本実施形態に係る医薬品は、その一例と� ��て、抗ホモシステイン酸抗体及び/またはそ の抗原結合フラグメントを有効成分として含 有するものが挙げられる。

 すなわち、抗ホモシステイン酸抗体及び/ またはその抗原結合フラグメントが、脳内の ホモシステイン酸に特異的に結合することに より、ホモシステイン酸がNMDA受容体へ結合� �るのを阻害すると共に、細胞外のホモシス� �イン酸濃度の上昇を抑制し、しかも、神経� �性疾患や、心臓病、ストレス症候群、不安� �候群、骨粗鬆症の予防や改善、治療を行う� �とのできる医薬品を提供するものである。

 またここで、抗ホモシステイン酸抗体は� ��ポリクローナル抗体であっても良く、また� ��モノクローナル抗体であっても良い。

 抗ホモシステイン酸抗体をポリクローナ� ��抗体とした場合には、ホモシステイン酸を� ��々な角度で捕捉する種々の抗体を含有して� ��るため、ホモシステイン酸がNMDA受容体に結 合するのを阻害したり、細胞内のホモシステ イン酸濃度の上昇を抑制する作用を効果的に 発現させることができる。

 また、抗ホモシステイン酸抗体をモノク� ��ーナル抗体とした場合には、ホモシステイ� ��酸に対する特異性を向上させることができ� ��ホモシステイン酸に類似する物質に結合す� ��ことで生起される副作用を可及的抑制する� ��とができる。

 また、医薬品には、抗ホモシステイン酸� ��体の抗原結合フラグメントを含有するよう� ��しても良い。

 この抗原結合フラグメントは、具体的に� ��抗ホモシステイン酸抗体のFab断片(Fab fragmen t)や、F(ab')2断片(F(ab')2 fragment)とすることが� �きる。

 このように、本実施形態に係る医薬品に� ��原結合フラグメントを含有させることで、� ��モシステイン酸に同抗原結合フラグメント� ��結合させて、ホモシステイン酸をNMDA受容体 に結合不可能な状態とし、ホモシステイン酸 による活性化を抑制することができる。

 また、本実施形態に係る医薬品では、前� ��抗ホモシステイン酸抗体が、ヒト抗体、ヒ� ��化抗体、部分的ヒト抗体、キメラ抗体また� ��組換え抗体であることとしても良い。

 ここで、ヒト抗体とは、イムノグロブリ� ��を構成するH鎖の可変領域及びH鎖の定常領� �並びにL鎖の可変領域及びL鎖の定常領域を含 む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコー ドする遺伝子に由来するイムノグロブリンの ことをいう。

 また、ヒト化抗体とは、ヒト以外の動物� ��抗体を、遺伝子工学や化学的な修飾によっ� ��部分的に改変し、ヒト抗体と同一または抗� ��性の問題が解決される程度に類似としたイ� ��ノグロブリンのことをいう。

 また、部分的ヒト抗体とは、ヒト以外の� ��物型抗体において、抗原性の問題が生じる� ��位をヒト型の抗体に由来する部位に置き換� ��たイムノグロブリンのことをいう。

 また、キメラ抗体とは、同抗体をコード� ��る遺伝子が、ヒトに限らず複数種の動物の� ��体遺伝子を組みかえて得られた遺伝子であ� ��て、同遺伝子により発現したイムノグロブ� ��ンのことをいう。

 また、組換え抗体とは、同抗体をコード� ��る遺伝子が人為的及び/または突然変異によ り組み換えられた遺伝子であって、同遺伝子 により発現したイムノグロブリンのことをい う。

 また、本実施形態に係る医薬品は、所定� ��担体にホモシステイン酸、又は薬学的に許� ��しうる範囲のホモシステイン酸塩若しくは� ��モシステイン酸誘導体を結合した複合体を� ��有する医薬品であっても良い。

 ここで用いられる担体は低分子化合物を� ��原として免疫する場合に通常用いられるも� ��が利用できる。たとえば、アルブミン、KLH( スカシ貝ヘモシアニン:keyhole limpet hemocyanin)� ��組換えコレラトキシンBサブユニット(recombin ant cholera toxin B subunit)、組換えシュードモ� ��スエキソプロテインA(recombinant pseudomonas exo protein A)、ポリスチレン、多糖などがあげら� ��る。これらの担体に、ホモシステイン酸ま� ��は薬学的に許容しうる範囲のホモシステイ� ��酸塩若しくはホモシステイン酸の誘導体を� ��合させて形成した複合体を医薬品に含有す� ��ことにより、ヒトの体内で該複合体を抗原� ��して認識させ、抗ホモシステイン酸抗体を� ��導することができる。すなわち、ワクチン� ��しても使用することができる。

 また、前記ホモシステイン酸又はホモシ� ��テイン酸誘導体は、架橋剤を介して結合す� ��のが望ましい。この架橋剤としては、グル� ��ルアルデヒド、グリオキサール、マロンア� ��デヒド、ノナンジアール、bis[sulfosuccinimidyl]  suberate、Dimethyl Suberimidate、disuccinimidyl tartra te、1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochl oride、m-maleimidobenzoyl-N-hydoxysuccinimide ester、(m-m aleimidobenzoyl-N-hydoxysuccinimide ester等、担体のア ミノ基、カルボキシル基、チオール基等とホ モシステイン酸のアミノ基、カルボキシル基 の反応性を利用したクロスリンカーが使用で きる。

 上述してきた本実施形態に係る医薬品は� ��ホモシステイン酸がNMDA受容体へ結合するの を阻害すると共に、細胞外のホモシステイン 酸濃度の上昇を抑制し、しかも、神経変性疾 患や、心臓病、ストレス症候群、不安症候群 、骨粗鬆症の予防や改善、治療を行うことの できる医薬品とすることができる。

 ここで、本実施形態に係る医薬品が心臓� ��、ストレス症候群、不安症候群、骨粗鬆症� ��各疾患に対して予防や改善、治療効果を生� ��する作用機序について具体的に説明すると� ��心臓病は、ホモシステイン酸が血管内皮に� ��用して内皮障害を発現し心臓病が発症する� ��考えられているが、本実施形態に係る医薬� ��がホモシステイン酸と結合しホモシステイ� ��酸を不活性化して内皮障害となるのを防ぐ� ��め心臓病を改善したり、治療することがで� ��るのである。なお、本実施形態に係る医薬� ��を予め投与しておくことにより、ホモシス� ��イン酸を不活性化することとなるため、心� ��病が発症するのを予防することができる。

 また、ストレス症候群は、ホモシステイ� ��酸が種々の神経系に作用してストレス情報� ��発現することによりストレス症候群が発症� ��ると考えられているが、本実施形態に係る� ��薬品がホモシステイン酸を不活性化して他� ��神経系の活性化を防ぐためストレス症候群� ��改善したり、治療することができるのであ� ��。なお、本実施形態に係る医薬品を予め投� ��しておくことにより、ホモシステイン酸を� ��活性化することとなるため、ストレス症候� ��が発症するのを予防することができる。

 また、同じように不安症候群は、ストレ� ��症候群と同様の作用によりホモシステイン� ��が不安症状を発現する神経系に作用して不� ��症候群が発症すると考えられているが、本� ��施形態に係る医薬品がホモシステイン酸を� ��活性化して不安症候群を改善したり、治療� ��ることができるのである。なお、本実施形� ��に係る医薬品を予め投与しておくことによ� ��、ホモシステイン酸を不活性化することと� ��るため、不安症候群が発症するのを予防す� ��ことができる。

 また、骨粗鬆症は、ホモシステイン酸が� ��破壊細胞に作用して骨破壊細胞の活性化を� ��き起こし骨粗鬆症が発症すると考えられて� ��るが、本実施形態に係る医薬品がホモシス� ��イン酸を不活性化して骨破壊細胞の活性化� ��なるのを防ぐため骨粗鬆症を改善したり、� ��療することができるのである。なお、本実� ��形態に係る医薬品を予め投与しておくこと� ��より、ホモシステイン酸を不活性化するこ� ��となるため、骨粗鬆症が発症するのを予防� ��ることができる。

 これらの医薬品の投与は、脳室内投与、� ��腔内投与、経口投与、静脈内投与、筋肉内� ��与、髄腔内投与、皮下投与、舌下投与、経� ��腸投与、経鼻、吸入、経皮投与、経皮的吸� ��のいずれであっても良い。

 本実施形態に係る医薬品を上述の形態で� ��与することにより、医薬品の効果を最大限� ��引き出すことができる。

 次に、本実施形態に係る医薬品をマウスに� ��与した試験結果について述べる。ここでは� ��下記の順を追って本試験について説明する� ��
(1)実験動物について
(2)医薬品について
(3)脳切片の検鏡
(4)水迷路試験(学習能力)
(5)水迷路試験(短期記憶)
(6)水迷路試験(長期記憶)
(7)血中ストレス指標物質量測定
(8)記憶力回復試験
(9)医薬品(ワクチン)の合成
(10)投与試験1
(11)投与試験2
(12)投与試験3
(13)血清中の抗体量の確認試験

〔1.実験動物について〕
 本試験では、実験動物として、家族性アル� ��ハイマー病のモデルマウス3xTg-ADのオスとメ スから生まれた第1世代子孫を用いることと� �た。

 家族性アルツハイマー病のモデルマウス3 xTg-ADは、APP遺伝子、Presenilin遺伝子、Tau遺伝� �の3つの遺伝子が改変されており、いずれも� ��族性アルツハイマー病の原因遺伝子である� ��以下、APP遺伝子、Presenilin遺伝子、Tau遺伝子 を総称して「原因遺伝子」という。

 この改変された原因遺伝子を有するヘテ� ��型モデルマウスのオスとメスとを掛け合わ� ��ると、メンデルの遺伝法則により、改変さ� ��た原因遺伝子を持たないNonTgマウスと、原� �遺伝子の全てが改変されているhomozygousマウ� ��と、原因遺伝子の半分が改変された原因遺� ��子であるhemizygousマウスとの3種のマウスが� �まれることとなる。

 これら3種のマウスは、普通食を施餌しな がら飼育を行うことにより、NonTgマウスは記� ��障害を発現せず、homozygousマウスは4ヶ月齢� �記憶障害を発現し、hemizygousマウスは6ヶ月齢 で発現することとなる。

 しかも、これら3種のマウスは、ビタミン B6欠乏食を施餌することにより、より顕著に� ��憶障害を発現することとなる。またNonTgマ� �スも記憶障害を発現する。

 そこで、以下の試験では、3ヶ月齢のNonTg� ��ウスと、3ヶ月齢のhemizygousマウスを用いて� �ビタミンB6欠乏食を施餌することにより各種 試験を行うこととした。

〔2.医薬品について〕
 以下の試験において前述のマウスに投与す� ��医薬品は、抗ホモシステイン酸抗体を調製� ��たり、所定の担体にホモシステイン酸を結� ��した複合体を調製することで実現すること� ��できるが、ここでは、MobiTec社製ウサギ由来 抗ホモシステイン酸ポリクローナル抗体(No.10 37GE)を医薬品として用いることとした。

 また、以下において、MobiTec社製ウサギ由 来抗ホモシステイン酸ポリクローナル抗体(No .1037GE)の原液を抗ホモシステイン酸抗体標準� ��として使用することとした。なお、以下に� ��いて、同標準液を2倍、10倍、100倍希釈した� ��薬品は、標準液を生理食塩水で希釈したも� ��である。

〔3.脳切片の検鏡〕
 次に、本実施形態に係る医薬品を投与したh emizygousマウス(以下、「Tg Exマウス」という)� ��脳内のAβ1-42量について、本実施形態に係る 医薬品を投与しないhemizygousマウス(以下、「T g controlマウス」という)との比較を行った。

 ここでいうAβ1-42は、前述の通り、老人斑 中に見られるアミロイドβタンパクであり、A β1-42が凝集して核となり、さらに可溶性のア ミロイドβタンパクを取り込みながら成長す� ��ことで沈着を起こし、脳神経細胞を侵すこ� ��により神経細胞変性疾患を生起すると考え� ��れている物質である。

 Aβ1-42の測定について具体的に説明すると 、まず、使用する被験動物として、2匹の3ヶ� ��齢のhemizygousマウスをそれぞれ1匹ずつ別々� �ケージに入れ、ビタミンB6欠乏食を自由に施 餌し、3週間に亘って飼育した。

 また、2匹のhemizygousマウスのうち、1匹に� ��本実施形態に係る医薬品を投与せずTg contro lマウスとし、もう1匹には本実施形態に係る� ��薬品を投与してTg Exマウスとした。

 Tg Exマウスへ投与した医薬品は、上述の� ��ホモシステイン酸抗体標準液を100倍希釈し� ��ものを用い、脳室へシリンジ針を穿刺して2 0μ1注入することにより投与した。また、こ� �医薬品の投与は、3日毎に行った。

 次に、上述の手段により飼育した各マウ� ��から脳を採取した。採取した各マウスの脳� ��氷薄切片とし、Aβ1-42を特異的に染色すべく 、免疫染色法により染色した。

 そして、染色した脳切片を光学顕微鏡に� ��検鏡し、各マウスにおけるAβ1-42の蓄積度合 いを目視にて比較した。この際、Aβ1-42が高� �度で存在する部位は茶褐色~黒色に染色され� ��斑点状や顆粒状に観察されることとなる。

 また、検鏡は扁桃体、大脳皮質、海馬を� ��心に行った。なお、扁桃体は情動を司る部� ��であって、異常をきたすと不安行動が生起� ��れ、大脳皮質は学習を司る部位であって、� ��常をきたすと学習能力の低下が生起され、� ��馬は記憶を司る部位であって、異常をきた� ��と記憶力の低下が生起される。

 これらの部位について検鏡した結果、Tg  controlマウスの脳切片は、扁桃体、大脳皮質� �海馬のいずれにおいても顆粒状に染色され� �Aβ1-42が強く認められ、Tg controlマウスの扁� �体、大脳皮質、海馬にはAβ1-42が多量に蓄積� ��ていることが示された。

 一方、Tg Exマウスの脳切片は、Tg control� �ウスの脳切片に比して扁桃体、大脳皮質、� �馬のいずれにおいても染色度合いが非常に� �く、Tg Exマウスの扁桃体、大脳皮質、海馬� �はAβ1-42がTg controlマウスに比して蓄積して� �ないことが示された。

 これらの検鏡結果を踏まえると、本実施� ��態に係る医薬品は、ホモシステイン酸がNMDA 受容体に結合するのを阻害して、細胞内にAβ 1-42が蓄積するのを防ぐことが示された。

 すなわち、細胞内のAβ1-42の濃度を低濃度 に保つことにより、神経細胞が障害を受ける のを防止して、神経変性疾患の予防や改善、 治療が可能であることが示された。また、ホ モシステイン酸は、自身も細胞毒性を有して おり、このホモシステイン酸の毒性を抗体に よって抑制することによっても、神経細胞が 障害を受けるのを防止して、神経変性疾患の 予防や改善、病状の進行の抑制、治療が可能 である。

 なお、本発明者らは、これらの部位を検� ��した際に撮影した画像を有しており、必要� ��応じて提出する用意がある。

〔4.水迷路試験(学習能力)〕
 次に、本実施形態に係る医薬品の学習能力� ��よび記憶力改善効果の確認を行うべく、モ� ��スの水迷路(Morris water maze)を用いた試験を� ��った。

 ここで、モリスの水迷路に使用する試験� ��置について説明すると、試験装置は、室温� ��した水を満たした大きな円形プール(直径1.5 m、高さ50cm)を備えており、同円形プール内の 水は、あらかじめ粉乳や非毒性色素等を加え て不透明としている。また、水深はマウスが 遊泳する際に底に体が接触しないよう充分に 深くしている。

 また、円形プールには、避難台(直径5cm)� �水面下に没した状態で設けられており、不� �明の水によって隠された状態となっている� �遊泳するマウスがこの避難台を探り当てる� �、台上で休憩することができるようにして� �る。

 そして、マウスをこの円形プールの水面� ��に放ち、避難台に到達するまでの時間や行� ��を分析することにより、学習能力や記憶能� ��の度合いを検証することができるようにし� ��いる。

 さらに詳説すると、避難台は、円形プー� ��を4分の1円に区画したいずれかの一つの略� �心部の水面下1.0cmに配設されている。

 また、円形プールの周囲には、マウスが� ��識可能な目印を配設しており、避難台に到� ��したマウスは、この目印を元に、避難台が� ��形プールのどの辺りに位置するか個々の能� ��に応じて学習や記憶するようにしている。

 換言すると、マウスが、プール周辺の任� ��のスタート地点から泳ぎ始めて、効率的に� ��難台の位置を特定することを可能とする能� ��は、迷路周囲の情報の利用に依存するよう� ��している。

 また、円形プール内におけるマウスの行� ��は、プールの中心2.5m上に吊り下げられたカ メラによって記録されており、このカメラは 、ビデオ追跡システムおよび、挙動解析ソフ トウェアを搭載するコンピュータに接続され ている。

 また、試験は、円形プールに避難台を備� ��た状態で、マウスに避難台の位置を学習・� ��憶させる訓練習得セッションと、避難台を� ��えたまま、または、避難台を取り去って観� ��するプローブドトライアルとの二段階で行� ��た。

 すなわち、本試験では、このような試験� ��置にて、4つの区画のうちで、無作為に選択 した区画をスタート区画とし、同スタート区 画に対して90度離れた位置のうちの1つに避難 台を設けてゴール区画として、まず訓練習得 セッションを行う。

 次いで、所定時間経過した後、プローブ� ��トライアルを行って、避難台のある状態で� ��タート地点から避難台に到達するまでの時� ��や、避難台のない状態でゴール区画内にて� ��泳しながら滞在する時間や、マウスの遊泳� ��にゴール区画の線を跨いだ回数について計� ��を行うことで学習能力や記憶能力について� ��証を行った。

 次に、上述のモリスの水迷路を用いた本� ��験(学習能力試験)の内容について説明する� �

 本試験では、前述の訓練習得セッション� ��行った後、1.5時間マウスをケージ内で自由� ��状態におき、その後、プローブドトライア� ��を行うことで、避難台の位置探索が学習に� ��りどの程度効率的に行われるかについて検� ��を行った。

 試験に使用したマウスは、以下の4種16匹の� ��ウスである。
(1)NonTgマウス(3ヶ月齢) 4匹
(2)Tg controlマウス(3ヶ月齢) 4匹
(3)TgEx(2倍希釈)マウス(3ヶ月齢) 4匹
(4)TgEx(100倍希釈)マウス(3ヶ月齢) 4匹

 ここで、(3)および(4)の希釈倍数は、前述� ��〔2.医薬品について〕にて示した抗ホモシ� �テイン酸抗体標準液の希釈倍数であり、抗� �モシステイン酸抗体のマウスへの投与量は� �TgEx(2倍希釈)マウス>TgEx(100倍希釈)マウスと している。なお、各マウスは〔脳切片の検鏡 〕の項で述べた方法により予め飼育されたも のである。

 上記マウスについてモリスの水迷路を用� ��、学習能力について試験した結果を表1およ び表2に示す。なお、結果は各群の4匹の平均� ��を示している。

 表1は、スタート区画の水面にマウスを放ち 、訓練習得セッションを行った際に避難台の あった区画(ゴール区画)内に入ってから、実� ��には撤去されている避難台を探して区画内� ��留まっていた時間を測定した結果を示して� ��る。

 表1からも分かるように、NonTgマウスは、� ��ール区画内で約43秒に亘って避難台を探し� �けたのに比して、Tg controlマウスでは、ゴー ル区画内で留まる時間が約27秒と短くなった� ��このことは、Tg controlマウスの学習能力が� �下していることを示唆している。

 一方、抗ホモシステイン酸抗体を接種し� ��マウス(TgExマウス)では、2倍希釈した標準液 を接種したマウスで約41秒、100倍希釈した標� ��液を接種したマウスで約45秒と、Tg controlマ ウスに比して長時間ゴール区画内で留まって おり、マウスの学習能力が改善していること が示された。

 表2は、マウスが遊泳中にゴール区画の分割 線を横断した回数を測定した結果を示してい る。

 表2からも分かるように、NonTgマウスは、� ��ール区画の線を横断した回数は6回であった のに対し、Tg controlマウスでは、横断した回� ��が3回と低くかった。このことは、Tg control� ��ウスの学習能力が低下していることを示唆� ��ている。

 一方、抗ホモシステイン酸抗体を接種し� ��マウス(TgExマウス)では、2倍希釈した標準液 を接種したマウスで4回、100倍希釈した標準� �を接種したマウスで6回と、Tg controlマウス� �比して長時間ゴール区画内で留まっており� �マウスの学習能力が改善していることが示� �れた。

 なお、抗ホモシステイン酸抗体を接種し� ��マウス(TgExマウス)の中でも、2倍希釈した標 準液を接種したマウスよりも、100倍希釈した 標準液を接種したマウスの方が、高い学習能 力改善効果が生起されているが、この現象は 、異種抗体によるアレルギー反応が原因のひ とつである可能性が考えられる。

〔5.水迷路試験(短期記憶)〕
 次に、本実施形態に係る医薬品の記憶力改� ��効果の確認を行うべく、モリスの水迷路(Mor ris water maze)を用いて試験を行った。具体的� ��は、スタート区画の水面にマウスを放った� ��点から、前述の訓練習得セッションを行っ� ��際に避難台のあった区画(ゴール区画)内に� �達するまでに要した時間を測定することで� �験を行った。

 なお、本試験では、訓練習得セッション� ��行った後、1.5時間マウスをケージ内で自由� ��状態におき、その後、プローブドトライア� ��を行うことで、避難台の位置をどの程度記� ��しているか検証を行った。プローブドトラ� ��アルは1匹のマウスあたり3回行い、各プロ� �ブドトライアルの間は1.5時間ケージ内に収� �して自由時間とした。

 試験に使用したマウスは、以下の5種20匹の� ��ウスである。
(1)NonTgマウス(3ヶ月齢) 4匹
(2)Tg controlマウス(3ヶ月齢) 4匹
(3)TgEx(2倍希釈)マウス(3ヶ月齢) 4匹
(4)TgEx(10倍希釈)マウス(3ヶ月齢) 4匹
(5)TgEx(100倍希釈)マウス(3ヶ月齢) 4匹

 ここで、(3)~(5)の希釈倍数は、前述の〔2.� ��薬品について〕にて示した抗ホモシステイ� ��酸抗体標準液の希釈倍数であり、抗ホモシ� ��テイン酸抗体のマウスへの投与量は、TgEx(2� ��希釈)マウス>TgEx(10倍希釈)マウス>TgEx(100 倍希釈)マウスとしている。なお、各マウス� �〔脳切片の検鏡〕の項で述べた方法により� �め飼育されたものである。

 上記マウスについて短期記憶力について� ��験した結果を表3に示す。なお、この結果は 各群における4匹の平均値を示している。

 表3は、訓練練習セッションにて、スタート 区画の水面にマウスを放った時点から、前述 の訓練練習セッションを行った際に避難台の あった区画(ゴール区画)内に到達するまでに� ��した時間を100%とし、プローブドトライアル を繰り返すうちに記憶が裏付けされてどの程 度時間短縮がなされるかを示したグラフであ る。なお、表3において、訓練練習セッショ� �時よりも時間を要した場合(100%を越えた場合 )は、全て100%として示している。また、説明� ��便宜上、表3において2匹いるTg controlマウス はそれぞれTg control(A)、Tg control(B)と示すこ� �とする。

 表3からも分かるように、NonTgマウスは、� ��練練習セッションに要した時間(100%)に対し� ��、1回目のプローブドトライアルで38%、2回� �のプローブドトライアルで16%、3回目のプロ� ��ブドトライアルで13%と、時間が顕著に短縮� ��れる傾向にあった。

 一方、Tg controlマウスでは、例えば、Tg c ontrol(A)マウスによれば、訓練練習セッション に要した時間(100%)に対して、1回目および2回� ��のプローブドトライアルで100%、3回目のプ� �ーブドトライアルで46%と、NonTgマウスに比べ て時間の短縮が非常に鈍化しているのが分か る。

 また、Tg control(B)マウスにいたっては、� �練練習セッションに要した時間(100%)に対し� �、3回全てのプローブドトライアルで100%と、 時間の短縮傾向が認められなかった。

 これらのことから、Tg controlマウスは、No nTgマウスに比して、短期記憶能力が低下して いることが分かる。

 ここで、抗ホモシステイン酸抗体を接種� ��たマウス群(TgExマウス群)に目を転じると、2 倍希釈した標準液を接種したマウスでは、訓 練練習セッションに要した時間(100%)に対して 、1回目のプローブドトライアルで89%、2回目� ��プローブドトライアルで62%、3回目のプロー ブドトライアルで59%と、時間が顕著に短縮さ れる傾向にあった。

 また、10倍希釈した標準液を接種したマ� �スも同様に、訓練練習セッションに要した� �間(100%)に対して、1回目のプローブドトライ� ��ルで91%、2回目のプローブドトライアルで76% 、3回目のプローブドトライアルで45%と、時� �が顕著に短縮される傾向にあった。

 また、100倍希釈した標準液を接種したマ� ��スも同様に、訓練練習セッションに要した� ��間(100%)に対して、1回目のプローブドトライ アルで56%、2回目のプローブドトライアルで29 %、3回目のプローブドトライアルで34%と、時� ��が顕著に短縮される傾向にあった。

 なお、抗ホモシステイン酸抗体を接種し� ��マウス(TgExマウス)の中でも、2倍希釈した標 準液を接種したマウスよりも、10倍希釈した� ��準液を接種したマウスの方が記憶力改善効� ��が高く、さらに、100倍希釈した標準液を接� ��したマウスの方がより高い記憶力改善効果� ��生起されているが、これらの現象について� ��、前述のように、異種抗体によるアレルギ� ��反応が原因のひとつである可能性が考えら� ��る。

 本試験の結果から、本実施形態に係る医� ��品は、ホモシステイン酸がNMDA受容体に結合 するのを阻害すると共に、細胞内のホモシス テイン酸濃度の上昇を抑制し、比較的短期間 における記憶力の改善が可能であることが示 された。

〔6.水迷路試験(長期記憶)〕
 次に、本実施形態に係る医薬品の比較的長� ��間における記憶力改善効果の確認を行うべ� ��、モリスの水迷路(Morris water maze)を用いて� ��験を行った。具体的には、前述の水迷路試� ��(短期記憶)と同様に、スタート区画の水面� �マウスを放った時点から、前述の訓練練習� �ッションを行った際に避難台のあった区画(� ��ール区画)内に到達するまでに要した時間を 測定することで試験を行った。

 なお、本試験では、訓練練習セッション� ��行った後、24時間マウスをケージ内で自由� �状態におき、その後、プローブドトライア� �を行うことで、避難台の位置をどの程度記� �しているか検証を行った。プローブドトラ� �アルは1匹のマウスあたり2回行い、各プロー ブドトライアルの間は24時間ケージ内に収容� ��て自由時間とした。

 試験に使用したマウスは、以下の3種12匹の� ��ウスである。
(1)NonTgマウス(3ヶ月齢) 4匹
(2)Tg controlマウス(3ヶ月齢) 4匹
(3)TgExマウス(3ヶ月齢) 4匹

 ここで、各マウスは〔脳切片の検鏡〕の� ��で述べた方法により予め飼育されたもので� ��る。上記マウスについて長期記憶力につい� ��試験した結果を表4に示す。なお、結果は、 各群の4匹の平均値を示している。

 表4は、訓練練習セッションにて、スタート 区画の水面にマウスを放った時点から、前述 の訓練練習セッションを行った際に避難台の あった区画(ゴール区画)内に到達するまでに� ��した時間を100%とし、プローブドトライアル を繰り返すうちに記憶が裏付けされてどの程 度時間短縮がなされるかを示したグラフであ る。なお、表4において、訓練練習セッショ� �時よりも時間を要した場合(100%を越えた場合 )は、全て100%として示している。

 表4からも分かるように、NonTgマウスは、� ��練練習セッションに要した時間(100%)に対し� ��、1回目のプローブドトライアルで90%、2回� �のプローブドトライアルで50%と、時間が顕� �に短縮される傾向にあった。

 一方、Tg controlマウスでは、訓練練習セ� �ションに要した時間(100%)に対して、1回目の� ��ローブドトライアルで100%、2回目のプロー� �ドトライアルで70%と、NonTgマウスに比べて時 間の短縮が非常に鈍化しているのが分かる。

 これらのことから、Tg controlマウスは、No nTgマウスに比して、長期記憶能力が低下して いることが分かる。

 ここで、抗ホモシステイン酸抗体を接種� ��たマウス(TgExマウス)に目を転じると、訓練� ��習セッションに要した時間(100%)に対して、1 回目のプローブドトライアルで80%、2回目の� �ローブドトライアルで25%と、時間が顕著に� �縮される傾向にあった。

 本試験の結果から、本実施形態に係る医� ��品は、ホモシステイン酸がNMDA受容体に結合 するのを阻害すると共に、細胞内のホモシス テイン酸濃度の上昇を抑制し、比較的長期間 における記憶力の改善が可能であることが示 された。

〔7.血中ストレス指標物質量測定〕
 次に、本実施形態に係る医薬品を投与したh emizygousマウス(Tg Exマウス)の血中ストレス指� ��物質量について、NonTgマウスと、本実施形� �に係る医薬品を投与しないhemizygousマウス(Tg� �control)との比較を行った。

 ここでいうストレス指標物質とは、アド� ��ナリン、ノルアドレナリン、ドーパミンの� ��とをいい、ベータアドレナジック受容体の� ��性化によるストレスが増加するにつれ、血� ��濃度が高くなることが知られている物質で� ��る。

 これらストレス指標物質の測定について� ��体的に説明すると、1匹のNonTgマウス(3ヶ月� �)と、2匹のhemizygous(3ヶ月齢)マウスとの3匹の� ��ウスをそれぞれ1匹ずつ別々のケージに入れ 、ビタミンB6欠乏食を自由に施餌し、3週間に 亘って飼育した。

 また、2匹のhemizygousマウスのうち、1匹に� ��本実施形態に係る医薬品を投与せずTg contro lマウスとし、もう1匹には本実施形態に係る� ��薬品を投与してTg Exマウスとした。

 Tg Exマウスへ投与した医薬品は、100倍希� ��した抗ホモシステイン酸抗体標準液であり� ��脳室へシリンジ針を穿刺して20μL注入する� �とにより投与した。また、この医薬品の投� �は、3日毎に行った。

 次に、このように飼育した各マウスから� ��血を行った。各マウスの採血は、眼底採血� ��により行われた。すなわち、マウスを少量� ��ジエチルエーテルで麻酔し、EMマイスター� �マトクリット毛細管を用いて眼下静脈より� �血を行った。その後、採取した血液を4℃に� ��2000rpmで、20分間遠心分離し、上清である血� ��を回収した。

 そして、同血清を高速液体クロマトグラ� ��ィー(HPLC)にて分析し、血清中に含まれるア� ��レナリン、ノルアドレナリン、ドーパミン� ��の定量を行った。

 表5は、各マウスの血清中におけるアドレナ リン量を示している。表5にも示すように、� �変された原因遺伝子を持たないNonTgマウスで は1mlあたり約15000pgのアドレナリンが検出さ� �たが、改変された遺伝子を有し、かつ、本� �施形態に係る医薬品を投与していないTg cont rolマウスでは、更に多い約22500pgのアドレナ� �ンが検出された。

 これらに比して、改変された遺伝子を有� ��、かつ、本実施形態に係る医薬品を投与し� ��Tg Exマウスでは、血中アドレナリン量が1ml� ��たり約5000pgと非常に低い値であった。

 次に、各マウスの血清中におけるノルア� ��レナリン量を表6に示す。

 表6にも示すように、改変された原因遺伝子 を持たないNonTgマウスでは1mlあたり約7800pgの� ��ルアドレナリンが検出されたが、改変され� ��遺伝子を有し、かつ、本実施形態に係る医� ��品を投与していないTg controlマウスでは、� �に多い約12500pgのノルアドレナリンが検出さ� ��た。

 これらに比して、改変された遺伝子を有� ��、かつ、本実施形態に係る医薬品を投与し� ��Tg Exマウスでは、血中ノルアドレナリン量� ��1mlあたり約6000pgと非常に低い値であった。

 次に、各マウスの血清中におけるドーパ� ��ン量を表7に示す。

 表7にも示すように、改変された原因遺伝子 を持たないNonTgマウスでは1mlあたり約750pgの� �ーパミンが検出された。また、改変された� �伝子を有し、かつ、本実施形態に係る医薬� �を投与していないTg controlマウスでも、NonTg� ��ウスとほぼ同等の約700pgのドーパミンが検� �された。

 これらに比して、改変された遺伝子を有� ��、かつ、本実施形態に係る医薬品を投与し� ��Tg Exマウスでは、血中ドーパミン量が1mlあ� ��り約320pgとNonTgマウスおよびTg controlマウス� ��りも顕著に低い値であった。

 これらの血中ストレス指標物質の定量結� ��を踏まえると、本実施形態に係る医薬品がT g Exマウスの体内でホモシステイン酸を抗体� ��より不活性化させてストレス反応を抑制し� ��ため血中ストレス指標物質が減少している� ��とが分かる。

 それゆえ、本実施形態に係る医薬品は、� ��臓病やストレス症候群、不安症候群を改善� ��たり、治療できることが示唆された。また� ��本実施形態に係る医薬品を予め投与してお� ��ことにより、ホモシステイン酸を不活性化� ��ることとなるため、心臓病やストレス症候� ��、不安症候群が発症するのを予防できるこ� ��が示唆された。

〔(8)記憶力回復試験〕
 次に、本実施形態に係る医薬品の記憶力回� ��の確認を行うべく、モリスの水迷路(Morris w ater maze)を用いて試験を行った結果について� ��明する。

 試験に使用したマウスは、以下の3種12匹の� ��ウスである。
(1)Tg controlマウス(3ヶ月齢) 5匹
(2)TgEx(脳室内投与)マウス(3ヶ月齢) 5匹
(3)TgEx(腹腔内投与)マウス(3ヶ月齢) 2匹

 ここで、(2)及び(3)のマウスに投与した本� ��施形態に係る医薬品は、前述の〔(2)医薬品� ��ついて〕にて示した抗ホモシステイン酸抗� ��標準液をそれぞれ5μLづつ使用した。なお、 各マウスは〔(3)脳切片の検鏡〕の項で述べた 方法により予め飼育されたものである。

 試験は、スタート区画の水面にマウスを� ��った時点から、前述の訓練練習セッション� ��行った際に避難台のあった区画(ゴール区画 )内に到達するまでに要した時間を測定する� �ととした。

 なお、本試験では、訓練練習セッション� ��行った後、マウスをケージ内で自由な状態� ��おき、その後、1日1回のプローブドトライ� �ルを行うことで、避難台の位置に関する記� �がどの程度回復するか検証を行った。プロ� �ブドトライアルは1匹のマウスあたり3回(3日� ��)行い、各プローブドトライアルの間はケー ジ内に収容して自由時間とした。また、(2)及 び(3)のマウスには、所定の投与方法により本 実施形態に係る医薬品5μLを毎日投与した。� �れらのマウスの記憶力回復について試験し� �結果を表8に示す。なお、この数値はそれぞ� ��の群の平均値を示す。

 ここで表8は、横軸を日数とし、縦軸は避難 台のあった区画(ゴール区画)内に到達するま� ��に要した時間を示している。また、表8にお いて、(1)Tg controlマウスは三角マーカを有す� ��実線で示し、(2)TgEx(脳室内投与)マウスは四� ��マーカを有する実線で示し、(3)TgEx(腹腔内� �与)マウスはひし形マーカを有する実線で示� ��ている。なお、表中に示す*印は、t検定に� �り群間の有意差が認められたことを示して� �る。

 表8からも分かるように、Tg controlマウス� ��、1回目のプローブドトライアルで58秒を要� ��、2回目のプローブドトライアルで48秒、3回 目のプローブドトライアルで29秒と、時間が� ��々に短縮される傾向にあった。

 一方、(2)及び(3)のTgExマウス群に着目する と、表8中において四角のマーカにて示すよ� �に、TgEx(脳室内投与)マウスは、1回目のプロ� ��ブドトライアルで13秒を要し、2回目のプロ� ��ブドトライアルで8秒、3回目のプローブド� �ライアルで5秒と、Tg controlマウスに比して1� ��目のプローブドトライアルから顕著に時間� ��短縮される現象が確認された。

 特に、1回目及び2回目のプローブドトラ� �アルでは、Tg controlマウスとの間に有意差(p& lt;0.01)が認められた。

 また、TgEx(腹腔内投与)マウスについても� ��1回目のプローブドトライアルで29秒を要し� ��2回目のプローブドトライアルで28秒、3回目 のプローブドトライアルで16秒と、Tg control� �ウスに比して1回目のプローブドトライアル� ��ら顕著に時間が短縮される現象が確認され� ��。

 そして、上述の試験に供したTg controlマ� �ス及びTgEx(脳室内投与)マウスについて、海� �を摘出し、超薄切片を調製してヘマトキシ� �ン・エオジン染色したものを検鏡した。そ� �結果を図1に示す。

 図1(a)は、Tg controlマウスの海馬の検鏡写� ��であり、図(b)は、TgEx(脳室内投与)マウスの� ��馬の検鏡写真である。図1(a)からもわかるよ うに、ビタミンB6欠乏食を与えられてアルツ� ��イマーを発症したTg controlマウスの海馬で� �、全体的に萎縮が見られるとともに、CA1の� �経細胞が密に集合した部位(図1中の丸で囲ん だ箇所の帯状に見える部位)の一部の染色度� �いが薄くなっていることがわかる。

 一方、TgEx(脳室内投与)マウスの海馬では� ��図1(b)からもわかるように、Tg controlマウス� ��比して萎縮は認められず、また、CA1の神経� ��胞が密に集合した部位の染色度合いも良好� ��あることから、多くの神経細胞が機能して� ��ることがわかる。

 ここで、Tg controlマウス及びTgEx(脳室内投 与)マウスの海馬の大きさを測定した結果を� �9に示す。

 表9は、Tg controlマウス及びTgEx(脳室内投与)� ��ウスの海馬の大きさを、同一個体の脳につ� ��て複数回(Tg controlマウスは5回、TgEx(脳室内� ��与)マウスは4回)超薄切片を調整し、測定し� ��結果を示している。

 表9からもわかるように、Tg controlマウス� ��海馬の直径の平均は、8.6±0.5mmであったのに 対し、TgEx(脳室内投与)マウスでは、9.9±0.4mm� �大きさを維持していることがわかった。

 また、TgEx(脳室内投与)マウスの海馬は、T g controlマウスの海馬に比して直径が有意に(p <0.01)大きいことが認められた。

 これらのことから、本実施形態に係る医� ��品を脳室内や腹腔内に投与することにより� ��記憶力を効果的に回復させることが可能で� ��ることが示された。

 しかも、特に着目すべき点として、(3)TgEx (腹腔内投与)マウスのように、本実施形態に� ��る医薬品の投与が腹腔内投与であっても、� ��著な記憶力の回復効果が見られた点が挙げ� ��れる。

 一般に、血液と脳(そして脊髄を含む中枢 神経系)の組織液との間には、物質交換を制� �する血液脳関門という機構が存在すること� �知られている。

 しかしながら、本実施形態に係る医薬品� ��、詳細な作用機序は未だ不明なものの、腹� ��内への投与でありながら、顕著な記憶力回� ��効果を生起させることができる。

 このことは、頭部や脳を侵襲することな� ��、医薬品の投与が可能であることを示唆す� ��結果であり、患者が受ける負担を飛躍的に� ��減させることができるものと考えられる。

 なお、本試験において各マウスには、ホ� ��システイン酸抗体を医薬品として投与した� ��、ホモシステイン酸と所定の物質とを結合� ��せてワクチンを投与して、生体内でホモシ� ��テイン酸抗体を誘導するようにしてもよい� ��

 すなわち、ホモシステイン酸と所定の担� ��とを結合させてワクチンを調製し、このワ� ��チンを医薬品としてヒトやマウスなどの生� ��に投与することで、同生体内にホモシステ� ��ン酸抗体を誘導して、ホモシステイン酸がN MDA受容体に結合するのを阻害すると共に、細 胞内のホモシステイン酸濃度の上昇を抑制し 、しかも、神経変性疾患や、心臓病、ストレ ス症候群、不安症候群、骨粗鬆症の予防や改 善、治療を行うようにしてもよい。

 さらに、このワクチンの調製に用いるホモ� ��ステイン酸に替えて、例えば、ホモシステ� ��ン酸の誘導体を用いることとしても良い。� ��なわち、以下の説明において、ワクチンの� ��製に用いるホモシステイン酸や、ワクチン� ��構成するホモシステイン酸は、分子式:C ₄ H ₉ NO ₅ Sで示されるホモシステイン酸の他、例えば� �ホモシステイン酸ナトリウム等薬学的に許� �しうる範囲のホモシステイン酸塩及びホモ� �ステイン酸の誘導体を含む概念である。

 以下、所定の担体にホモシステイン酸又� ��ホモシステイン酸を結合した複合体を含有� ��る医薬品に係る具体的な一実施形態につい� ��述べる。本実施形態では、所定の担体とし� ��前述のKLH(スカシ貝ヘモシアニン:keyhole limpe t hemocyanin)を用い、ホモシステイン酸を結合� ��せて複合体を形成し、この複合体を医薬品( ワクチン)としてマウスに投与することとし� �。

 〔(9)医薬品(ワクチン)の合成〕
 本実施形態に係るワクチンは、図2に示す方 法により合成を行った。まず、L-ホモシステ� ��ン酸(L-Homocysteic acid) 0.27mmolに過剰量のグル タルアルデヒド(Glutaraldehyde)2.7mmolを反応させ� ��図2(a)に示すように、ホモシステイン酸のア ミノ基をグルタルアルデヒドで修飾した(HCA-G A)。

 次いで、得られたHCA-GAの過剰量をKLH上に� ��数存在するアミノ基と反応させて、図2(b)に 示すように、中間体を合成した。

 そして、この中間体を還元した後、ゲル� ��過により低分子を除き、図2(c)に示すように 、KLHとホモシステイン酸の複合体(HCA-G-KLH)を� ��た。

 次に、生理食塩水(0.9%塩化ナトリウム溶� �)0.1 mLあたり、抗原(HCA-G-KLH)約100μgを含む溶� ��に等量のフロインドの完全アジュバント(Fre und' complete adjuvant:FCA)を添加し十分に乳化さ� ��この乳化液を本実施形態に係る医薬品(ワク チン)とした。

〔(10)投与試験1〕
 次に、このワクチンの効果を検証すべく、� ��ウスに投与して確認試験を行った。試験は� ��合成したワクチンを投与する試験群と、ワ� ��チン非投与対照群と、記憶障害を発現して� ��ない正常群との3群を設定し、これらのマウ スを水迷路試験に供することで行った。また 、試験は、1日1回5日間連続で行った。なお、 いずれのマウスも、ビタミンB6欠乏食を自由� ��施餌して飼育したマウスである。
  試験群:(TgEx)5ヵ月齢マウス(2匹) HCA-G-KLHワ� ��チン投与
  対照群:(Tg-control)5ヵ月齢マウス(2匹)
  正常群:(3x-Tg)3ヵ月齢マウス(2匹)

 なお、試験群へのワクチン投与は、一匹� ��たり約0.2 mL(100μg)を腹腔内に投与した。な� ��、投与する部位は、背部皮下数ヶ所にわけ� ��投与しても良い。

 また、試験群へのワクチン投与は、生後4 ヵ月齢の時点で行い、その後、4.5ヵ月齢でブ ースター投与を行っている。

 試験群にてブースター投与した薬剤は、� ��ロインドの不完全アジュバント(Freund's incom plete adjuvant:FIA)を用いてHCA-G-KLHの量を半分の� ��50 μg / 匹で同様に調製したものである。� ��のようにして得られた3群のマウスを水迷路 試験に供した結果を表10に示す。

 表10は、各群のマウスがゴール到達まで� �要する時間の経時変化を示したグラフであ� �、縦軸はゴール到達までに要した時間(各群2 匹の平均値)、横軸は日数である。

 試験群は四角のマーカで示す折れ線グラ� ��、対照群は菱形のマーカで示す折れ線グラ� ��、正常群は三角のマーカで示す折れ線グラ� ��としている。なお、1日目については、全て の群において、ゴール到達までに60秒以上を� ��したが、便宜上60秒を要したものとし、2日� ��以降については、実測値を示している。ま� ��、×印のマーカで示す折れ線グラフは、正� �群の折れ線グラフを一日分平行移動させた� �ラフであり、試験群との比較を行うための� �考用折れ線グラフである。

 表10を見ると分かるように、試験群と対� �群とを比較すると、対照群は、試験開始の1� ��目から5日目に至るまで、ゴール到達に要す る時間は約50~60秒とほぼ横這いで推移してい� ��が、試験群は、試験1日目及び2日目では対� �群に対して顕著な差は見られなかったもの� �、3日目より徐々に差が現れ、4日目及び5日� �では到達時間の顕著な低下が認められた。

 このことは、対照群が5日間に亘って試験 を行ってもゴールの位置を覚えられなかった のに対し、試験群は、日数を経る毎にゴール の位置をより明確に覚え効率的にゴールへ向 かえたことを示している。

 また、試験群の2日目から5日目までのグ� �フの傾きについて、正常群とのグラフの傾� �と比較すると、四角のマーカのグラフと×印 のマーカのグラフとを参照すれば分かるよう に、ほぼ同様の挙動を示している。

 すなわち、試験群と正常群とを比較する� ��、1日のずれがあるものの、ほぼ同じ傾きで 、到達時間の短縮がみられた。

 これは、正常マウスとほぼ同等の記憶能� ��が損傷するのを防いだワクチンによる予防� ��果であると言える。

 なお、本投与試験1にて試験群及び対照群 として用いたマウスは、ビタミンB6欠乏食を� ��餌しながら飼育することで、約5ヵ月齢で記 憶障害を発症するマウスである。

 すなわち、本投与試験結果1によれば、記 憶障害の発症初期段階において、本実施形態 に係る医薬品(ワクチン)を投与することによ� ��、記憶障害を効果的に予防可能であること� ��分かる。

〔(11)投与試験2〕
 つぎに、十分に記憶障害を発症しているマ� ��スに対し本実施形態にかかる医薬品(ワクチ ン)を投与した場合における記憶力改善効果� �ついて検証を行った。

 本投与試験2では、記憶障害を発病した6� �月齢のマウス(2匹)に対し、5日間の水迷路試� ��を行い、同一個体が6.5ヵ月齢の時点で本実� ��形態に係る医薬品(ワクチン)を投与し、7ヵ� ��齢の時点でブースター投与し、7.5ヵ月齢と� ��った時点で再度4日間の水迷路試験を行った 。なお、いずれのマウスも、ビタミンB6欠乏� ��を自由に施餌して飼育したマウスである。� ��投与試験2の結果を表11に示す。

 表11は、マウスがゴール到達までに要す� �時間の経時変化を示したグラフであり、縦� �はゴール到達までに要した時間(各群2匹の平 均値)、横軸は日数である。

 三角形のマーカで示す折れ線グラフはワ� ��チン投与前の到達時間の経時変化を示した� ��ラフ、四角のマーカで示す折れ線グラフは� ��ワクチン投与後の到達時間の経時変化を示� ��たグラフである。なお、1日目については、 ワクチン投与後(四角のマーカ)以外の群にお� ��て、ゴール到達までに60秒以上を要したが� �便宜上60秒を要したものとし、2日目以降に� �いては、実測値を示している。また、菱形� �マーカで示す折れ線グラフは、3ヵ月齢の記� ��障害を発症していないマウスによる到達時� ��の経時変化を示した折れ線グラフである。

 表11の三角形マーカーのグラフで示すよ� �に、ワクチン投与前の6ヵ月齢時点でのマウ� ��は、試験1日目から5日目に至るまで、いず� �もゴールに到達するまでに50~60秒の時間を要 していた。

 その後、同マウスに対しワクチンを接種� ��ることにより、四角形マーカのグラフで示� ��ように、ワクチン投与前の状態に比して、� ��験1日目ではゴール到達までの時間に顕著な 差異は見られなかったものの、2~4日目には大 幅な低下傾向が確認された。

 また、菱形のマーカのグラフで示す正常� ��と比較すると、やや傾きが緩いものの、か� ��り似た低下傾向を示すことが分かる。

 すなわち、本投与試験2の結果から、実施 形態に係る医薬品(ワクチン)は、記憶障害が� ��症した状態であっても、記憶改善効果を生� ��することができる。

〔(12)投与試験3〕
 つぎに、ビタミンB6を補完した通常食にて� �育し記憶障害を発症させたマウスに対し、� �施形態にかかる医薬品(ワクチン)を投与した 場合における記憶力改善効果について検証を 行った。

 前述までの試験は、記憶障害を顕著に発� ��させるべくビタミンB6欠乏食を施餌して飼� �したマウスを被験動物として使用したが、� �タミンB6欠乏という特殊条件下での試験であ ったとも考えられるため、今回は、マウスを 通常食にて飼育し、自然発生的に記憶障害を 発症した例について試験を行うこととした。

 本投与試験3では、通常食にて飼育した6ヵ� �齢のオスのマウス5匹を被験動物として使用� ��た。
  試験群:(TgEx)6ヵ月齢マウス(2匹) HCA-G-KLHワ� ��チン投与
  対照群:(TgEx)6ヵ月齢マウス(3匹) KLH投与
 上記試験群の2匹のマウスは、5ヵ月齢の時� �で本実施形態に係る医薬品(ワクチン)を投与 し、5.5ヵ月齢の時点でブースター投与してい る。また、対照群の3匹のマウスについては� �HCA-G-KLH の代わりにKLHをアジュバント(初回FC A、2回目以降FIA)に加え乳化させたものを医薬 品(ワクチン)と同様の方法で投与した。これ� ��試験群2匹及び対照群3匹のマウスに対して� �5日間の水迷路試験を行った。本投与試験3の 結果を表12に示す。

 表12は、マウスがゴール到達までに要す� �時間の経時変化を示したグラフであり、縦� �はゴール到達までに要した時間(各群の平均� ��)、横軸は日数である。

 四角形のマーカで示す折れ線グラフは対� ��群の到達時間の経時変化を示したグラフ、� ��角形のマーカで示す折れ線グラフは、ワク� ��ンを投与した試験群の到達時間の経時変化� ��示したグラフである。なお、1日目について は、ワクチン投与後(四角のマーカ)以外の群� ��おいて、ゴール到達までに60秒以上を要し� �が、便宜上60秒を要したものとし、2日目以� �については、実測値を示している。

 表12の四角形マーカーのグラフで示すよ� �に、ワクチン投与前の6ヵ月齢時点でのマウ� ��は、試験1日目から5日目に至るまで、いず� �もゴールに到達するまでに50~60秒の時間を要 していた。

 一方、ワクチンを接種した試験群のマウ� ��は、三角形マーカのグラフで示すように、� ��照群に比して、試験1日目ではゴール到達ま での時間に顕著な差異は見られなかったもの の、2~4日目には大幅な低下傾向(28秒→39秒→3 2秒→28秒)が確認された。

 このように、本投与試験3の結果を踏まえ ると、本実施形態に係る医薬品(ワクチン)は� ��ビタミンB6欠乏によるものではなく、自然� �症的に惹起された記憶障害に対しても、記� �改善効果を生起可能であることが示唆され� �と言える。

〔(13)血清中の抗体量の確認試験〕
 次に、本実施形態に係る医薬品(ワクチン)� �投与したマウスと、投与していないマウス� �の血清中における免疫グロブリンG(IgG)及び� �疫グロブリンM(IgM)の量の比較を行った。試� �は、投与群4個体と、非投与群4個体との計8� �体で行った。本試験の結果を表13に示す。

 表13のグラフは、投与群における血清中� �IgM及びIgGの量と、非投与群における血清中� �IgM及びIgGの量とを比較したグラフである。� �お、値は平均±標準偏差を示している。

 表13に示すように、ワクチンを投与して� �ないマウスの血清中のIgG量は、400±115μg/mlで あったのに対し、ワクチンを投与したマウス の血清中のIgG量は、1575±196μg/mlと高い値を示 していた。

 また、ワクチンを投与していないマウス� ��血清中のIgM量は、130±90μg/mlであり、ワクチ ンを投与したマウスの血清中のIgM量は、688±1 48μg/mlと高値であった。

 これらのデータを踏まえると、マウスに� ��リクローナルの抗ホモシステイン酸抗体を� ��与したときの結果と、ワクチン投与による� ��憶改善効果とは、全く一致するため、ワク� ��ンによって、抗ホモシステイン酸抗体が作� ��れたことが推定できる。

 すなわち、ワクチン投与により免疫グロ� ��リン量が増加していることからも、抗ホモ� ��ステイン酸抗体がが産生されていることが� ��く示唆される。

 この結果から、本実施形態に係る医薬品( ワクチン)は、血中の抗ホモシステイン酸抗� �を誘導することが示唆された。

 このように、本実施形態に係る所定の担� ��にホモシステイン酸を結合した複合体を含� ��する医薬品によれば、抗ホモシステイン酸� ��体を誘導することができ、ホモシステイン� ��がNMDA受容体に結合するのを阻害すると共に 、細胞内のホモシステイン酸濃度の上昇を抑 制して、神経変性疾患の予防や改善、治療が 可能であることが示された。

 また、同様の作用機序から、心臓病、ス� ��レス症候群、不安症候群、骨粗鬆症の予防� ��改善、治療も可能であるものと考えられた� ��

 なお、本実施形態では、アジュバントを� ��ロインドの完全アジュバントやフロインド� ��不完全アジュバントを用いることとしたが� ��これに限定されるものではなく、例えば、T iterMax(登録商標)、 Gold Adjuvant(シグマ社)、Imj ect(登録商標)アルミニウムアジュバント(Alum(� ��アス社)など)やムラミルジペプチドなどを� �いるようにしても良い。

 ここまで説明してきたように、本実施形� ��に係る医薬品によれば、抗ホモシステイン� ��抗体またはその抗原結合フラグメントを有� ��成分として含有することとしたため、抗ホ� ��システイン酸抗体やその抗原結合フラグメ� ��トがホモシステイン酸に結合し、ホモシス� ��イン酸がNMDA受容体に結合するのを阻害する ことができる。

 また、免疫系にてホモシステイン酸が貪� ��されるのを促し、細胞内のホモシステイン� ��濃度を低下させることができて、細胞内に� ��剰量のホモシステイン酸が生成されたこと� ��由来する神経変性疾患や、心臓病、ストレ� ��症候群、不安症候群、骨粗鬆症の予防や改� ��、治療が可能な医薬品を提供することがで� ��る。

 すなわち、前述の試験結果を再度振り返� ��ながら、これらの効果についてまとめると� ��アルツハイマー病のモデルマウス3xTg-AD由来 のhemizygousマウスにビタミンB6欠乏食を与え、 人為的に欠乏症を誘発すると、まずhemizygous� �ウスは行動学的な不安症状を発現し、扁桃� �、海馬、皮質の神経細胞内にベータアミロ� �ドを蓄積し神経機能が病理変化を示すこと� �なる。

 また、それに呼応して著しいストレスホ� ��モンの増加が観察される(表5~表7のTg control� ��参照。)。また、同じく記憶障害が観察され た(表1~表4のTg controlを参照。)。いずれも、No nTgに比して、記憶に伴う標的に到達する時間 が短縮しない点が特徴的である。特に表1に� �けるTg controlマウスでは、学習に伴う、区画 内に留まる時間が短く、表2におけるTg control マウスでは、区画を横切る回数も最も少ない 。

 それに対して抗ホモシステイン酸抗体を� ��与したマウス(TgExマウス)は、Tg controlマウ� �に比して、ストレスホルモンが減少し(表5~� �7のTgExを参照。)、記憶に伴う標的に到達す� �時間が短縮した。また、表1におけるTgExマウ スでは、学習に伴う、区画内に留まる時間が 長く、表2におけるTgExマウスでは、区画を横� ��る回数もTg controlマウスに比して増加して� �る。

 即ち、これらのデータは、抗ホモシステ� ��ン酸抗体により、不溶性のAβ1-42の神経細胞 内蓄積を効果的に抑制した結果に基づくもの であると言える。このことは、抗体の基質特 異性に鑑みれば、Aβ1-42の神経細胞内蓄積は� �ホモシステイン酸の増加が大きな原因のひ� �つであると推定される。

 それゆえ、TgExマウスでは、記憶障害や不 安症状が消失し、ストレスホルモンが増加せ ず、記憶がよく、学習能力も良い結果を出し た。

 これらの結果から、本実施形態に係る医� ��品により、発病因子であるホモシステイン� ��が細胞内で増加するのを効果的に抑制する� ��め、ホモシステイン酸の濃度上昇に伴う疾� ��の発現が顕著に抑制された。

 最後に、上述した各実施の形態の説明は� ��発明の一例であり、本発明は上述の実施の� ��態に限定されることはない。このため、上� ��した各実施の形態以外であっても、本発明� ��係る技術的思想を逸脱しない範囲であれば� ��設計等に応じて種々の変更が可能であるこ� ��はもちろんである。