteros e sua variabilidade quanto ao nível de toxicidade tem sido uma limitação importante do uso do CrylDa. Especificamente, von Frankenhuyzen (Frankenhuyzen, K. 2009. Minireview: Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis crystal proteins. Journal of Invertebrate Pathology. 101 : 1-16) relatou que CrylDa tinha o menor espectro de atividade das proteínas Cry1 contra uma variedade de espécies de lepidópteros (tóxicas contra apenas 44% das espécies testadas) em comparação com as principais proteínas Cry1A e 2Aa testadas (ativas contra > 80% das espécies testadas). Devido às limitações da proteína CrylDa nativa no espectro de atividade e sua variabilidade em nível de toxicidade, pesquisadores tem trabalhado para melhorar a estrutura da proteína Cry1 Da nativa para se tornar mais eficiente contra um espectro maior de insetos pragas da ordem Lepidoptera, mais especificamente a lagarta da espiga ( Helicoverpa zea).

O documento W020071 07302 descreve o uso de sequências de Cry1C, Cry1D ou CrylDa para produzir uma nova proteína quimérica potencialmente ativa contra a lagarta da espiga. Da mesma maneira, os documentos WO2015143311 e WO2016061377 descrevem modificações estruturais da proteína Cry1 Da na tentativa de ampliar o espectro contra outras pragas de lepidópteros, especificamente lagarta da espiga ( Helicoverpa zea) incluindo modificações na sequência de aminoácidos nativa do CrylDa ou na fusão com outras proteínas inseticidas para aumentar a atividade inseticida contra um espectro mais amplo de pragas de lepidópteros. Por causa do foco desses experimentos e descobertas terem se voltado para aumentar o espectro da atividade de CrylDa contra outros lepidópteros, essencialmente não existem dados disponíveis referentes à toxicidade de Cry1 Da ou suas variantes de ocorrência natural contra populações de S. frugiperda incluindo aquelas resistentes a Cry1F. O único estudo envolvendo a avalição de Cry1 Da expressa em plantas de milho transgênica mostrou que essa proteína tem efeito pequeno ou moderado de proteção contra os danos foliares causados por S. frugiperda (população não especificada no trabalho). E ainda, não são mostrados dados específicos sobre toxicidade desta proteína contra esta praga. Dado o nível de dano produzida no estudo citado acima, é razoável concluir que as plantas transgênicas tiveram apenas um pequeno efeito toxico sobre os insetos.

Com relação às plantas geneticamente modificadas, construções de DNA que codificam proteínas desejadas são individualmente inseridas no genoma da planta por transformação genética. Os atuais métodos de transformação das plantas utilizam principalmente a Agrobacterium tumefaciens que geralmente levam a um baixo número de cópias das construções gênicas dentro do genoma da planta hospedeira. As construções genicas são compostas de um promotor, região codificadora e terminador. O promotor é o elemento regulador e determinante da expressão tanto temporalmente como especialmente do gene. Geralmente para expressão de quantidade suficientemente grande, como é o caso de produção de proteína inseticida para controle de insetos-pragas lepidópteros, as construções utilizam promotores constitutivos como por exemplo o que controla a expressão do gene da ubiquitina em milho.

A integração da construção de DNA no genoma do hospedeiro é aleatória, e essa inserção aleatória no DNA do genoma da planta pode impactar um gene cujo produto é crítico para a sobrevivência da planta, tornando a planta resultante inviável. Além disso, a inserção aleatória pode ter como alvo uma região do genoma do hospedeiro que pode influenciar negativamente a expressão do gene de interesse, independentemente do uso de promotores constitutivos. Em outros exemplos, a superprodução do produto genético da construção tem efeitos prejudiciais para a célula, levando principalmente à diminuição da produtividade. Devido a esses problemas em potencial, é comum produzir dezenas (em alguns casos centenas) de eventos diferentes e rastrear esses eventos para um único evento que possua os padrões e níveis desejados de expressão transgênica para fins comerciais.

Um evento que possui níveis ou padrões desejados de expressão transgênica é útil para ser transferido para outros backgrounds genéticos da mesma espécie através de um cruzamento sexual tradicional. Existem relatos de genes que mesmo em expressão de níveis altos e constitutivos no genótipo progenitor, não necessariamente apresentaram a mesma resposta em outros backgrounds genéticos. Dessa forma é desejável que, além de uma expressão espacial e temporal adequadas, eventos de transformação apresentem uma variação baixa de expressão do gene em cruzamentos com outros genótipos (diferentes backgrounds).

Neste caso, a descendência de tais cruzamentos mantém as características de expressão transgênica da planta hospedeira transformante original. Essa estratégia é usada para garantir a expressão genética confiável em várias variedades que estão bem adaptadas às condições locais de crescimento. Isso é impactado por ter inserido o DNA integrado em locais ideais dentro do genoma, proporcionando, assim, os melhores níveis de expressão temporal e espacial, estabilidade em várias gerações de criação e em várias origens genéticas. Como tal, a localização genômica física do DNA inserido torna-se uma característica fundamental da eficácia do produto resultante e, portanto, é nova.

Também seria de grande interesse estabelecer um método capaz de detectar a presença de um evento de transformação específico, a fim de determinar a presença do referido evento para teste de qualidade de sementes, liberação de campo e em plantas ou amostras processadas. Tais métodos poderiam ser utilizados também para determinar e acompanhar a segregação do gene em progénies de cruzamentos sexuais, rastreabilidade do evento em cruzamentos e detecção em alimentos derivados das plantas recombinantes. Um método de detecção do ácido nucléico bem conhecido, mas não limitado, é a amplificação de DNA in vitro pela técnica do PCR (Polimerase Chain Reaction - Reação de Polimerase em Cadeia) usando iniciadores de polinucleotídeo. O outro método é a hibridização do DNA usando sondas de ácido nucléico. Os métodos de detecção podem utilizar iniciadores ou sondas baseadas em elementos comuns entre diferentes construções gênicas ou baseadas em regiões especificas da construção.

Pelas razões mencionadas acima, há uma necessidade de identificação de métodos de detecção baseados em sequências novas de ácido nucléico que são únicas ao evento de milho transgênico, úteis para identificar o evento de milho transgênico e para detectar ácidos nucléicos do evento de milho transgênico em um produto de planta, bem como de kits compreendendo os reagentes necessários para o uso na detecção destes ácidos nucléicos em um produto de planta.

SUMÁRIO

A presente invenção refere-se a um evento de milho transgênico, designado ME240913 compreendendo um novo genótipo transgênico que contém uma sequência de ácido nucléico crylDa otimizada para expressão em milho. A sequência de codificação crylDa codifica uma variante truncada da proteína nativa CrylDa de SEQ ID NO: 3 que surpreendentemente confere alto nível de proteção das plantas contra danos nas folhas produzidos por várias populações de S. frugiperda que ocorrem naturalmente no Brasil (tipo selvagem e resistente ao Cry1 F). É importante ressaltar que o tecido foliar do evento ME240913 produz uma alta toxicidade inesperada para pragas de insetos lepidópteros, como insetos Noctuidae, particularmente S. frugiperda. Além da sequência codificante crylDa, a presente invenção também fornece outros ácidos nucléicos que são únicos ao evento ME240913, a saber a sequência de um amplicon resultante de reação PCR utilizando iniciadores específicos para confirmar a sequência de junção 5’, a sequência de junção 3’, sequências flanqueadoras 5’ e 3’, e/ou complementos das mesmas. A invenção também fornece amplicons compreendendo os ácidos nucléicos únicos do evento ME240913, plantas de milho transgênico compreendendo os ácidos nucléicos únicos do evento ME240913 e sementes das plantas de milho transgênico.

A presente invenção também se refere a métodos para produzir uma planta de milho transgênica compreendendo os ácidos nucléicos únicos da invenção pelo cruzamento sexuado de uma primeira planta de milho progenitora com uma segunda planta de milho progenitora para produzir uma pluralidade de plantas descendentes de primeira geração, em que pelo menos uma das referidas plantas progenitoras compreende um ácido nucléico único para o evento ME240913, seleção de uma planta descendente de primeira geração que seja resistente a infestação por insetos-pragas lepidópteros, autopolinização da planta descendente de primeira geração para produzir uma pluralidade de plantas descendentes de segunda geração, e seleção, dentre as plantas descendentes de segunda geração, de uma planta que seja resistente a insetos-pragas lepidópteros.

A presente invenção descreve ainda métodos para controlar insetos-pragas lepidópteros, tais como da família Noctuidae, particularmente S. frugiperda. As plantas de milho compreendendo o evento ME240913 e métodos da presente invenção são eficazes para o controle de populações insetos-pragas lepidópteros específicas, tal como S. frugiperda, que se tornaram resistentes às plantas expressando proteína Cry1F.

Métodos para a produção de sementes de milho híbridas também são revelados. Tais métodos compreendem as etapas de plantio de sementes de uma primeira linhagem de milho congénita compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeos única para o evento ME240913 e de sementes de uma segunda linhagem congénita tendo um genótipo diferente, cultivo de plantas de milho resultantes das referidas sementes plantadas até a época de floração, emasculação das flores das plantas de uma das linhagens congénitas de milho, cruzamento sexual das duas diferentes linhagens congénitas uma com a outra, e colheita da semente híbrida assim produzida.

Uma amostra da semente, e consequentemente plantas de milho cultivado da semente, compreendendo ácidos nucléicos únicos para o evento ME240913 foi depositada na American Type Culture Collection (ATCC) com número de acesso PTA-126224. As plantas do milho transgênico da invenção apresentam essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas correspondentes das plantas de milho não-transgênicos isogênicos em adição àquelas conferidas nas plantas de milho pelo novo genótipo da invenção. Produtos de planta e extratos das plantas de milho ME240913, tecidos e sementes também são fornecidos pela presente invenção.

A presente invenção fornece ainda métodos de introgressão do evento ME240913 em linhagens de milho por meio do cruzamento sexual de plantas contendo o evento ME240913, tais como, por exemplo, mas não limitado as plantas obtidas a partir das sementes depositadas na American Type Culture Collection (ATCC) com número de acesso PTA-126224.

De acordo com a presente invenção, o evento ME240913 pode ser combinado com outros eventos transgênicos de milho por meio de métodos conhecidos na técnica, tais como piramidação de genes. O ensinamento de que ME240913 produz um alto nível de controle contra danos às plantas produzidos por várias populações de S. frugiperda brasileiras (incluindo insetos resistentes a Cry1 F) estabelece que o novo evento é tóxico para as populações de S. frugiperda resistentes a Cry1 F no Brasil. Estes resultados também indicam que o evento ME240913 atua através de um mecanismo de ação distinto do que o Cry1F e, portanto, o evento do milho será muito eficaz quando combinado com outros genes inseticidas incorporados na planta usando piramidação gênica. O evento ME240913 também expressa o gene de resistência ao herbicida pat (bar). Portanto, o evento ME240913 também pode ser usado para reduzir a taxa de resistência a herbicidas usando a piramidação gênica.

Exemplos de piramidação gênica incluem, mas não são limitados a eventos de resistência a herbicida e a insetos-pragas. Por meio de tais métodos, o evento ME240913 pode ser combinado, por exemplo, com eventos contendo um ou mais genes selecionados de um gene pat, um gene cp4 epsps (5-enolpiruvil-chiquimato-3-fosfato sintase), um gene crylAb, um gene cry1F, um gene vip3A, um gene cry1A.105, um gene cry2Ab, um gene cry3Bb, um gene cry34Ab, um gene cry35Ab, um gene mcry3A, ecry3.1Ab, um gene dvsnf7, e um gene amy797E.

A presente invenção também fornece um par de iniciadores de polinucleotídeo que compreende um primeiro iniciador de polinucleotídeo e um segundo iniciador de polinucleotídeo, os quais funcionam juntos na presença de um DNA molde do evento ME240913 em uma amostra para produzir um amplicon diagnóstico do evento ME240913, em que o primeiro iniciador de polinucleotídeo compreende uma parte da sequência flanqueadora 5’, da sequência flanqueadora 3’, e/ou de seus complementos, em que o segundo iniciador de polinucleotídeo compreende uma parte de uma sequência inserida específica, ou seus complementos, e em que o referido evento de milho ME240913 apresenta uma sequência específica contendo a inserção do evento e sequências flanqueadoras no genoma do milho.

A presente invenção se refere a plantas de milho transgênico bem como a células e tecidos da mesma, os quais compreendem uma molécula de ácido nucléico da invenção.

Em uma modalidade, a planta de milho transgênica é resistente a insetos-pragas lepidópteros. Em uma modalidade de maior preferência, a planta de milho transgênica é altamente resistente a danos nas folhas produzidos por populações de S. frugiperda de ocorrência natural encontradas em regiões produtoras de milho no Brasil.

Em outra modalidade, a planta de milho transgênica é altamente tóxica para S. frugiperda, produzindo 100% de mortalidade quando alimentada com tecido de folhas frescas. Em outra modalidade, a planta de milho transgênica é uma planta altamente tóxica a S. frugiperda, como evidenciado por alta mortalidade e morbidade a S. frugiperda após diluição do folhas liofilizadas do evento ME240913 na relação de 1 :25 (peso/peso) com dieta artificial. A alta toxicidade do tecido foliar liofilizado de planta do evento ME240913 mostra que o referido evento é muito eficiente no controle de S. frugiperda e útil para piramidização de vários genes de controle de insetos.

São também reveladas sementes de milho, que compreendem uma molécula de ácido nucléico da invenção. Em uma modalidade, as sementes de milho estão depositadas na American Type Culture Collection sob o número de acesso PTA-126224 e são usadas para produzir plantas de milho transgênicas.

Ainda, a presente invenção se refere a um produto das plantas de milho evento ME240913, tecido ou semente, as quais compreendem uma sequência de nucleotídeos da presente invenção ou seus complementos, e na qual a sequência é detectável no produto de planta usando uma amplificação do ácido nucléico ou método de hibridização do ácido nucléico.

A invenção contempla ainda produtos de planta, tais como, mas não limitados a grão de milho, forragem, farinha de milho, polvilho de milho, xarope de milho, óleo de milho, amido de milho, e cereais fabricados no todo ou em parte com produtos derivados de milho.

A presente invenção também fornece kits para detecção de ácidos nucléicos que são únicos para o evento ME240913, os quais compreendem pelo menos uma molécula de ácido nucléico que é um iniciador ou sonda compreendendo uma sequência de ácido nucléico compreendendo uma sequência específica, e os complementos das mesmas, e em que o referido iniciador ou sonda, ao amplificar ou hibridizar uma sequência de ácidos nucléicos alvo em uma amostra seguida da detecção do amplicon ou hibridização com a sequência alvo, é diagnóstico para a presença das sequências de ácidos nucléicos únicas para o evento ME240913 na amostra.

São ainda revelados métodos para detecção da presença de pelo menos uma molécula de ácido nucléico que é única para o evento ME240913 em uma amostra compreendendo ácidos nucléicos de milho, em que os referidos métodos compreendem as seguintes etapas: colocar a amostra em contato com um par de iniciadores específicos da presente invenção, executar uma reação de amplificação de ácido nucléico de forma a produzir um amplicon, e detectar o referido amplicon, em que o amplicon compreende sequências de ácidos nucléicos únicas para o evento ME240913, ou seus complementos, e em que o referido evento de milho ME240913 apresenta uma sequência específica contendo a inserção do evento e sequências flanqueadoras no genoma do milho.

Outro método para detecção da presença de uma molécula de ácido nucléico que é única para o evento ME240913 em uma amostra compreendendo ácidos nucléicos do milho compreende as etapas de: colocar a amostra em contato com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência com o DNA genômico do evento ME240913 e não hibridiza sob condições de alta estringência com o DNA de uma planta de milho controle, em que a sonda compreende uma sequência de nucleotídeos única para o evento ME240913, e de seus complementos, submeter a amostra e a sonda a condições de hibridização de alta estringência, e detectar a hibridização da sonda com a molécula de ácido nucléico, em que o referido evento de milho ME240913 apresenta uma sequência específica contendo a inserção do evento e sequências flanqueadoras no genoma do milho.

Ainda, são revelados método para controle de insetos- pragas lepidópteros de plantas de milho, em que as plantas de milho compreendem uma molécula de ácido nucleico que compreende sequências de ácidos nucléicos únicas para o evento ME240913, ou seus complementos, em que os referidos métodos compreendem as etapas de plantio de sementes obtidas a partir de uma planta compreendendo as referidas sequências de ácidos nucléicos únicas para o evento ME240913 em uma área de cultivo de plantas de milho suscetíveis a insetos-pragas lepidópteros.

Além disso, são descritos métodos para o controle de pragas de insetos lepidópteros de plantas de milho, em que as plantas de milho contêm proteína CrylDa truncada e modificada, produzida a partir da expressão de sequências únicas de uma sequência ácidos nucléicos únicos para o evento ME240913, levando ao acúmulo dos níveis de expressão em folhas da proteína truncada e modificada CrylDa os quais são altamente protetores contra os danos foliares causados por populações que ocorrem naturalmente no Brasil e são também de alta toxicidade contra S. frugiperda como pode ser visto nas altas taxas de mortalidade nos estudos realizados.

São ainda revelados o uso de uma planta, célula de planta, parte de planta ou semente compreendendo o evento ME240913 para cruzar com uma segunda planta, regenerar uma planta, plantar ou cultivar um campo de plantas ou produzir um produto de planta.

Estes e outros aspectos da invenção ficarão mais aparentes a partir da descrição detalhada a seguir.

DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS NA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

SEQ ID NO: 1 é a sequência de nucleotídeos codificadora da proteína Cry1 Da truncada, otimizada para expressão em milho presente no evento ME240913.

SEQ ID NO: 2 é a sequência de ácido nucleico da construção completa do transgene do evento ME240913 compreendo na seguinte ordem: a região terminadora 3’ UTR do gene Tvsp; região codificadora do gene fosfinotricina acetil transferase (bar), região de enhancer traducional (tev); região promotora do gene CaMV 35S duplicado, região promotora do gene da ubiquitina (ubi); sequência de ácido nucleico códon-otimizada do gene crylDa (SEQ ID NO: 1); e região terminadora 3’ UTR do gene da nopalina sintase.

SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácidos da proteína CrylDa truncada expressa pelo evento ME240913.

SEQ ID NO: 4 é a sequência de junção 5’.

SEQ ID NO: 5 é a sequência de junção 3’. SEQ ID NO: 6 é a sequência flanqueadora 5’.

SEQ ID NO: 7 é a sequência flanqueadora 3’.

SEQ ID NO: 8 é a sequência de nucleotídeos compreendendo a sequência flanqueadora 5’ (nucleotídeos 1-116), a sequência completa do inserto (nucleotídeos 117-6306) e a sequência flanqueadora 3’ (nucleotídeos 6307-6424) do evento ME240913.

SEQ ID NO: 9 é uma sequência de iniciador forward útil na amplificação da sequência de junção 5’.

SEQ ID NO: 10 é uma sequência de iniciador reverse útil na amplificação da sequência de junção 5’. SEQ ID NO: 11 é uma sequência ilustrativa de amplicon resultante de PCR utilizando iniciadores específicos para confirmar a sequência junção 5’.

SEQ ID NO: 12 é uma sequência de sonda útil na detecção da sequência de junção 5’. SEQ ID NO: 13 é uma sequência de iniciador forward útil na amplificação da sequência de junção 3’.

SEQ ID NO: 14 é uma sequência de iniciador reverse útil na amplificação da sequência de junção 3’.

SEQ ID NO: 15 é uma sequência ilustrativa de amplicon resultante de PCR utilizando iniciadores específicos para confirmar a sequência junção 3’.

SEQ ID NO: 16 é uma sequência de sonda útil na detecção da sequência de junção 3’.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 é um diagrama representativo do inserto do evento ME240913 e das respectivas sequências de nucleotídeos que definem o referido evento, incluindo sequências de junção e flanqueadoras 5’ e 3’ do genoma de milho.

A Figura 2 é um diagrama representativo das construções gênicas Ubi::cry1Da::NOS e 2x35S::bar::Tvsp do inserto do evento ME240913 inseridas nos sítios das enzimas Hindlll e EcoRI do vetor binário pTF 101.1, entre as bordas direita e esquerda do TDNA.

A Figura 3 mostra o resultado da avaliação do evento ME240913 com relação ao controle de S. frugiperda utilizando folhas frescas de milho por um período de 5 dias. Amostra de folha fresca de milho não OGM (a) e milho geneticamente modificado com CrylDa (b) são mostradas.

A Figura 4 mostra o resultado de ensaios de exposição de S. frugiperda ao tecido fresco de folhas de dois backgrounds genéticos contendo o evento ME240913. Sobrevivência de S. frugiperda (%), foi avaliada até 3 dias após a exposição das larvas recém eclodidas a folhas frescas de milho controle e folhas de milho expressando evento ME240913 em dois diferentes backgrounds genéticos (híbrido e RC1 F1) são mostrados. A Figura 5 mostra a taxa de sobrevivência de larvas recém eclodidas após 14 dias de exposição as folhas liofilizadas na diluição de 1 :25 em dieta artificial do controle e o evento ME240913.

A Figura 6 mostra os tamanhos das lagartas vivas após 7 (A) e 10 (B) dias de exposição a tecido liofilizado de folha diluído 1:25 do Evento ME240913 na dieta artificial em comparação com dieta controle. A Figura 7 mostra o resultado de nível de dano nas folhas das plantas de milho controle (conv) e do Evento ME240913 (OGM) em parcelas infestadas por seis populações diferentes de S. frugiperda.

A Figura 8 mostra fotografias de danos em plantas de milho controle (esquerda) e do Evento ME240913 (direita) em campo infestado por populações de S. frugiperda de Palotina/PR (8A), Rondonópolis/MT (8B), Rondonópolis + Campo Verde/MT (8C), Paracatu/MG (8D), Sete Lagoas/MG (8E), e Ivatuba/PR (8F).

A Figura 9 se refere ao resultado em gráfico da nota de injúria (±IC, P = 0,05) causada pela infestação de S. frugiperda em escala de Carvalho, 1970. Trat 1 = milho transgênico compreendendo a molécula de ácido nucléico códon-otimizada crylDa da presente invenção (SEQ ID NO: 1) + População de lagartas resistentes à Cry1 F; Trat 2 = Linhagem de milho L3 não transgênico + População de lagartas resistentes à Cry1 F; Trat 3 = milho transgênico compreendendo a molécula de ácido nucléico códon-otimizada cryl Da da presente invenção (SEQ ID NO: 1) + População de lagartas suscetíveis; Trat 4 = Linhagem de milho L3 não transgênico + População de lagartas suscetíveis.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Salvo se definido de outro modo, todos os termos da técnica, anotações e outras terminologias científicas aqui utilizadas destinam-se a ter os significados normalmente compreendidos pelos técnicos no assunto do campo da presente invenção. Em alguns casos, os termos com significados comumente entendidos são definidos no presente documento com a finalidade de trazer clareza e/ou para pronta referência, e a inclusão de tais definições no presente documento não deve ser interpretada, necessariamente, como representando uma diferença substancial em relação ao que é geralmente entendido no estado da técnica. As técnicas e os procedimentos descritos ou referidos pelo presente documento são geralmente bem compreendidos e empregados usando a metodologia convencional pelos técnicos no assunto. Conforme apropriado, os processos que envolvem o uso de kits e reagentes disponíveis comercialmente são geralmente realizados de acordo com protocolos e/ou parâmetros definidos pelo fabricante, salvo quando indicado de outra forma.

Vale ressaltar que a presente invenção, onde for apropriado, não se limita à metodologia, protocolos, linhagem de células, gêneros ou espécies de animais, construções e reagentes específicos descritos, os quais, de forma óbvia, podem variar. Além disso, a terminologia utilizada no presente documento é apenas para o propósito de descrever exemplos de realizações específicas, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção.

Ao longo do presente documento, as formas singulares “um”, “uma” e “o”, “a”, ou formas singulares de qualquer termo ou expressão, incluem as referências ao plural, a menos que o contexto dite claramente de outra forma.

Ao longo do presente documento, a palavra “compreende”, e quaisquer variações como “compreendem” ou “compreendendo”, devem ser interpretadas como “termos abertos”, podendo implicar na inclusão de elementos ou grupos de elementos adicionais, os quais não foram explicitamente descritos, não possuindo caráter limitativo.

Ao longo do presente documento, a palavra “consiste”, e quaisquer variações como “consistem” ou “consistindo”, devem ser interpretadas “termos fechados”, não podendo implicar na inclusão de elementos ou grupos de elementos adicionais, os quais não foram explicitamente descritos, possuindo caráter limitativo.

Ao longo do presente documento, os valores exatos ou faixas de valores exatos fornecidos com relação a um fator, quantidade, concentração ou preferência particular devem ser interpretados como também fornecendo valores ou faixas de valores aproximados correspondentes, tal como por meio da expressão “cerca de”.

Ao longo do presente documento, palavras e expressões como “preferencialmente”, “particularmente”, “por exemplo”, “como”, “tal como”, “mais particularmente” e similares, e suas variações, devem ser interpretadas como características inteiramente opcionais, realizações preferenciais ou exemplificações possíveis não exaustivas, sem conferir caráter limitativo de escopo.

Ao longo do presente documento, palavras e expressões como “ácidos nucleicos”, “nucleotídeos” e similares devem ser interpretadas como ácidos nucleicos ou nucleotídeos que ocorrem naturalmente, sintéticos ou artificiais. Compreendem desoxirribonucleotídeos (DNA) ou ribonucleotídeos (RNA) ou qualquer análogo de nucleotídeo e polímeros ou híbridos dos mesmos na configuração sense (senso) ou antisense (antissenso), de fita simples ou fita dupla. Salvo quando disposto de outra forma, uma sequência de ácido nucleico específica também abrange implicitamente variantes conservadoramente modificadas desta (por exemplo, substituições de códons degenerados) e sequências complementares, bem como as sequências explicitamente indicadas. O termo “ácido nucleico” é utilizado de maneira alternada no presente documento com os termos “gene”, “cDNA”, “mRNA”, “oligonucleotídeo”, “molécula de ácido nucleico” ou “iniciador”.

As expressões “molécula de ácido nucleico”, “sequência de ácido nucleico” e similares referem-se a um polímero de bases de DNA ou RNA de fita simples ou fita dupla, lido da extremidade 5’ para a extremidade 3’. Inclui DNA cromossômico, plasmídeo de autorreplicação, polímeros infecciosos de DNA ou RNA que desempenham um papel principalmente estrutural, entre outros. Também se referem a uma lista consecutiva de abreviaturas, letras, caracteres ou palavras, que representam nucleotídeos ou genes, conforme usualmente empregados no campo técnico da presente invenção.

Como usado neste documento, o termo “amplificado” significa a construção de cópias múltiplas de uma molécula de ácido nucléico ou cópias múltiplas complementares à molécula de ácido nucléico usando pelo menos uma das moléculas de ácido nucléico como um padrão. Sistemas de amplificação incluem, mas não estão limitados ao sistema de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), sistema da reação em cadeia da ligase (LCR), amplificação baseada em sequência de ácido nucléico (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontário), sistemas de Q-Beta Replicase, sistema de amplificação baseada na transcrição (TAS), e amplificação pelo deslocamento da fita (SDA). Ver, por exemplo: Diagnostic Molecular Microbiology: Principies and Applications, D. H. Persing, e outros, Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1993). O produto da amplificação é descrito como um amplicon.

Uma “sequência codificante” é uma sequência de ácido nucléico que é transcrita em RNA tal como mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, RNA senso ou RNA antissenso. Preferencialmente, o RNA é então traduzido em um organismo para produzir uma proteína.

Ao longo do presente documento, palavras e expressões como “similaridade de sequência”, “identidade” e similares, com relação a uma outra sequência, deve ser interpretada como a porcentagem de nucleotídeos na sequência que é idêntica aos nucleotídeos de outra sequência, após o alinhamento das sequências e a introdução de gaps, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequência. De acordo com a presente invenção, a expressão “pelo menos 70% de similaridade”, por exemplo, é definida como similaridade ou identidade de 70 a 100%. Preferencialmente, a porcentagem de similaridade é de pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100%.

Um “gene” é uma região definida que está localizada dentro de um genoma e que, apesar da sequência codificante mencionada acima, pode compreender outras, primariamente sequências de ácido nucléico regulatórias, responsáveis pelo controle da expressão, ou seja, a transcrição e a tradução da região codificante. Um gene também pode conter outras sequências não traduzidas 5' e 3' e sequências de terminação. Outros elementos que podem estar presentes são, por exemplo, íntrons.

“Gene de interesse” refere-se a qualquer gene que, quando transferido a uma planta, confere à planta uma característica desejada, tais como resistência a antibióticos, resistência a vírus, resistência a insetos, resistência a doenças, ou resistência a outras pragas, tolerância a herbicidas, valor nutricional melhorado, melhora do desempenho em um processo industrial ou capacidade reprodutiva alterada.

“Genótipo” conforme usado neste documento é o material genético herdado das plantas de milho de origem. O genótipo ME240913 refere-se ao material genético heterólogo transformado dentro do genoma de uma planta bem como o material genético flanqueando a sequência inserida.

Uma sequência de ácido nucléico “heteróloga” é uma sequência de ácido nucléico não naturalmente associada a uma célula hospedeira na qual está introduzida, incluindo a ocorrência não natural de cópias múltiplas de uma sequência de ácido nucléico.

Uma sequência de ácido nucléico “homóloga” é uma sequência de ácido nucléico naturalmente associada a uma célula hospedeira na qual está introduzida. “Alta toxicidade” do tecido da folha de milho refere-se à capacidade de amostras de tecido da folha produzirem 100% de mortalidade para espécies de lepidópteros, como S. frugiperda, dentro de 7 dias após a exposição ao tecido da folha. Outra parte da definição de "alta toxicidade" é a capacidade do tecido foliar seco, diluído 1 :25 com tecido foliar convencional de milho, de produzir > 95% de mortalidade e morbidade dentro de 14 dias após a exposição à dieta do tecido foliar.

‘Operacionalmente ligada” refere-se à associação das sequências de ácido nucléico em um fragmento de ácido nucléico único para que a função de uma afete a função da outra. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado a uma sequência codificante ou a um RNA funcional quando este é capaz de afetar a expressão da sequência codificante ou do RNA funcional (isto é, quando a sequência codificante ou do RNA funcional está sob o controle transcricional do promotor). As sequências codificantes em orientação senso ou antissenso podem ser operacionalmente ligadas às sequências regulatórias.

“Proteção de plantas”, conforme usado neste documento, refere-se à capacidade da planta de milho intacta de resistir aos danos foliares produzidos por pragas suscetíveis de lepidópteros, incluindo, mas não se limitando à proteção contra danos nas folhas produzidos por S. frugiperda. A proteção pode ser observada examinando plantas ou fotografias de plantas a fim de comparar os danos observados para plantas de milho controle com aqueles observados em planta de milho que expressa Cryl Da. "Proteção de plantas", conforme usado neste documento, também se refere à capacidade da planta intacta de resistir a danos produzidos por pragas de lepidópteros suscetíveis, incluindo, mas não se limitando ao uso de métodos padrão e aceitos de classificação de danos às plantas.

“Iniciadores” ou “primers”, conforme usados neste documento, são ácidos nucléicos isolados que são aneladas a uma fita de DNA alvo complementar pela hibridização do ácido nucléico para formar um híbrido entre o iniciador e a fita de DNA alvo, e então estendido ao longo da fita de DNA alvo por uma polimerase, tal como DNA polimerase. Pares ou conjuntos de iniciadores podem ser usados para amplificação de uma molécula de ácido nucléico, por exemplo, pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ou outros métodos convencionais de amplificação do ácido nucléico.

Uma “sonda” é um ácido nucléico isolado ao qual é ligado um marcador detectável convencional ou uma molécula repórter, tal como um isótopo radioativo, ligante, agente quimioluminescente ou enzima. Tal sonda é complementar a uma fita de um ácido nucléico alvo, no caso da presente invenção, a uma fita de DNA genômico do evento de milho ME240913. O DNA do evento ME240913 pode ser de uma planta de milho ou de uma amostra que inclui DNA do evento ME240913. As sondas de acordo com a presente invenção incluem não somente ácidos ribonucleicos ou desoxirribonucleicos, mas também poliamidas e outros materiais de sonda que se unem especificamente a uma sequência de DNA alvo e podem ser usados para detectar a presença daquela sequência de DNA alvo.

Iniciadores e sondas possuem geralmente entre 10 e 15 nucleotídeos ou mais de comprimento. Iniciadores e sondas também podem possuir pelo menos 20 nucleotídeos ou mais de comprimento, ou pelo menos 25 nucleotídeos ou mais, ou pelo menos 30 nucleotídeos ou mais de comprimento. Tais iniciadores e sondas hibridizam especificamente a uma sequência alvo sob condições de hibridização de alta estringência. Iniciadores e sondas de acordo com a presente invenção podem ter sequência completa complementar com a sequência alvo, embora as sondas que diferem da sequência alvo e que retêm a habilidade para hibridizar as sequências alvo podem ser projetadas por métodos convencionais.

“Condições de estringência” ou “condições de hibridização estringentes” incluem referências a condições sob as quais uma sonda irá hibridizar à sua sequência alvo, para um grau maior detectável do que a outras sequências. Condições de estringência são dependentes da sequência alvo e irão diferir dependendo da estrutura do polinucleotídeo. Pelo controle da estringência da hibridização e/ou condições de lavagem, as sequências alvo que serão 100% complementares à sonda (sonda homóloga) podem ser identificadas. Alternativamente, condições de estringência podem ser ajustadas para permitir alguma inadequação nas sequências de forma que graus mais baixos de similaridade sejam detectados (sonda heteróloga). Sequências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas mais altas. Um guia extensivo para a hibridização dos ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hibridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 “OverView of principies of hibridization and the strategy of nucleic acid sonda assays”, Elsevier: New York; e Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Ausubel e outros, Eds., Greene Publishing and Wiley-lnterscience: New York (1995), e também Sambrook e outros (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (5 ^a Ed. Cols Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Especificidade é tipicamente a função das lavagens pós- hibridização, sendo a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final os fatores críticos. De forma geral, as condições de hibridização de alto estringência e de lavagem são selecionadas por estarem aproximadamente a 5°C abaixo do ponto de fusão térmica (T _m ) para a sequência específica em uma força iônica e pH definidos. AT _m é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% da sequência alvo hibridiza em uma sonda perfeitamente compatível. Tipicamente, sob condições de alta estringência uma sonda irá hibridizar em sua sequência alvo, mas não em outras sequências.

Um exemplo de condições de hibridização de alta estringência para a hibridização dos ácidos nucléicos complementares que possuem mais de 100 resíduos complementares num filtro em "Southern Blot" ou "Northern Blot" é 50% formamida com 1 mg de heparina a 42°C, a hibridização sendo executada durante a noite. Um exemplo de condições de lavagem de estringência muito alta é 0,15M NaCI a 72°C por aproximadamente 15 minutos. Um exemplo de condições de lavagem de alta estringência é uma lavagem 0,2x SSC a 65°C por 15 minutos (ver, Sambrook, infra, para uma descrição do buffer SSC).

Um bom exemplo de condições de hibridização para a presente invenção incluem hibridização em 7% SDS, 0,25 M NaP0 ₄ pH 7,2 a 67°C durante a noite, seguida por duas lavagens em 5% SDS, 0,20 M NaP0 ₄ pH 7,2 a 65°C por 30 minutos em cada lavagem, e duas lavagens em 1% SDS, 0,20 M NaP0 ₄ pH 7,2 a 65°C por 30 minutos em cada lavagem. Um bom exemplo de lavagem de estringência média para um duplex de, por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é 1x SSC a 45°C por 15 minutos. Um bom exemplo de lavagem de estringência baixa para um duplex de, por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é 4- 6x SSC a 40°C por 15 minutos.

Para sondas de aproximadamente 10 a 50 nucleotídeos, condições de alta estringência tipicamente envolvem concentrações de sal de menos de aproximadamente 1 ,0 M Na íon, tipicamente concentrações de aproximadamente 0,01 a 1 ,0 M Na íons (ou outros sais) num pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é tipicamente de pelo menos de aproximadamente 30°C. Condições de alta estringência também podem ser alcançadas com a adição de agentes destabilizantes como a formamida. Geralmente, um sinal para taxa de ruído de 2x (ou superior) do que o observado para uma sonda não relacionada no ensaio específico de hibridização indica a detecção de uma hibridização específica. Ácidos nucléicos que não hibridizam entre si sob condições de alta estringência são ainda substancialmente idênticos se as proteínas que eles codificarem forem substancialmente idênticas. Isto ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucléico é criada usando a máxima degeneração do códon permitida pelo código genético.

A seguir alguns bons exemplos de conjuntos de condições de hibridização/lavagem que podem ser usadas para hibridizar as sequências de nucleotídeos que são substancialmente idênticas às sequências de nucleotídeos de referência da presente invenção: uma sequência de nucleotídeos de referência preferencialmente hibridiza para a sequência de nucleotídeos de referência em 7% de Dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaP0 ₄ , 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 2X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais preferencialmente em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaP0 ₄ , 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 1X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais preferencialmente ainda em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaP0 ₄ , 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,5X SSC, 0,1% SDS a 50°C, preferencialmente em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaP0 ₄ , 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais preferencialmente em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaP0 ₄ , 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1X SSC, 0,1% SDS a 65°C. As sequências da presente invenção podem ser detectadas usando todas as condições acima. Para fins de definir a invenção, são usadas as condições de alta estringência.

Ao longo do presente documento, palavras e expressões como “promotor”, “sequência promotora” e similares devem ser interpretadas como uma sequência de DNA que, uma vez operativamente ligada a uma sequência de nucleotídeos de interesse, é capaz de controlar a transcrição da sequência de nucleotídeos de interesse em RNA. Um promotor está localizado a 5’ (ou à montante) em relação ao local de início de transcrição de uma sequência de nucleotídeos de interesse cuja transcrição em mRNA ele controla e fornece um sítio para a ligação específica da RNA polimerase e outros fatores de transcrição para o início da transcrição. Pode incluir outras sequências reguladoras, conhecidas por um técnico no assunto. De acordo com a presente invenção, o promotor pode ser heterólogo ou homólogo à respectiva célula ou hospedeiro. Uma sequência de ácido nucleico é “heteróloga” a um organismo ou a uma segunda sequência de ácido nucleico se ela se origina a partir de uma espécie diferente ou, se a partir da mesma espécie, é modificada de sua forma original.

Conforme usado neste documento, o termo "único" para o evento ME240913 significa características distintivas do evento ME240913. Desta forma, ácidos nucléicos únicos para o evento ME240913 não são encontrados em outras plantas de milho que não sejam ME240913.

Conforme usado neste pedido de patente, o termo “milho” refere-se à espécie Zea mays e inclui todas as variedades de plantas que podem ser reproduzidas com milho, incluindo espécies selvagens de milho.

“Kit de Detecção”, conforme usado neste pedido de patente, refere-se a um kit de partes úteis na detecção da presença ou ausência de ácidos nucléicos únicos para plantas ME240913 em uma amostra, onde o kit compreende sondas de ácido nucléico e/ou iniciadores da presente invenção, que formam híbridos especificamente sob condições de alta estringência com uma sequência alvo de DNA, e outros materiais necessários para possibilitar métodos de amplificação ou hibridização do ácido nucléico. Ao longo do presente documento, o termo “transformação” e similares deve ser interpretado como um processo para a introdução de DNA heterólogo em uma célula, tecido vegetal ou planta. Pode ocorrer sob condições naturais ou artificiais, como pelo uso de vários métodos bem conhecidos na técnica, seja em uma célula hospedeira procarionte ou eucarionte. O método é geralmente selecionado com base na célula hospedeira que será transformada e pode incluir, mas não se limitar a, infecção virai, eletroporação, lipofecção, bombardeamento de partículas (biobalística) e mediada por Agrobacterium. Ao longo do presente documento, o termo “transgene” deve ser interpretado como qualquer sequência de ácido nucleico que é introduzida em uma célula por meio de manipulações experimentais, podendo ou não ser integrado ao genoma. Um transgene pode ser uma “sequência de DNA endógeno”, ou “sequência de DNA exógeno” (ou seja, “heterólogo”). A expressão “sequência de DNA endógeno” refere- se a uma sequência de nucleotídeos que é naturalmente encontrada na célula na qual é introduzida. A expressão “sequência de DNA exógeno” refere-se a uma sequência de nucleotídeos que não é naturalmente encontrada na célula na qual é introduzida. O termo “transgênico”, quando se refere a um organismo transformado, significa um organismo transformado com uma molécula de DNA recombinante que compreende preferencialmente um promotor adequado operacionalmente ligado a uma sequência de DNA de interesse.

Ao longo do presente documento, o termo “vetor” deve ser interpretado como uma construção contendo uma sequência de DNA que é operativamente ligada a uma ou mais sequências controle adequadas capazes de levar à expressão da dita sequência de DNA em um hospedeiro adequado. Tais sequências controle incluem um promotor para efetuar a transcrição, uma sequência operadora opcional para o controle de tal transcrição, uma sequência codificante dos sítios de ligação adequados do mRNA ao ribossomo, e às sequências que controlam o término da transcrição e tradução, por exemplo.

Podem ser diversos os vetores adequados para a realização da presente invenção. Esses vetores podem ser replicados de forma autónoma no organismo hospedeiro ou ser replicados pelo cromossomo. O vetor pode, também, ser um plasmídeo. De acordo com o presente documento, os termos “plasmídeo” e “vetor” são algumas vezes utilizados de forma alternada. Preferencialmente, o vetor, de acordo com a presente invenção, compreende a molécula de ácido nucleico crylDa compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 , conforme definida no presente documento.

Conforme usado neste o termo "evento" transgênico refere- se a uma planta recombinante produzida pela transformação e regeneração de um tecido ou célula da planta com DNA heterólogo, por exemplo, um cassete de expressão que inclui um gene de interesse. O termo "evento" refere-se ao transformante original e/ou à descendência do transformante que inclui o DNA heterólogo. O termo "evento" também se refere à descendência produzida por um cruzamento sexual entre o transformante e outra linhagem de milho. Ainda, depois do retrocruzamento repetido com um parente, o DNA introduzido e o DNA flanqueador dos parentes transformados estão presentes na descendência do cruzamento no mesmo local do cromossomo. O termo "evento" também refere-se ao DNA do transformante original compreendendo o DNA inserido e a sequência genômica flanqueadora imediatamente adjacente ao DNA inserido que esperar-se-ia ser transferido para uma descendência que recebe o DNA inserido incluindo o transgene de interesse como resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem progenitora que inclui o DNA inserido (por exemplo: o transformante original e a descendência resultante do cruzamento) e uma linhagem progenitora que não contém o DNA inserido. Normalmente, a transformação do tecido da planta produz múltiplos eventos, cada um representa a inserção de uma construção de DNA dentro de uma localização diferente no genoma de uma célula de planta. Baseado na expressão do transgene ou outras características desejáveis, um evento particular é selecionado. Desta forma, os termos "evento ME240913" e “evento” podem ser usados de forma intercambiável.

Uma planta do milho ME240913 resistente aos insetos pode ser reproduzida primeiramente pelo cruzamento sexual de uma primeira planta de milho progenitora consistindo em uma planta de milho cultivada a partir de uma planta de milho ME240913 transgênico, tal como uma planta de milho ME240913 cultivada a partir da semente depositada no ATCC sob número de acesso: PTA-126224, e a descendência desta derivada da transformação com o cassete de expressão dos meios de execução da presente invenção que conferem resistência a insetos-pragas lepidópteros, com uma segunda planta de milho progenitora pode ou não apresentar resistência a insetos-pragas lepidópteros, desta forma produzindo uma pluralidade de primeiras plantas da primeira geração; e depois pela seleção de uma primeira planta da primeira geração que é resistente a insetos-pragas lepidópteros; e autopolinização planta descendente de primeira geração, desta forma produzindo uma pluralidade de plantas descendentes de segunda geração; e finalmente pela seleção de plantas descendentes de segunda geração resistentes a insetos-pragas lepidópteros. Estas etapas podem ainda incluir o retrocruzamento da planta da primeira geração resistente a insetos-pragas lepidópteros ou da planta da segunda geração resistente a insetos-pragas lepidópteros com a segunda planta de milho progenitora ou uma terceira planta de milho progenitora, desta forma produzindo uma planta de milho que seja resistente a insetos-pragas lepidópteros. Tais métodos podem ser utilizados para a introgressão do evento ME240913 em linhagens de milho bem como para a piramidação do evento ME240913 com outros eventos transgênicos.

Ao longo do presente documento, as expressões “célula hospedeira”, “organismo hospedeiro” e similares devem ser interpretadas como sendo o organismo hospedeiro específico ou a célula alvo específica, mas também como sendo os descendentes ou potenciais descendentes desses organismos ou células. Uma vez que, devido à mutação ou aos efeitos ambientais, determinadas modificações podem surgir em gerações sucessivas, esses descendentes não precisam ser necessariamente idênticos à célula parental. No entanto, ainda estão incluídos no escopo de proteção da presente invenção. De acordo com a presente invenção, as células hospedeiras podem ser procarióticas ou eucarióticas. Preferencialmente, a célula hospedeira de acordo com a presente invenção, é uma célula hospedeira de planta. Preferencialmente, compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é única ao evento ME240913, que é selecionada dentre SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e complementos das mesmas.

Ao longo do presente documento, palavras e expressões como “célula vegetal transgênica”, “planta transgênica” e similares devem ser interpretadas como células ou plantas que possuem e preferencialmente expressam, por meio de manipulações experimentais, um transgene, bem como também se referem à progénie de uma planta transgênica e gerações subsequentes de plantas, conforme acima.

Ao longo do presente documento, o termo “planta” e similares deve ser interpretado como sendo a parte ou o todo do organismo vegetal. Por “parte”, neste contexto, entende-se células vegetais e tecidos, órgãos e partes de plantas em todas as suas manifestações, como sementes, folhas, anteras, fibras, espiga, raízes, pelos de raízes, caules, embrião, calos, cotilédones, pecíolos, material coletado, tecido vegetal, tecido reprodutivo e culturas de células. As plantas transgênicas, de acordo com a presente invenção, podem ser geradas e autofecundadas ou cruzadas com outros indivíduos a fim de obter plantas transgênicas adicionais. Plantas transgênicas também podem ser obtidas por propagação vegetativa de células vegetais transgênicas.

Ao longo do presente documento, palavras e expressões como “praga”, “insetos-pragas lepidópteros” e similares devem ser interpretadas como insetos da ordem Lepidoptera, incluindo, mas sem se limitar, às famílias Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae, Crambidae e Tineidae, mais particularmente noctuídeos Spodoptera sp., particularmente S. frugiperda (Noctuidae) e cambídeos Diatraea sp., particularmente D. saccharalis (Crambidae).

Uma das realizações da presente invenção refere-se a um método de controle de insetos-pragas lepidópteros de plantas de cultivo, incluindo, mas não limitado a lagartas. Qualquer método de controle de insetos-pragas lepidópteros de plantas de cultivo está incluído no escopo da presente invenção, não sendo de particular relevância para a obtenção das realizações da invenção, desde que as plantas de cultivo, de acordo com a presente invenção, compreendam pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que é única ao evento ME240913, que é selecionada dentre SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, e complementos das mesmas, em que o método compreende, preferencialmente, o plantio de sementes obtidas a partir de uma planta compreendendo pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que é única ao evento ME240913, conforme definida no presente documento, em uma área de cultivo de plantas de cultura suscetíveis a insetos-pragas lepidópteros. A classe “CrylDa” de proteínas compreende também seus homólogos. “Homólogo” significa que a proteína indicada ou polipeptídeo sustentam uma relação definida para outros membros da classe CrylDa de proteínas.

Esta invenção refere-se a uma linhagem geneticamente melhorada de milho que produz uma proteína CrylDa truncada, modificada para controle de insetos-pragas lepidópteros. A invenção é particularmente projetada para um evento de milho transgênico designado ME240913 compreendendo um novo genótipo, bem como para composições e métodos para detectar ácidos nucléicos únicos ao evento ME240913 em uma amostra biológica. A invenção é ainda projetada para plantas de milho compreendendo o genótipo ME240913, para sementes transgênicas das plantas de milho, e para métodos para produzir uma planta de milho compreendendo o genótipo ME240913 pelo cruzamento de um milho cruzado com si mesmo compreendendo o genótipo ME240913 ou outra linhagem de milho. Plantas de milho compreendendo o genótipo ME240913 da invenção são úteis no controle de insetos-pragas lepidópteros incluindo, mas não limitado à família Noctuidae e/ou Crambidae, preferencialmente S. frugiperda e D. saccharalis. Plantas de milho do evento ME240913 mostram proteção das plantas contra pragas sensíveis de lepidópteros, incluindo, mas não se limitando a S. frugiperda resistente a Cry1F e a Cry1A, do tipo selvagem

Em outra modalidade, as plantas de milho mostram alta toxicidade para pragas suscetíveis de lepidópteros, incluindo, mas não se limitando a S. frugiperda.

Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é única ao evento ME240913.

Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico isolada que se liga uma molécula de DNA heteróloga introduzida no genoma do evento ME240913 para o genoma do DNA no evento ME240913 compreendendo pelo menos 10 ou mais (por exemplo 15, 20, 25, 30 ou mais) nucleotídeos contíguos da molécula do DNA heteróloga e pelo menos 10 ou mais (por exemplo 15, 20, 25, 30 ou mais) nucleotídeos contíguos do DNA do genoma flanqueando o sítio de inserção da molécula de DNA heteróloga. Estão também incluídas as sequências de nucleotídeos que compreendem 10 ou mais nucleotídeos da sequência de inserção contígua do evento ME24091 3 e pelo menos um nucleotídeo do DNA flanqueador do evento ME240913 adjacente à sequência de inserção. Tais sequências de nucleotídeos são únicas, e diagnosticam o evento ME240913. A hibridização ou amplificação do ácido nucléico do DNA genômico do evento ME240913 produz um amplicon compreendendo tais sequências únicas que permite diagnosticar o evento ME240913. Em um aspecto desta modalidade, a sequência de nucleotídeos é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 5 e 8, e os complementos das mesmas.

Em outra modalidade, a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeos que compreende pelo menos uma sequência de junção do evento ME240913, na qual uma sequência de junção transpõe a junção entre um cassete de expressão heteróloga inserido dentro do genoma do milho e o DNA do genoma do milho pareando o local de inserção a qual é única para o referido evento ME240913 e é diagnóstica para o evento ME240913. Em um aspecto desta modalidade, a sequência de junção é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4 e 5, e os complementos destas.

Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico isolada que une uma molécula de DNA heteróloga ao genoma da planta de milho no evento ME240913, a qual compreende pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 5, e os complementos das mesmas.

Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é única ao evento ME240913, em que a referida sequência de nucleotídeos codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em um aspecto desta modalidade, a sequência de nucleotídeos é SEQ ID NO: 8 e/ou o complemento da mesma.

Em outra modalidade, a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em 4, 5 e 8, e os complementos destas. Em um aspecto desta modalidade, a molécula de ácido nucléico isolada está contida em uma semente de milho depositada na “American Type Culture Collection” sob o número de acesso PTA-126224, ou em plantas cultivadas a partir da referida semente.

Em uma modalidade da presente invenção, um amplicon compreendendo uma sequência de nucleotídeos única para o evento ME240913 é fornecida. Em um aspecto desta modalidade, a sequência de nucleotídeos é selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 11 e 15, e os complementos das mesmas.

Em outra modalidade, a presente invenção engloba os iniciadores da sequência flanqueadora para detectar o evento ME240913. Tais iniciadores da sequência flanqueadora compreendem uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 10 nucleotídeos contíguos da sequência flanqueadora 5' ou 3'. Em um aspecto desta modalidade, os nucleotídeos contíguos são selecionados de pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 6 (sequência flanqueadora 5'), ou os complementos da mesma. Em outro aspecto desta modalidade, o iniciador da sequência flanqueadora 5' apresenta a sequência de SEQ ID NO: 9 ou o complemento da mesma. Em outro aspecto desta modalidade, os nucleotídeos contíguos são selecionados pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 7 (a sequência flanqueadora 3'), ou os complementos da mesma. Ainda, em um outro aspecto desta modalidade, o iniciador da sequência flanqueadora 3' apresenta a sequência de SEQ ID NOs: 12 ou o complemento da mesma.

Ainda em outra modalidade, a presente invenção engloba um par de iniciadores de polinucleotídeos compreendendo um primeiro iniciador de polinucleotídeo e um segundo iniciador de polinucleotídeo que funcionam juntos na presença de um molde de DNA do evento ME240913 em uma amostra para produzir um amplicon diagnóstico para o evento ME240913. Em um aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador e/ou o segundo iniciador é escolhido de SEQ ID NO: 9, 10, ou os complementos das mesmas. Em outro aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador e/ou o segundo iniciador é selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 13, 14, e os complementos das mesmas. Ainda, em outro aspecto desta modalidade, o amplicon que é produzido pelo par de iniciadores compreende SEQ ID NO: 11 , 15, ou os complementos das mesmas.

Em outra modalidade, a presente invenção engloba um par de iniciadores de polinucleotídeos compreendendo um primeiro iniciador de polinucleotídeo e um segundo iniciador de polinucleotídeo que funcionam juntos na presença de um modelo de DNA do evento ME240913 em uma amostra para produzir um amplicon diagnóstico para o evento ME240913. Onde o primeiro iniciador é igual ou é complementar a uma sequência do genoma da planta de milho que pareia com o ponto de inserção de uma sequência de DNA heteróloga inserida no genoma do evento ME240913, e a segunda sequência de iniciador de polinucleotídeos é igual ou é complementar à sequência de DNA heteróloga inserida no genoma do evento ME240913.

Em um aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador de polinucleotídeo compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos da 5 posição 1-116 e 6307-6424 de SEQ ID NO: 8 e os complementos das mesmas. Em um outro aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador é selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 9, 13, e os complementos destas. Em outro aspecto desta modalidade, o segundo iniciador do polinucleotídeo compreende pelo menos 10 nucleotídeos 10 contíguos da posição 117-6306 de SEQ ID NO: 8, ou complementos da mesma. Ainda, em um outro aspecto desta modalidade, o segundo iniciador do polinucleotídeo é selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 10, 14, e os complementos das mesmas.

Em outro aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador do 15 polinucleotídeo, que é apresentado na SEQ ID NO: 9, e o segundo iniciador do polinucleotídeo, que é apresentado na SEQ ID NO: 10, funcionam juntos na presença de um modelo de DNA do evento ME240913 em uma amostra para produzir um amplicon diagnóstico para o evento ME240913. Em uma modalidade deste aspecto, o 20 amplicon compreende a sequência de nucleotídeos apresenta na SEQ ID NO: 11.

Ainda em outra modalidade, a presente invenção se refere a um método para detecção da presença de uma molécula de ácido nucléico que é única ao evento ME240913 em uma amostra 25 compreendendo ácidos nucléicos de milho, onde o método compreende: (a) colocar a amostra em contato com um par de iniciadores, (b) executar uma reação de amplificação de ácido nucléico, de forma a produzir um amplicon, e (c) detectar o amplicon.

Em uma outra modalidade, a presente invenção se refere a

BO um método para detecção da presença de uma molécula de ácido nucléico que é única ao evento ME240913 em uma amostra compreendendo ácido nucléico do milho, onde o método compreende: (a) colocar a amostra em contato com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência com DNA genômico do evento ME240913 e não hibridiza sob condições de alta estringência com DNA de uma planta de milho controle, em que a sonda compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e complementos das mesmas; (b) submeter a amostra e a sonda a condições de hibridização de alta estringência; e (c) detectar hibridização da sonda para a molécula de ácido nucléico. A detecção pode ser feita por qualquer meio bem conhecido na técnica incluindo fluorescência, quimiluminescência, radiológica, imunológica e outros. No caso em que a hibridização é usada como um meio para a amplificação de uma sequência particular para produzir um amplicon que é diagnóstico para o evento ME240913, a produção e a detecção do amplicon por qualquer meio bem conhecido na técnica é um indicativo da hibridização com sequência alvo onde pelo menos uma sonda ou um iniciador é utilizado(a).

O termo “amostra biológica” define uma amostra derivada de uma planta de milho que contém ou é suspeita de conter um ácido nucléico compreendendo entre cinco e dez nucleotídeos em qualquer lado do ponto no qual um ou outro dos dois pontos terminais da sequência de DNA heteróloga inserida é unida à sequência de DNA genômico dentro do cromossomo no qual a sequência de DNA heteróloga foi inserida, neste documento também conhecido como sequências de junção. Além disto, a sequência de junção compreende tão pouco quanto dois nucleotídeos: aqueles sendo o primeiro nucleotídeo dentro do DNA flanqueador ou genômico adjacente ao covalentemente unido ao primeiro nucleotídeo dentro da sequência de DNA heteróloga inserida. Em um aspecto desta modalidade, a sonda compreende uma sequência de nucleotídeos compreendendo pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NOs: 4, 5, e os complementos destas.

Ainda em outra modalidade, a presente invenção se refere a um kit para a detecção dos ácidos nucléicos que são únicos ao evento ME240913 em uma amostra biológica. O kit compreende pelo menos uma molécula de ácido nucléico de comprimento suficiente de polinucleotídeos contíguos para funcionar como um iniciador ou sonda em um método para detecção do ácido nucléico. A amplificação ou a hibridização com uma sequência de ácido nucléico alvo em uma amostra seguida da detecção do amplicon ou hibridização com a sequência alvo diagnostica a presença de sequências de ácido nucléico únicas ao evento ME240913 na amostra. O kit ainda compreende outros materiais necessários para permitir a amplificação ou a hibridização do ácido nucléico. Em um aspecto desta modalidade, uma molécula de ácido nucléico contida no kit compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada de SEQ ID NO: 9, 10, 12, 13, 14, 16, e os complementos das mesmas. Em outro aspecto desta modalidade, a molécula de ácido nucléico é um iniciador selecionado do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 9, 10, 13, 14, e os complementos das mesmas. Ainda, em outro aspecto desta modalidade, o amplicon compreende SEQ ID NO: 11 , 15, ou os complementos das mesmas. Uma variedade de métodos de detecção pode ser usada, incluindo, mas não limitados a TAQMAN, amplificação térmica, reação em cadeia por ligase, Southern-blot, ELISA e métodos de detecção colorimétrica e fluorescente. Em particular, a presente invenção fornece kits para detectar a presença da sequência alvo, isto é, pelo menos a sequência SEQ ID NO: 4, 5, ou uma sequência de junção em uma amostra contendo ácido nucléico genômico do ME240913. O kit é compreendido por pelo menos dois polinucleotídeos capazes de se ligarem ao sítio alvo ou substancialmente adjacente ao sítio alvo e pelo menos um meio para detectar a ligação do polinucleotídeo no sítio alvo. Os meios de detecção podem ser por fluorescência, quimioluminescência, colorimetria ou isotopia e podem ser acoplados pelo menos com métodos imunológicos para detectar a ligação. O kit também pode detectar a presença do sítio alvo em uma amostra, isto é, pelo menos a sequência SEQ ID NO: 4, 5, ou uma sequência de junção do evento ME240913, levando vantagem de duas ou mais sequências de polinucleotídeos que juntas são capazes de se ligar às sequências de nucleotídeo adjacentes ou dentro de aproximadamente 100 pares de base da sequência alvo e que podem ser estendidas entre si para formar um amplicon que contém pelo menos o sítio alvo.

Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método para detectar a proteína CrylDa em uma amostra biológica, o método compreende: (a) extrair proteína do tecido do evento ME240913; (b) analisar a proteína extraída usando um método imunológico compreendendo anticorpos específicos para a proteína CrylDa produzida pelo evento ME240913; e (c) detectar a ligação do anticorpo mencionado com a proteína CrylDa.

Ainda em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um produto de planta derivado de uma planta de milho do evento ME240913, tecido, ou semente, onde o produto de planta compreende uma sequência de nucleotídeos que é igual ou é complementar à sequência que é única ao evento ME240913, e onde a sequência é detectável no produto de planta usando um método de amplificação ou hibridização de ácido nucléico. Em um aspecto desta modalidade, a sequência de nucleotídeos é igual ou é complementar a pelo menos uma dentre SEQ ID NO: 4, 5 e complementos das mesmas. Em um outro aspecto desta modalidade, o produto de planta é selecionado do grupo consistindo em farinha de milho, fubá, xarope do milho, óleo de milho, maisena e cereais fabricados no todo ou em parte que contenham produtos à base de milho.

Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um extrato de um produto de planta derivado de uma planta de milho ME240913, tecido ou semente compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é igual ou é complementar a uma sequência que é única ao ME240913. Em um aspecto desta modalidade, a sequência é detectável no extrato usando um método de amplificação ou hibridização de ácido nucléico. Em outro aspecto desta modalidade, a sequência é igual ou é complementar a pelo menos uma dentre SEQ ID NO: 4 e 5. Ainda, em outro aspecto desta modalidade, o produto de planta é selecionado dentre o grupo consistindo em farinha de milho, fubá, xarope do milho, óleo de milho, maisena, e cereais fabricados no todo ou em parte que contenham produtos à base de milho.

Outra modalidade da presente invenção refere-se a uma planta de milho, ou partes da mesma, e a sementes de uma planta de milho compreendendo o genótipo do evento transgênico ME240913, onde o genótipo compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NOs: 4, 5 ou complementos das mesmas. Um exemplo de semente de milho compreende as moléculas de ácido nucléico da invenção que foram depositadas no dia 28/10/2019 e atribuídas o número de acesso PTA-126224. Em um aspecto desta modalidade, a planta de milho é das linhagens de milho Hill. Contudo, um técnico com conhecimentos comuns na área reconhecerá que o genótipo ME240913 pode ser introduzido dentro de qualquer variedade de planta que possa ser reproduzida com milho, incluindo espécies selvagens de milho, e desta forma, a lista de linhagens reproduzidas desta modalidade não deve ser limitada.

Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a uma planta de milho compreendendo pelo menos uma primeira e uma segunda sequência de DNA ligadas para formar uma sequência de nucleotídeos contíguos, onde a primeira sequência de DNA está dentro de uma sequência de junção e compreende pelo menos aproximadamente 10 nucleotídeos contíguos selecionados do grupo consistindo em nucleotídeos 1-116 e 6307-6424 de SEQ ID NO: 8, e os complementos das mesmas, em que a segunda sequência de DNA está dentro da sequência de DNA heteróloga inserida e compreende pelo menos aproximadamente 10 nucleotídeos contíguos selecionados do grupo consistindo em nucleotídeos 117-6306 de SEQ ID NO: 8, e os complementos das mesmas; e em que a primeira e segunda sequências de DNA são úteis como sondas ou iniciadores de nucleotídeo para detectar a presença das sequências de ácido nucléico do evento de milho ME240913 em uma amostra biológica. Em um aspecto desta modalidade, os iniciadores de nucleotídeo são usados em um método de amplificação de DNA para amplificar uma sequência de DNA alvo do DNA padrão extraído da planta de milho e a planta de milho é identificável dentre outras plantas de milho pela produção de uma amplicon correspondendo a uma sequência de DNA compreendendo SEQ ID NO: 11 , 15 e complementos das mesmas.

Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a uma planta de milho, onde o genótipo ME240913 confere a resistência a insetos-pragas lepidópteros à planta de milho. Em um aspecto desta modalidade, o genótipo transgênico conferindo resistência a insetos- pragas lepidópteros à planta de milho da invenção compreende um gene crylDa truncado ou modificado.

Em outra modalidade, a planta de milho expressa concentrações adequadas na folha da proteína crylDa truncada e modificada para conferir altos níveis de proteção da folha da planta contra danos por S. frugiperda. Em outra modalidade, verificou-se que o alto nível de proteção de folhas de plantas ocorre em várias populações de S. frugiperda atual no Brasil, incluindo populações conhecidas por possuir altas frequências de S. frugiperda resistente a cry1F. Em outra modalidade, a inserção do gene cryl Da da planta de milho ME20913 produz expressão adequada da proteína CrylDa truncada e modificada em tecido foliar para produzir alta toxicidade para espécies susceptíveis de lepidópteros, incluindo S. frugiperda. Em ainda outra modalidade, a planta de milho ME20913 é altamente tóxica para S. frugiperda resistente a Cry1F.

Ainda em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma planta de milho resistente a insetos-pragas lepidópteros compreendendo as etapas de: cruzar sexualmente uma primeira planta de milho progenitora com uma segunda planta de milho progenitora, em que a referida primeira ou segunda planta de milho progenitora compreende o DNA evento ME240913, de forma a produzir uma pluralidade de plantas descendentes de primeira geração; selecionar uma planta descendente de primeira geração compreendendo o evento ME240913. Preferencialmente o método compreende ainda autopolinizar a planta descendente de primeira geração, de forma a produzir uma pluralidade de plantas descendentes de segunda geração; e selecionar a partir das plantas descendentes de segunda geração, uma planta compreendendo o evento ME240913. Em uma modalidade, a etapa de seleção pode ser feita com base na avalição de resistência a insetos-pragas lepidópteros, detecção do DNA do evento ME240913 de acordo com os métodos ensinados na presente invenção ou tratamento com herbicida e seleção de plantas resistentes ao herbicida promovida pelo gene PAT (bar) de resistência a herbicida contido no evento ME240913. Em uma modalidade preferida o método para produzir uma planta de milho transgênica compreendendo os ácidos nucléicos únicos da invenção compreende o cruzamento sexuado de uma primeira planta de milho progenitora contendo o evento ME240913 com uma segunda planta de milho progenitora não transgênica para produzir plantas descendentes, seleção de uma planta descendente de primeira geração que seja resistente a infestação por insetos-pragas lepidópteros, repetição do ciclo de retrocruzamento por 4 vezes, autopolinização da planta progenitora contendo o evento ME240913 para obtenção de plantas em homozigose.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de produção de sementes de milho híbridas compreendendo as etapas de: plantar sementes de uma primeira linhagem de milho congénita compreendendo o evento ME240913 e sementes de uma segunda linhagem congénita tendo um genótipo diferente; cruzar sexualmente as duas diferentes linhagens congénitas uma com a outra; e colher a semente híbrida produzida desta maneira. Em uma modalidade preferencial o método compreende pelo menos uma das etapas de cultivar plantas de milho resultantes das referidas plantadas até a época de floração e emascular as flores das plantas de uma das linhagens congénitas de milho. Em um aspecto desta modalidade, a primeira linhagem de milho reproduzida fornece os descendentes femininos. Em outro aspecto desta modalidade, a primeira linhagem de milho reproduzida fornece os descendentes masculinos. A presente invenção também se refere a sementes híbridas produzidas pelo método incorporado e a plantas híbridas cultivadas da semente.

Os exemplos subsequentes têm unicamente o propósito de ilustrar uma ou mais incorporações preferenciais da invenção e não são para serem construídos como limitador do escopo da invenção. EXEMPLOS

Exemplo 1 - Construção qênica

A construção gênica contendo o promotor da ubiquitina, a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 codificando a sequência de aminoácidos da proteína inseticida CrylDa truncada de SEQ ID NO: 3, otimizada para expressão em milho e a região 3’ do gene da nopalina sintase de Agrobacterium foi sintetizada no Serviço de Clonagem de DNA (http://www.dna-cloning.com/) no vetor pUC flanqueado pelos sítios de restrição Hindlll e EcoRI. A construção foi transferida do pUC para o vetor pTF101 (Paz et al., 2004) usando as enzimas de restrição EcoRI e Hindlll e ligase T4, de acordo com as instruções do fabricante (LifeTech). A seleção do plasmídeo recombinante pTF101 UBI:: cry1Da::NOS foi realizada através da transformação do E. coli DH5a usando a espectinomicina e a clonagem foi confirmada por sequenciamento e clivagem com as enzimas Hindlll e BamHI. Para o sequenciamento foi utilizado o kit comercial BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems). DNA plasmidial de duas colónias de bactéria contendo a construção gênica foi sequenciado e comparado com a sequência de interesse e constatou-se que elas eram idênticas.

Uma vez confirmada a clonagem do gene UBI::cry1 Da::NOS no plasmídeo pTF101 , esta construção gênica foi utilizada para transformar a cepa de Agrobacterium tumefaciens EHA101 , utilizando a metodologia de eletroporação (BioRad/MicroPulser). O mesmo procedimento de confirmação da transformação acima foi realizado para comprovação da presença do vetor binário recombinante contendo o gene crylDa em A. tumefaciens. O DNA plasmidial foi isolado de colónias de A. tumefaciens, amplificado com primers para detecção do gene bar.

Agrobacterium tumefaciens EHA 101 contendo as construções gênicas de interesse (UBI::cry1 Da::NOST e 35S::bar::35T) foi utilizada na transformação genética de milho.

Exemplo 2 - Transformação genética de embriões imaturos de milho Hill via Agrobacterium tumefaciens

O genótipo utilizado neste protocolo de transformação é o milho Hill (Armstrong et al., 1991), conforme protocolo por Frame et al. (2002), com pequenas modificações. Brevemente, para a transformação deste genótipo, foram coletados embriões imaturos entre 1 ,8 - 2,0 mm de comprimento (10 -12 dias após a polinização). Espigas utilizadas para a coleta dos embriões foram mergulhadas em uma solução de 1 :1 de água sanitária comercial (2,5% hipoclorito de sódio) e H2O destilada com 1-2 gotas de Tween 20, por 20 minutos. Em seguida, foram enxaguadas com água destilada estéril por 5 minutos, duas vezes.

Os embriões imaturos foram coletados com 0 auxílio de uma espátula a partir de um corte superficial dos grãos. Para a transferência da construção genica para 0 milho utilizou-se Agrobacterium tumefaciens EHA101. A partir de uma cultura estoque da A. tumefaciens contendo a construção genica de interesse, mantida em glicerol a -80 °C, uma estria foi feita em meio YEP (5 g.L ¹ de extrato de levedura; 10 g.L ¹ de peptona; 5 g.L ^-1 de NaCI; 15 g.L ^-1 de bacto ágar) contendo os antibióticos necessários (espectinomicina 100 mg.L ¹ e 50 mg.L ¹ kanamicina) e a placa foi incubada por 2 a 3 dias a 28 °C placa mãe). Para a transformação genética, uma estria da Agrobacterium utilizando uma colónia isolada da placa mãe foi feita em meio YEP contendo os antibióticos necessários. A placa foi incubada por 2 a 5 dias a 19 °C. Em seguida, a Agrobacterium foi ressuspendida em meio de infecção (4,0 g.L ¹ de N6 sais; 68,4 g.L ¹ de sacarose; 36,0 g.L ¹ de glicose; 0,7 g.L ¹ de prolina; 1 ,5 mg.L ¹ de 2,4-D; 1 ,0 mL.L ¹ N6 vitaminas (1000X = 1 ,0 g.L ^-1 de tiamina HCI; 0,5 g.L ^-1 de piridoxina HCI; 0,5 g.L ^-1 ácido nicotínico); pH 5,2) suplementado com 100 mM de acetoseringona até atingir uma OD550 = 0,3-0, 4 e, incubada em agitador a ~150 rpm, 23 °C por 2 horas.

Para a infecção dos embriões imaturos de milho, 50 a 100 embriões foram coletados em 1 ml_ de meio de infecção acrescido de acetoseringona. Após a coleta, os embriões foram enxaguados duas vezes, 1 ml_ da cultura bacteriana foi adicionado e a suspensão incubada por cinco minutos a 23 °C. Após a infecção, os embriões foram transferidos para a superfície de meio de co-cultivo (4,0 g.L ¹ de N6 sais; 1 ,5 mg.L ¹ de 2,4-D; 30,0 g.L ^-1 de sacarose; 0,7 g.L ^-1 de prolina; 1 ,0 mL.L ¹ N6 vitaminas (1000X); 0,85 mg.L ¹ de AgN0 ₃ ; 100 mM de acetoseringona; 300 mg.L ^-1 de L-cisteína; 3,0 g.L ^-1 de phytagel; pH 5,8) com o escutelo voltado para cima. As placas foram incubadas no escuro a 20 °C por 3 a 5 dias. Após o co-cultivo os embriões foram transferidos para o meio de repouso (4,0 g.L ¹ de N6 sais; 1 ,5 mg.L ¹ de 2,4-D; 30,0 g.L ¹ de sacarose; 0,5 g.L ¹ de MES; 0,7 g.L ^-1 de prolina; 1,0 mL.L ¹ N6 vitaminas (1000X); 0,85 mg.L ^-1 de AgN0 ₃ ; 100 mg.L ^-1 de Tioxin; 3,0 g.L- ¹ de phytagel; pH 5,8) a 28 °C (escuro) por 7 a 15 dias. Em seguida, os embriões foram transferidos para o meio de seleção (4,0 g.L ^-1 de N6 sais; 1 ,5 mg.L ^-1 de 2,4-D; 30,0 g.L ^-1 de sacarose; 0,5 g.L ^-1 de MES; 0,7 g.L ¹ de prolina; 1 ,0 mL.L ¹ N6 vitaminas (1000X); 0,85 mg.L ¹ de AgN0 ₃ ; 100 mg.L ^-1 de Tioxin; 1 ,5 e 3,0 mg/L de bialaphos; 3,0 g.L ^-1 de phytagel; pH 5,8) (25 embriões/placa). Subcultivos destes embriões em meio seletivo são realizados a cada 15 dias até a seleção de calos crescendo vigorosamente.

Calos selecionados foram transferidos para meio de regeneração (4,62 g.L ^-1 de MS sais; 60,0 g.L ^-1 de sacarose; 100 mg.L ^-1 de mio-inositol; 1 ,0 mL. L ¹ de MS vitaminas (1000X); 1 ,5 mg/L de bialaphos; 4,0 g.L ^-1 de phytagel; pH 5,8) e incubados a 26 ± 2 °C (escuro) por 15 a 21 dias. Calos prontos para a germinação, possuindo aspecto seco e coloração branca opaca, foram transferidos para o meio de germinação (4,62 g.L ^-1 de MS sais; 30,0 g.L ^-1 de sacarose; 100 mg.L ^-1 de mio-inositol; 1 ,0 mL.L ^-1 de MS vitaminas (1000X = 0,5 g.L ^-1 de tiamina HCI; 0,5 g.L ^-1 de piridoxina HCI; 0,05 g.L ^-1 ácido nicotínico); 3,0 g.L ^-1 de phytagel; pH 5,8) (12 calos por placa), 25 °C, 80-100 pE/m ² /sec de intensidade luminosa, 16 horas de fotoperíodo.

Plântulas com raízes bem desenvolvidas e as estruturas foliares medindo cerca de 5 cm de comprimento (14 a 20 dias), foram transplantadas para vasos em casa de vegetação contendo uma mistura de solo e matéria orgânica (2/3 de solo e 1/3 de matéria orgânica (TDP 30/15) produzida comercialmente passando por uma fase de aclimatação.

Após obtenção do genótipo Hill com o evento ME240913, o evento foi introgredido do genótipo Hill para a linhagem tropical L3, utilizando seleção assistida por marcadores moleculares.

Exemplo 3 - Bioensaios

Visando avaliar a suscetibilidade do milho transgênico expressando a proteína CrylDa truncada a S. frugiperda, realizaram-se bioensaios em laboratório. Os bioensaios foram realizados da seguinte maneira: lagartas recém-eclodidas da espécie S. frugiperda foram utilizadas para infestar folhas de plantas de milho transgênico crylDa e a isolinha não transgênica (5 lagartas por planta). Os estádios de desenvolvimento de milho utilizados foram V7 e V8 e os experimentos foram realizados em recipientes plásticos e incubados em câmara de crescimento aclimatadas (28C e 60% umidade, luminosidade 12 hrs). As avaliações das notas de danos ocorreram após 05 dias. Em cada caso, o delineamento experimental foi composto por: “grupo experimental” (evento ME240913 de milho transgênico contendo a construção crylDa truncada) e “grupo controle” (milho não transgênico).

Os parâmetros avaliados foram: nota de injúria utilizando a escala proposta por Carvalho, 1970 (0: planta com folhas não- danificadas; 1: planta apresentando folhas raspadas; 2: planta apresentando folhas furadas; 3: planta apresentando folhas rasgadas; 4: planta apresentando lesão no cartucho; e 5: planta apresentando cartucho destruído); sobrevivência de lagartas (contou-se o número de lagartas sobreviventes em cada vaso); e biomassa de lagartas (utilizando balança de precisão de quatro casas decimais).

Exemplo 4 - Bioensaios para controle de S. fruaioerda utilizando o evento transqênico de milho ME240913

Ensaios com S. frugiperda inicialmente, o evento ME240913 foi testado para o controle dessa praga. Sementes do evento foram germinadas em casa de vegetação e quando as plantas atingiram o estádio entre V10 e V12 folhas as duas folhas mais novas de cada planta foram utilizadas em bioensaios com S. frugiperda. Foram realizadas três repetições, com cinco lagartas por repetição. Utilizou-se folhas dos milhos Hill e L3 como controle negativo (lagartas crescem normalmente) e folhas do milho com a tecnologia Viptera® como controle positivo (lagartas não conseguem crescer). Neste primeiro teste foi verificado que o evento ME240913 possuía boa capacidade de controlar o desenvolvimento da lagarta, atingindo 100% de mortalidade (Tabela 1).

Tabela 1 - Avaliação do evento ME240913 com relação ao controle de S. fruaioerda

O bioensaio com este evento foi repetido, utilizando-se quatro repetições com 20 lagartas por repetição, e os resultados confirmaram que este evento possui a capacidade de controlar o desenvolvimento da S. frugiperda (Tabela 2). A Figura 3 é representativa dos bioensaios de alimentação com S. frugiperda em milho não-transgênico e milho transgênico da presente invenção. Nesse experimento não se utilizou o tratamento com o genótipo de milho Viptera.

Tabela 2 - Avaliação de eventos transqênicos de milho com relação ao controle de S. frugiperda fbioensaio 2)

Exemplo 5 - Exposição ao tecido fresco de folhas de dois backqrounds aenéticos contendo o evento ME240913

Nesse experimento foi utilizado hibrido 1 da linhagem Helix L85 X linhagem Embrapa L3 ME240913 (folhas V8 e V9). O híbrido 2 foi de Hill ME240913 X linhagem Embrapa L3 (folhas V5 e V6) e o controle o híbrido das linhagens Helix L85 X Embrapa L3 (folhas V8 e V9). Ambos os híbridos eram heterozigotos para o evento ME240913.

Discos de folhas frescas de 1,8 cm de diâmetro foram cortados usando um cortador metálico e colocados em ágar a 2,0% (1 mL/poço) em bandejas de bioensaio de plástico com 128 poços (Bio- Ba-128, C-D International, Pitman, NJ, EUA).

Utilizou-se para os ensaios uma população de laboratório lagarta do cartucho, S. frugiperda da Embrapa Milho e Sorgo suscetível padrão, a mesma utilizada por Omoto et al 2016, como padrão de suscetibilidade (Omoto, C., Bernardi, O., Salmeron, E., Sorgatto, R. J., Dourado, P. M., Crivellari, A., Carvalho, R. A., Willse, A., Martinelli, S., & Head, G. P. (2016). Field-evolved resistance to CrylAb maize by S odo tera frugiperda in Brazil. Pest Management Science, 72(9), 1727-1736.). mantida em dieta artificial e sem pressão seletiva de inseticidas ou Bt.

Uma larva recém eclodida (0 a 24 horas) foi colocada em cada poço contendo um disco foliar usando um pincel fino. As placas foram seladas com adesivos Bio-CV-16 (C-D International, Pitman, NJ, EUA) e colocadas em câmara climatizada (temperatura 26 ± 1 °C; umidade relativa de 60 ± 10%; fotoperíodo 14:1 Oh claro :escuro). Cento e vinte larvas foram usadas para cada tratamento.

A mortalidade foi avaliada após 24 horas de exposição e, posteriormente, diariamente, até 100% de mortalidade. Considerou-se como lagartas mortas aquelas que não respondem ao toque do pincel.

Folhas frescas de milho expressando o tecido foliar do evento ME240913 produziram mortalidade por S. frugiperda a partir do dia dois após alimentadas e a mortalidade de 100% após três dias. O mesmo padrão de mortalidade rápida e completa foi observado nos dois híbridos testados. O resultado é ilustrado na Figura 4. Exemplo 6 - Exposição a tecido liofilizado de folha diluído 1:25 do Evento ME240913 na dieta artificial

Esse experimento avaliou o evento ME240913 no cruzamento da linhagem Helix L85 X linhagem Embrapa L3 contendo o evento ME240913 (folhas coletadas no estádio V8 e V9) e como controle o híbrido das linhagens Helix L85 X Embrapa L3 (folhas V8 e V9). Resultados foram comparados com aqueles obtidos utilizando folhas do hibrido controle Helix L85 X Embrapa L3, também coletadas nos estádios V8 e V9.

Aproximadamente sete plantas dos dois híbridos de milho descritos acima foram colhidas após 27 dias de crescimento. As folhas entre os estádios de desenvolvimento V8 e V9 foram colocadas em sacos plásticos congelados com nitrogénio líquido e transferidos para um freezer ultrabaixo de -80°C. Os tecidos das folhas foram liofilizados utilizando dessecação em congelamento. Após a liofilização, o material foi moído usando um moedor de tecidos (IKA A11 Basic). As amostras das folhas liofilizadas e moídas foram armazenadas em copos plásticos com tampas seladas em temperatura ambiente.

As folhas de milho transgênico liofilizadas foram preparadas em uma proporção de 1 :25 na dieta artificial de S. frugiperda apresentando 4% (p/p). O controle negativo continha 4% de tecido não transgênico liofilizado. Aproximadamente 1 L da dieta artificial de S. frugiperda foi preparado com um protocolo adaptado contendo apenas 56% da quantidade total de ágar ao protocolo regular. A dieta foi resfriada e mantida a 55 °C em banho-maria conforme necessário. Para cada tratamento, 160 g de dieta de S. frugiperda foram adicionadas ao copo de plástico contendo tecido liofilizado pré-pesado. O tecido da folha foi misturado com uma espátula até ficar visualmente uniforme. A mistura foi transferida para um saco plástico grosso com um furo em uma das extremidades e a dieta foi adicionada em cada um dos poços em uma bandeja de bioensaio (bandejas CD-Internacional de 128 poços) pressionando a dieta através de todo o saco (como um saco de confeiteiro). Aproximadamente 0,8 ml de mistura de pó de dieta / folha foram distribuídos em cada um dos 128 poços individuais para cada material transgênico e não transgênico (total de 256).

Utilizou-se a população de S. frugiperda suscetível padrão descrita no ensaio supracitado.

Uma larva recém eclodida (0 a 24 horas) foi colocada em cada um dos poços usando uma escova fina. As placas foram seladas com adesivos Bio-CV-16 (C-D International, Pitman, NJ, EUA) e colocadas em câmara climática (temperatura 26 ± 1 ° C; umidade relativa de 60 ± 10%; fotoperíodo 14:10 h claro: escuro).

A mortalidade foi registrada nos dias 3, 6-10 e 13-14 dias após a exposição. Larvas visivelmente inativas que não se moviam quando tocadas com uma escova fina eram consideradas mortas.

Nesse experimento foi observado mortalidade de 67% no dia 7 e 97% no dia 14 (125/128 larvas). As três larvas restantes apresentaram inibição significativa no crescimento em comparação com as larvas que se alimentavam de tecido foliar controle (testemunha). A Figura 5 ilustra o resultado de sobrevivência de lagartas recém eclodida de S. frugiperda (%), avaliada até 14 dias após exposição a folhas liofilizadas na proporção de 1:25 com dieta artificial obtidas a partir de folhas do evento ME240913 e o controle Exemplo 7 - Proteção contra danos às folhas em plantas de milho do Evento ME240913 em campos infestados por seis populações diferentes de S. frugiperda de diferentes origens

As plantas de controle foram obtidas do híbrido entre as linhagens Helix L85 X Embrapa L3. As plantas contendo o evento foram obtidas do híbrido entre as linhagens Helix L85 x Embrapa L3 ME240913. Populações de ocorrência natural de S. frugiperda foram coletadas no estádio de larvas em seis locais distintos de produção de milho no Brasil, conforme descrito: duas populações foram coletadas no Estado do Paraná (Palotina e Ivatuba), duas no Estado de Mato Grosso (Rondonópolis e Campo Verde) e duas no Estado de Minas Gerais (Paracatu e Sete Lagoas). As larvas foram mantidas em condições de laboratório com dieta artificial até a fase adulta (ciclo em torno de ~ 30 dias) sem pressão seletiva de inseticidas ou Bt. As larvas recém eclodidas foram então infestadas nas plantas no estágio de crescimento V4 em condições de campo.

Os tratamentos consistiram em uma combinação de dois híbridos e seis populações de insetos com três repetições. Foram plantadas parcelas de cinco linhas com cinco metros de comprimento; cuja infestação foi realizada nas três fileiras centrais e as quais foram utilizadas para a avaliação. As duas linhas restantes foram usadas como zona tampão (bordadura).

A avaliação do dano causado pela alimentação da lagarta nas plantas de milho foi realizada de acordo com Davis et al. 1992. Em resumo, foi utilizada uma escala de 0 a 9, na qual 0 representava plantas sem nenhum dano e 9 representava plantas com folhas expandidas destruídas. Assim o aumento da unidade na escala representou maiores níveis de lesões nas folhas.

Os escores de campo foram registrados 7, 14 e 21 dias após as exposições.

A média de dano visual das folhas do tratamento controle utilizando o hibrido de milho L85XL3 produziram uma nota de infestação para as seis diferentes populações de S. frugiperda variando de 3,4 a 5,19 no tratamento controle e próximos de zero no híbrido expressando CrylDa. Ou seja,, médias de notas das plantas avaliadas no híbrido contendo o evento com CrylDa foram consideravelmente menores (<0,1).

A Figura 7 ilustra os resultados de notas de dano (escala de Davis et al, 1992) de 0 a 9, causada pela alimentação de diferentes populações S. frugiperda (± Intervalo de Confiança, a 5% de probabilidade), em híbrido convencional (conv) que não expressa o evento ME240913 e em híbridos de milho ME240913) em campo. Avaliado aos 14 dias após a infestação.

As Figuras 8A a 8F mostram o híbrido simples controle (convencional) obtido do cruzamento entre as linhagens Helix-L85 x Embrapa-L3 (à esquerda nas fotos) e sua respectiva versão isogênica contendo o evento, Helix-L85 x Embrapa-L3 com evento ME240913 (à direita nas fotos). Cada foto mostra a versão convencional e a versão contendo o evento ME240913, infestadas individualmente por cada uma de seis diferentes populações de S. frugiperda coletadas no Brasil, nos seguintes locais: população coletada em Palotina-PR (8A), Rondonópolis-MT (8B), Rondonópolis+Campo Verde-MT (8C), Paracatu-MG (8D), Sete Lagoas-MG (8E) e Ivatuba-PR (8F). Danos nas folhas são visíveis nos controles à esquerda em cada foto, enquanto o híbrido contendo o evento ME240913 não mostra danos (híbrido à direita em cada foto).

Exemplo 8 - Bioensaios utilizando populações de lagartas resistentes ao Milho transqênico contendo o gene Crv1F

Ensaios foram realizados para verificar o potencial do evento ME240913 no controle de população de S. frugiperda resistente à proteína Cry1F.

O experimento foi realizado em casa de vegetação, com o plantio do milho transgênico, contendo o evento ME240913 e do milho não transgênico (controle negativo). Lagartas recém eclodidas pertencentes a duas populações distintas de S. frugiperda (uma população resistente ao gene Cry1F e outra população sensível ao mesmo gene) foram inoculadas nas plantas de milho (15 lagartas por planta), em estágio V7 e V8. Após a infestação, os vasos foram isolados com gaiola voil e as avaliações das notas de injúria ocorreram após 07, 14 e 21 dias. O delineamento experimental foi composto por 04 tratamentos, com 05 vasos cada, contendo de 02 a 03 plantas de milho por vaso:

Tratamento 1 : Evento transgênico ME240913 infestado com a população de S. frugiperda resistente à proteína Cry1 F de acordo com Leite et al. 2016.

Tratamento 2: Linhagem isogênica L3 não transgênica infestada com a população de S. frugiperda resistente à proteína Cry1F de acordo com Leite et al 2016.

Tratamento 3: Evento transgênico ME240913 infestado com a população de lagartas suscetíveis oriunda de criação de manutenção do laboratório de entomologia da Embrapa Milho e Sorgo.

Tratamento 4: Linhagem isogênica não transgênica infestada com a população de lagartas suscetíveis oriunda de criação de manutenção do laboratório de entomologia da Embrapa Milho e Sorgo.

Os resultados indicaram que a planta transgênica com o evento ME240913 foi capaz de controlar a infestação com a população de S. frugiperda resistente à proteína Cry1 F, tão bem quanto em relação à população suscetível, inibindo seu desenvolvimento (Figura 9) e protegendo a planta do ataque por tal praga, conforme observado pela nota de injúria (±IC, P=0,05). O percentual de sobrevivência de S. frugiperda, avaliada 21 dias após a liberação de lagartas em diferentes tratamentos, foi de 0% para os tratamentos 1 e 3, e cerca de 65% e 35% para os tratamentos 2 e 4, respectivamente. A biomassa de S. frugiperda, avaliada 21 dias após a liberação de lagartas em diferentes tratamentos, foi de 0% para os tratamentos 1 e 3, e cerca de 260 mg e 300 mg para os tratamentos 2 e 4, respectivamente. Em ambos os casos, as médias não são sobrepostas pelo IC, diferem entre si (P=0,05).

Este exemplo 8 descreve o uso de uma sequência códon otimizada de CrylDa para produzir plantas de milho expressando uma sequência truncada de CrylDa com alto nível de toxicidade (100% de mortalidade) tanto para as populações selvagens como para populações de S. frugiperda resistentes a Cry1F. O fato de identificar 100% de mortalidade em populações de S. frugiperda resistentes a Cry1 F quando folhas frescas do evento ME240913 foram utilizadas para alimentar essas populações de S. frugiperda confirma o fato de que a proteína truncada e códon modificada expressa do gene CrylDa utilizado age através de um mecanismo diferente daquele existente no evento comercial que contém o gene Cry1F.

DEPÓSITO Sementes de milho do evento ME240913 revelado acima foram depositadas em 28/10/2019 de acordo com o Tratado de Budapeste na American Type Culture Colection (ATCC), 1801 Universidade de Boulevard, Manassas, VA 20110, sob número de acesso PTA-126224.