DE STEROIDES NATURELS 3BETA

HYDROXYLES ET LEUR UTILISATION

La présente invention est relative à des compositions pharmaceutiques contenant à titre de principe actif des dérivés 7-hydroxyléε d'hormones stéroïdes naturelles possédant, le cas échéant, une fonction 3/3 hydroxyle, et leur utilisation comme déclencheur ou stimulateur de l'immunité (ci-après dénommé "effecteur de l'immunité") et plus particulièrement de l'immunité cellulaire ; ces compositions pharmaceutiques peuvent être également utilisées comme agents anti-glucocorticoïdes.

La famille des stéroïdes hormonaux 33-hydroxyléε comprend: la pregnènolone connue comme 3/3-hydroxy-5- pregnène-20-one (désignée ci-après par PREG) , la déhydrqépiandrostérone connue comme 33-hydroxy-5- androstène-17-one (désignée ci-après par DHEA) , 1'androstènediol connu comme 5-androstène-3?,173-diol (désigné ci-après par 5-DIOL) , 1'iosandrostérone ou épiandrostérone connue comme 3/3-hydroxy-5α- androstane-17-one (désignée ci-après par ISOA) et 1'androstanediol connu comme 5α-androstane-33,17?-diol (désigné ci-après par ADIOL) .

La PREG est connue comme étant le précurseur de 1'ensemble des hormones stéroïdes. La PREG est formée irréversiblement à partir du cholestérol dans des tissus et des organes comme la partie corticale des glandes surrénales, les gonades (E. Baulieu, Hormones, Publ. Hermann (1978)) et le cerveau (Z. Hu et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84, 8215-8219 (1987)). Formée dès le plus jeune âge, ses quantités circulantes sont élevées et relativement stables (E. DePeretti et E. Mappus, J. Clin. Endocr. Metab., 57, 550-556

(1983)). Elle peut être transformée en progestérone même dans le cerveau (Y. Ak a et al., J. Cell. Biol., 121, 135-143 (1993)) mais sa transformation irréversible en hormones inéralocorticoïdeε et glucocorticoïdes n'a lieu que dans les glandes corticosurrénales (E. Baulieu, Hormones, Publ. Hermann (1978) ) .

La DHEA est un 17-cétostéroïde qui est quantitativement une des hormones stéroïdes adrénocorticales majeures présentes dans le sang des humainε et autreε mammifèreε. M.E. Windholz, The Merck Index, Ninth Edition (1976) ; K. Die and C. Lentner, Geigy Scientific Tables (1975) ; E. Barret-Connor et al., N.E.J.M. 315_, 1519-1524 (1986). Bien que la DHEA semble servir d'intermédiaire dans la synthèse des stéroïdes deε gonadeε, la première fonction phyεiologique de la DHEA n'eεt pas claire. Il est connu, cependant, que leε concentrationε plaε atiques de cette hormone, maximales danε la εeconde décade de la vie, déclinent ensuite pour finalement atteindre 5% du taux originel chez les personnes âgées.

Dans certains cas, la DHEA présente des propriétés d'effecteur de l'immunité : dans R.M. Loria, T.H. Inge, S.S. Cook, A.Z. Szakl et W. Regelson (1988), J. Med. Virol., ^6, 301-314, elle permet d'augmenter la survie de souris infectées par leε virus humainε CVB4 Edwardε ou HSV2, quand elle est injectée par voie souε-cutanée en quantitéε de l'ordre de 1 g/kg, et ce, 4 heures avant l'infection virale. Cet effet est aussi observé lorsque la DHEA est administrée par voie orale (0,4% dans le régime) pendant 16 se aineε avant l'infection.

Pluε généralement, les mêmes auteurs, danε le brevet US n° 5.077.284, démontrent un effet positif sur deε patientε atteints du SIDA traités par des doseε 400 à 2500 mg/jour, et recommandent 1'utiliεation de la

DHEA, conjointement à un antiviral, à des doseε de 25 mg/kg à 2 g/kg.

La production irréversible de DHEA à partir de la PREG • est surtout connue dans le tiεεu corticosurrénalien et dans les gonades (E. Baulieu,- Hormones, Publ. Hermann (1978)). La DHEA n'est d'ailleurs produite qu'à partir de l'adrénarche et sa quantité circulante augmente avec la puberté (E. DePeretti et E. Mappuε, J. Clin. Endocr. Metab., 57, 550-556 (1983)). Dèε l'âge adulte, deε quantités importantes de DHEA circulent dans le sang des humains et des autres mammifères, mais ces quantités maximales dans la seconde décade de la vie humaine déclinent ensuite pour atteindre finalement moins de 10% du taux originel chez les personnes d'âge très avancé (N. Orentreich et al., J. Clin. Endocr. Metab., 59, 551-555 (1984)) .

Le 5-DIOL dérive directement de la DHEA dont la fonction 17-cétone est réduite par une oxydoréductase. Ses quantités circulanteε εont faibleε comparéeε à celles de la DHEA car 1'oxydoréduction agit aussi en sens inverse pour donner de la DHEA, et que des androgenes comme la testosterone peuvent en dériver même dans la peau (I. Faredin et I. Toth, Acta Med. Acad. Sci. Hung., 32, 139-152 (1975)) .

Dans les gonades, la DHEA et le 5-DIOL sont successivement transforméε de manière irréversible en hormones androgenes (testosterone) puis oestrogènes (oestradiol) par une série de réactions enzymatiques connueε (E. Baulieu, Hormones, Publ. Hermann (1978)).

La testosterone est réduite irréversiblement dans les tissus cibles en son dérivé androgéniquement actif, la 5α-dihydrotestostérone. C'est de ce stéroïde que dérivent l'ADIOL et l'ISOA par des réactions enzymatiques réversibles (E. Baulieu, Hormones, Publ. Hermann (1978)). Les quantités circulantes de ces deux

εtéroïdeε sont faibles chez 1'adulte et sont nulles avant la puberté et presque nulles après la ménopause et l'andropause (P. Mauvaiε-Jarviε et G. Charransol, Nvelle.- Presse Médic, 23, 1565-1569 (1973); C. Hopkinson et al., J. Steroid Bioche . , 8, 1253-1257 (1977); G. Habrioux et al., Steroidε, 32, 61-71 (1978) ) .

L'utiliεation de la PREG n'a jamaiε été enviεagée pour des applications thérapeutiques car ce stéroïde est le précurseur de l'ensemble des hormones stéroïdes. Par contre, la DHEA a des effets démontrés dans différentes conditions physiopathologiques, incluant notamment le cancer, le diabète, le vieillissement, l'obésité. Ces différentε effetε εont décritε danε une εérie d'articles collèges danε un ouvrage récent εur leε effets biochimiques, biologiqueε et cliniques de la DHEA (The biologie rôle of dehydroepiandrosterone. Editeurs: M. Kalimi et W. Regelson, Publication: Walter de Gruyter, Berlin, New York, 1990) . Le mode d'action exact de la DHEA y est étudié mais non encore expliqué de manière certaine. Toutes les publications indiquent que pour obtenir un effet, la DHEA doit être administrée soit oralement, soit en sous-cutané à des doses importantes allant de 25 mg/kg à 2g/kg, et ce, en administrations répétées.

Cependant, l'utilisation de la DHEA dans une composition thérapeutique ou prophylactique se heurte à trois problèmes :

- la faible solubilité de la DHEA dans des solutionε aqueuses,

- la nécessité de l'injecter plusieurε heureε avant l'antigène pour obtenir l'effet recherché,

- les quantités importantes nécessaires à l'obtention d'un effet risquent d'entraîner un coût prohibitif et des effets secondaires indésirableε.

De la même manière, le 5-DIOL a récemment été utiliεé pour obtenir une réponse antivirale augmentée chez la souris. Les doses reconnues comme efficaces sont de 20 mg/kg à 320 g/kg après administration sous-cutanée, ou de 0,4% du poids des aliments (R. Loria et D. Padgett, Arch. Virol., 127, 103-115 (1992)). Les effets secondaireε connuε du 5-DIOL limitent néanmoins considérablement son utilisation thérapeutique chez l'homme.

Enfin, le ADIOL et l'ISOA ne sont pas employés ni envisagés en tant qu'agents thérapeutiques à cauεe de leur action androgène relativement forte (P. Robel et al.. Biochimie, 53, 81-96 (1971)).

Deε stéroïdes 3 β-hydroxyles comme la PREG, la DHEA, le 5-DIOL sont hydroxylés en position 7 dans de nombreux tisεuε comme ce - a déjà été montré chez le rat (Y. Akwa et al., Biocnem. J. , 288, 959-964 (1992)) et la souris (R. Morfin et G. Courchay, J. Steroid Biochem. Molec. Biol., (sous presεe) ) . Pour le ADIOL et l'ISOA, des hydroxylations en position 6 ou 7 ont été miseε en évidence chez l'homme (R. Morfin et al.. Biochimie, 59, 637-644 (1977)), chez le rat (J. Guiraud, R. Morfin et al., Steroids, 34, 241-248 (1979)) et chez le chien (R. Morfin et al. Eur. J. Biochem. , 109, 119-127 (1980)). Cette découverte a été confirmée et étendue chez l'homme (F. Jacolot et al., J. Steroid Biochem., 14, 663-669 (1981); S. Tunn et al., J. Steroid Biochem., 28, 257-263 (1987)) et chez le rat (J. Isaacε et al., Steroidε, 33, 639-657 (1979); M. Warner et al., Endocrinology, 124, 2669-2706 (1979)). Ceε hydroxylations en 6 ou 7 sont spécifiques des stéroïdes 3 _/ 3-hydroxylés et le processus enzymatique opère de manière irréversible.

Il en ressort donc que les stéroïdeε 6 ou 7- hydroxyléε forméε ne peuvent donner naissance aux hormones εtéroïdeε claεεiqueε telleε que leε

minéralocorticoïdes, glucocorticoïdeε, progestatifs, androgenes et oestrogènes et ils sont apparus comme inactifs dans les domaines de ces dernières hormones ( A. Sunde et al., J. Steroid Biochem., 16, 483-488 (1982); F. Celotti et al., J. Steroid Biochem., 18, 397-401 (1983)).

Divers articles récents démontrent aussi l'existence d'une asεociation entre leε systèmeε endocriniens et immunitaires; il y est suggéré que la DHEA jouerait un rôle régulateur anti-glucocorticoïde (A. Meikle et al., J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 42, 293-304 (1992)), bien que des recherches avec ce stéroïde n'aient apporté que des réponseε négativeε (P. Mohan et M. Cleary, Steroidε, 57, 244-247 (1992)).

La présente invention a pour but de pallier les différents problèmes soulevés plus haut sur l'utilisation thérapeutique de la DHEA ou de la PREG et découle de la découverte selon laquelle, non seulement les microsomes de cerveau de rat, mais la .peau, l'intestin, le colon, le coecum, la rate, le thymus et le cerveau de la souris, étaient capables de convertir la DHEA et la prégnénolone en des dérivés polaires, et plus hydrosolubleε, que sont les dérivés 7α-hydroxylés. Des dérivés 7j0-hydroxylés ont également été détectéε. De plus, la quantité de dérivés 7α-hydroxylés augmente avec l'âge deε animaux.

La préεente invention est relative à des compositionε pharmaceutiques comprenant à titre de principe actif des composéε de formule générale :

(i)

ou la formule

danε lesquelles les substituan OtsRR, RI et R2 ont les significationε εuivantes :

R = -H ou fonction ester de 1 à 100 atomes de carbone, RI = -H ₂ ou =0 (cétone) , ou β-OH (hydroxyle) , ou 3-CO-R ₃ , ou )8-CHOH-R ₃ , avec R ₃ étant un groupe alcoyle comprenant de 1 à 4 atomes de carbone, de préférence méthyle, R2 = -H ou un halogène, les radicaux 6, 7 et en 16 peuvent être en poεition ou β , en aεsociation avec un véhicule pharmaceutique.

Dans leε compoεés préférés de l'invention, R est un hydrogène, RI est une fonction = 0 ou —CO-CH ₃ .

Dans les composés de formule I ou II les substituants des hydrogènes en positionε 6 et 7 peuvent être une cétone.

En outre, danε la formule générale II, leε radicaux en 6 et 7 peuvent être mutuellement excluεifε ou être préεents sur la même molécule.

L'invention concerne plus particulièrement leε compositions pharmaceutiques dans lesquelleε leε composés du genre en question sont associés à un véhicule pharmaceutique approprié au mode d'administration choisi.

Les compositions pharmaceutiques de l'invention contenant à titre de principe actif un composé de

formule I ou de formule II peuvent être utilisées comme effecteurs de l'immunité cellulaire, notamment dans : la prévention du développement du SIDA par traitement des sujets séropositifs pour HIVl, HIV2 et autres retroviruε responsableε de ce εyndrome,

- la prévention et le traitement des procesεus néoplasiqueε telε que les cancers de la peau, de l'intestin, des glandes mammaires, du syεtème nerveux, deε glandes surrénales, des gonades, et des leucémies,

- la prévention et le traitement des maladies auto-immunes telles le lupus érythémateux disséminé,

- le traitement des dysfonctionnementε de 1'axe hypothalamo-hypophysaire-surrénalien,

- la prévention de 1'immunoεuppression due au stresε, et du déclin de l'immunité naturelle avec l'âge ou toute autre immunoεuppreεεion.

L'invention concerne également 1'utiliεation des molécules de formule I ou II dans la fabrication d'une composition pharmaceutique utilisable comme anti- glucocorticoïde, et ce, dans toutes les utilisationε thérapeutiques impliquant la recherche d'une action contraire à celle des glucocorticoïdes naturels ou de synthèεe.

Les pathologies concernées sont toutes celles où l'utilisation d'agentε glucocorticoïdeε eεt médicalement déconεeillée, ainεi que celles découlant des effets secondaires indéεirables de ces mêmes glucocorticoïdes.

Parmi ces pathologieε aεεociéeε aux glucocorticoïdeε, et aux effetε εecondaireε indéεirables dûε aux glucocorticoïdes, on peut citer, à titre d'exemples:

- le syndrome de Cushing,

- les tumeurs surrénalienneε,

- les désordres de l'axe hypothalamo-hypohyso- εurrénalien,

- les effets diabétogènes et immunosuppreεεeurs deε glucocorticoïdeε,

- la faibleεεe, l'atrophie muεculaire, leε retardε de cicatrisation et l'amincissement de la peau dûs aux glucocorticoïdes,

- leε ulcèreε digestifε, 1'oεtéoporose, la mobilisation des acides graε et l'accumulation des graisseε résultant de la prise de glucocorticoïdes,

- la cataracte chez l'adulte et la diminution de la croissance des enfants traitéε par leε glucocorticoïdeε,

- les infections opportunistes, les dysménorrhées, leε insomnies et les états dépressifs résultant de traitements ou d'actions glucocorticoïdes excesεifs.

L'effet pharmacologique maximal de ces composés est obtenu par toute voie d'administration amenant la molécule active au niveau des cellules viséeε, ce qui comprend notamment 1'administration per os, sous- cutanée, per-cutanée, intramusculaire ou topique.

Un dosage avantageux des composés de formule I ou II utiliséε dans la fabrication de la composition thérapeutique est de 1 à 100 mg/kg chez les mammifères.

Aux fins d'administration d'un stéroïde, des solvants organiques sont habituellement utilisés dans la pharmacopée animale et humaine. Il s'agit notamment: du DMSO (diméthyl sulfoxyde) pour l'injection intramusculaire ou sous-cutanée;

- les solvants pour les stéroïdeε injectables par voie souε-cutanée ou intramuεculaire qui εont couramment deε huiles .végétales (ricin, olive, arachide,...) quelques fois hydrogénées ou neutralisées. Quelques stéroïdeε sont aussi injectés souε forme de suspension dans la carboxyméthyl cellulose;

- les administrations transcutanées (pommades, gels) utilisant surtout des mélangeε (galéniques et excipients) où l'on retrouve des alcools (éthylène.

propylène glycolε) , deε alcools gras (εtéarylique, octyl-2-dodécanol, en C ₂₀ •••)/ ^de la vaseline, des huiles végétales (ricin, olive...).

De nouvelleε for ulationε permettent aussi une absorption transcutanée ou transépithéliale retardée. Il s'agit d'inclusions dans le polyvinylpyrrolidone ou danε le polyéthylène glycol ou danε deε matriceε polymériεéeε avec de la εilice fumée.

L'administration au niveau du colon peut utiliser la voie rectale avec des suppoεitoireε (beurre de cacao) maiε auεεi la voie orale avec leε cyclodextrines qui emprisonnent le principe actif hydrophobe et le libèrent une fois détruit dans le colon (J. Szetli, Pharmaceut. Technol. Int., 3, 16-24 (1991)).

L'invention concerne enfin les médicaments utilisableε comme effecteurε de 1•immunité ou deεtinéε à la prévention ou au traitement de maladies ou de symptomeε résultant de 1'action de glucocorticoïdeε caractérisés en ce qu'ils contiennent un composé de formule I ou de formule II en asεociation avec un véhicule pharmaceutique approprié au mode d•adminiεtration choiεi.

Leε différents exemples qui suivent montrent sans caractère limitatif les effets thérapeutiques deε dérivéε 7α ou 7 β-hydroxyles, aussi bien comme effecteurs de 1'immunité que comme agents anti- glucocorticoïdeε.

I- EFFET EFFECTEUR DE L'IMMUNITE

L'effet effecteur de l'immunité a été éprouvé par injection sous-cutanée concomitante à celle d'un antigène et du dérivé 7α ou 73-hydroxylé à des souris C57BL/6, selon un protocole d'immunisation clasεique. (Methods in Enzymology (1980), vol. 70) .

L'effet du composé comme effecteur de l'immunité cellulaire est mesuré par la quantité d'IgG circulanteε

dirigéeε contre l'antigène, et ce, 21 jourε aprèε l'injection, aprèε une injection de rappel à 14 jourε.

Leε exemples suivantε, sans caractère limitatif, décrivent l'invention. - EXEMPLE I : Effet de la 7αOH-DHEA et de la 7JOH-DHEA:

. Préparation (synthèεe) des la- et 73-hydroxy- déhydroépiandrostérone :

L'acétate de DHEA (1) (1 g. Sigma D-4500) , est tranεformé en 33-acétoxy, 7α-bromoandroεt-5-ène-l7-one (2) par le procédé publié par J. ORR and J. BROUGHTON (J. Org. Che . (1970) 3_5, 1126-1129) utiliεant le N- bromosuccinimide sous irradiation lumineuse.

Le dérivé brome obtenu est transformé en un mélange de 3 _/ 8, 7α(3)-diacétoxy-androst-5-ène-17-one (3) en traitant par le mélange acétate de K/acide acétique selon A. NUSSBAUM et al. (J. A . Chem. Soc. (1960) 82, 2641) .

Le mélange obtenu est saponifié danε C0 ₃ K ₂ méthanolique à reflux pendant 3 heureε. Aprèε extraction deε εtéroïdeε saponifiés, le 3β, la- dihydroxy-androεt-5-ène-17-one (4) est séparé du 33, 7jS-dihydroxy-androst-5-ène-17-one (5) par chromatographie préparative sur gel de silice élue par l'acétate d'éthyle. L'épimère Iβ est élue en premier complètement séparé du stéroïde 7α qui eεt élue ensuite.

Le (4) est cristalliεé danε acétate d'éthyle/n- hexane. Leε cristaux (120 mg) ont un point de fusion de 182-183°C correεpondant à ceux trouvéε par R. DODSON et al. (J Am. Chem. Soc. (1959) 80., 6295-6297) et par G. DEFAYE et al. (J. Steroid Biochem. (1978) 9, 331-336).

Le (5) eεt cristallisé de la même manière (280 mg) . Les cristaux ont un point de fusion de 214-215°C correspondant à ceux trouvés par les mêmes auteurs que ci-deεsus.

Le pasεage de (4) et (5) en chromatographie en phaεe gazeuεe couplée à la spectrométrie de masse souε la forme de dérivéε di-triméthylεilyloxy donne pour chacun un ion moléculaire à 448 correspondant à la masεe attendue et leε mêmeε tempε de rétention et profilε de fragmentation que celui deε mêmes dérivés de (4) et (5) de référence (fournis par H.A. LARDY, Univerεité du Wisconsin) .

. Protocole d'immunisation :

Trente cinq lots de 5 souriε C57BL/6 âgéeε de 6 semaines subisεent une injection εouε-cutanée de 200 μg de lysozyme de blanc d'oeuf de poule le premier et le quatorzième jour d'un protocole d'immunisation. Des solutions de DHEA (Sigma D.4500) dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) sont injectées de la même manière à des temps variables avant la première injection de lysozyme. Des quantités compriseε entre 0,25 et 2 g/kg εont utiliεées. Dix autres lotε de 5 souris subiεεent une injection sous-cutanée de 6,25 à 50 mg/kg de 7α-hydroxy-DHEA ou de 7;0-hydroxy-DHEA en solution dans le DMSO au même moment que la première du lysozyme. Deux lots ne reçoivent que le DMSO avec le lysozyme (contrôles) . Les blancs correspondant à un lot de 5 souris ne subissant aucune injection.

Trois semaines après les premières injections, les animaux alors âgés de 9 semaines sont décapités. Le sang de chaque animal est recueilli, et la présence d'immunoglobulines G (IgG) anti-lysozyme est mesurée dans deε dilutionε en εérie des sérums par un doεage immunoenzymatique utilisant des IgG de chèvre anti-IgG de souriε (Fc) marquées à la peroxydase.

Les résultatε sont indiqués dans leε ligneε 1, 3, 6 et 7 du tableau 1, où l'effet particulièrement marqué des faibles doεeε de la 7αOH-DHEA apparaît. La 730H- DHEA a un effet équivalent à celui de la DHEA injectée

1 heure avant l'antigène, mais à des doses 20 fois plus faibles.

- EXEMPLE II : Effet du la OH et 7β OH prégnénolone :

. Préparation (synthèεe) deε la- et 7,9-hydroxy- prégnénolone :

L'acétate de prégnénolone (1) (Sigma, P-9254) , eεt tranεformé en 33-acétoxy-7α-bromoprégn-5-ène-20-one (2) par le procédé publié par J. ORR and J. BROUGHTON (J. Org. Chem. (1970) , 3_5, 1126-1129) utiliεant le N- bromoεuccinimide εouε irradiation lumineuεe.

Le dérivé brome obtenu eεt tranεformé en un mélange de 3β, 7α(/3)-diacétoxy-prégn-5-ène-20-one (3) en traitant par le mélange acétate de K/acide acétique selon A. NUSSBAUM et al. (J. Am. Chem. Soc. (1960) 82,, 2641) ..

Le mélange obtenu eεt saponifié dans C0 ₃ K ₂ méthanolique à reflux pendant 3 heureε. Aprèε extraction deε εtéroïdeε saponifiés, le 3,5, 7α- dihydroxy-prégn-5-ène-20-one (4) est séparé du 3 _/ 3, Iβ- dihydroxy-prégn-5-ène-20-one (5) par chromatographie preparative sur gel de silice élue par l'acétate d'éthyle. L'épimère Iβ est élue en premier complètement séparé du stéroïde la qui eεt élue ensuite.

Le (4) est cristallisé dans l'acétate d'éthyle/n- hexane. Les cristaux sont contrôlés par réεonance magnétique nucléaire (200 MHz), 0.55 (3H, ε, Me-18) , 0.99 (3H, ε, Me-19) , 2.13 (3H, ε, Me-21) , 3.62 (1H, m, H-3) , 3.86 (1H, ε, H-7) , 5.62 (1H, d, H-6) . Le paεsage du dérivé di-triméthylsilyloxy de (4) en chromatographie en phase gazeuεe couplée à la spectrométrie de masεe donne 1•ion moléculaire attendu à 476 et le profil de fragmentation correspondant.

Le (5) est cristallisé dans l'acétate d'éthyle/n- hexane. Les cristaux sont contrôlés par réεonance magnétique nucléaire (200 MHz), 0.63 (3H, ε, Me-18) , 1.05 (3H, ε, Me-19), 2.12 (3H, ε, Me-21) , 3.53 (1H, m.

H-3) , 3.83 (1H, d, H-7) , 5.30 (1H, s, H-6) . Le paεεage du dérivé di-tri éthylεilyloxy de (5) en chromatographie en phaεe gazeuse couplée à la spectrométrie de maεεe donne 1•ion moléculaire attendu à 476 et le profil de fragmentation correspondant.

. Protocole d'immunisation :

Celui-ci est réalisé de la même façon que danε l'exemple I.

Leε réεultats sont indiqués lignes 2 et 5 du tableau 1.

- EXEMPLE III : Effet des androst-5-ène-3/3, 7α(/3), 17/3-triθl (7αOH ADIOL et 730H ADIOL) :

Préparation (εynthèεe) deε androst-5-ène-3/3, la (β) , 17,9-triθl (7αOH ADIOL et 730H ADIOL) :

L'.acétate de déhydroépiandrostérone (DHEA) (1) (Sigma, D-4500) , est oxydé en position 7 par le complexe Cr0 ₃ -diméthylpyrazole selon SALMOND et al. (J. Org. Chem. (1978) 4_3, 2057) et conduit au 3/3-acétoxy- androst-5-ène-7, 17-dione (2). Ce produit est identique (point de fusion, Rf chro atographique, absorption UV, spectre de masse) à celui fourni en référence par J. JACQUES (Collège de France) .

(2) est réduit par NaBH^ dans le méthanol et conduit au mélange deε épimèreε 3 _/ 3-acétoxy- la (β) , 173-dihydroxy-androεt-5-ène (3) . Aprèε εaponification du mélange (3) danε le KOH/méthanol, les androst-5- ène-3 _/ 3, la , 17/3-triol (4) et androεt-5-ène-3/3, 7 _/ 3, 17/3-triol (5) εont εucceεεivement obtenuε et complètement εéparéε par chromatographie sur gel de silice -élue par l'acétate d'éthyle.

(4) et (5) sont cristalliséε danε l'acétone/n- hexane. Leε criεtaux de (4) ont un point de fusion de 272-273°C correspondant à celui rapporté par G. DEFAYE et al. (J. Steroid Biochem. (1978) 53, 331-336) et son dérivé tri-triméthyl-silyloxy préεente, après chromatographie en phase gazeuse couplée à la

spectrométrie de masse l'ion moléculaire attendu à 522 et le profil de fragmentation correspondant.

Les cristaux de (5) ont un point de fusion de 244-245°C correεpondant à celui rapporté par G. DEFAYE et al. J. Steroid Biochem. (1978) 9_, 331-336) , et εon dérivé tri-triméthylεilyloxy présente, après chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de maεεe l'ion moléculaire attendu à 522 et le profil de fragmentation correspondant.

. Immunisation :

Un lot de 5 souris εubit l'injection εous-cutanée de 125 mg/kg de 5-androstène-3/3, 17 _/ 9-diol (ADIOL) une heure avant la première injection de lyεozyme, et deux lots de 5 souris sont traités par 25 mg/kg de la- hydroxy-ADIOL ou de 7/3-hydroxy-ADIOL au moment de la première injection de lysozyme.

. Résultats :

Les résultats sont indiqués lignes 4, 8 et 9 du tableau 1 ci-desεouε.

Tableau 1 : Mesures immunoenzymatiqueε des IgG anti- lysozyme présenteε danε le εérum de souris C57BL/6 immunisées contre le lyεozyme aprèε traitement par la prégnénolone (PREG) ou la DHEA ou l'androst-5- ène-3 _/ 3,17/3-diol ou leurs dérivés 7-hydroxylés ou par aucun stéroïde.

La DHEA ou la PREG ou 1'ADIOL est injecté sous la peau 1 heure avant la première injection de lysozyme. Les dérivés 7-hydroxylés εont adminiεtrés au moment de l'injection du lysozyme. La mesure im unoenzymatique des IgG anti-lyεozyme dans des dilutionε εériéeε deε sérums de chaque animal utiliεe deε IgG de chèvre anti-IgG de εouriε marquéeε à la peroxydaεe εur deε plaqueε 96-puitε traitéeε au lyεozyme. La moyenne deε denεités optiques mesurées dans chaque lot de 5 souris est calculée ainsi que la déviation standard (SD) .

TABLEAU 1

Calculé à partir deε meεures sur des dilutions supérieureε du εéru .

Stéroïde injecté Denεitéε optiqueε ± SD danε les (doεe) dilutionε εériqueε

1/180 1/540

1. Contrôles (nulle) 0,15±0,01 0,13±0,01 0,10±0,01

2. PREG (0,5 g/kg) "4,6711,21 1,83±0,48 0,56±0,15

3. DHEA (1,0 g/kg) 0,40±0,06 0,26±0,04 0,14±0,02

4. ADIOL (125 mg/kg) 0,26±0,09 0,37±0,06 0,22±0,03

5. 7 -hydroxy-PREG ^* 4,46±0,30 ^* 2,20±0,14 0,77±0,05 (6,25 mg/kg)

6. 7 -hydroxy-DHEA 1,21±0,37 0,74±0,21 0,43±0,12 (6,25 mg/kg)

7. 7/3-hydroxy-DHEA 0,46±0,06 0,31±0,04 0,13±0,01 (50,0 mg/kg)

8. 7 -hydroxy-ADIOL 0,15±0,02 0,14±0,01 0,11±0,01 (25,0 mg/kg)

9. 7/3-hydroxy-ADIOL 0,18±0,06 0,18±0,02 0,12±0,01 (25,0 mg/kg)

La PREG, la DHEA et l 'ADIOL augmentent les concentrations sériqueε d'IgG anti-lyεozyme lorsque ces stéroïdes sont administréε au moins une heure avant l'injection du lysozyme. Les meilleurs réponses sont obtenues avec 0,5 g/kg de PREG et 1 g/kg de DHEA (tableau 1) . Lorsque ces stéroïdes sont injectés au même moment que le lysozyme, les quantités d'IgG restent identiqueε à celleε trouvéeε chez leε contrôles.

Par contre, les dérivés 7α-hydroxyléε de la PREG et de la DHEA déclenchent une production accrue d'IgG lorεqu'ilε εont adminiεtréε au même moment que le lyεozyme. La quantité la plus faible injectée (6,25 mg/kg) est la plus active (tableau 1). L'injection dans ces conditions de 50 mg/kg de 7/3-hydroxy-DHEA donne une réponse identique à celle de lg/kg de DHEA administrée

I heure avant celle du lysozyme (tableau 1) . Leε dérivés 7-hydroxylés de 1'ADIOL ne déterminent, à la dose testée, qu'une très faible augmentation des IgG anti-lysozyme sériques (tableau 1) .

Ces résultats relient 1'hydroxylation tisεulaire deε précurεeurs naturels des hormones stéroïdes au déclenchement de la réponse immunitaire. Le temps de latence pour l'action de la PREG ou de la DHEA sur l'augmentation des IgG anti-lysozyme implique la transformation de ces stéroïdeε en métaboliteε actifs. La démonstration de leur hydroxylation en la dans les tissus cutanés, et celle de l'effet immédiat de ces dérivés 7α-hydroxylés sur la production accrue d'IgG anti-lysozyme contribuent à le prouver. L'étude des hydroxylations de stéroïdes 3/3-hydroxylés dans diverε tissus chez plusieurs espèces (R. Morfin, S. Di Stéfano, J.F. Charles and H.H. Floch (1977) Biochimie, 59, 637-644; J.T. Iεaacε, I.R. Me Dermott and D.S. Coffey (1979), Steroidε, 3J3, 675-692; M. Warmer, P. Tollet, M. Strόmεtedt, K. Carlstrόm and J.A. Gustafsson (1989), J. Endocrinol., 122, 341-349; Y. Akwa, R. Morfin, P. Robel and E.E. Baulieu, (1992), Biochem. J., 288, 959-964 ; R. Morfin, résultatε non publiéε εur la εouriε) a prouvé que 1'hydroxylation en 7 eεt majoritaire en la mais avec de faibles quantités en Iβ .

II apparaît auεsi que la 7α-hydroxy-DHEA est bien plus active que son épimère en 7/3. Il n'en reste pas moinε que leε épimèreε en 7/3 et les compositions les contenant doivent également être conεidéréε comme faiεant partie de l'invention.

Ceε exempleε εont donnéε à titre d'illuεtration mais ne sont pas limitatifs

- ni de la dose utilisée,

- ni de la présence d'une double liaison 5-6 sur le stéroïde,

- ni de l'effet obεervé sur la synthèεe deε IgG.

La DHEA 7α-hydroxylée conεtitue un métabolite naturel de la DHEA, ce qui pourrait expliquer les difficultés antérieurement observéeε avec la DHEA. En effet, leε quantitéε de DHEA néceεεaireε à la miεe en évidence deε effetε phyεiologiques observés par divers auteurs (The biologie rôle of Dehydroepiandrostérone, Editeurs M. Kalimi, W. Regelson, Publication Walter de Gruyter, Berlin, New York, 1990), et le fait qu'un effet stimulateur de 1'immunité néceεεitait une injection préalable à celle de l'antigène, ε'expliquent-ilε peut-être à poεteriori par le fait que leε activitéε observées pour la DHEA devaient pasεer par une nécessaire métaboliεation préalable de ce εtéroïde.

II- EFFET ANTIGLUCOCORTICOIDE :

L'effet anti-glucocorticoïde de ces molécules a été prouvé par les études de leur compétition avec la Dexaméthazone radio-marquée pour sa rétention nucléaire danε leε celluleε de tissus hépatique, cérébral, splénique et thymique chez la εouris C57BL/6, selon le protocole publié par P. Mohan et M. Cleary sur des hépatocytes de rat (Steroidε, 57, 244-247 (1992)). Ce protocole expérimental eεt lui-même une adaptation de la méthode de D. Colvar et al; (Clin. Chem., 34, 363-369 (1988)).

Les exemples suivantε, εans caractère limitatif décrivent 1'invention.

La figure 1 représente 1'effet anti- glucocorticoïde de différents dérivés teεtés, mesurés par compétition avec la dexamethasone radioactive quant à leur liaiεon εur les noyaux d•hépatocyteε de rat.

Leε hépatocyteε iεolés sont incubés pendant 1 heure à température ambiante avec des concentrations croisεantes (2-80 nM) de ³ H-Dexaméthazone (DEX ^* ) . Les mêmes incubations εont répétéeε en présence d'un excès

de 100 fois (200-8000 nM) de Dexamét. îazone non radioactive (DEX ^* /DEX) ou de 7α-hydroxy DHEA (DEX ^* /7aDHEA) ou de 7α-hydroxy-5DIOL (DEX ^* /7a5DIOL) ou de 6c_-hydrσxy-ISOA (DEX ^* /6aISOA) ou de 7α-hydroxy-ISOA (DEX ^* /7aISOA) . Les noyaux des hépatocyteε sont ensuite isolés et purifiés et la radioactité correεpondant à la DEX ^* retenue est mesurée et exprimée en cpm/lOμg d'ADN. L'aire souε la courbe DEX ^* correspond à un déplacement nul de la radioactivité (zéro) . L'aire sous la courbe DEX ^* /DEX qui correspond au déplacement de la radioactivité par la même molécule est pris arbitrairement comme 100. Les aires sous les courbes obtenues avec les autres stéroïdes permettent de calculer par interpolation entre les aires zéro et 100 les coefficients de déplacement de la liaison nucléaire de la DEX ^* -

Le fait que les stéroïdes testés qui se sont révélés les plus actifs soient des dérivés naturels des hormoneε stéroïdes androgenes prend pleinement sa signification au travers des nombreuseε interactions observées au cours de traitementε par deε associationε de glucocorticoïdeε et de stéroïdes androgenes anabolisants (O. Linet, Progr. Drug Res., 14, 139-195 (1970)). Les effets "anti-glucocorticoïdes" observés à la suite de ces traitementε εont très variables et peuvent être maintenant expliqués par la nécessité d'une métabolisation préalable des stéroïdeε androgenes administrés afin que des dérivés 7-hydroxyléε actifε soient produits.

Cette conεtatation amène donc à considérer des molécules stéroïdes de synthèse reconnueε comme possédant un effet semblable à cel ^ de leur parent naturel, telle la 16-Bromo-ISOA (A. Schwartz et al., Adv. Cancer Res., Publ. Académie Press, 51, 391-424 (1988); G. Gordon et al., Adv. Enzyme Regul., Publ. Pergamon Press, 26, 355-382 (1987)). La tranεformation

poεsible d'un tel stéroïde en un dérivé 6- ou 7-oxygéné particulièrement actif nouε amène donc à conεidérer que ceε dérivéε et leε compositions les contenant font partie de l'invention.

Le mécanisme exact de l'interaction des stéroïdes 6- et 7-oxygénés avec le complexe Glucocorticoïde- récepteur-ADN n'est pas réεolu ; néanmoinε, l'effet anti-glucocorticoïde observé dans chacun deε exemples donnés peut être considéré comme une illustration non limitative des dérivéε utilisables dans la mesure où il répond à l'une des formules I ou II ci-dessus. Ces exemples ne sont pas non plus limitatifs de la dose, ni du mode d'administration utilisés, ni des effetε thérapeutiques résultant de leur utilisation.

- EXEMPLE IV: Effet anti-glucocorticoïde de la 7α- hydroxy-DHEA et de la 7/3-hydroxy-DHEA:

Préparation (synthèse) deε la- et Iβ-hydroxy-DHEA:

Celle-ci est effectuée comme dans l'exemple I. Test d'activité anti-glucocorticoïde:

Des souris C57BL/6 âgées de 7 à 12 semaineε εont traitéeε par la Métyrapone (25mg/kg) 24 heureε et 12 heureε avant le sacrifice des animaux, de manière à diminuer leur taux de glucocorticoïdes naturels et à augmenter les concentrations cellulaires en récepteurs spécifiqueε des glucocorticoïdes (R. Rupprecht et al., J. Neuroendocr. , 2, 803-806 (1990)). Les souris sont anesthésiées à l'éther et saignées, puis perfuséeε par la voie intracardiaque avec du sérum physiologique contenant de la collagénaεe B (0.03g/100ml) pendant 10 minuteε. Le foie, le cerveau, la rate et le thymuε εont prélevéε et les cellules de chaque organe sont récupérées par la méthode décrite (P. Mohan et M. Cleary, Steroids, 57, 244-247 (1992)). Leε quantitéε de celluleε obtenueε εont eεtiméeε sur la base de la mesure de l'ADN contenu dans les préparations. Leε

cellules sont incubées pendant 1 heure à température ambiante en présence de quantités croissantes (2nM à 80nM) de Dexaméthazone tritiée additionnée ou non d'une quantité 100 fois supérieure de Dexaméthazone non radioactive ou d'un des compoεéε à teεter.

Lés noyaux sont récupérés et leur contenu radioactif mesuré comme décrit par le auteurs citéε pluε haut.

Les résultats correpondants sont portés sur une courbe (Figure 1) où la radioactivité mesurée par lOμg d'ADN cellulaire est exprimée en fonction de la molarité de Dexaméthazone tritiée incubée. Le déplacement attendu de la Dexaméthazone tritiée par la Dexaméthazone non radioactive est observé. L'aire sous la courbe de la Dexaméthazone tritiée seule est mesurée et prise comme zéro. L'aire sous la courbe de la Dexaméthazone tritiée additionnée d'un excès de 100 fois en Dexaméthazone non radioactive est mesurée et prise comme 100. Les aires sous courbe, pour chacun des stéroïdeε non radioactifs testés par addition individuelle d'une quantité 100 fois supérieure à celle de la Dexaméthazone tritiée, sont mesuréeε et leur coefficient de déplacement de la Dexaméthazone tritiée liée danε leε noyaux calculé par interpolation sur la base du zéro et du 100.

Les résultats obtenus pour chacun des quatre organes avec la 7α-hydroxy-DHEA et la 7/3-hydroxy-DHEA sont présentés dans le tableau 2 aux lignes 1 et 2. Le déplacement de la Dexaméthazone tritiée qu'ils occasionnent dans leε noyaux prouve leur action anti- glucocorticoïde, la 7α-hydroxy-DHEA étant pluε efficace que l'épimère 7/3.

- EXEMPLE V: Effet anti-glucocorticoïde de la 7α- hydroxy-PREG et de la 73-hydroxy-PREG:

Préparation (synthèεe) deε la- et 7/3-hydroxy-PREG:

Cette préparation est identique à celle décrite dans l'exemple II.

Test d'activité anti-glucocorticoïde:

Celui-ci est réalisé de la même façon que dans l'exemple IV.

Les résultats εont indiqués aux lignes 3 et 4 du tableau 2. Le déplacement de la Dexaméthazone tritiée qu'ilε occasionnent dans les noyaux prouve leur effet anti-glucocorticoïde.

- EXEMPLE VI: Effet des 5-androstène-3/?,7α( _/ 3) ,17/3- triols (7α-hydroxy-5DIOL et 7/3-hydroxy-5DIOL) :

Préparation (synthèse) des 7α-hydroxy-5DIOL et Iβ- hydroxy-5DIOL:

La préparation eεt identique à celle décrite danε l'exemple III. Test d'activité anti-glucocorticoïde:

Celui-ci est réaliεé de la même manière que danε l'exemple IV.

Seul le 7α-hydroxy-5DIOL eεt teεté sur les noyaux d'hépatocyteε. Leε réεultatε εont indiquéε à la ligne 5 du tableau 2. Le déplacement de la Dexaméthazone tritiée liée danε leε noyaux d'hépatocyteε par le 7α- hydroxy-5DIOL prouve εon effet anti-glucocorticoïde.

- EXEMPLE VII: Effet des dérivés 6- et 7-oxygénés de stéroïdes 3/3-hydroxylés et 5α-réduits:

Préparation (synthèse) des 3/3-hydroxy-5c.-androstane- 7,17-dione (7-oxo-ISOA) , 3/3,6c.-dihydroxy-5α-androstane- 17-one (6α-hydroxy-ISOA) , 3/3,7α-dihydroxy-5c.- androstane-17-one (7 -hydroxy-ISOA) , 3/3,7/3-dihydroxy- 5 -androstane-17-one (7/3-hydroxy-ISOA) , 5c.-androstane- 3/3,7c.,17/3-triol (7c_-hydroxy-ADI0L) et 5α-androstane-3/3,

7/3,170-triol (7/3-hydroxy-ADIOL) :

La synthèse, l'identification et les propriétéε chromatographiqueε de ceε stéroïdes ont été effectuées par nos soins et publiées en détail (A. Kerebel, R. Morfin, F. Berthou et al., J. Chromatogr. , 140, 229-244 (1977)) ^' .

Deux autres stéroïdes sont commerciaux: la 3/3- hydroxy-5-pregnène-7,20-dione (7-oxo-PREG) (Steraloids Inc., Q5400) , et la 3/3-hydroxy-5-androstène-7,17-dione (7-oxo-DHEA) (Steraloidε Inc., A8320) . Teεts d'activité anti-glucocorticoïde:

Ceux-ci sont réalisés avec ces molécules de la même façon que dans 1'exemple I. Les résultats obtenus sont indiqués aux lignes 6,7,8,9,10,11 et 12 du tableau 2 où les dérivés de l'ISOA et de l'ADIOL se révèlent tous très actifs.

Légende du Tableau 2 :

Les stéroïdes suivants, désignéε de 1 à 13 εont: 1. 7_-hydroxy-DHEA (7α-0H-DHEA) , 2. 7,5-hydroxy-DHEA (7/3-OH-DHEA) , 3. 7c_-hydroxy-PREG (7/3-OH-PREG) , 4. 7/3- hydroxy-PREG (7/3-OH-PREG) , 5. 7α-hydroxy-5DIOL (7α- 0H-5DI0L) , 6. 7α-hydroxy-ISOA (7α-0H-IS0A) , 7. 7/3- hydroxy-ISOA (7/3-OH-ISOA) , 8. 7α-hydroxy-ADI0L (7c_-OH- ADIOL) , 9. 6α-hydroxy-ISOA (6α-OH-ADIOL) , 10. 7-oxo- PREG, 11. 7-oxo-DHEA, 12. 7-oxo-ISOA, 13. Dexaméthazone (DEX) .

Le déplacement de la liaiεon nucléaire de la Dexaméthazone tritiée par une concentration 100 foiε εupérieure de chacun de ceε εtéroïdeε eεt mesuré comme indiqué dans la Figure 1. L'absence de stéroïde compétiteur est prise comme zéro, et la présence de Dexaméthazone non radioactive prise comme 100. les coefficients de déplacement entrainéε par chacun deε autreε εtéroïdeε εont calculéε εur cette base, chaque résultat étant la moyenne de triplicata.

TABLEAU 2

Stéroïde testé Foie Cerveau Thymus Rate

85 91

94 81

96 125

100 100

Leε réεultatε préεentéε ci-deεεuε montrent que leε dérivéε 7-hydroxyléε de la DHEA, de l'ISOA et du 5-DIOL déplacent activement la Dexaméthazone tritiée de εa liaiεon nucléaire. Leε déplacementε avec leε autreε stéroïdes sont significatifs mais moins marqués. Le fait que ces résultats soient exprimés par rapport au déplacement obtenu par des quantités équivalentes de Dexaméthazone non radioactive, et notre observation précédente (demande de brevet français n° 92.12548) démontrant un effet immunoactivateur de ces mêmes stéroïdes chez la souris qui implique le blocage de 1'effet immunosuppresseur connu des glucocorticoïdes, conduisent à proposer 1'utiliεation de εtéroïdes testéε dans une composition pharmaceutique pour un traitement anti-glucocorticoïde.

La Dexaméthazone est un εtéroïde de synthèse qui est peu métabolisé (H. Siebe et al., Rénal Physiol. Biochem., 16, 79-88 (1993)) et qui possède une affinité pour le récepteur cytosolique des glucocorticoïdes supérieure à celle des glucocorticoïdes naturels tels que la corticostérone ou le cortisol. Le fait que la liaison du complexe Dexaméthazone-récepteur cytosolique sur les siteε de reconnaissance nucléaires soit diminuée par les stéroïdes testés confirme la potentialité d'un effet anti-glucocorticoïde. Par ailleurs, nos travaux (non rapportés ici) indiquent qu'il n'existe pas de récepteurs cytoεoliques ou nucléaires spécifiques de la 7α-hydroxy-DHEA, mais son action conduisant à l'activation des procesεuε immunitaires peut être considérée comme essentiellement anti-glucocorticoïde.