USO

Campo da Invenção

[1] A presente invenção enquadra-se nos campos da farmácia, medicina, química e biotecnologia e descreve um peptídeo análogo da insulina compreendendo a fórmula:

AAi-TV- AA ₂ -T- AA ₃

o qual apresenta a capacidade de reduzir os níveis de glicose no sangue.

[2] São também objetos desta invenção uma composição farmacêutica contendo o referido peptídeo, bem como o seu uso para preparar a referida composição farmacêutica oral para esta finalidade.

Antecedentes da Invenção

[3] A diabetes mellitus, ou simplesmente diabetes, é um grupo de doenças metabólicas em que se verificam níveis elevados de glicose no sangue durante um longo intervalo de tempo. Os sintomas da elevada quantidade de glicose incluem necessidade frequente de urinar e aumento da sede e da fome.

[4] Quando não tratada, a diabetes pode causar várias complicações agudas, como a cetoacidose, coma hiperosmolar hiperglicêmico ou morte. Dentre as complicações a longo prazo, estão doenças cardiovasculares, acidentes vasculares cerebrais, doença renal crónica, úlceras no pé e retinopatia diabética .

[5] A diabetes tem duas causas principais: produção de quantidade insuficiente de insulina pelo pâncreas ou células não responsivas à insulina produzida . Existem três tipos principais de diabetes: (i) a diabetes mellitus tipo 1, que resulta da produção de quantidade insuficiente de insulina pelo pâncreas, (ii) a diabetes mellitus tipo 2, que tem origem na resistência à insulina e que pode também desenvolver insuficiência na produção de insulina e (iii) a diabetes gestacional, uma condição em que a mulher sem diabetes apresenta níveis elevados de glicose no sangue durante a gravidez .

[6] Tanto a prevenção quanto o tratamento da diabetes consistem em manter uma dieta saudável, praticar regularmente exercício físico, manter um peso normal e abster-se de fumar. Em pessoas com a doença, é importante controlar a pressão arterial e manter a higiene dos pés.

[7] A diabetes do tipo 1 deve ser tratada com injeções regulares de insulina, enquanto a diabetes do tipo 2 pode ser tratada com medicamentos associados ou não à insulina. Ainda, em pessoas obesas com diabetes do tipo 2, a cirurgia de redução do estômago pode ser uma medida eficaz. A diabetes gestacional geralmente resolve-se por si própria após o nascimento do bebê.

[8] Existem diversos tipos de insulina: a insulina de ação rápida, a insulina de ação prolongada e as insulinas de ação intermediária. Dependendo das necessidades do paciente, os tipos de insulina podem ser associados para uso durante o dia e a noite.

[9] Por sofrer interferência das enzimas estomacais, a insulina é um hormônio que não pode ser administrada por via oral.

[10] Dentre os medicamentos de uso oral, diversas classes de medicamentos que apresentam mecanismos de ação diferentes podem ser usadas para alcançar o mesmo objetivo, a saber, diminuir o nivel de açúcar no sangue.

[11] Dentre estas, podemos citar as sulfonilureias, as biguanidas, as meglitinidas, as tiazolidinedionas, os sequestrantes dos ácidos biliares e os inibidores da DPP-4, SGLT-2 e alfa-glucosidase .

[12] Além de serem usados isoladamente, alguns destes medicamentos podem ser usados em terapia de combinação oral, uma vez que diferentes mecanismos para diminuir a glicose no sangue podem potencializar o resultado final. Por exemplo, uma biguanida pode ser associada a uma sulfonilureia, uma vez que uma atua no fígado e a outra atua no pâncreas .

[13] Embora outras combinações possam ser usadas, é preciso tomar algumas precauções . Além de ser mais caro, o aumento dos efeitos colaterais também é um risco. Dessa forma, a busca por novas terapias se faz necessária.

[14] Nesse sentido, estudos in vitro e in vivo mostraram o envolvimento de várias proteases, peptidases e peptideos em doenças metabólicas, tais como resistência à insulina, obesidade e sindromes metabólicas, sugerindo que peptidases podem desempenhar diferentes papéis.

[15] Como exemplo, observa-se que animais nocaute para carboxipeptidase E apresentam fenótipo de obesidade, enquanto camundongos nocaute para dipeptidil peptidase-4 (DPP4 ) são resistentes ao desenvolvimento de adiposidade e obesidade induzida por dieta rica em gordura, além de serem mais sensíveis à insulina.

[16] Animais com deleção do gene da neurolisina são mais tolerantes a glicose, mais sensíveis à insulina e produzem mais glicose no fígado utilizando o piruvato como precursor (gliconeogênese) .

[17] Em decorrência dessas alterações metabólicas, esses animais correm menor distância comparados aos animais selvagens, sugerindo a ligação da neurolisina à capacidade de metabolismo oxidativo e resistência ao exercício físico.

[18] Em paralelo às alterações na expressão gênica, o conteúdo peptídico intracelular também aparece alterado de forma muito específica.

[19] No músculo esquelético gastrocnêmio, dois peptídeos derivados de troponina I (SADAMLKALLGSKHK e DMEVKVQKSSKELEDMNQKL) aumentaram mais de 2 vezes. No tecido adiposo, dois peptídeos diferentes, um derivado da proteína de ligação acil-CoA (VEKVDELKKKYGI) e um derivado da subunidade alfa da hemoglobina (LASVSTVLTSKYR) , aumentaram mais de 2 vezes. No fígado, peptídeos endocanabinoides contendo a sequência da hemopressina de camundongos (PVNFKLLSH) ou do peptídeo anteriormente identificado como antinociceptivo AGH (AGHLDDLPGALSA) diminuíram mais de 2 vezes .

[20] Com uma diversidade distinta de peptídeos intracelulares devido à ausência da neurolisina, ocorreram alterações fenotípicas como as observadas no metabolismo energético, sugerindo que os peptídeos intracelulares possam participar diretamente ou indiretamente da regulação da expressão gênica nos tecidos adiposo, muscular e hepático analisados .

[21] Nesse sentido, muitos estudos têm usado peptídeos sintéticos para perturbar as funções intracelulares, sendo esse um conceito bem estabelecido na literatura. Peptídeos racionalmente desenhados podem ser reintroduzidos em células e atuar intracelularmente como moduladores de interações proteína-proteína intracelulares .

[22] Considerando a importância de conhecer os eventos biológicos relacionados à sinalização celular, são várias as estratégias usadas para atingir esses objetivos como o uso de modelos biológicos . Assim, vários estudos usando culturas de miotúbulos do músculo esquelético foram feitos em linhagens L6 de rato e C2C12 de camundongo, como modelos in vitro relacionados a variações de massa muscular.

[23] Nestes modelos de estudos, diferenças em alguns aspectos metabólicos foram observadas, como a expressão de receptores para drogas. Portanto, o uso destes modelos celulares pode ser de particular importância por que podem predizer o comportamento metabólico em células humanas .

[24] Em vista do acima exposto, a presente invenção propõe um peptídeo análogo à insulina, bem como o seu uso para o preparo de composições farmacêuticas orais para o a redução dos níveis de glicose.

[25] Em várias concretizações, testes in vivo com a composição farmacêutica ora proposta nesta invenção mostram resultados surpreendentes quanto à sua atividade redutora de glicose no sangue, sendo esta uma boa candidata a substituto da insulina.

[26] As buscas de anterioridades revelaram documentos apenas parcialmente relevantes para a presente invenção, nenhum deles antecipando ou sequer sugerindo qualquer dos objetos da presente invenção.

[27] 0 documento US 20090137063 descreve um método que compreende detectar a presença de fragmentos de proteína em uma amostra biológica para verificar sua qualidade. O documento cita o peptídeo LASVSTVLTSKYR, mas não há, no referido documento, qualquer menção ou sugestão aos objetos da presente invenção.

[28] O documento de anterioridade US 2015/0010631 Al faz referência ao tratamento de doenças inflamatórias, tal como a diabetes, por meio do uso de nanopartícuias imuno- modifiçadas. Embora a proteína LASVSTVLTSKYR seja citada, a mesma está associada, nesta descrição, à tireoidite, e não a redução da glicemia plasmática.

[29] O documento WO 2003102023 descreve, entre outros, o peptídeo LASVSTVL como associado a tumores . O referido peptídeo é reportado como tendo a capacidade de se ligar a uma molécula do MHC humano classe I, sendo, portanto, potencialmente útil para produzir um medicamento para o tratamento de tumores . Não há qualquer menção ou sugestão aos objetos da presente invenção.

[30] Do que se depreende dos conhecimentos do estado da técnica, não foram encontrados documentos que antecipam ou sugerem os ensinamentos da presente invenção, muito menos seus surpreendentes efeitos técnicos, de forma que a solução aqui proposta, é provida dos requisitos de novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

Sumário da Invenção

[31] A presente invenção descreve um peptideo análogo da insulina compreendendo a fórmula:

AA1-TV- AA2-T- AA3

o qual apresenta a capacidade de reduzir os níveis de glicose no sangue.

[32] Adicionalmente, são objetos da invenção uma composição farmacêutica oral contendo o referido peptideo, bem como o seu uso para preparar a referida composição farmacêutica, para esta finalidade, surgindo como uma alternativa terapêutica promissora à administração da insulina (injetável) .

[33] Estes e outros objetos da presente invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

Breve Descrição das Figuras

[34] A descrição detalhada a seguir e as figuras

I ilustram as principais caracteristicas e concretizações da presente invenção.

[35] Tais detalhamentos ou figuras não devem ser entendidos como limitativos e servem somente para ilustrar algumas das concretizações da presente invenção.

[36] As figuras IA e 1B representam graficamente os ensaios de sinalização de C2C12.

[37] As figuras 2A-D representam graficamente os testes de tolerância à glicose nos camundongos administrados i.p. ou oralmente com peptídeos Ric2 ou Ric4.

[38] As figuras 3A e 3B representam o western blotting para ERK e AKT em células C2C12 tratadas com peptídeos derivados de Ric4.

[39] As figuras 4A-F representam graficamente os testes de tolerância à glicose nos camundongos administrados i.p. ou oralmente com peptídeos Ric2 ou Ric4.

[40] A figura 5 mostra as sequências de peptídeos derivados de Ric4 indicando, entre linhas pontilhadas, as sequências mínimas que fazem parte dos derivados com atividade farmacológica .

[41] A figura 6 representa graficamente a captação de glicose em células C2C12.

Descrição Detalhada da Invenção

[42] A presente invenção descreve um peptídeo análogo da insulina compreendendo pelo menos 7 aminoácidos e apresentando a fórmula:

AA1-TV- AA2-T- AA3 em que:

AAi é ausente, o aminoácido S, o dipeptídeo VS, o tripeptídeo SVS, o tetrapeptídeo ASVS, o pentapeptídeo LASVS ou o pentapeptídeo Acetilado Ac-LASVS;

AA2 é o aminoácido L, o dipeptídeo DLeu-L, ou o dipeptídeo

L-DLeu;

AA3 é ausente, o aminoácido S, o dipeptídeo SK, o tripeptídeo SKY, o tetrapeptídeo SKYR ou o tetrapeptídeo amidado SKYR-NH2 ;

e/ou formas modificadas, cíclicas dos mesmos, versões amidadas, metiladas, PEGiladas, seus sais;

e/ou combinações dos mesmos.

Em uma concretização, o peptídeo da invenção é selecionado dentre as SEQ. ID. 1, SEQ. ID. 2, SEQ. ID. 3, SEQ. ID. 4, SEQ. ID. 5, SEQ. ID. 6, SEQ. ID. 7, SEQ. ID. 8, SEQ. ID. 9, SEQ. ID. 10, SEQ. ID. 11, SEQ. ID. 12, SEQ. ID. 13, SEQ. ID. 14, SEQ. ID. 15, SEQ. ID. 16, SEQ. ID. 17, SEQ. ID. 18, SEQ. ID. 19, SEQ. ID. 20, ou combinações dos mesmos.

[43] Adicionalmente, são objetos da invenção uma composição farmacêutica contendo o referido peptídeo, bem como o seu uso para o tratamento de diabetes ou distúrbios do metabolismo da glicose.

[44] A composição farmacêutica compreende o peptídeo e um veículo farmaceuticamente aceitável, a qual pode estar na forma de tablete, gel, líquido oral ou xarope, cápsula, supositório, solução injetável, forma inalável ou adesivo.

[45] Em várias concretizações , os testes in vivo com o peptídeo da invenção demonstraram resultados surpreendentes quanto à sua atividade redutora da glicose, algumas concretizações adicionalmente proporcionando a vantagem de ser administrável por via oral, sendo um bom candidato a substituto da insulina injetável.

[46] Assim, o peptideo (ativo) não sofre degradação durante a ingestão oral, característica particularmente desejável, uma vez que enzimas naturais degradam peptideos e proteínas quando no trato digestivo e raramente um medicamento com um ativo peptídico se mostra viável.

[47] Os exemplos mostrados a seguir têm o objetivo somente de exemplificar algumas das diversas modalidades de concretização da invenção, contudo, sem limitar o escopo da mesma .

[48] Em alguns exemplos, foram avaliados os efeitos de redução de glicose da composição da invenção in vivo pela administração oral a animais (Mus musculus ou camundongo) com diferentes regimes de tratamento, incluindo o oral, comparativamente a outros peptideos ou ao controle com salina.

Exemplo

Uso do peptídeo para preparo de composição farmacêutica redutora de glicose

[49] Inicialmente, o efeito proporcionado pelos peptideos intracelulares abaixo foi investigado:

SADAMLKALLGSKHK (Ricl) ,

DMEVKVQKSSKELEDMNQKL (Ric2), VEKVDELKKKYGI (Ric3)

e LASVSTVLTSKYR (Ric4)

sobre a célula muscular, pela observação da expressão de proteínas específicas (ERK, pERK, AKT e pAKT) envolvidas na regulação da via de sinalização da insulina no músculo esquelético.

[50] Para tal, as células C2C12 do músculo esquelético de camundongos foram diferenciadas em miotubos e utilizadas como modelo.

[51] Em seguida, o efeito dos peptídeos intracelulares Ricl, Ric2, Ric3 e Ric4 na expressão de genes relacionados a funções glicolíticas e energéticas foi avaliado.

[52] A tabela 1, abaixo, sumariza os resultados de modulação da expressão gênica observados. O efeito dos peptídeos intracelulares Ricl, Ric2, Ric3 e Ric4 nas vias de sinalização também foi investigado. A ativação da fosforilação de Erk (1/2) (Thr202-Tyr204) foi observada para a insulina, Ric2 e Ric4, enquanto a fosforilação de Akt (Ser473) foi observada para os peptídeos de insulina, Ric2, Ric3 e Ric4 (conforme mostrado na Figura 1) .

[53] Como pode ser observado na Tabela 1, exceto pelo Ric3, os três outros peptídeos foram capazes de estimular a expressão de vários genes relacionados às funções metabólicas. A insulina foi utilizada como controle positivo e foi capaz de estimular a expressão de todos os genes investigados, enquanto os peptídeos intracelulares investigados foram capazes de estimular um grupo específico de genes.

[54] Em seguida, testou-se o efeito in vivo dos peptideos Ric2 e Ric4 nos níveis de glicose no sangue após administração intraperitoneal ou oral em animais C57BL6 (n = 5) em jejum durante 8 h antes da administração intraperitoneal de glicose (2g/Kg) . 0 nível de glicose no sangue foi determinado usando um medidor de glicose manual antes e aos intervalos de 15, 30, 60, 90 e 120 min após administração de glicose (vide Figura 2) . Após 20 min da administração da glicose, os animais receberam administração intraperitoneal de solução salina, insulina (0,75 UI/Kg) , peptídeo intracelular Ric2 ou Ric4 (600 pg/Kg) .

[55] O nível de glicose no sangue foi determinado sugerindo que, além da insulina, os peptideos Ric2 e Ric4 também poderiam diminuir os níveis sanguíneos de glicose quando administrados por via intraperitoneal (ip) (Figura 2) . Enquanto o peptídeo Ric2 diminui o nível de glicose no sangue até 10 min após sua administração, o peptídeo Ric4 diminui o nível de glicose no sangue até 40 min após sua administração .

[56] Em seguida, após 20 min da administração da glicose, os camundongos receberam uma administração intraperitoneal de solução salina ou insulina (0,75 UI/Kg) e os peptideos intracelulares Ric2 ou Ric4 ( 600 pg/Kg) foram administrados por via oral . Enquanto o peptídeo Ric2 administrado oralmente não produziu diminuição na glicemia, o peptídeo Ric4 produziu uma diminuição da glicemia até 40 min após a administração (vide Figura 2). [57] Ambos os testes de tolerância à glicose e à insulina sugeriram que os animais Nln ^-/ ~ são mais eficientes para absorver a glicose, o que parece estar relacionado, pelo menos em parte, com uma melhor capacidade de resposta do músculo e do tecido adiposo de animais Nln ^_/" em relação à sinalização de insulina em animais C57BL6 selvagens.

[58] Portanto, os resultados mostrados na presente invenção sugerem que o peptídeo intracelular Ric4 poderia estar envolvido nas alterações do fenótipo metabólico observadas em animais Nln ^-/_ .

[59] 0 peptideo Ric4 foi rapidamente degradado por extratos de fígado e rim, sugerindo que as enzimas presentes nesses tecidos são capazes de metabolizar este peptídeo com uma clivagem inicial que ocorre na ligação Leu-The .

[60] O peptídeo contendo essa modificação, denominado Ric4-16 (Ac-LASVSTV [DLeu] TSKYR-NH2 ) , foi demonstrado ser mais estável quando digerido com extratos de tecidos como rim e fígado (Tabela 2) .

Tabela 2. Avaliação da estabilidade hidrolítica dos

[61] Em vista disto, foram realizadas modificações estruturais racionais de Ric4 as quais geraram 16 derivados (Ric4-1 a Ric4-16; Tabela 3) que foram reavaliados na ativação da expressão gênica e na transdução de sinal e na redução da glicemia após a administração oral.

[62] Em geral, os peptideos derivados se comportam de forma exclusiva considerando seus efeitos na ativação da expressão gênica e transdução de sinal. A expressão de genes glicoliticos ALDOA, PGAM2, GCK e Fbpl foi estimulada por derivados Ric4 contendo em comum a sequência TVLTSKY, enquanto os genes energéticos MYL1 e SPMx foram estimulados por peptideos contendo a sequência TVL em comum (Tabelas 4 e 5) .

[63] A estimulação de ambas as classes de genes incluindo ALDOA, MYL1, GCK, PGAM2 e Fbpl foi observada para o derivado de Ric4 STVLTSKYR (Figura 5) . Os derivados de Ric4 que contêm a sequência C-terminal STVL/DLeuTSKYR ativam a fosforilação de ERK _Z enquanto os peptideos que contêm a sequência N-terminal LASVSTVLT ativam a fosforilação de AKT (Figura 6) .

[64] Os derivados Ric4 contendo a sequência TVLTSKY ativam tanto a fosforilação de AKT como de ERK (Figura 6) . Em seguida, testamos a administração oral de derivados de Ric4 e seus efeitos sobre a glicemia. Os derivados de Ric4 AC-LASVSTVLTSKYR-NH2 e Ac-LASVSTV-DLeu-TSKYR (600 pg/Kg) reduziram os níveis de glicose no sangue após administração oral (Figura 7) .

[65] A tabela 2 mostra as diferentes concretizações dos peptídeos da invenção, todos eles sendo peptídeos sintéticos não naturais derivados a partir do Ric4.

Tabela 3 - Peptídeos sintéticos não naturais derivados do

[66] A figura 3 mostra os resultados de modulação da fosforilação proteica mediante a administração de diferentes concretizações dos peptideos da invenção (16 peptideos derivatizados de Ric4, Ric4-1 a Ric4-16; P1-P16) .

[67] A figura 5 mostra os resultados de testes in vivo de avaliação de glicose no sangue mediante administração oral de diferentes concretizações de composto da invenção, peptideos derivatizados de Ric-4 como indicados. As condições experimentais em ambos os casos incluiram: 12 h; NaCl 0,9%; Glicose 2 g/Kg; Insulina 0.75 UI/kg; peptideo da invenção 600 pg/Kg; n = 5; * p < 0,05, ** p < 0,01; ***p < 0,001 comparado ao controle.

[68] As tabelas 4 e 5 mostram os resultados de testes com os peptideos da invenção em diferentes concretizações, todas envolvendo os 16 peptideos não naturais derivatizados de Ric 4, P1-P16.

[69] A figura 5 mostra as sequências (entre linhas pontilhadas) dos peptideos testados e as regiões em comum relevantes para os resultados de testes in vivo de avaliação de modulação da expressão de genes envolvidos no metabolismo de glicose.

[70] A figura 6 mostra um gráfico de barras com as medidas de captação de glicose em nM, mediante administração de diferentes compostos. A figura mostra que a administração de Ric4 e derivados pode proporcionar maior captação de glicose do que a insulina. * p < 0, 05, ** p < 0,01; comparado ao controle.

[71] Como pode ser observado, Ric4 e alguns dos seus derivados têm propriedades semelhantes à insulina. No entanto, nem todos os genes estimulados pela insulina são estimulados pelo Ric4 ou seus derivados, o que sugere que Ric4 pode exibir seu próprio espectro seletivo de ativação gênica e de vias de sinalização.

[72] Modificações estruturais de Ric4 sugerem que os aminoácidos T6V7L8T9S10 devem estar presentes em derivados de Ric4 que estimulam a fosforilação de ERK e AKT.

[73] Peptideos Ric4 e derivados estimulam a captação de glicose em células C2C12 independente da insulina. Esses dados sugerem que o Ric4 atua por meio de um mecanismo distinto do peptideo-1 semelhante ao glucagon, que regula a produção de glicose hepática e a captação de glicose muscular através de sua capacidade de estimular a secreção de insulina .

[74] Ric4 e seus derivados parecem depender do receptor de insulina para induzir a captação de glicose. Portanto, o receptor de insulina de ligação a Ric4 poderia estar ativando a fosforilação de ERK e AKT que deveria induzir a translocação de Glut4 para a membrana plasmática para aumentar a captação de glicose in vivo e no miotubo de células C2C12 diferenciadas. Outros mecanismos permanecem possíveis, e novas investigações devem abordar, com maiores detalhes, o mecanismo responsável pelos efeitos in vitro e in vivo do Ric4 e seus derivados.

3o

O

00

h H

S3

B

o o o o

27

[ 75 ] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas .