Diese Steroide zeichnen sich dadurch aus, daß sie im Gegensatz zu systemisch wirksamen naturlichen und synthetischen Estrogenen, in- klusive 17a-Estradiol, selektive neurotrope estrogen-Ahnliche Tran- skriptionswirkung besitzen.

Diese Steroide sind Verbindungen der allgemeinen Formel I in der Ri ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder eine Alky- loxygruppe von 1 bis 5 C-Atomen darstellt, R2 ein Wasserstoffatom, ei- ne Alkylgruppe von 1 bis 5 C-Atomen, eine Acylgruppe von 1 bis 5 C- Atomen, eine Gruppierung der aligemeinen Formel S02NRIORI,, wobei R10 und Rn unabhängig voneinander jeweils ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe von 1 bis 5 C-Atomen oder zusammen mit dem Stickstoff eine Pyrrolidino-, Piperidino-oder Morpholinogruppe bedeuten, R3 ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe darstellt, R4 ein Wasser- stoffatom, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkylgruppe bis 5 C-Atomen bedeutet, Rs und R6 unabhängig voneinander jeweils ein Wasserstoffa- tom oder ein Halogenatom bedeuten, R7 für ein Wasserstoffatom oder

eine Methylgruppe steht, R8 ein Wasserstoffatom und eine Hydroxyl- gruppe, ein Oxogruppe oder eine Gruppierung der aligemeinen Formel CR12R, 3 bedeutet, in der R12 und R13 unabhängig voneinander jeweils ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom darstellen, Rg eine Methyl- oder Ethylgruppe bedeutet, Z für eine C, C-Doppelbindung oder einen substituierten oder unsubstituierten Cyclopropanring steht und die Gruppierung >CRsR6 entweder a-oder p-ständig angeordnet ist, wobei R7 ? ß-ständig ist, wenn >CRsR6 a-ständig ist und umgekehrt.

Eine abrupte oder allmähliche Abnahme der Estrogen-Konzentrationen im Organismus kann sowohl bei Frauen als auch bei Männern unter physiologischen (zunehmendes Alter, Menopause) und pathologischen Bedingungen (Gonadektomie, Einsatz von GnRH-Analoga als supple- mentäre Krebstherapie) auftreten.

Zu den bekanntesten klinischen Symptomen des Estrogen-Ausfalls ge- hören Störungen der Thermoregulation in der Form von Hitzewallun- gen, Osteoporose und erhöhte Prädisposition zu Herz-und Kreislauf- Erkrankungen (Netter A, The menopause. In : Thibault C, Levasseur MC, Hunter RHF (eds), Reproduction in Mammals and Man, Ellipses, Paris, 627-642,1993).

Neueste klinische Studien (van den Beld AW et al., The role of estro- gens in physical and psychosocial well-being in elderly men, The Aging Male 1 (Suppl. 1), 54,1998) haben eindeutige Beweise für eine Sen- kung der Serum-Estrogenspiegel mit zunehmendem Alter beim Mann erbracht. Dadurch wird das Vorhandensein und die pathophysiologi- sche Relevanz eines"Estrogen-Mangelsyndroms"beim alternden Mann unterstrichen.

Das Gehirn stellt ein sehr wichtiges Zielorgan der Estrogenwirkung dar. Estrogene haben einen entscheidenden physiologischen Einfluß auf viele neurobiologische Prozesse. Ihre Effekte lassen sich im allgemei- nen in zwei großen Gruppen-organisierende und aktivierende-klassi- fizieren (McEwen BS et al., Steroid hormones as mediators of neural plasticity, J Steroid Biochem Mol Biol 39 : 223-232,1991).

Die Ersteren betreffen hauptsächlich die geschlechtsspezifische Orga- nisation neuraler Substrate während der frühen Ontogenese.

Die zweite Gruppe umfaßt spezifische Veränderungen in der Funktion neuraler Regelkreise unter dem Einfluß von Estrogenkonzentrationen, die aus der physiologischen Sekretion der Gonaden nach der Ge- schlechtsreife resultieren. Die aktivierenden Effekte von Estrogenen im ZNS kommen u. a. bei den folgenden physiologischen Prozessen zum Ausdruck : geschlechtsspezifische Regulation der Gonadotropin-Sekretion (Fink G, Gonadotropin secretion and ist control. In : Knobil E, Neil JD (eds), The Physiology of Reproduction, Raven Press, New York, 1349-1376, 1988), Steuerung des Sexualverhaltens (Baum MJ et al., Hormonal basis of proceptivity and receptivity in female primates, Arch Sex Behav 6 : 173- 192,1977), Regulation der neuroendokrinen Reagibilität auf Streß (Viau V, Meaney MJ, Variations in the hypothalamic-pituitary-adrenal response to stress during the estrous cycle in the rat, Endocrinology 129 : 2503-2511, 1991), Lernen und Retention von Verhaltensmustern mit adaptiver Relevanz (O'Neal MF et al., Estrogen affects performance of ovariectomized rats in a two-choice water-escape working memory task, Psychoneuroen- docrinology 21 : 51-65,1996), Aufrechterhaltung der Reaktionsbereitschaft von neurochemischen Me- chanismen, die für die Gewährleistung der Vigilanz und adäquaten In- formationsverarbeitung unentbehrlich sind (Fink G et al., Estrogen control of central neurotransmission : effects on mood, mental state and memory, Cell Mol Neurobiol 16 : 325-344,1996), dynamische Veränderungen der Dichte interneuronaler Kontakte in Hirnstrukturen mit entscheidender Rolle für die kognitive Leistung und den emotionalen Status (Wooley CS, McEwen BS, Estradiol mediates fluctuations in hippocampal synapse density during the estrous cycle in the adult rat. J Neurosci 12 : 2549-2554,1992).

Das enorme neurotrope Potential von Estrogenen findet einen Aus- druck in ihrer Fähigkeit, die Expression von einer Reihe von ZNS-spezifischen Genen zu indu- zieren, deren Produkte für das Überleben von Nervenzellen von kriti- scher Bedeutung sind (Miranda RC, Sohrabji F, Toran-Allerand CD, Presumptive estrogen target neurons express mRNA for both the neu- rotrophins and neurotrophin receptors : a basis for potential develop- ment interactions of estrogen with the neurotrophins, Mol Cell Neurosci 4 : 510-525,1993), die Vielfalt und Qualität der Signalübertragung im ZNS (Luine VN Estradiol increases choline acetyltransferase activity in specific basal forebrain nuclei and projection areas of female rats, Exp Neurol 89 : 489-490,1985) ; (Weiland N, Glutamic acid decarboxylase messenger ribonucleic acid is regulated by estradiol and progesterone in the hip- pocampus, Endocrinology 131 : 2697-2702,1992) ; (Bossé R, Di Paolo T, The modulation of brain dopamine and GABAA receptors by estra- diol : a clue for CNS changes occurring at menopause, Cell Mol Neuro- biol 16 : 199-212,1996), zu gewährleisten und die Resistenz von Nervenzellen gegenüber pathologischen Einwir- kungen zu erhöhen (Goodman Y et al., Estrogens attenuate and corti- costerone exacerbates excitotoxicity, oxidative injury, and amyloid b- peptide toxicity in hippocampal neurons, J Neurochem 66 : 1836-1844, 1996).

Klinische Befunde implizierten den Estrogenmangel als kausalen Fak- tor in der Pathogenese des Morbus Alzheimer und deuten auf die Mög- lichkeit einer Estrogen-Substitution, die klinische Manifestation bzw.

Progredienz dieser Erkrankung aufzuhalten (Henderson VW et al., Estrogen replacement therapy in older women : comparisons between Alzheimer's disease cases and controls, Arch Neurol 51 : 896-900, 1994) ; (Paganini-Hill A, Henderson VW, Estrogen deficiency and risk of Alzheimer's disease, Am J Epidemiol, 140 : 256-261,1994).

Eine Reihe von Neuropeptiden, deren Gentranskription durch physiolo- gische Estrogenmengen beeinflusst wird (z. B. Oxytozin und Arginin-

Vasopressin) spielen eine wichtige Rolle bei der Steuerung emotionaler Verhaltenskomponenten (Adan RA, Burbach JP, Regulation of vaso- pressin and oxytocin gene expression by estrogen and thyroid hormo- ne, Progr Brain Res 92 : 127-136,1992).

Berichte in der Fachliteratur weisen darauf hin, daß Estrogenmangel mit einer deutlichen Abschwächung der Fähigkeit des Organismus, re- aktive Sauerstoffspezies und freie Radiale zu eliminieren, einhergeht (Niki E, Nakano M, Estrogens as antioxidants. Methods Enzymol 186 : 330-333,1990) ; (Lacort M et al., Protective effects of estrogens and catecholestrogens against peroxidative membrane damage in vitro, Li- pids 30 : 141-146,1995). Der Überschuß an freien Radikalen wird in Mechanismen der zellulären Schädigung in mehreren Organen und Sy- stemen impliziert und mit der Pathogenese von neurodegenerativen Er- krankungen im Zusammenhang gebracht (Smith CD et al., Excess brain protein oxidation and enzyme dysfunction in normal aging and in Alz- heimer's disease. Proc Natl Acad Sci USA 88 : 10540-10543,1991) ; (Hastings TG, Zigmond MJ, Neurodegenerative disease and oxidative stress : insights from an animal model of Parkinsonism. In : Fiskum G (ed), Neurodegenerative Diseases, Plenum Press, New York, 37-46, 1996). Daher wird der Estrogen-Substitution auch eine Rolle im Sinne der Aufrechterhaltung und Erhöhung der endogenen antioxidativen Ka- pazität beigemessen (Behl C et al., 17b-Estradiol protects neurons from oxidative stress-induced cell death in vitro, Biochem Biophys Res Commun 216 : 473-482,1995).

Zum gegenwärtigen Zeitpunkt erfolgt die Estrogen-Substitution mit na- türlichen und synthetischen Estrogenen, deren Wirkung in allen Estro- genrezeptor-enthaltenden Organen und Systemen auftritt, d. h. prak- tisch im gesamten Körper. Da jedoch diese Estrogene bereits in gerin- gen pharmakologischen Dosen eine starke Zellproliferation in Geweben des weiblichen Genitaltraktes (Endometrium) und dem Brustdrüsene- pithel verursachen, die schließlich in einer karzinogener Entdifferenzir rung ausarten, ist ihre Anwendung für die Therapie von Symptomen ei-

nes Estrogen-Mangels im ZNS durch mehrere Gegenindikationen be- grenzt (Bernstein BA, Ross RK, Henderson BE, Relationship of hormo- ne use to cancer risk. J Natl Cancer Inst Monograph 12 : 137-147, 1992).

Die proliferativen Effekte von Estrogenen gelten als unmittelbare Risi- kofaktoren für die Entstehung einer benignen Prostata-Hyperplasie und/oder Gynäkomastie beim Mann (Knabbe C, Endokrine Therapie von Prostataerkrankungen. In : Allolio B Schulte HM (eds), Praktische En- dokrinologie, Urban & Schwarzenberg, München, 645-651,1996).

Aus diesem Grund wurde die Estrogen-Substitution beim Mann, trotz erwiesenen Indikationen, nie ernsthaft in Erwägung gezogen.

Die Verwendung von natürlichen und synthetischen Estrogenen mit sy- stemischer Wirkung-d. h. in allen Organen und Systemen des Körpers -zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen wird durch die folgenden Patente beansprucht : US 4,897,389, US 5,554,601 und WO 95/12402, WO 97/03661, DE 43 38 314 C1.

-US 4,897,389 schützt die Anwendung von Estradiol, Estron und Estriot, allein oder in Kombination mit Gonadotropinen, Androge- nen, anabolen Androgenen oder humanem Wachstumshormon, zur Behandlung seniler Demenz, Morbus Parkinsoni, zerebraler Atrophie, Morbus Alzheimeri, zerebellarer Atrophie, senilem oder essentiellem Tremor.

-US und WO 95/12402 schützt die Anwendung von estrogenen Substanzen, darunter auch solche, die eine geringfü- gige"sexuelle Aktivität"aufweisen, zur Protektion von Nervenzel- len vor progredienter Schädigung und dem Zelltod, und zur Be- handlung neurodegenerativer Erkrankungen. Als Beispiel für eine Substanz mit geringfügiger"sexueller Aktivität"und neuroprotek- tiver Wirkung wird 17a-Estradiol angeführt.

-WO 97/03661 schützt die Anwendung von nicht-estrogenen Sub- stanzen, die in ihrer Struktur mindestens zwei Ringstrukturen auf-

weisen, wobei mindestens eine davon ein terminaler phenolischer Ring ist, und deren Molekülgewicht weniger als 1000 Dalton be trägt, zur Gewährleistung von Neuroprotektion.

-DE 43 38 314 C1 beschreibt Steroide mit phenolischer A-Ring- Struktur, deren radikalfangenden und antioxidativen Eigenschaften unabhängig vom Maß der estrogen-ähnlichen Wirksamkeit sind. Die se Verbindungen können zur Prophylaxe und Therapie radikalver- mittelter Zellschädigungen eingesetzt werden.

In all diesen Patentschriften soll die therapeutische und neuroprotekti- ve Effizienz der enthaltenen Substanzen auf einen oder mehrere der folgenden Endeffekten basieren : -Stimulation der Biosynthese von natürlichen neuronalen Wachs- tumsfaktoren ; -Stimulation der Aktivität von Acetylcholin-synthetisierenden Enzy- men bzw. der Aufnahme (Uptake) von Substraten der Acetylcho-lin- Synthese ; -direkte Zytoprotektion durch Erhöhung der Resistenz von Nerven- zel len gegenüber dem Entzug von Nährsubtraten bzw. Wachstums- fak toren ; -Verminderung der Empfindlichkeit von Nervenzellen gegenüber frei- en Radikalen und reaktiven Sauerstoff-Spezies, die infolge einer traumatischen bzw. neurotoxischen Einwirkung freigesetzt werden.

Jedoch werden in keiner der aufgeführten Patentschriften Steroide mit selektiven estrogen-ähnlichen neurotropen Transkriptionseffekten dar- gestellt ; d. h. solche, die bei einer Dosierung in vivo, die im reprodukti- ven System keine signifikante biologische Wirkung zeigen, die Tran- skription estrogen-abhängiger Gene im ZNS in einem estrogen- ähnlichen Modus beeinflussen.

Insbesondere gilt es zu unterstreichen, dall die in den Patentschriften US 5,554,601 und WO 95/12402 beschriebene Wirkung von 17a- Estradiol-einer Substanz, die eine reduzierte Estrogenität im Genital- trakt aufweist (Clark JH et al., Effects of estradiol 17a on nuclear oc- cupancy of the estrogen receptor, stimulation of nuclear type 11 sites, and

uterine growth, J Steroid Biochem 16 : 323-328,1982)-sich nur auf die Protektion von kultivierten Nervenzellen vor dem durch den Entzug von Nährmittel induzierten Zelltod bezieht, wobei die relative Potenz von 17a-Estradiol mit derjenigen von 17b-Estradiol nicht evaluiert wurde.

Daraus kann man schlußfolgern, daß aus den bisher veröffentlichten Untersuchungen und Patentschriften jegliche Hinweise für eine selekti- ve neurotrope Wirkung von 17a-Estradiol bzw. seinen Derivaten fehlen, während 17b-Estradiol bekanntlich keine ZNS-Selektivität aufweist und damit als ein Estrogen mit systemischer Wirkung einzustufen ist. Die Patentschriften WO 97/03661 und DE 43 38 314 C1 interpretieren die zytoprotektive Wirkung von Estrogenen für eine Konsequenz der radi- kalfangenden Eigenschaften ihres terminale phenoiischen A-Rings.

Eine dissoziierte neurotrope Wirkung von 17a-Estradiol, die auf einer Beeinflussung der Transkription von estrogen-sensitiven Genen ba- siert, wurde weder innerhalb der Patentschrift untersucht, noch wurde in der Literatur daruber berichtet.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, pharmazeutische Präparate zur gezielten Substitution des Estrogenmangels im Zentralnervensy- stem (ZNS) ohne Beeinflussung anderer Organe oder Systeme zu fin- den.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelost, daß ausgewählte Steroide zur Herstellung pharmazeutischer Präparate verwendet wer- den, die die Substitution des Estrogenmangels im ZNS ohne Beeinflus- sung anderer Organe oder Systeme gewährleisten.

Die Steroide zeichnen sich dadurch aus, daß sie im Gegensatz zu sy- stemisch wirksamen natürlichen und synthetischen Estrogenen, inklusi- ve 17a-Estradiol, selektive neurotrope estrogen-ähnliche Transkripti- onswirkung besitzen.

Es wurde überraschend festgestellt, daß die ausgewählten Steroide in ihrer erfindungsgemäßen Verwendung

-eine selektive Beeinflussung der Transkription estrogen-abhangiger Gene im ZNS und Veränderungen entsprechender physiologischer Pa- rameter verursachen ; -ZNS-spezifische Transkriptionseffekte in solchen Dosen aufweisen, die in Geweben des Reproduktionssystems keine bioloische Effekte haben ; -ZNS-spezifischen Transkriptionseffeke bei solchen Dosierungen aufweisen, in denen weder 17b-Estradiol, noch 17a-Estradiol, eine Wirksamkeit zeigen ; -und die Transkription estrogen-abhängiger Gene im ZNS nicht tuber die Wirkung von sekundär gebildetem 17b-Estradiol beeinflussen.

Diese Steroide sind Verbindungen der aligemeinen Formel I in der R, ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder eine Alky- loxygruppe von 1 bis 5 C-Atomen darstellt, R2 ein Wasserstoffatom, ei- ne Alkylgruppe von 1 bis 5 C-Atomen, eine Acylgruppe von 1 bis 5 C- Atomen, eine Gruppierung der allgemeinen Formel SO2NRroR11, wobei Rio und Rn unabhängig voneinander jeweils ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe von 1 bis 5 C-Atomen oder zusammen mit dem Stickstoff eine Pyrrolidino-, Piperidino-oder Morpholinogruppe bedeuten, R3 ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe darstellt, R4 ein Wasser- stoffatom, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkylgruppe bis 5 C-Atomen bedeutet, Rs und R6 unabhängig voneinander jeweils ein Wasserstoff-

atom oder ein Halogenatom bedeuten, R7 für ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe steht, Rg ein Wasserstoffatom und eine Hydroxyl- gruppe, ein Oxogruppe oder eine Gruppierung der allgemeinen Formel CRi2Ri3 bedeutet, in der Riz und Ri3 unabhängig voneinander jeweils <BR> <BR> <BR> <BR> ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom darstellen, Rg eine Methyl- oder Ethylgruppe bedeutet, Z für eine C, C-Doppelbindung oder einen substituierten oder unsubstituierten Cyclopropanring steht und die Gruppierung >CRsR6 entweder a-oder ß-ständig angeordnet ist, wobei R7 ß-ständig ist, wenn >CR5R6 α-ständig ist und umgekehrt.

Bevorzugte Verbindungen sind 15ßH,3'H-Cycloprop (10), 8-tetraen-3,17a-diol, 15ßH,3'H-Cycloprop[14,15]-18a-homo-estra-1,3,5(10),8-tetrae n- <BR> <BR> <BR> <BR> 3,17α-ol.<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>17a-Hydroxy-15pH, 3'H-cycloprop [14, 15]-estra-1,3,5 (10), 8-tetraen-3-yl-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> pentanoat, 17-Methylen-15ßH,3'H-cycloprop[14,15]-estra-1,3,5(10).8-tet raen-3-ol, 15ßH, 3'H-3', 3'-difluoro-cycloprop (10), 8-tetraen- 3,17a-diol, 17-Methylen-15ßH,3'H-cycloprop[14,15]-estra-1, 3,5 (10), 8-tetraen-3-yl- sulfamat, 17-Difluoromethylen-15ßH,3'H-cycloprop[14,15]-estra-1,3,5(1 0),8- tetraen-3-ol, 3-Methoxy-15ß-methyl-3'H-cycloprop[14,15]-estra-1, 3,5 (10), 8-tetraen- 3-ol, 15α-Methyl-3'H-cycloprop[14,15]-estra-1, 3,5 (10), 8-tetraen-3,17a-diol, 17-Difluoromethylen-15pH, 3'H-cycloprop [14, 15]-estra-1,3,5 (10), 8- <BR> <BR> <BR> <BR> tetraen-3-yl-(tetramethylenimino) sulfonat,<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 17-Methylen-3'H-cycloprop [8, 9]-15pH, 3'H-cycloprop [14,15]-estra- (10)-trien-3-ol.

Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist die erfindungsgemä- ße Verwendung der Verbindungen zur Herstellung pharmazeutischer

Präparate zur Prophylaxe und Therapie der altersabhängigen Vermin- derung der kognitiven Leistung, der altersbedingten und perimenopau- salen Dysphorie, des premenstruellen Syndroms, der Neurose und Neurasthenie, von Angstzustände und-neurosen, von Hitzewallungen nach Estrogen-Deprivation (Menopause, Gonadektomie, Behandlung mit GnRH-Analoga) und der psychogenen Hemmung des Sexualver- haltes.

Es wurde festgestellt, daß dabei das Risiko einer Beeinträchtigung hormonsensitiver Gewebe des Reproduktionssystems (Endometrium, Myometrium, Prostata, Brustdrüse) im Sinne einer unkontrollierter Proliferation ind Karzinogenese weitgehend ausgeschlossen werden kann.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch pharmazeutische Präparate zur oralen und parenteralen, incl. topischen, rektalen, sub- cutanen, intravenösen, intramuskulären, intraperitonealen, intrana- salen, intravaginalen, intrabukkalen oder sublingualen Applikation, die neben ublichen Träger-und Verdünnungsmitteln eine in dem Anspruch 1 aufgezeigte Verbindung als Wirkstoff enthalten.

Als pharmazeutische Formulierungen können zur Anwendung kommen : -Tabletten oder Dragees von 0,1 bis 2 mg täglich oral, -Ampullen von 0,1 bis 2 mg tägiich als subkutane Injektion, -Pflaster mit transdermaler Freisetzung von 0,05 bis 2 mg täglich, -subkutane Implantate mit täglicher Freisetzungskapazität von 0,05 bis 2 mg, -Gele und Cremen mit transdermaler Freisetzung von 0,05 bis 2 mg täglich, -bukkal applizierbare Systeme mit einer täglichen Freisetzung von 0,1 bis 1 mg.

Die Arzneimittel der Erfindung werden mit den übtichen festen oder flüssigen Trägerstoffen oder Verdünnungsmitteln und den üblicher- weise verwendeten pharmazeutisch-technischen Hilfsstoffen entspre-

chend der gewünschten Applikationsart mit einer geeigneten Dosierung in bekannter Weise hergestellt.

Am Beispiel von 15pH, 3'H-Cycloprop 5 (10), 8-tetraen- 3, 17α-diol (Verbindung der allgemeinen Formel I : Ri=R2=R3=R4=Rs=R6=R7=H ; R8=a-OH, ßH ; Rg=CH3 ; Z=C, C-Doppelbindung)-nachfolgend in den Figuren als Prototypsub- stanz dokumentiert-wird die erfindungsgemäße selektive estrogenähn- liche Wirkung experimentell im Vergleich mit 17b-Estradiol und 17a- Estradiol nachgewiesen.

Beispiel 1 Einfluß auf das Uterusgewicht nach chronischer subkutaner Appli- kation in vivo Geschlechtsreife (drei Monate alt, Gewicht 25030 g) weibliche Wistar- Ratten (Tierzucht Schönwalde GmbH, Deutschland) wurden unter Ke- tamin-Narkose ovarektomiert. Nach 14 Tagen wurden die Tiere subku- tan mit osmotischen Minipumpen (Alzett, USA) implantiert, die eine Ta- gesdosis von 0,01,0,1,0,3,1,3,30 und 100 ug der zu untersuchen- den Substanzen (15pH, 3'H-Cyclopropl14, 15]-estra-1,3,5 (10), 8-tetraen- 3,17a-diol, 17b-estradiol und 17a-estradiol) über 7 Tage freisetzten ; die Kontrolltiere erhielten ein entsprechendes Volumen an Vehikel (Propylenglykol). Am 7. Behandlungstag wurden die Tiere getötet und <BR> <BR> die Uterus-Feuchtgewichte (bezogen auf 100 g Körpergewicht) ermit- telt.

Fig. 1 zeigt die uterotrope Wirkung von verschiedenen Dosen von 17b- Estradiol (Rechteck-Symbole), 17a-Estradiol (Kreis-Symbole) und 15pH, 3'H-Cycloprop [14, 15]-estra-1,3,5 (10), 8-tetraen-3,17a-diol, (Dreieck-Symbole) bei ovariektomierten Ratten. Jeder Punkt stellt den Mittelwert Standardfehler (x SEM) von 7-10 Versuchstieren dar ; das

schattierte Feld zeigt die Streuungsbreite dieses Parameters in Place- bo-behandelten Tieren (OVX).

Es ist ersichtlich, daß mit 17b-Estradiol eine signifikante Vergrößerung des Uterus bereits bei Tagesdosen von 0,03 bis 0,1 µg erzielt wurde.

Für einen vergleichbaren uterotropen Effekt benötigte man Tagesdosen von 100 ug 17a-Estradiol bzw. 30 pg der Substanz 15ßH, 3'H- Cycloprop [14,15]-estra-1, 3, 5 (10), 8-tetraen-3,17a-diol.

Dieses Ergebnis zeigt, dal3 die Wirksamkeit von 15pH, 3'H- Cycloprop [14, 15]-estra-1,3,5 (10), 8-tetraen-3, 1 7a-diol im weiblichen Genitaltrakt etwa 1000-fach geringer als diese von 17b-Estradiol und vergleichbar mit derjenigen von 17a-Estradiol ist.

Beispiel 2 Aktivierung der Transkription eines a-Estrogenrezeptor-abhängigen Reportergens in vitro Brustkrebszellen MCF-7/2A, die die Alpha-lsoform des Estrogenrezep- tors (ERa) exprimieren, wurden mit dem Reporter-Plasmid EREwtcLUC stabil transfiziert. Der Reporter enthält den Estrogen-Response Ele- ment (ERE) von Vitellogenin, einen Thymidinkinase-Promotor und das Luciferase-codierende Gen von Photinus pyralis. Die Zelikultur wurde für 7 Tage vor Beginn des Experiments in steroid-freiem Medium kulti- viert und anschließend mit 17b-Estradiol, 17a-Estradiol bzw. der Sub- stanz 15ßH, 3'H-Cycloprop [14, 15J-estra-1,3,5 (10), 8-tetraen-3,17a-diol in vier verschiedenen Konzentra-tionen (10-", 10-'°, 10'9 und 10-8 M) für 48 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden lysiert und die Transkripti- on des Luciferase-Reportergens wurde durch Bestimmung der Lucife- rase-Aktivität mit einem spezifischen Testansatz (Serva/Promega, Deutschland) ermittelt.

Fig. 2 zeigt die Induktion der Transkription eines stabil transfizierte- nestrogen-abhängigen Reporter-Gens (Luciferase) in Estrogenrezeptor-

exprimierenden Brustkrebszellen MCF-7 nach 48-stündiger Behandlung mit verschiedenen Dosen von 17b-Estradiol (Rechteck-Symbole), 17a- Estradiol (Kreis-Symbole) und 15pH, 3'H-Cycloprop [14,15]-estra- 1,3,5 (10), 8-tetraen-3,17a-diol (Dreieck-Symbole). Die Figur steilt die Mittelwerte von zwei unabhängigen Versuchen dar.

Es ist ersichtlich, daß die untersuchten Substanzen dosis-abhängig die Transkription des Reporters stimulieren. Die Effizienz von 15ßH, 3'H- Cycloprop [14, 15]-estra-1,3,5 (10), 8-tetraen-3, 17a-diol und 17a- Estradiot ist um eine Größenordnung (d. h. 10-fach) geringer als diese von 17b-Estradiol.

Dieses Ergebnis zeigt, daß die Substanz 15ßH, 3'H-Cycloprop [14,15]- estra-1,3,5 (10), 8-tetraen-3,17a-diol eine um das mehrfache schwäche- re Estrogenwirkung in Brustkrebs-Gewebe hat.

Beispiel 3 Stimulation der Transkription des Oxytocin-Gens im Gehirn nach chronischer Behandlung in vivo mit Dosen, die am Uterus unwirk- sam sind Geschlechtsreife (drei Monate alt, Gewicht 250130 g) weibliche Wistar- Ratten (Tierzucht Schönwalde GmbH, Deutschland) wurden unter Ke- tamin-Narkose ovarektomiert. Nach 14 Tagen wurden die Tiere subku- tan mit osmotischen Minipumpen (Alzett, USA) implantiert, die eine Ta- gesdosis von 0,01,0,1 und 1 ug der zu untersuchenden Substanzen (15ßH, 3'H-Cycloprop 5 (10), 8-tetraen-3,17a-diol, 17b-estradiol und 17a-estradiol) über 7 Tage freisetzten ; die Kontroll- tiere erhielten ein entsprechendes Volumen an Vehikel (Proplenglykol). Unmittelbar nach der Tötung der Tiere, wurden die Uterus-Feuchtgewichte (bezogen auf 100 g Körpergewicht) ermittelt.

Die Messenger-Ribonukleinsäure (mRNA), die die Biosynthese von Oxytozin codiert, wurde durch in-situ-Hybridisierung mit einer spezifi- schen radioaktiv-markierten Oligodeoxynukleotid-Sonde nach einer

etablierten Methode (Fischer D et al, Lactation as a model of naturally reversible hypercorticalism : plasticity in the mechanism governing hy- pothalamo-pituitary-adrenal activity in the rat, J Clin Invest 96 : 1208- 1215,1995), 1995) im hypothalamischen Nucleus paraventricularis (PVN) dargestellt. Behandlungsbedingte Veränderungen in der Tran- skription des Oxytocin-Gens wurden durch densitometrische Messun- gen der spezifischen Hybridisierungssignale innerhalb der definierten anatomischen Stukturen quantifiziert.

Fig. 3 zeigt die Induktion von Oxytozin-codierenden Transkripten (OT mRNA ; obere Graphik) im hypothalamischen paraventrikulären Nu- kleus ovariektomierter Ratten nach chronischer subkutaner Behandlung mit 17b-Estradiol (Kreis-Symbole), 17a-Estradiol (Rechteck-Symbole) und 15pH, 3'H-Cycloprop [14, 15]-estra-1,3,5 (10), 8-tetraen-3,17a-diol (Dreieck-Symbole) in drei verschiedenen Dosierungen. Die untere Gra- phik zeigt die Effekte der getesteten Substanzen auf das Uterusge- <BR> <BR> <BR> wicht. Jeder Punkt stellt x + SEM von 5-7 Einzelbestimmungen. Das schattierte Feld zeigt die Streuungsbreite des entsprechenden Para- meters in Vehikel-behandelten Ratten. Die Sternzeichen bezeichnen signifikante Unterschiede (p<0,05) im Vergleich zu der Kontrollgruppe (OVX).

Die Ergebnisse zeigen,-daß 15pH, 3'H-Cyciopropt14,15]-estra- 1,3,5 (10), 8-tetraen-3,17a-diol die Transkription des Oxytozin-Gens im PVN dosisabhängig stimuliert, wobei der Stimulationseffekt demjenigen von 17b-Estradiol sehr ähnlich ist. Allerdings sind die neurotropen Transkriptionseffekte von 15ßH, 3'H-Cycloprop (10), 8- tetraen-3,17a-diol, unterschiedlich als bei 17b-Estradiol, mit keiner Uterus-Vergrößerung assoziiert. In den verwendeten Dosierungen hatte 17a-Estradiol keinen Einfluß auf die Konzentrationen von Oxytozin- mRNA im hypothalamischen PVN.

Diese Ergebnisse dokumentieren eine selektive estrogen-ähnliche Wir- kung von 15ßH, 3'H-Cycloprop [14, 15]-estra-1,3,5 (10), 8-tetraen-3,17a- diol im Gehirn der weiblichen Ratte.

Beispiel 4 Stimulation der Transkription des antiapoptotischen Gens bcl-2 im Hippokampus nach chronischer Behandlung in vivo mit Dosen, die keine uterotrope Wirkung zeigen Das Untersuchungsmaterial stammte von Tieren, die im unter Beispiel 3 beschriebenen Experiment behandelt wurden. Das Gen bcl-2 codiert die Synthese eines Proteins, das in der Kaskade der Zellproliferation involviert ist und dem programmierten Zelltod (Apoptose) entgegenwirkt (Merry DE, Korsmeyer SJ, Bcl-2 gene family in the nervous system, Ann Rev Neurosci 20 : 245-267,1997). Die Transkription dieses Gens wird durch Estrogene stimuliert (Kandouz M et al., Antagonism between estradiol and progestin on Bcl-2 expression in breast cancer cells, Int J Cancer 68 : 120-125,1996).

Gyrus dentatus ist ein Bestandteil der hippokampalen Formation, in dem die Neurogenese bei der Ratte auch im Erwachsenenalter persi- stiert (Gould E et al, Proliferation of granule cell precursors in the dentate gyrus of adult monkeys is diminished by stress, Proc Natl Acad Sci USA 96 : 3168-317,1998) und bcl-2 exprimiert ist. Bcl-2-Transkripte wurden in Hirnschnitten durch in-situ-Hybridisierung mit einer spezifi- schen Oligonukleotid-Sonde (Clark RSB et al., Apoptosis-suppressor gene bcl-2 expression after traumatic brain injury in rats, J Neurosci 17 : 9172-9182,1997) dargestellt, und nach der im Beispiel 3 beschrie- benen Methode densitometrisch quantifiziert.

Fig. 4 zeigt den Einfiuß von drei verschiedenen Dosen von 17b- Estradiol (Kreis-Symbole), 17a-Estradiol (Rechteck-Symbole) und 15ßH, 3'H-Cycloprop [14,15]-estra-1,3, 5 (10), 8-tetraen-3, 17a-diol (Dreieck-Symbole) auf die Expression von bcl-2 im Gyrus dentatus des

Hippokampus ovariektomierter Ratten ; Zeichen und Abkürzungen wie in Fig. 3.

Die Behandlung mit der Substanz 15ßH, 3'H-Cycloprop [14,15]-estra- 1,3,5 (10), 8-tetraen-3,17a-diol resultierte in einer dosisabhängigen Sti- mulation der Expression von bcl-2 im Gyrus dentatus. Der Effekt war mit demjenigen, der durch gleiche Dosen 17b-Estradiol ausgelöst wur- de, identisch. Die Substanz 17a-Estradiol hatte in den verwendeten Dosierungen keinen Effekt auf die Transkription von bcl-2-ersichtlich aus Figur 4.

Diese Ergebnisse zeigen, daß in der verwendeten Dosierung, 155iH, 3'H-Cycloprop [14, 15]-estra-1,3,5 (10), 8-tetraen-3,17a-diol die Transkription des antiapoptotischen Gens bcl-2 im ZNS nach einem estrogen-ähnlichen Modus beeinflußt, ohne daß eine Wirkung am Ute- rus auftritt.

Beispiel 5 Dissoziierte Induktion von Oxytozin-Rezeptoren im Gehirn und im Myometrium Bindungsstellen mit identischen biochemischen Charakteristika für das Peptidhormon Oxytozin sind im Myometrium und im ZNS vorhanden. In beiden Organen verursacht akute oder chronische Estrogen- Behandlung einen Anstieg der Anzahl (Dichte) von Oxytozin- Rezeptoren. Die Hirnstrukturen, in denen dieser Parameter besonders empfindlich auf Estrogene reagiert, sind Nucleus interstitialis striae terminalis, Nucleus ventromedialis und der amygdaloide Nuklearkom- ptex. Estrogen-bedingte Induktion von Oxytozin-Rezeptoren in diesen Strukturen befindet sich in einer kausalen Relation zur Ausprägung von einer Reihe von prosozialen Verhaltensmustern, darunter auch Sexual- verhalten (Insel TR, Oxytocin-a neuropeptide for affiliation : evidence from behavioral, receptor autoradiographic, and comparative studies, Psychoneuroendocrinotogy 17 : 3-35,1992).

Zu Bestimmungen der Dichte von Oxytozin-Rezeptoren in definierten anatomischen Strukturen ist die autoradiographische Darstellung durch Bindung des radioaktiv markierten Oxytozin-Rezeptorantagonisten d (CHz) 5-Tyr (Me) 2, Thr4, Orn8-[125I]Tyr9-Vasotocin (125I-OVTA) die Me- thode der Wahl (Kremarik P et al., Histoautoradiographic detection of oxytocin-and vasopressin-binding sites in the telencephalon of the rat, J Comp Neurol 333 : 343-359,1993).

Gefrierschnitte vom Gehirn und Uterus von ovariektomierten Ratten, die 7 Tage lang eine tägliche subkutane Dosis von 1 pg 15, H, 3'H- Cycloprop [14, 15]-estra-1,3,5 (10), 8-tetraen-3, 17a-diol, 17b-Estradiol bzw. 17a-Estradiol erhielten (vgl. Beispiel 3), wurden Mit 125 I-OVTA (NEN DuPont, Deutschland) in einer Konzentration von 50 pM inku- biert. Anschließend wurden Filmautoradiogramme erstellt, die zur den- sitometrischen Bestimmung der Oxytozin-Bindungsstellen nach einem etablierten Verfahren verwendet wurden (Patchev VK et al., Oxytocin binding sites in rat limbic and hypothalamic structures : site-specific modulation by adrenal and gonadal steroids. Neuroscience 57 : 537- 543,1993).

Fig. 5 zeigt die spezifische Bindung eines'251-markierten Liganden des Oxytozin-Rezeptors (1251-OVT) im Myometrium und in zwei estrogen- sensitiven Hirnstrukturen, dem hypothalamischen ventromedialen Nu- kleus (VMN) und dem Nucleus interstitialis striae terminais (BNST), nach einer 7-tägigen Behandlung mit 17b-Estradiol (schwarze Saule), 17a-Estradiol (schraffierte Saule) und 15pH, 3'H-Cycloprop [14,15]- estra-1, 3, 5 (10), 8-tetraen-3, 17a-dio) (graue Saule) in einer Tagesdosis von 1 µg. Die Sternzeichen zeigen signifikante Unterschiede (p<0,05) im Vergleich zu Placebo-behandelten ovariektomierten Ratten (OVX).

Die rechte Graphik stellt die Effekte der getesteten Substanzen auf die Proliferation des Endometriums dar. Jede Saute repräsentiert x SEM von 4-5 Einzelbestimmungen.

Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind ebenfalls auf Fig. 5 darge- stellt. Die Behandlung mit 17b-Estradiol und 15ßH, 3'H-

Cycloprop [14,15]-estra-1,3,5 (10), 8-tetraen-3,17a-diol resultierte in ei- nem signifikanten Anstieg der Dichte von Oxytozin-Rezeptoren in allen untersuchten Hirnstrukturen, wobei 15pH, 3'H-Cycloprop [14,15]-estra- 1,3,5 (10), 8-tetraen-3,17a-diol im VMN einen schwächeren Effekt ais 17b-Estradiol zeigte. Die Substanz 17a-Estradiol war bei der verwen- deten Dosierung in keiner Hirnstruktur wirksam. Im Myometrium verur- sachte 17b-Estradiol eine starke Induktion von Oxytozin- Bindungsstellen, während 17a-Estradiol und die Substanz 15pH, 3'H- Cycloprop 5 (10), 8-tetraen-3,17a-diol eine signifikant geringere Wirkung zeigten. Die computer-gestützte Messung der Stärke des Endometriums in den Uteruspräparaten zeigte, daß die Tagesdosis von 1 µg 17b-Estradiol eine signifikante endometriale Proliferation ver- ursacht, während 15ßH, 3'H-Cycloprop [14,15]-estra-1,3,5 (10), 8-tetraen- 3,17a-diol und 17a-Estradiol in einer äquivalenten Dosierung die Stär- ke des Endometriums nicht beeinflussen.

Zusammenfassend zeigen die unter Beispiel 5 dargestellten Resultate, daß die Substanz 15ßH, 3'H-Cycloprop [14,15]-estra-1,3,5 (10), 8-tetraen- 3,1 7a-diol einen biochemischen Parameter-den Oxytozin-Rezeptor- der sowohl für das reproduktive System (Myometrium) als auch for das ZNS charakteristisch ist, vorwiegend im Zentralnervensystem beein- flusst und sich durch diese selektive neurotrope Wirkung von den na- türtichen Estrogenen 17b-Estradiol und 17a-Estradiol qualitativ unter- scheidet.

Beispiel 6 Beeinflussung der kognitiven Funktionen nach chronischer Be- handlung Es ist bekannt, daß eine Verminderung der Estrogenkonzentrationen mit einer Erniedrigung der Lern-und Gedächtnisleistung assoziiert ist (Kopera H, Estrogens and psychic functions. Aging and estrogens, Front Hormone Res. 2 : 118-133,1973).

Eine Korrelation zwischen Serum-Estrogenspiegel und kognitiver Lei- stung wurde auch im Tierversuchsmodell nachgewiesen (Kondo Y, Su- zuki K, Sakuma Y, Estrogen aleviates cognitive dysfunction following transient brain ischemia in ovariectomized gerbils, Neurosci Lett 238 : 45-48,1997).

Zur Vergleichsuntersuchung des Einflusses der Substanzen 15ßH, 3'H- Cycloprop [14, 15]-estra-1,3,5 (10), 8-tetraen-3,17a-diol, 17b-Estradiol und 17a-Estradiol auf die kognitive Leistung wurde das folgende Expe- riment durchgeführt : Geschlechtsreife weibliche Wistar-Ratten (Gewicht 24020 g) wurden unter Nembutal-Narkose ovarektomiert. Eine Woche nach der Operati- on wurde mit täglicher subkutaner Verabreichung der Substanzen in den folgenden Tagesdosen begonnen : 17b-Estradiol, 1 pg ; 17a- Estradiol, 100 pg ; 15pH, 3'H-Cycloprop [14, 15]-estra-1,3,5 (10), 8- tetraen-3,17a-diol, 30 ug. Die gesamte Behandlungsdauer war 14 Ta- ge. Am 5. und 6. Behandlungstag wurden Trainingssitzungen zum Er- lernen eines konditionierten Escape-Verhaltens nach einer etablierten Methode (Diaz-Veliz G et al., Influence of the estrous cycle, ovariec- tomy and estradiol replacement upon the acquisition of conditioned avoidance responses in rats, Physiol Behav 46 : 397-401,1989) durch- geführt. Jedes Tier wurde in einer Sitzung 50 Mal der Kombination aus einem unbedingten (elektrische Reizung) und zwei konditionierenden Stimuli (Licht-und Schall-Signal) exponiert. Am 7. Behandlungstag wurde die Retention des erlernten Verhaltensmusters getestet. Nach einer 6-tägigen Unterbrechung der Lernsitzungen, wurde am 14. Be- handlungstag die Extinktion des erlernten konditionierten Verhaftens ermittelt. Die Anzahl der korrekten Verhaltensreaktionen (Escape in das"sichere"Abteil des Apparats innerhalb von drei Sekunden nach Präsentation der konditionierenden Signale) aus 50 aufeinanderfolgen- den Expositionen wurde als Kriterium für die Bewertung der Retention bzw. Extinktion des erlernten Verhaltens verwendet.

Fig. 6 zeigt den Einfluß von 17b-Estradiol (schwarze Saule), 17a- Estradiol (schraffierte Saule) und 15, ßH, 3'H-Cycloprop [14,15]-estra- 1,3,5 (10), 8-tetraen-3,17a-dioi (graue Saule) auf die Aquisition und Retention eines neuen Verhaltensmusters bei ovariektomierten Ratten (offene Saule ; OVX). Die Sternzeichen zeigen signifikante Unter- schiede im Vergleich zu den Placebo-behandelten Tieren (OVX) am entsprechenden Testtag. Die folgenden Uterusgewichte (x SEM ; n = 8-10 pro Behandlungsgruppe ; Angaben in mg/100g KG) wurden nach 14-tägiger Behandlung ermittelt : OVX, 53 2 ; 17b-Estradiol, 187 9 ; 17a-Estradiol, 100 5 ; 15ßH, 3'H-Cycloprop (10), 8- tetraen-3,17a-diol, 108 4.

Es ist ersichtlich, daß die Substanz 15pH, 3'H-Cycloprop [14,15]-estra- 1,3,5 (10), 8-tetraen-3,17a-diol in der verwendeten Dosierung einen estrogen-ähnlichen stimulierenden Effekt auf die Retention des er- lernten Verhaltensmusters hat, wobei die uterotrope Wirkung signifi- kant geringer ist, als diese von 17b-Estradiol in einer täglichen Dosis von 1 µg. Dieses Ergebnis weist nach, daß 15pH, 3'H-Cycloprop [14,15]- estra-1,3,5 (10), 8-tetraen-3,17a-diol die kognitive Leistung wie ein Estrogen beeinflußt, während in reproduktiven Organen eine geringfü- gige proliferative Wirkung zeigt.

Beispiel 7 Biotransformation von17a-Hydroxy-14, 15a-methylen-estra-, 3,5 (10), 8-tetraen-3-ol und 17a-Estradiol zu 17b-Estradiol Ovariektomierte Ratten erhielten tägliche subkutane Dosen von 100 µg 17a-Estradiol, 30 pg 15 H, 3'H-Cycloprop [14, 15]-estra-1, 3,5 (10), 8- tetraen-3,17a-diol bzw. 1 pg 17b-Estradiol über 7 Tage (vgl. Beispiel 6). Am letzen Behandlungstag wurden die Serumkonzentrationen von 17b-Estradiol im den drei Versuchsgruppen ermittelt und mit denenigen bei vehikel-behandelten Kontrolltieren verglichen.

Fig. 7 zeigt Serumwerte von 17b-Estradiol nach einer 7-tãgiger subku- taner Behandlung ovariektomierter Ratten mit 17b-Estradiol (schwarze Saule), 17a-Estradiol (schraffierte Saule) und 15ßH. 3'H- Cycloprop 5 (10), 8-tetraen-3,17a-diol (graue Säule) in den angegebenen Dosierungen. Sternzeichen bezeichnen signifikante Differenzen im Vergleich zu den Werten, die bei Placebo-behandelten Tieren gemessen wurden ; die Letzteren waren unterhalb der Nach- weisgrenze der Methode ; jede Behandlungsgruppe bestand aus 7 Tie- ren.

Es ist ersichtlich, daß nach der Applikation von 17b-Estradiol und 17a- Estradiol in den erwahnten Dosierungen meßbare Konzentrationen von 17b-Estradiol im Serum registriert werden. Chronische subkutane Be- handlung mit 15pH, 3'H-Cycloprop [14, 15]-estra-1,3,5 (10), 8-tetraen- 3,17a-diol verursacht keinen Anstieg der endogenen 17b- Estradiolspiegel. Dieses Ergebnis weist darauf, daß die beobachteten pharmakologischen Effekte nach der Verabreichung von 15pH, 3'H- Cycloprop 5 (10), 8-tetraen-3,17a-diol nicht auf eine Biotransformation der Substanz zu 17b-Estradiol zurückzuführen sind.