【발명의 명칭】

골분화 촉진능 및 치주인대섬유모세포 활성 촉진능을 갖는 펩타이드 및 이의 용도

【기술분야】

본 특허출원은 2014 년 7 월 28 일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2014-0095893 호에 대하여 우선권을 주장하며， 상기 특허출원의 개시 사항은 ^' 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명은 골분화 촉진능 및 치주인대섬유모세포 활성 촉진능을 갖는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

【발명의 배경이 되는 기술】

뼈는 우리 몸에서 석회화된 대표적인 조직으로세 재형성 과정을 통해 우리 몸을 지탱하는 역할을 하고 있다. 뼈에 생기는 질환들의 원인은 크게 3 가지로 분류 될 수 있는데， 첫째， 성장 발육과정에서 크기의 이상이 생기는 경우， 둘째， 뼈의 리모델링 과정에서 조골세포에 의한 뼈 형성과 파골세포에 의한 흡수에 균형이 깨지는 경우, 셋째， 뼈의 석회화 혹은 광물화 (mineral izat ion)에 이상이 생기는 경우가 있다.

TGF-β (Transforming growth factor-beta) 수퍼패밀리는 TGF-β， 노달 (Nodal ) , 액티빈 (Act ivin) , BMPs(bone morphogenet ic proteins)와 같은 40 개 이상의 종류로 구성되어 있다. TGF-β 시그널링은 특정한 타입 I 과 타입 I I 세린 /트레오닌 키나아제 수용체들이 복합체를 형성하여 이형복합체 (heteromer ic complex)의 형태를 통해 원형질막을 가로질러 첫 번째로 신호를 전달한다. TGF-^ /BMPs 는 신체에서 다양한 기능과 포유류 발달 과정의 골 형성에 관여하는 것으로 알려져 있다.

TGF-β /ΒΜΡ 시그널링이 방해 되면， 종양 전이， 단지증， 관절염과 같은 다발성 골 관련 질환에 영향을 받게 된다.

인체의 뼈는 매일 조금씩 분해되고, 분해 된 양만큼 새로운 뼈로 채워짐으로써 항상성을 유지하는 매우 역동적인 기관이다. 뼈를 분해 하는 파골세포와 뼈를 재생하는 조골 세포 중 한 가지 세포의 활성이 증가하거나 감소하게 되면， 항상성 파괴로 인한 여러 질병들이 일어날 수 있다. 뼈를 흡수 하는 파골세포의 활성이 증가하게 되면, 뼈의 분해가 촉진， 뼈가 얇아지고 쉽게 부러지는 골다공증과 같은 질병이 일어나게 되며， 조골세포의 활성이 증가하게 되면， 골밀도의 증가로 뼈의 기형이나 골 석회증이 일어나게 된다. 그렇기 때문에 파골세포와 조골세포의 균형이 중요하다.

지금까지 알려진 약품으로는 바이오시밀러 의약품 전문기업인 코리아본뱅크에서 최근 골형성 단백질 ' 라퓨젠' 에 대해 식품의약품 안전청으로부터 임상시험을 승인받아 임상시험에 들어가 있다. 이 외에도 대웅제약에서 골형성 촉진 단백질 'BMP2 '와 인공뼈를 접목한 신개념 바이오 융합 의료기기로서 노보시스를 출시했는데 이 노보시스는 임풀란트를 비롯한 골이식 관련 치료에 다양하게 활용될 예정으로 자가이식보다 뼈가 더 잘 붙고 수술시간과 출혈은 줄어들어 빠른 회복을 기대할 수 있다고 보고하였다. 이 외에도 동화약품에 'DW1350' 이라는 약품이 파골세포 억제뿐만 아니라 조골세포의 촉진 기능이 뛰어난 약품으로 출시되었지만 지금까지 계속 임상시험을 진행 하고 국내에 출시되지 않은 상황이다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기슬 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

【발명의 내용】

【해결하고자 하는 과제】

본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 우수한 펩타이드들을 개발하고자 노력한 결과， 서열목록 제 1 서열 또는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 조골세포의 성장 및 분화를 촉진하고 치주인대섬유모세포의 활성을 촉진 등 우수한 생리활성을 갖는다는 것을 규명함으로써， 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서， 본 발명의 목적은 골 분화 촉진 활성 및 치주인대섬유모세포 활성 촉진능을 갖는 템타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 치주질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

【과제의 해결 수단】

본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 서열목록 제 1 서열 및. 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종의 아미노산 서열로 이루어진 조골 분화 촉진 활성을 갖는 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면， 본 발명은 서열목록 계 1 서열 및 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종의 아미노산 서열로 이루어진 치주인대섬유모세포 분화 촉진 활성을 갖는 펩타이드를 제공한다. 본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 우수한 펩타이드들을 개발하고자 노력한 결과, 서열목록 제 1 서열 또는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 조골세포의 성장 및 분화를 촉진하고 치주인대섬유모세포의 활성을 촉진 등 우수한 생리활성을 갖는다는 것을 규명하였다.

본 발명의 펩타이드는 서열목록 제 1 서열 또는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 펩타이드는 서열목록 제 1 서열 또는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되어 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면， 본 발명의 펩타이드는 조골세포의 증식을 촉진하며, Smadl , Smad5 및 Smad8 의 인산화를 유도하여 BMP 시그널을 활성화 시키고, 골 형성 마커로 알려진 ALKAlkal ine phosphatase) , COLlAKCol lagen type I alpha 1) 및 BSP (Bone sialoprotein)의 발현을 증가시킴으로써 결과적으로 골 분화를 촉진시킨다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면， 본 발명의 펩타이드는 PI3K 및 Akt 인산화를 통해 치주인대섬유모세포의 성장을 촉진하고， PI3K 및 Akt 의 인산화를 증가시키며, COLlAKCol lagen type I alpha 1) 및 DSPP (Dent in sialophosphoprotein)과 같은 활성 마커의 발현을 증가시켜 치주인대섬유모세포의 활성을 촉진시킴으로써 궁극적으로 치주 조직 재생 활성을 나타낸다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "펩타이드" 는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법， 특히 고상 합성 기술 (sol idᅳ phase synthesis techniques ; Merri f ield, J . _. Amer . Chem. Soc . 85: 2149-54( 1963)； Stewart , et al . , Sol id Phase Pept ide Synthesi s , 2nd. ed. , Pierce Chem. Co . : Rockford, 111(1984) ) 또는 액상 합성 기술 (US 등록특허 제 5, 516 ,891호)에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 펩타이드의 N— 또는 C—말단은 아세틸기， 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기， 팔미토일기， 미리스틸기， 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜 (PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합될 수 있다.

상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 언급되는 용어 "안정성" 은 "인 비보" 안정성 뿐만 아니라, 저장 안정성 (예컨대， 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 템타이드를 보호하는 작용을 한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 상술한 서열목록 제 1서열 및 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 서열목록 제 1 서열 또는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에， 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이， 본 발명의 서열목록 제 1 서열 또는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 조골세포의 증식 및 분화를 촉진하기 때문에 골 질환의 예방 또는 치료에 매우 유효하다.

본 발명의 골 질환 예방 또는 치료용 조성물은 조골 기능이 원활하지 못하여 골밀도가 떨어지거나 또는 관절의 염증 등으로 인해 파골 작용이 과도한 경우에 발생하는 모든 질환에 사용될 수 있으며， 예컨대 골다공증, 소년기 골다공증， 골형성 부전증, 골연화증， 골 괴사증， 구루병， 골수염， 치조골 소실， 뼈의 파젯병 (Paget ' s di sease) , 고칼슘혈증, 원발성 부갑상선기능항진증， 전이성 (metastat i c) 골 질환, 골수종， 류마티스 관절염에서의 골 소실, 전이성 골 질환, 암에 의한 골 소실， 섬유성 골이형성증, 무형성 골 질환， 대사성 골 질환 및 나이에 따른 골 질량의 소실 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면， 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로 제조될 수 있다. ^'

본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량" 은 상술한 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 층분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서， 락토스， 덱스트로스， 수크로스, 솔비를, 만니를, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘， 알기네이트， 젤라틴, 규산 칼슴， 미세결정성 셀를로스， 폴리비닐피를리돈, 셀를로스, 물, 시럽, 메틸 셀를로스， 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슴 및 미네랄 오일 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제， 감미제, 향미제， 유화제， 현탁제， 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 、제제는 Remington' s Pharmaceut ical Sciences (19th ed. , 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구， 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고， 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입， 국소 투여， 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식， 환자의 연령， 체중， 성， 병적 상태， 음식， 투여 시간， 투여 경로, 배설 속도 및 반웅 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편， 본 발명의 약제학적 조성물의 어떤 투여량은 1 일 당 0.0001-200/g이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라ᅳ 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 액스제， 분말제， 과립제， 정제， 갑셀제 또는 젤 (예컨대， 하이드로젤) 형태일 수도 있으며， 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 상술한 서열목록 제 1 서열 및 서열목록 제 2 서열의 아'미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 치주질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성.물은 상술한 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에， 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

치주질환 치료의 궁극적인 목표는 치조골， 치주인대， 백악질 등 파괴된 조직의 재생에 있다. 사람치주인대섬유모세포는 치주인대섬유모세포와 골모세포 그리고 백아모세포로 분화， 증식이 가능함으로서 치주조직재생의 중추적 역할을 담당하기 때문에 치주조직재생을 위한 치주조직 공학의 웅용 시 활용해야할 대표적인 세포이다. 치주조직의 재생을 위해서는 다양한 분화 능력이 있는 치주인대세포들의 증식을 촉진시켜 조직재생을 유도하는 것이 중요하다. 하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 치주인대섬유모세포의 증식과 활성을 촉진하여 치주 조직의 유지와 재생에 관여하는 세포외기질 구성성분의 강화 효과를 나타낸다. 따라서， 본 발명의 조성물은 다양한 치주질환의 예방 또는 치료에 매우 유효하다.

치주질환은 수많은 구강 감염 질환들 중의 하나로， 30 세 이상의 인간에서 발생하는 치아 소실의 주요 원인이다. 본 명세서의 용어 "치주질환 (peridontal disease)" 은 실질적으로 치주조직 (per iodont ium)에 영향을 미치는 수많은 질환들을 포함한다. 치주조직은 치아의 피복조직 및 지지조직으로 구성되어 있으며, 치조골 (alveolar bone), 치주 인대 (periodontal ligament), 백악질 (cementum) 및 치은 (gingiva)을 포함한다. 많은 다른 질환들이 치아 -지지조직 (tooth-supporting structures)에 영향을 미치는 반면에, 플락크-유도된 염증성 레전이 치주질환의 대부분을 차지하고 전통적으로 치은염 (gingivitis) 또는 치주염 (periodontitis)으로 분류된다.

본 발명에서 치주질환은 치주염 (periodontitis), 치은염 (gingivitis)， 치관주위염 ( 6 )] 011^^3)， 치주 고름집 (Parodontal abscess) , 치주증 (Per iodontosis)， 기타 치주질환 (other periodontal diseases) 또는 이들의 조합에서 선택된다.

본 명세서의 용어 "치은염 (gingivitis)" 는 치은조직의 염증으로， 치주질환 발병의 첫 번째 사인이다. 본 명세서의 용어 "치주염 (periodontitis)" 은 치은 유니트 (gingival unit) 뿐 아니라, 치조골， 치주 인대 및 백악질에서 발생하는 염증을 의미한다. 일반적으로， 치주염은 치은의 만성 부착 (attachment)의 소실 (loss) 및 골의 방사성 소실에 의해 특징지워진다.

본 발명은 치주질환의 효과적인 예방 및 치료를 위하여 구강용 조성물 형태로 제공될 수 있으며， 상기 구강용 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으며, 통상의 제형을 가질 수 있다. 구체적으로는 치약， 구강세정제 또는 구강청정제 등의 제형을 가질 수 있다. 본 발명에서 제공하는 구강용 조성물은 그 제형에 따라 제제화에 필요한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며， 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다. 예를 들면， 구강용 조성물의 제형이 치약류인 경우， 연마제， 습윤제， 기포제， 결합제， 감미제， pH 조절제， 방부제, 약효성분, 향료， 증백제， 색소， 용제 등을 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명의 치주질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

【발명의 효과】

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

( i ) 본 발명의 서열목록 제 1 서열 또는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 조골세포의 증식과 분화 촉진 및 치주인대섬유모세포의 증식과 활성 촉진 효능을 나타낸다.

( i i ) 본 발명의 펩타이드는 smadl/5/8 인산화와 같은 BMP 시그널링을 증가시켜 조골세포의 성장 및 C0L1A1 , BSP , ALP와 같은 분화 마커의 발현을 증가시킴으로써 궁극적으로 조골 활성을 나타낸다.

( i i i ) 본 발명의 펩타이드는 PI3K 및 Akt 인산화를 통해 치주인대섬유모세포의 성장을 촉진하고 C0L1A1 및 DSPP과 같은 활성 마커의 발현을 증가시킴으로써 궁극적으로 치주 조직 재생 활성을 나타낸다.

( iv) 본 발명은 상술한 펩타이드를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 치주질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

【도면의 간단한 설명]

도 la 는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 1 서열의 펩타이드를 처리한 골모세포의 세포성장 촉진 효과를 나타낸 그래프이다. 도 lb 는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 2 서열의 펩타이드를 처리한 골모세포의 세포성장 촉진 효과를 나타낸 그래프이다. 도 2a 는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 1 서열의 펩타이드를 처리하였을 때 발현되는 ALP (Alkal ine phosphat ase)의 정도를 세포 염색을 통해서 확인한 결과 이다. 도 2b 는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 2 서열의 펩타이드를 처리하였을 때 발현되는 ALP (Alkal ine phosphatase)의 정도를 세포 염색을 통해서 확인한 결과 이다.

도 3a 는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 1 서열의 펩타이드를 처리하였을 때 골 분화 마커의 mRNA 발현 정도를 확인 한 결과 이다.

도 3b 는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 2 서열의 펩타이드를 처리하였을 때 골 분화 마커의 mRNA 발현 정도를 확인한 결과 이다.

도 4a 는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 1 서열의 펩타이드를 처리하였을 때 골 분화 관련 시그널인 Smadl/5/8 의 인산화 정도를 확인한 결과 이다.

도 4b 는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 2 서열의 펩타이드를 처리하였을 때 골 분화 관련 시그널인 Smadl/5/8 의 인산화 정도를 확인한 결과 이다.

도 5 는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 1 서열의 펩타이드를 처리하였을 때 콜라겐 스폰지 내로 침투된 골세포의 양상을 H&E 염색으로 확인 한 결과이다.

도 6a 는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 1 서열의 펩타이드를 처리하였을 때 치주인대섬유모세포의 세포성장 촉진 효과를 나타낸 그래프이다.

도 6b 는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 2 서열의 펩타이드를 처리하였을 때 치주인대섬유모세포의 세포성장 촉진 효과를 나타낸 그래프이다.

도 7a 는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 1 서열의 펩타이드를 처리하였을 때 치주인대섬유모세포의 세포 성장 촉진 관련 단백질인 PI3K 및 Akt의 인산화 정도가 증가하는 것을 확인한 결과이다. 도 7b 는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 2 서열의 펩타이드를 처리하였을 때 치주인대섬유모세포의 세포 성장 촉진 관련 단백질인 PI3 및 Akt의 인산화 정도가 증가하는 것을 확인한 결과이다. 도 8a 는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 1 서열의 펩타이드를 처리하였을 때 치주인대섬유모세포의 활성화 정도를 관련 유전자인 C0L1A1 및 DSPP의 mRNA 발현 증가로 확인한 결과이다.

도 8b 는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 2 서열의 펩타이드를 처리하였을 때 치주인대섬유모세포의 활성화 정도를 관련 유전자인 C0L1A1 및 DSPP의 mRNA 발현 증가로 확인한 결과이다.

【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예

합성예 1 : 펩타이드 합성

클로로 트리틸 클로라이드 레진 (Chloro tr i tyl chlor ide resin ; CTL res in, Nova biochem Cat No . 01-64-0021) 700 mg 을 반웅용기에 넣고 메틸렌 클로라이드 (MC) 10 를 가하여 3 분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드 (DMF) 10 ^를 넣어 3 분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반웅기에 10 ^의 디클로로메탄 (DCM) 용액을 넣고 Fmoc-Ser(tBu)-0H (Bachem , Swi ss) 200 瞧 ol e 및 디이소프로필 에틸아민 (DIEA) 400 画 ol e 을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고， 1 시간 동안 교반하면서 반웅시켰다. 반웅 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2 : 1)를 DCM 에 녹여 10 분간 반응시키고 과량의 DCM/DMF( 1 : 1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 DMF 를 10 넣어 3 분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액 (20%의 피페리딘 (Piper idine)/DMF) 10 m£를 반웅용기에 넣고 10 분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10 분간 반웅을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3 분씩 DMF 로 2회， MC로 1회, DMF로 1회 세척하여 Ser (tBu)-CTL Resin을 제조하였다. 새로운 반웅기에 10 ^의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Lys(Boc)-0H (Bachem _;

Swi ss) 200 匪 ole , HoBt 200 匪 ole 및 Bop 200 隱 ole 을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반웅기에 400醒 ole DIEA (N,N-Di isopropylethylamine) 를 분획으로 2 번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5 분간 교반하였다. 녹인 아미노산 흔합용액을 탈보호된 레진이 있는 반웅용기에 넣고 1 시간 동안 상온에서 교반하면서 반웅시켰다. 반웅액을 제거하고 DMF 용액으로 3 회 5 분씩 교반한 후 제거하였다. 반웅 레진을 소량 취하여 카이저 테스트 (Nihydrin test)를 이용하여 반웅 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2 번 탈보호 반웅시켜 Lys(Boc)- Ser(tBu)-CTL Resin을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다.

선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Ser(tBu) , Fmoc-Asp(OtBu) , Fmocᅳ Arg(Pbf )， Fmoc-Leu , Fmoc-Asn(Trt) , Fmoc-Leu , Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Arg(Pbf ) 순으로 연쇄반웅을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10 분씩 2 번 반웅시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 무수초산과 DIEA, HoBt(Hydroxybenzotriazole)를 넣어 한시간동안 아세틸화를 수행한 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3 번을 세척하고， 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후， 오산화인 (Phosphorus pent oxide, P205) 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액 [TFACTrifluroacetic acid) 95%, 증류수 2.5%, 티오아니졸 (Thioanisole) 2.5%] 30 ^을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2 시간 반웅을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고， 레진을 소량의 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후， 원심분리하여 침전을 모으고, 2 번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 Arg - Ser - Leu - Asn - Leu - Arg - Asp - Ser - Gin - Lys - Ser 펩타이드 1(서열목록 제 1 서열)을 0.85 g 합성하였다 (수율: 89.9%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 분자량 1303(이론값 ： 1303.440)을 얻을 수 있었다. 위와 같은 방법으로 서열 2 펩타이드 (Phe - Asp - Met - Gly - Ala - Tyr - Lys - Ser - Ser - Lys )(서열목록 제 2서열)도 합성하였다. (수율 ： 92.1%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 분자량 1133(이론값 :1133.275)의 값을 얻을 수 있었다.

【표 1】

실시예 1: 합성 펩타이드를 활용한 골 세포 성장효과의 확인

합성예 1 에서 합성된 서열 펩타이드에 대한 BMP2 유사 효능을 분석하기 위해 근아세포주 (myoblast cell line)인 C2C12 세포를 이용한 ΜΊΤ 어세이를 진행하여 증식 촉진 효능이 있는지 확인 하였다.

C2C12 세포를 500 ιι\ί 용량의 조직 배양용 플라스크를 이용하여 10% 우태아혈청 (FBS; fetal bovine serum, Sigma)을 포함하는 DMEM(Dulbecco' s modified Eagle's medium, Gibco)에서 배양하였다. 배양된 세포주들을 1% 트립신 용액으로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심 분리하여 세포 침전물만을 모았다. 이를 FBS 가 함유되지 않은 DMEM 배양액에 다시 현탁한 후, 96-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 1 X 103 세포가 되도록 넣고 24 시간 동안 37°C , 5% C02 조건 하에서 배양하였다. 24 시간 뒤 혈청을 완전히 제외한 동일한 배양액으로 배지를 교환한 뒤 표준을 잡기위한 공 시료와 합성 펩타이드를 증류수에 멸균상태로 녹인 뒤 10 jug/mi 의 농도로 72 시간을 위와 동일 조건으로 배양하였다. 배양 완료된 웰에 MTT 시료를 넣어주고 4 시간 후 형성된 포마잔을 DMS0 에 녹이고 560 nm 흡광도를 측정하여 세포 증식을 측정 하였다. 도 1 은 서열목록 제 1 서열 및 제 2 서열의 펩타이드 처리 후의 조골세포의 성장에 대한 결과이다. 도 la 및 lb에서 나타낸 바와 같이 본 발명의 펩타이드는 조골세포의 성장을 크게 증진시켰다.

본 발명의 펩타이드는 BMP lb 형 수용체에 결합하여 발굴된 것으로써 본 펩타이드는 골 형성에 중요한 단백질인 BMP 와 동일한 기능을 하는 것으로 확인되었다. 본 발명의 BMP 수용체 lb 형 결합 펩타이드는 천연의 BMP와 유사한 기능을 수행한다 . 실시예 2: 합성 펩타이드의 골 분화 촉진 효과 확인

합성예 1 에서 합성된 서열 펩타이드에 대한 BMP2 유사 효능을 분석하기 위해 전구 -골아세포주 (pre-osteoblast cel l l ine)인 MC3T3-E1 세포를 이용하여 ALP(Alkal ine Phosphatase) 염색을 통해 조골세포 분화 촉진 효능을 나타내는지 확인하였다. MC3T3-E1 세포를 24-웰 플레이트에 3 X 104 세포가 되도록 넣고 24 시간 동안 37 ^° C , 5% C02 조건 하에서 배양하였다. 24 시간 후 10% FBS, 50 g/ml 아스코르브산 + 100 mM b- 글리세로포스페이트가 함유된 알파 -MEM 배지에 합성한 펩타이드들을 10 U g/ml , 50 u g/ml 농도로 처리하고 배지를 3 일에 한번 씩 교체해 주면서 13 일간 배양하였다. 배양 완료된 플레이트 웰을 PBS 로 2 회 세척 후 아세톤, 37 포름알데히드, 시트르산 용액이 섞인 고정 버퍼로 30초간 세포 고정하였다. 백혈구 알칼라인 포스파타아제 염색 키트 (SIGMA) 이용하여 아래의 염색을 진행하였다.

FBB-알칼라인 용액， 아질산 나트륨 용액을 1 : 1 로 섞어 2 분간 처리한 후 증류수와 나프틀 AS-BI 알칼라인 용액으로 이루어진 버퍼를 처리하여 37 ^° C 배양기에서 1시간 동안 발색시켰다.

실험결과, 전구-골아세포 MC3T3-E1 에 서열목록 제 1 서열 및 제 2서열의 펩타이드를 농도별로 처리하였을 때 분화 촉진에 따른 ALP 발현 증가를 확인하였다 (도 2a, b) . 실시예 3 ： 합성 펩타이드에 의한 골 분화 관련 유전자의 발현 증가 확인

합성예 1 에서 합성된 서열 펩타이드에 의한 골 분화 관련 유전자

BSPCbone sialoprot in) 및 COLlAKcol lagen type I alpha 1)의 mRNA 발현 정도를 확인하기 위해 MC3T3-E1 세포를 6-웰 플레이트에 2 X 105 세포가 되도록 넣고 24시간 동안 37 ^° C , 5% C02 조건 하에서 배양하였다. 24시간 뒤 FBS 10% 포함된 배지에 각각의 펩타이드를 10 p g/ml , 50 y g/ml 농도로 처리 하고 양성 대조군으로 사용된 BMP2 는 100 ng/ml 로 처리 하였다. 2 일 후 PBS로 세척하고 Easy blue( Intron)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 1 의 RNA 와 RT premixture( Intron)를 이용하여 cDNA 를 합성하고, PCR premixture(Bioneer)를 이용하여 PCR을 진행한 후 아가로오스 겔에 걸어 각 유전자의 mRNA 발현 정도를 확인 하였다.

실험결과， 전구-골아세포 MC3T3-E1 에 서열목록 제 1 서열 및 제 2 서열의 펩타이드를 농도별로 처리하였을 때 골 분화 유전자의 mRNA 발현이 증가됨을 확인하였다 (도 3a, b) . 실시예 4: 합성 펩타이드에 의한 골분화의 시그널 촉진 효과 확인

골 분화 촉진에 관련된 시그널인 pSmadl/5/8 을 본 펩타이드가 활성화 시키는지 확인하기 위하여 MC3T3-E1 세포를 6-웰 플레이트에 2 X 105 세포가 되도록 넣고 24시간 동안 37 ^° C , 5% C02 조건 하에서 배양하였다. 24 시간 뒤 혈청이 포함 되지 않는 배지로 교환하여 24 시간 동안 배양하고 난 후 펩타이드를 10 y g/ml 농도로 처리하고 양성대조군으로 사용된 BMP2 는 50 ng/ml 로 처리하여 15 분, 30 분 후에 PBS 로 세척하고 용해버퍼를 넣고 용해시킨 후 단백질을 얻어 웨스턴 블롯팅을 진행 하였다. 실험결과, 전구-골아세포 MC3T3-E1 에 서열목록 제 1 서열 및 제 2 서열의 펩타이드를 농도별로 처리하였을 때 골 분화 시그널 활성화를 나타내는 Smadl/5/8 의 인산화가 촉진되는 것을 확인하였다 (도 4a, b) . 실시예 5: 합성 펩타이드에 의한 골세포 침투 및 증식 효과 확인

서열목록 제 1 서열의 펩타이드 100 을 콜라겐 스폰지 0.5 mm * 0.5 mm 크기에 적셔 Balb/c 마우스의 등 뒤에 이식하고 2주간 두었다. 그 후 콜라겐 스폰지를 적출하여 파라핀 블록으로 제작하고 H&E 염색을 통해 콜라겐 스폰지 내의 골세포 침투 및 증식 정도를 측정하였다 (도 5) . 이를 통해 인 비트로 상에서 보여졌던 서열목록 제 1서열 펩타이드의 골세포 증식 및 분화 와 같은 골 형성 촉진 효능을 인 비보 상으로도 재확인 할 수 있었다. 실시예 6 : 합성 펩타이드에 의한 치주인대섬유모세포의 성장 촉진 효과 확인

서열목록 제 1서열 및 제 2서열 펩타이드의 치주 조직에 대한 효과를 확인하기 위해 치주인대섬유모세포 (Human periodontal l igament f ibroblast )에 대한 성장 촉진 효과를 분석하였다. 치주인대섬유모세포를 48-웰 플레이트에 1 X 103 세포가 되도록 넣고 24 시간 동안 37 ^° C， 5% C02 조건 하에서 배양하였다. 24 시간 뒤 혈청이 포함 되지 않은 배지로 교환하여 6 시간 동안 배양한 후 펩타이드를 0.05-10 u g/ml 농도로 처리하고 양성대조군으로 사용된 BMP-2 및 IGF-1 은 0.2 u g/ml 농도로 처리하고 72 시간 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양 상층액을 제거하고 에탄올을 이용하여 세포를 고정화 한 다음 세포고정이 끝난 후, PBS (phosphate buf fer sal ine)로 3 회 세척하였다. 세척용액을 제거한 뒤 비색 SRB 용액으로 처리하고 1% 아세트산으로 층분히 세척을 한 뒤 현미경으로 세포를 관찰하여 생존 세포의 상태를 관찰하였으며， 20 mM 트리스로 탈 염색된 용액에 대해 자외선 560 nm 에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존 상태를 측정하였다.

실험결과, 치주인대섬유모세포에 서열목록 제 1 서열 및 제 2 서열의 펩타이드를 농도별로 처리하였을 때 세포의 성장이 처리 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다 (도 6a, b) . 실시예 7: 합성 펩타이드에 의한 치주인대섬유모세포의 성장 촉진 기전 확인

서열목록 제 1 서열 및 제 2 서열 펩타이드의 치주인대섬유모세포 (Human periodontal l igament f ibroblast )에 대한 성장 촉진 효과를 확인하기 위해 관련 시그널링 분자들의 인산화 정도를 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다. 치주인대섬유모세포를 6-웰 플레이트에 5 X 105 세포가 되도톡 넣고 24 시간 동안 37°C , 5% C02 조건 하에서 배양한 후 펩타이드를 10 u g/ml 농도로 처리하고 양성대조군으로 사용된 bFGF 는 0.2 g/ml 농도로 처리한 뒤 5-15 분 배양 시간별로 세포를 회수하여 전체 단백질을 분리하고 P-PI3K, p-Akt에 대한 웨스턴 블롯팅을 진행하였다.

실험 결과, 치주인대섬유모세포에 서열목록 제 1 서열 및 제 2 서열의 펩타이드를 처리하였을 때 PI3K 및 Akt 의 인산화 정도가 증가됨을 확인하였다 (도 7a, b) . 실시예 8: 합성 펩타이드에 의한 치주인대섬유모세포의 활성 촉진 확인

서열목록 제 1서열 및 제 2서열 펩타이드의 치주인대섬유모세포 활성 촉진 효과를 확인하기 위해 관련 유전자의 mRNA 발현을 RT-PCR 로 확인하였다. 치주인대섬유모세포를 24-웰 플레이트에 1.5 X 104 세포가 되도록 넣고 24시간 동안 37 ^° C , 5% C02 조건 하에서 배양하였다. 24시간 뒤 혈청이 포함 되지 않은 배지로 교환하여 24 시간 동안 배양한 후 펩타이드를 1， 10 u /ml 농도로 처리하고 양성대조군으로 사용된 BMP-2 및 IGF-1 은 0.2 y g/ml 농도로 처리하고 72 시간 배양하였다. 배양 완료 후 PBS 로 세척하고 Easy blue( Intron)를 이용하여 RNA 를 분리하였다. 1 의 RNA 와 RT premixture( Intron)를 이용하여 cDNA 를 합성 하고， PCR premixture(Bioneer)를 이용 하여 PCR 을 진행 한 후 아가로오스 겔에 걸어 각 마커의 mRNA 레벨을 확인하였다.

실험 결과， 치주인대섬유모세포에 서열목톡 제 1 서열 및 제 2 서열의 펩타이드를 농도별로 처리하였을 때 세포 활성 관련 유전자인 C0LlAl(al ha-l type I col l agen) 및 DSPP(Dent in si alophosphoprotein)의 mRNA 발현 정도가 증가하는 것을 확인하였다 (도 8a , b) . 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현예일뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.