Arzneimittel zur Behandlung von fibrosierenden Lungenkrankheiten

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel bzw. ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von fibrosierenden Lungenkrankheiten, insbesondere der Idiopathischen Pulmonalen Fibrose (IPF) und der Unspezifischen (nonspecific) Interstitiellen Pneumonie (NSIP). Dabei findet ein Agens Verwendung, welches eine Korrektur der in den alveolären Typ-Il Zellen auftretenden maladaptiven ER-Stressantwort bzw. eine Blockierung der epithelialen Apoptose bewirkt.

Stand der Technik:

Klinischer Hintergrund Es existiert ein breites Spektrum an interstitiellen Lungenerkrankungen, wovon die Idiopathischen Interstitiellen Pneumonien (IIP) einen bedeutenden Teil darstellen. Neben den „nichtklassifizierbaren Interstitiellen Pneumonien" werden sieben Gruppen der IIP unterschieden, darunter die IPF und die NSIP.

Ein gemeinsames Charakteristikum a) der Sporadischen IPF, b) der familiären Formen der IIP und c) von bestimmten lysosomalen Speichererkrankungen wie dem Hermansky Pudlak Syndrom oder der Niemann-Pick Krankheit Typ B/C (Lipidstoff- wechselerkrankung, Lipidose) ist die Apoptose von Lungenepithelzellen:

a) Die IPF macht etwa 20-30% aller Interstitiellen Lungenerkrankungen (ILD) aus und ist mit einem rasch fortschreitenden Verlauf und einer überlebenszeit von im Mittel 3-5 Jahren nach Diagnose die IIP mit der schlechtesten Prognose. IPF, für die bis heute keine wirksame Behandlung existiert, zeichnet sich durch eine fortschreitende Veränderung der alveolären Architektur und einen Austausch des Lungenepi- thels durch fibrotisches Gewebe aus, was nach wenigen Jahren zum Tode führt.

Nach neueren Theorien geht die vermehrte epitheliale Apoptose, insbesondere der alveolären Typ-Il Zellen, nicht auf eine Entzündung zurück, sondern steht im Zusammenhang mit einer chronischen epithelialen Schädigung und einer nachfolgen- den, fehlerhaften alveolären Reparatur.

b) Es wurde gezeigt, dass in etwa 10% der familiären Formen der IIP sowohl Mutationen in den Genen der humanen Telomerase (TR) als auch solche in der Telome- rase Reverse Transkriptase (TERT) zur Fibrose führen. Aller Wahrscheinlichkeit 5 nach umfasst die Mutation wiederum das alveoläre Epithel und geht mit einer gestörten DNA Reparatur und folglich einer intrinsischen epithelialen Schädigung in den alveolären Epithelzellen einher, deren Tod möglicherweise als eine Folge von kurzen Telomeren anzusehen ist.

I O Bei einigen wenigen Arten der familiären Formen der IIP werden Mutation in der car- boxyterminalen Domäne des hydrophoben Surfactant-Proteins (SP)-C (SFTPC) als Ursache der Krankheit beschrieben. Die Mutationen führen hierbei zu der Translation eines fehlerhaften SP-C-Proproteins (proSP-C), welches nicht korrekt zum reifen SP- C prozessiert werden kann. Als Folge kommt es zu dessen Fehlfaltung und Akkumu-

15 lation im Endoplasmatischen Retikulum (ER), mit sukzessiver Induktion von ER- Stress, Proteasom-Dysfunktion und Caspase-3-Aktivierung, was schließlich zum Zelltod der alveolären Typ-Il Zellen führt.

Im Gegensatz zu diesen familiären Formen konnte bei sporadischen Formen der IPF .0 und NSIP keine Mutation im SFTPC-Gen festgestellt werden. Dennoch wurden quantitative Veränderungen im alveolären Surfactant-Pool beobachtet, und zwar insofern, als dass neben dem deutlichen Mangel an maturem SP-C und SP-B die Surfactant- spezifischen Phospholipide Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und Phosphati- dylglycehn (PG) signifikant reduziert im Vergleich zu gesunden Probanden vorlagen. >5

Die Rolle von Napsin A und Kathepsin H

Neben SP-C ist auch und insbesondere das SP-B ein essentieller Bestandteil des Lungen-Surfactant und wird als 42 kDa Vorläuferprotein in alveolären Typ-Il-Zellen hergestellt und anschließend entlang des sekretorischen Weges zu einem 8.6 kDa JO großen, maturen Polypeptid prozessiert. Die proteolytische Prozessierung der hydrophoben Surfactantproteine B und C sind mehrstufige Prozesse, in die mehrere unterschiedliche Proteasen involviert sind; für SP-C ist dieser bisher noch nicht vollständig aufgeklärt.

Bekannt ist aber, dass die SP-C Prozessierung mit der Verarbeitung von SP-B verbunden ist, und zwar insofern, als dass nur matures SP-B die Lyse der inneren Vesi- kel innerhalb der multivesikulären Körperchen und damit den Zugang von Proteasen wie Kathepsin H zur aminoterminalen Domäne des SP-C Vorläufers proSP-C erlaubt.

Napsin A, eine in den alveolären Typ-Il Zellen exprimierte Aspartat-Protease, ist eines der für die SP-B-Prozessierung relevanten Proteine. Durch immunoelektronen- mikroskopische Untersuchungen von alveolären Typ-Il-Zellen konnte die Lokalisation von Napsin A im ER, in Golgi-Vesikeln, in multivesikulären Körperchen und in den Lamellarkörperchen, welche die letzte intrazelluläre Stufe der Surfactantproduktion darstellen, nachgewiesen werden. Es wurde gezeigt, dass die Genexpression von Napsin A durch den Thyroid Transkriptionsfaktor 1 (TTF1 ) reguliert wird.

Daneben wurde Kathepsin H, eine Cystein-Protease, ebenfalls mit der Verarbeitung des SP-B-Vorläuferpolypeptids in Verbindung gebracht. Innerhalb der Lunge wurde Kathepsin H in den multivesikulären Körperchen und Lamellarkörperchen von Typ-Il- Zellen sowie auch in den Lysosomen von Alveolarmakrophagen gefunden.

Napsin A und Kathepsin H sind in Bezug auf ihre Aminosäurensequenz bereits cha- raktehsiert (Napsin A: vgl. [1] oder Swiss-Prot Datenbank unter NAPSAJH U MAN, accession number O96009; Kathepsin H: vgl. [2] oder Swiss-Prot Datenbank unter CATH_HUMAN, accession number P09668).

Antwort der Zelle auf die Akkumulation ungefalteter Proteine: Wie aus der Literatur bekannt, greifen verschiedene Zell-Stress-Faktoren in die Proteinfaltung ein und können zu einer Akkumulation von un- oder fehlgefaltetem, sowie auch zu überschüssigem Protein im ER-Lumen führen, was einen endoplasmatischen Retikulum (ER)-Stress und die Aktivierung der sogenannten Unfolded Protein Response (UPR) und/oder der ER Overload Response (EOR) zur Folge hat. Solche Zell-Stress-Faktoren sind beispielsweise die Beeinträchtigung der Kalzium- Homöostase oder änderung des Redox-Status in der Zelle durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS), eine erhöhte Synthese sekretorischer Proteine, die Präsenz ungefalteter Proteine, die überfüllung des ER-Lumens infolge der Produktion überschüs-

siger Proteine (z. B. nach einer viralen Infektion), Zucker/Glukose-Mangel, Veränderungen in der Glykosylierung oder ein überschuss an Cholesterol.

Die UPR bzw. EOR ist ein intrazellulärer Signaltransduktionspfad, der Informationen 5 über den Zustand der Proteinfaltung im ER-Lumen ins Zytoplasma und den Zellkern weiterleitet. Die translationale Attenuierung der globalen Proteinsynthese bei gleichzeitiger transkriptioneller Induktion von UPR/ERSE (ER Stress-Response-Element)- Genen und ein Ubiquitin/Proteasom abhängiger Abbau von ER-Proteinen im Zytoplasma (ERAD, ER-/Associated Degradation) sind die Folge. 10

Die transiente Attenuierung der mRNA Translation erfolgt über die Phosphorylierung des eukaryotischen Translations-Initiations-Faktors 2α (elF2α) durch die Kinase PERK (PKR-like ER Kinase, Pancreatic elF2-alpha-Kinase) und führt zu einer Reduktion der generellen Proteinbiosynthese. Gleichzeitig wird jedoch die Translation 15 bestimmter UPR-relevanter mRNA, wie diejenige des Transkriptionsfaktors ATF4 (/Activation-Transcription-Factor 4) erhöht.

Ein zentraler Steuerungsfaktor der UPR über die Signalproteine IRE1 (/nositol- Requiring Protein 1 ), PERK und ATF6 (/Activation-Transcription-Factor 6) ist das ER-

.0 Chaperon Grp78/BiP (Anti-Glucose-Regulated Protein 78/lmmunglobulin-heavy chain-ß/nding Protein). Unter normalen Bedingungen wirkt dieses als negativer Regulator durch Bindung der genannten Signaltransduktionsfaktoren. Unter ER-Stress bindet BiP jedoch in seiner Funktion als Chaperon an ungefaltete Proteine und dissoziiert von IRE1 , PERK und ATF6, was diese freisetzt.

>5

IRE1 und ATF6 bzw. das nachgeordnete XBP1 (X-box-ßinding Protein 1 ), sowie das genannte ATF4 sind für die transkriptionelle Induktion UPR-relevanter Ziel-Gene verantwortlich. Dies führt u.a. zu einer vermehrten Produktion von Chaperonen und Faltungskatalysatoren, was die Faltungskapazität des ER erhöht. Zusätzlich werden

50 auch Gene verstärkt transkribiert, welche Proteine kodieren, die die ERAD vermitteln, was zum Abbau ungefalteter Proteine im Zytoplasma bzw. zur Ausschleusung derselben aus dem ER beiträgt.

Wie aus diesen Ausführungen ersichtlich ist, besteht die Aufgabe der UPR/EOR in der Anpassung der Faltungskapazität und der sekretorischen Pfade an die Menge des zu faltenden Proteins. Bei länger andauernder Aktivierung der UPR/EOR bzw. wenn der ER Stress die Kapazität der UPR/EOR übersteigt, kommt es jedoch zum 5 programmierten Zelltod.

Drei vom ER ausgehende proapoptotische Signalpfade sind bekannt, und zwar werden diese durch IRE1 stromabwärts (downstream) über Stress-Signalkaskaden (c-jun N-terminale Kinase, JNK), durch die über den PERK und ATF4 Signalpfad in- I O duzierte CHOP-Induktion (C/EBP-Homologous Protein) und durch Caspase-12 (in der Maus) bzw. durch die homologe Caspase-4 (beim Menschen) vermittelt.

Insbesondere gilt das CHOP-Protein als potenter Mediator der apoptotischen ER- Stressantwort, indem es stromabwärts (downstream) die Dimerisierung und Translo-

15 kation des pro-apoptotischen Effektors Bax (ßCL2-associated X protein) vom Zytop- lasma in die Mitochondhen induziert und somit den mitochondrialen Apoptose- Signalweg aktiviert. Die konsekutiv eingeleitete Freisetzung von Cytochrom C bewirkt den Verlust der funktionellen Integrität der Mitochondrien und führt zur Aktivierung von Caspase-9, welche die apoptotische Kaskade über Caspase-3 initiiert. Die apop-

.0 totische ER Stressantwort kann außerdem indirekt über den ER Stress-Sensor IRE-1 durch die Ausbildung eines zytoplasmatischen Signaltransduktionskomplexes und die Aktivierung von Stresskinasen wie JNK (c-Jun N-terminal kinase) eingeleitet werden, welche folgend die Rolle in der Apoptoseinduktion übernimmt. Schließlich kann das ER auch direkt über Caspase-12 (Maus) bzw. Caspase-4 (homologes Gen im

.5 Menschen), die als einzige Caspase mit dem ER-Kompartiment assoziiert ist, die apoptotische Kaskade induzieren.

Die ursächlichen Zusammenhänge zwischen dem Krankheitsbild der IPF, der Apop- tose der Typ-Il Zellen, der UPR und den genannten Signalmolekülen und Proteasen, JO insbesondere Napsin A und Kathepsin H, waren jedoch unklar, was eine Ursachenbekämpfung im Zusammenhang mit fibrosierenden Lungenerkrankungen nicht zuließ.

Aufgabenstellung:

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht darin, ein Arzneimittel bzw. ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von fibrosierenden Lungenkrankheiten zur Verfügung zu stellen, insbesondere solcher Lungenkrankheiten, welche mit einer ER-Stress Antwort und einer Apoptose von alveolären Epithelzellen einhergehen, wie die sporadische IPF, familiäre Formen der IIP und bestimmte lysosomale Speicherkrankheiten wie das Hermansky Pudlak Syndrom oder die Niemann-Pick Krankheit, wobei die IPF und die NSIP von besonderer Bedeutung für die vorliegende Erfindung sind. Weitere Aufgaben ergeben sich aus den Ansprüchen und der folgenden Beschreibung.

Oben genannte Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Arzneimittel zur Behandlung von fibrosierenden Lungenkrankheiten gelöst, wobei es ein oder mehrere, die in den alveolären Typ-Il Zellen auftretende ER-Stressantwort regulierende, vorzugsweise eine maladaptive ER-Stressantwort blockierende, Agenzien beinhaltet. Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung (bevorzugte Agentien, Arzneimittel, Verabreichungsformen) werden ebenfalls in diesem Dokument beschrieben.

Von besonderer Bedeutung für die vorliegende Erfindung ist auch ein Therapieverfahren gegen fibrosierende Lungenerkrankungen (insbesondere IPF und NSIP), die mit einer in den alveolären Typ-Il-Zellen auftretenden ER-Stressantwort assoziiert sind. Das Therapieverfahren beinhaltet die Verabreichung einer therapeutisch aktiven Menge eines die in den alveolären Typ-Il Zellen auftretende ER-Stressantwort regulierenden (vorzugsweise eine maladaptive ER-Stressantwort blockierenden) Agens an ein Säugetier. Das beschriebene Therapieverfahren ist dann besonders bevorzugt, wenn es die Verabreichung eines oder mehrerer der in diesem Dokument genannten Arzneimittel und/oder Agentien beinhaltet. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise in einer der Formen und/oder auf eine der Arten wie sie in diesem Doku- ment beschrieben sind. Normalerweise handelt es sich beim Säugetier um einen Menschen obwohl auch eine veterinärmedizinische Anwendung vorgesehen sein kann. Eine therapeutisch wirksame Menge ist eine Menge, die ausreicht, um den angestrebten Effekt (insbesondere eine therapeutisch vorteilhafte Wirkung) zu erreichen, bei dem es sich vorzugsweise um eine teilweise oder gänzliche Behebung der

Krankheitsursachen und/oder um eine Linderung in Bezug auf die krankheitsbedingten Symptome handelt.

In diesem Zusammenhang soll der Begriff der maladaptiven ER-Stressantwort auch die epitheliale Apoptose als direkte Folge mit umfassen.

Unter einem „regulierenden Agens" sind sowohl agonistische wie auch antagonistische Agenzien (Effektormoleküle bzw. wirkende Substanzen) zu verstehen, welche ihre aktivitätsfördernde oder aktivitätshindernde Wirkung über den Einfluss auf die Aktivität eines Zielmoleküls, insbesondere eines Polynukleotids oder eines Polypeptids, via enzymatischer Aktivität, inhibierender Bindung an das Zielmolekül, Beeinflussung der Transkription bzw. Translation eines Polynukleotids (DNA bzw. RNA), dem Einfluss auf post-translationale Modifikationen des Zielproteins etc. ausüben. Unter dem Begriff „regulierendes Agens" kann weiterhin eine autologe oder heterolo- ge Zellpräparation verstanden werden, die aufgrund der Differenzierung in einen alveolären Typ-Il Charakter durch Repopulation des Alveolarraums die geschädigten alveolären Typ-Il Zellen ersetzt und die korrekte Prozessierung der hydrophoben Surfactantproteine wiederherstellt.

Agonisten weisen beispielsweise die Form von Proteinen, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten oder sog. „small molecules" etc. auf, während Antagonisten z.B. Proteine, Nukleinsäuren - inkl. Ribozyme oder RNAi -, Kohlenhydrate, Antikörper oder small molecules etc. sein können. Unter RNAi (RNA interference) soll allgemein ein zielerkennendes RNA-Molekül verstanden werden, dessen Aktivität im Wege eines RNAi-Mechanismus zu einer Hemmung der Genexpression durch Abschalten (Silen- cing) des entsprechenden Gens führt (beispielsweise: siRNA oder small hairpin (sh)RNA).

Eingeschlossen sind auch Agentien, welche nicht direkt Einfluss auf ein Zielmolekül nehmen, sondern erst die Produktion des eigentlichen Agonisten oder Antagonisten bewirken, wie beispielsweise für ein Effektormolekül kodierende Nukleinsäuren, welche zwecks Expression in die Zielzelle bzw. das Zielgewebe eingeführt werden.

Es wurde gefunden, dass Patienten mit einer IPF und auch einer NSIP eine ausgeprägte maladaptive, d.h. zum programmierten Zelltod führende ER-Stressantwort im alveolären Epithel bzw. den Typ-Il Zellen, aufweisen. Als eine wesentliche Ursache dieser chronischen maladaptiven ER-Stressantwort wurde die gestörte Prozessie- rung des SP-B durch Minderexpression oder Fehlen der beiden Proteasen Napsin A und Kathepsin H - oder einer der beiden genannten Proteasen - in Verbindung mit einem intrazellulären Anstau von n icht prozessiertem SP-B-Vorläuferprotein (proSP-B) identifiziert. Dieses Phänomen war begleitet mit verminderten Proteinspiegeln an vollständig prozessierten, maturen S urfactantp rote informen von SP-B und SP-C in Lungengewebe und bronchoalveolärer Lavage Flüssigkeit (BALF), verbunden mit der Anwesenheit von unprozessierten SP-B-Vorstufen und sogar nicht- prozessierten 21 kDa proSP-C im Alveolarraum von Patienten mit IPF (Abb. 1 ). Das Auffinden solcher, normalerweise im Alveolarraum nicht vorkommender, Proformen des SP-C in der BALF kann als diagnostisches Kriterium für die Diagnose der IPF dienen (Abb. 1 ).

Von Bedeutung für die vorliegende Erfindung ist deshalb auch ein in vitro Verfahren (vorzugsweise zur Erkennung und/oder zur Bestimmung des Schweregrads und/oder zur Verlaufsbeurteilung und/oder zur Prognose von fibrosierenden Lungenkrankhei- ten und/oder IPF), wobei sich das Verfahren dadurch auszeichnet, dass in isolierten alveolären Typ Il-Zellen und/oder isoliertem Lungengewebe und/oder isolierter bronchoalveolärer Flüssigkeit (vorzugsweise aus einer Lavage) das Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein von nicht-prozessiertem 21 kDa proSP-C festgestellt und/oder die Menge an - nicht-prozessiertem 21 kDa proSP-C und/oder

- unvollständig prozessierten SP-B Vorstufen und/oder

- vollständig prozessiertem SP-B und/oder

- vollständig prozessiertem SP-C gemessen wird, wobei - die Messung mittels Western-Blot erfolgt und/oder

- es die gemessenen Werte und/oder von diesen Werten abgeleitete Informationen mittels einer Ausgabeeinheit (Display, Drucker etc.) sichtbar gemacht werden und/oder

- die Erkennung und/oder die Bestimmung des Schweregrads und/oder die Verlaufsbeurteilung und/oder die Prognose auf der der Grundlage der gemessenen Werte und/oder auf der Grundlage von Informationen erfolgt, die von diesen Werten abgeleitet sind, wobei es bevorzugt ist, dass dies computergestützt erfolgt. Bevorzugt handelt es sich bei den isolierten Zellen und/oder dem isolierten Lungengewebe und/oder der isolierten bronchoalveolären Flüssigkeit um Isolate aus dem Menschen oder der Maus.

Es ist bekannt, dass die Genexpression von Napsin A von dem thyroidalen Trans- kriptionsfaktor TTF- 1 reguliert wird. Weitere Transkriptionsfaktoren sind allerdings bis dato nicht beschrieben. Ebenso ist über die Regulation der Protease Kathepsin H nichts bekannt.

Es wurde daher eine Analyse der 4.0-kb stromaufwärts (in 5'-Richtung) liegenden Promotorregion von Napsin A und Cathepsin H durchgeführt. Die Analyse ergab für beide Proteasen eine regulatorische Region im distalen (~ -2.900/1.100-kb) und im proximalen Promotorbereich (~ -1.100/+0.001 -kb) [Abb. 2]. Dabei zeigte die Promotoranalyse für das Napsin A-Gen Bindungsstellen für 16 Transkriptionsfaktoren, darunter AP-1 (Activator protein-1 ), AML-I a (Acute myeloid leukemia 1 protein, Syno- nym: RUNX), Sox-5 (Transkriptionsfaktor Sox-5), Foxa2 (Forkhead box protein A2, Synonym HNF-3-ß), SP-1 (Transcription factor SP-1 ), SREBP (Sterol regulatory ele- ment-binding protein), Cdx-1 (Homeobox protein Cdx-1 , Synonym: CdxA), C/EBPα (CCAAT/enhancer-binding protein alpha), NFKB (Nuclear factor kappa-B), Transkriptionsfaktoren der GATA-Familie (GATA 1 ,2,3,X [X=5,6]), TTF-1 (Thyroid transcription factor, Synonym: Homeobox protein Nkx2.1 ), MZF-1 (Myeloid zinc finger 1 ), und pu- tative Bindungsstellen für HSF2 (Heat shock factor 2) und USF (Upstream stimula- ting factor). Es wurde keine TATA -Box in der proximalen Napsin A-Promotorregion gefunden. Die GC-reiche TATA-Iose proximale Promotorregion des CTSH-Gens (~ - 1.200/+0.001 -kb) zeigte in der Nähe zum Transkriptionsstart Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren SP-1 , GATA-2 und GATA-X, gefolgt von auffallend vielen Bindungsmotiven für die Transkriptionsfaktoren MZF-1 und GATA-1. In der distalen CTSH Promotorregion (~ -2800/-1200 -kb) fanden sich Bindungsstellen für p300 (Histonacetyltransferase p300), AML-I a, Sox-5, und u. a. für die Transkriptionsfaktoren TTF-1 und Foxa2.

Unter der (maladaptiven) ER-Stressantwort in den Typ-Il Zellen ist in der vorliegenden Anmeldung diejenige zelluläre Antwort bzw. Reaktion zu verstehen, welche durch die gestörte Prozessierung des SP-B durch Minderexpression oder das Fehlen der Protease Napsin A und/oder der Protease Kathepsin H ausgelöst wird oder in ursächlichem Zusammenhang damit steht und schließlich zum Tod der Typ-Il Zellen führt.

Die durch Effektormoleküle bzw. Agentien zu regulierende Zellreaktion im Zusam- menhang mit oben erwähnten Krankheiten ist folglich die (apoptotische) ER- Stressantwort. Diesbezüglich wurden Napsin A und Kathepsin H als primäre Zielmoleküle identifiziert, wobei die Verhinderung der Apoptose der alveolären Typ-Il Zellen alternativ auch über die Blockierung der zur Apoptose führenden Signaltransduk- tionspfade erfolgen kann, wie dies weiter unten beschrieben wird.

Deshalb ist das genannte Arzneimittel besonders vorteilhaft, wenn es sich bei den die maladaptive ER-Stressantwort regulierenden Agenzien um eines oder mehrere der folgenden handelt:

- ein die Menge an in den alveolären Typ-Il-Zellen vorhandenem Napsin A regulie- rendes Agens,

- ein die Menge an in den alveolären Typ-Il-Zellen vorhandenem Kathepsin H regulierendes Agens,

- ein ein TTF-1 -Polynukleotid enthaltendes Agens,

- ein ein SREBP-Polynukleotid (genauer: prozessierte nukleare Transkriptionsfakto- ren SREBP-1 a, SREBP-1 c, SREBP-2) enthaltendes Agens,

- ein ein Foxa2-Polynukleotid enthaltendes Agens,

- ein ein AP-1 -Polynukleotid enthaltendes Agens,

- ein ein SP-1 -Polynukleotid enthaltendes Agens,

- ein ein C/EBPα-Polynukleotid enthaltendes Agens, - ein ein GATA-1 ,-2,-3, oder GATA-X (X=5,6)-Polynukleotid enthaltendes Agens,

- ein ein MZF-1 -Polynukleotid enthaltendes Agens,

- ein ein Sox-5-Polynukleotid enthaltendes Agens,

- ein ein ReI B, c-Rel, und p65, NF-kappa-B p105 subunit und NF-kappa-B p100 su- bunit (NFκB-Komponenten)-Polynukleotid enthaltendes Agens,

- ein ein USF1/2 -Polynukleotid enthaltendes Agens,

- ein ein HSF2 -Polynukleotid enthaltendes Agens,

- ein p300- -Polynukleotid enthaltendes Agens,

- ein ein AML-I a (RUNX)- Polynukleotid enthaltendes Agens,

5 - ein ein Homeobox protein CDX-1 Polynukleotid enthaltendes Agens,

- ein Napsin-A-Polypeptid

- ein Kathepsin-H-Polypeptid

- ein Runt-related transchption factor 1 Polypeptid

- ein Homeobox Protein CDX-1 Polypeptid

I O - ein Polypeptid, das durch eines der oben genannten Polynukleotide oder Teile davon kodiert wird, wobei es bevorzugt ist, dass falls es sich beim Polypeptid um das durch das SREBP-Polynukleotid kodierte Polypeptid handelt, es einer der folgenden prozessierten Transkriptionsfaktoren ist: SREBP-I a, SREBP-I c oder SREBP-2,

- bronchoalveoläre Stammzellen und/oder

15 - unbehandelte und/oder ex vivo zu alveolären Typ-Il-Zellen differenzierte Stammzellen aus dem Knochenmark und/oder

- unbehandelte und/oder ex vivo zu alveolären Typ-Il-Zellen differenzierte pluripotente Stammzellen aus Hautfibroblasten und/oder

- Zellen, in denen die Expression eines oder mehrerer Gene verändert ist, wobei die .0 genannten Gene ein oder mehrere der oben genannten Polynukleotide oder Teile davon enthalten, wobei die Teile mindestens so lang sind, dass die bekannte Aktivität der genannten Proteine sichergestellt ist. Es handelt sich dabei um eine gezielte Veränderung der Expression.

.5 Dem Fachmann ist bekannt, wie die Expression eines Gens zu verändern ist. Die Veränderung der Expression kann sowohl auf der Ebene der Transkription als auch auf der Ebene der Translation erfolgen, beispielsweise durch Knock-down, Knock-out (bspw. durch Deletion des Gens), Einsatz von regulatorischen Nukleotidsequenzen (bspw. induzierbare Promotoren), RNAi, Ribozyme oder durch eine andere in diesem

50 Text beschriebene oder dem Fachmann bekannte Methode. Als Referenzpunkt (d.h. als Beispiel für eine „unveränderte Expression") dient die Expression (Stärke, Zeitpunkt etc.) der entsprechenden Wildtyp-Gene in ihrer natürlichen Umgebung, d.h. in einem gesunden Wildtyp-Organismus. Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Zellen, in denen die Expression eines

Gens verändert ist, um solche Zellen, die eines oder mehre der oben genannten Polynukleotide mit einer Transkriptionsrate transkribieren und/oder einer Translationsrate translatieren, die höher oder niedriger als diejenige von alveolären Typ-Il Zellen im gesunden Wildtyp-Organismus ist. Die genannten Zellen liegen vorzugsweise in Form einer autologen oder heterologen Zellpräparation vor.

Nach einer bevorzugten Ausgestaltung handelt es sich bei den Zellen um bronchoal- veoläre Stammzellen (z.B. wie beschrieben in: Kim et al, 2005 [3]) und/oder Typ Il Zellen (z.B. wie beschrieben in: Serrano-Mollar et al., 2007 [4]) und/oder unbehan- delte und/oder ex vivo differenzierte Stammzellen aus dem Knochenmark (z.B. dem Knochenmark entstammende, mesenchymale Stammzellen wie beschrieben in: Ortiz et al., 2003 [5]) und/oder pluripotente Stammzellen aus Hautfibroblasten (z.B. wie beschrieben in: Takahashi et al., 2007 [6]). Insbesondere Bronchoalveoläre Stammzellen sind aufgrund ihrer Pluripotenz bevorzugt. Von ihnen und alveolären Typ-Il Zellen ist aus Versuchen zum kompensatorischen Lungenwachstum nach Pneumektomie bekannt, dass sie zum Größenwachstum beitragen. Rückverwandelte, pluripotente Stammzellen aus der Haut sind im Kontext der vorliegenden Erfindung insbesondere wegen ihrer Verfügbarkeit besonders vorteilhaft. Die genannten Zellpopulationen können zur Korrektur der gestörten Surfactantprotein Prozessierung einge- setzt werden, wobei für die vorliegende Erfindung sowohl autologe als auch hetero- loge Stammzellen geeignet sind. Die genannten Zellen bzw. Zellpopulationen werden vorzugsweise entweder intratracheal instilliert (im Rahmen einer Bronchoskopie) oder aber inhalativ verabreicht (vorzugsweise per Venturi- oder Piezo-basierten Verneblertechnologien). Zell-gestützte Verfahren, die auf einen Ersatz der Funktion al- veolärer Typ-Il- Zellen gerichtet sind, sind nicht nur für IPF, sondern für alle Fibroseformen anwendbar, die mit einer Apoptose der alveolären Typ-Il Zellen einhergeht (z.B. DNA Schaden durch Medikamente, Bestrahlung oder infolge Telomerasemuta- tionen).

Von besonderer Bedeutung ist - z.B. als Modell für die Forschung - auch ein nicht-menschlicher Organismus oder isolierte Teile eines Organismus, die sich dadurch auszeichnen dass die Expression eines oder mehrerer Gene gezielt verändert ist (vgl. zur veränderten Genexpression auch Ausführungen oben), wobei die genannten Gene ein oder mehrere der folgenden Polynukleotide oder Teile davon

enthalten: TTF-1 , ein SREBP-Polynukleotid (genauer: prozessierte nukleare Transkriptionsfaktoren SREBP-I a, SREBP-I c, SREBP-2), Foxa2, AP-1 , SP-1 , C/EBPα, GATA-1 ,-2,-3, oder GATA-X (X=5,6), MZF-1 , Sox-5, ReI B, c-Rel, p65, NF-kappa-B p105 subunit, NF-kappa-B p100 subunit, NFκB-Komponenten, USF1/2, HSF2, p300, 5 AML-I a (RUNX), Homeobox protein CDX-1 Polynukleotid. Dabei sind bevorzugt ein oder mehrere der genannten Polynukleotide ganz oder teilweise entfernt oder deren Transkription und/oder Translation unterdrückt oder vermindert.

Beim nicht-menschlichen Organismus handelt es sich vorzugsweise um ein Säuge- I O tier (mit Ausnahme von Menschen), bevorzugt eine Maus. Bei den lebenden Teilen eines Organismus handelt es sich bevorzugt um eine oder mehrere Zellen gleicher oder unterschiedlicher Art und/oder gleichen oder unterschiedlichen Genotyps und/oder gleicher oder unterschiedlicher Entwicklungsstufe und/oder gleichen oder unterschiedlichen Differenzierungsstadiums, wobei diese Zellen beispielsweise in der 15 Form von Zellsuspensionen, Zellverbänden (Zellschichten, Zellhaufen etc.), Geweben, Organteilen oder Organen etc. vorliegen. Es handelt sich bei den lebenden Teilen eines Organismus beispielsweise um Teile, die (vorzugsweise mittels eines technischen Verfahrens) aus dem Organismus isoliert wurden. Sind es isolierte Teile eines Organismus, so handelt es sich beim Organismus vorzugsweise um einen Men- .0 sehen oder eine Maus.

Besonders bevorzugt ist in diesem Zusammenhang eine Maus, welche (vorzugsweise nach Kreuzung mit SP-CrtTA Mäusen und Doxycyclingabe) eines oder mehrere der folgenden Transgene im Alveolarepithel überexprimiert: p50ATF6, spliced

.5 XBP-1 , ATF4, shRNA gegen Napsin A, shRNA gegen Kathepsin H.

Durch die direkte Zuführung der für die Prozessierung des SP-B notwendigen Proteasen Napsin A und/oder Kathepsin H bzw. durch eine Regulation der Napsin A Transkription bzw. Translation und/oder der Kathepsin H Transkription bzw. Translation in alveolären Typ-Il Zellen, ebenfalls mit dem Ziel einer Erhöhung der Menge an

JO in der Zelle vorhandenem Napsin A und Kathepsin H Protein, wird eine Wiederherstellung der korrekten Prozessierung des SP-B bei Patienten mit IPF und NSIP erreicht.

Von besonderer Bedeutung ist ein genanntes Arzneimittel, wenn es sich beim die Menge an in den alveolären Typ-Il-Zellen vorhandenem Napsin A regulierenden Agens um ein die Napsin-A-Transkription und/oder die Napsin-A-Translation regulierendes Agens handelt, welches vorzugsweise ein Napsin-A-Polynukleotid enthält 5 und/oder es sich beim die Menge an in den alveolären Typ-Il-Zellen vorhandenem Kathepsin H regulierenden Agens um ein die Kathepsin-H-Transkription und/oder die Kathepsin-H-Translation regulierendes Agens handelt welches vorzugsweise ein Ka- thepsin-H-Polynukleotid enthält.

10 Aus dem Vorhandensein von Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren, welche sich sowohl im natürlichen Napsin A Promotor wie auch im natürlichen Kathepsin H Promotor finden, ergibt sich die Möglichkeit einer gleichzeitigen Transkriptionsregulation dieser beiden Gene. Bei diesen Transkriptionsfaktoren handelt es sich neben TTF-1 um sechs weitere Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen in der Promotorsequenz so-

15 wohl des CTSH(Kathepsin H)- als auch des λ//APS>A(Napsin A)-Genes. Diese sind im folgenden aufgeführt:

- Thyroid transcription factor 1 [TTF-1] (Synonym: Homeobox protein Nkx-2.1 ) [TTF-1 , Accession number (SwissProt): P43699] ist als Transkriptionsfaktor für Nap-

.0 sin A und SP-B bekannt; Zusätzlich konnte nun eine Bindungsstelle für TTF-1 im Kathepsin H-Promotor nachgewiesen werden).

- Runt-related transcription factor 1 (Synonym: Oncogene AML-1 ). Accession number (SwissProt): Q01196

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- Forkhead box protein A2 [Foxa2] (Synonym: Hepatocyte nuclear factor 3-beta (HNF-3-beta) (HNF-3B), Accession number (SwissProt): Q9Y261

- Transcription factor GATA-6 (Synonym:GATA-binding factor 6), Accession number 50 (SwissProt): Q92908.

- Transkriptionsfaktor Sox-5, Accession number (SwissProt): P35711.

- Transkriptionsfaktor AP-6 (activator protein 1 , Synonym: Proto.oncogene c-jun, Accession number (SwissProt): P05412.

- Transkriptionsfaktor SP-1 , Accession number (SwissProt): P08047. 5

Die Transkriptionsfaktoren GATA-1 und MZF-1 wurden hier in dieser Auflistung ausgeschlossen, da sie eindeutig - und auch mit einem höheren Score - im proximalen Promotorbereich des CTSH-Gens dominieren (Abb. 2).

I O Die anderen Transkriptionsfaktoren, die an die Promotorsequenz von NAPSA (Nap- sin A) und nicht von CTSH (Kathepsin H) binden werden im folgenden aufgeführt:

- SREBP-1 (Sterol regulatory element binding protein 1 ), Accession number (SwissProt): P36956;

15

- SREBP-2 (Sterol regulatory element binding protein 2), Accession number (SwissProt): Q12772;

- C/EBP alpha (CCAAT/enhancer-binding protein alpha (C/EBP alpha), Accession .0 number (SwissProt): P49715;

- Homeobox protein Cdx-A, Caudal-type homeodomain protein CDX1. Accession number (NCBI): NM_001804;

.5 - NFKB (Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit, Accession number (SwissProt): P19838), Nuclear factor NF-kappa-B p100 subunit, Accession number (SwissProt): Q00653;

sowie Bindungsstellen für die Elemente:

50 - USF (Upstream stimulatory factor 1 (Major late transcription factor 1 ), USF1 , Accession number (SwissProt): P22415, und Upstream stimulatory factor 2 (Upstream transcription factor 2) (FOS-interacting protein) (FIP) (Major late transcription factor 2), USF2, Accession number (SwissProt): Q15853;

- HSF2 Heat shock factor protein 2 (HSF 2) (Heat shock transcription factor 2) (HSTF 2), HSF2, Accession number (SwissProt): Q03933.

Die anderen Transkriptionsfaktoren, die an die Promotorsequenz von CTSH (Ka- thepsin H), und nicht von NAPSA (Napsin A) binden werden im folgenden aufgeführt:

- MZF-1 (Myeloid zinc finger 1 (MZF-1 ) (Zinc finger protein 42) (Zinc finger and SCAN domain-containing protein 6), MZF-1 , Accession number (SwissProt): P28698;

- Transkriptionsfaktor GATA-1 , Accession number (SwissProt): P15976;

- Transkriptionsfaktor GATA-2, Accession number (SwissProt): P23769;

- Transcriptionsfaktor GATA-3; Accession number (SwissProt): P23771 ;

sowie eine Bindingstelle für Histon Acetyltransferase p300; Accession number (SwissProt): Q09472.

Die direkte Einschleusung eines dieser Transkriptionsfaktoren, vorzugsweise des Transkriptionsfaktors Foxa2, als Polypeptid oder als Polynukleotid zwecks überexpression, wiederum vorzugsweise unter Kontrolle eines SP-C Promotors, bevorzugt in Verbindung mit einem oder mehreren CMV-Verstärkerelementen, erlaubt die erwähnte gleichzeitige Napsin A bzw. Kathepsin H Transkriptionsregulation.

Neben den oben genannten Trankskriptionsfaktoren kommen prinzipiell alle Signalmoleküle als Zielproteine in Frage, welche in die Napsin A und/oder Kathepsin H Produktion involviert sind, oder im Zusammenhang mit der ER-Stressantwort und der Apoptose von Typ-Il-Zellen stehen.

Dem Fachmann ist bekannt, wie die Wirkung eines Effektors auf die Aktivität eines Zielmoleküls festgestellt werden kann und wie die Produktion eines solchen Effektors zu bewerkstelligen ist.

Standard Bindungs-Tests umfassen beispielsweise immunologische Nachweisverfahren wie ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) oder RIA (radioimmunoas- say), mit Signaldetektion bei Bindung eines Effektormoleküls an ein markiertes Zielmolekül, oder sie erfolgen über den Nachweis der Induktion eines Reporter-Gens,

5 eine BIA (real-time bimoleculare interaction analysis), die Verwendung von Hefe- Zwei-Hybrid oder Drei-Hybrid-Systemen (yeast two-hybrid- oder three-hybrid Verfahren). Möglich ist auch eine Messung der Wanderungsgeschwindigkeit eines an ein Zielmolekül gebundenen Effektors bei der SDS Gelelektrophorese oder bei der Gelfiltrationschromatographie im Vergleich zu derjenigen eines Ungebundenen usw.

10

Im Rahmen eines Effektor-Aktivitäts-Tests, kann beispielsweise die Veränderung der katalytischen Aktivität eines Zielmoleküls nach Bindung eines Effektormoleküls festgestellt werden, woraus sich die Tauglichkeit des Effektors als Antagonist für das Zielmolekül ergibt.

15

Möglich ist auch die Feststellung der Veränderung der Genexpression des Zielmolekül-Gens in Gegenwart eines Effektors mittels Northern-Blot, real-time RT-PCR_(re- verse transcription-polymerase chain reaction; „Echtzeitanalyse" der Polymerase- Kettenreaktion) oder mit Hilfe von DNA-Microarrays (Genchips) etc.

>0

Soll die Produktion eines Polypeptids gemessen werden, so kann die in Gegenwart eines Effektormoleküls erhöhte oder verminderte Herstellung desselben in der Zelle beispielsweise mittels immunochemischer Methoden wie Western-Blot (Immunoblot- Technik), aber auch durch Proteomanalyse mittels zweidimensionaler (2D) Gelelekt-

.5 rophorese festgestellt werden.

Außerdem sind in vivo Tests zur Bestimmung der Effektor-Aktivität über das Auslösen einer messbaren zellulären Antwort in Gegenwart eines Effektormoleküls ebenfalls in der Literatur beschrieben. JO

Die Suche nach Effektormolekül-Kandidaten ist mit Hilfe heutiger Substanz- Bibliotheken (computergestütztes Synthesekonzept, sogenannte „Compound libra- ries"), mit Methoden der rechnergestützten Modellerstellung (computer-modelling)

zur Auffindung von ähnlichkeiten und Komplementaritäten und unter Verwendung der vorhandenen Hochdurchsatz (HTS)-Screening-Methoden kein Problem.

Wenn von einem beliebigen „Polypeptid X" die Rede ist, so soll darunter ein be- stimmtes Polypeptid, vorzugsweise die isolierte Wildtyp-Form im betrachteten Organismus, und/oder eine Menge (im mathematischen Sinne) an Polypeptiden verstanden werden, deren Elemente gegenüber der Wildtyp-Form eine Homologie der Aminosäurensequenz von mindestens 99%, 98%, 95%, 90% oder 80% aufweisen, wobei alle umfassten Polypeptide der Menge dieselbe definierte Funktion der Wildtyp-Form besitzen. Beim fraglichen „Polypeptid X" handelt es sich nicht um die Wildtyp-Form in ihrer natürlichen Umgebung, sondern um ein hergestelltes bzw. verändertes Polypeptid und/oder ein isoliertes Wildtyp-Polypeptid. Ist nichts anderes erwähnt, so wird unter Kurzbezeichnungen für Effektormoleküle wie ATF 4, ATF 6, XBP1 , CHOP, TTF1 , IRE1 , PERK, Bax, Caspase-4, etc. jeweils das reife Polypeptid verstanden.

Beispielsweise ist unter einem Napsin A Polypeptid ein bestimmtes Napsin A Polypeptid, vorzugsweise die isolierte Wildtyp-Form im betrachteten Organismus, vorzugsweise eines Säugers, besonders bevorzugt des Menschen, und/oder eine Menge an Napsin A Polypeptiden zu verstehen, deren Elemente zur Wildtyp-Form eine Homologie der Aminosäurensequenz von mindestens 99%, 98%, 95%, 90% oder 80% aufweisen, wobei alle umfassten Napsin A Polypeptide der Menge die Funktion der Napsin A Wildtyp-Form besitzen.

Natürlich sind dem Fachmann bekannte, gängige post-translationale Polypeptid- Modifikationen mit einzubeziehen, welche wiederum vom Organismus, in dem das Polypeptid hergestellt wird, abhängen. Dies ist besonders relevant bei der biotechnologischen Herstellung von Polypeptiden.

Die Herstellung von Polypeptiden ist bekannt. Diese werden z.B. rein chemisch syn- thetisiert oder in einer Vielzahl von eukaryotischen oder prokaryotischen Wirtszellen exprimiert und dann isoliert. Dabei müssen diese Zellen nicht notwendigerweise von der gleichen Spezies wie das zur Expression verwendete Polynukleotid stammen (Beispiel: Insulinproduktion [7]). Auch ist dem Fachmann bekannt, wie Fusionsproteine herzustellen sind z.B. um einen Transport des Polypeptids in ein bestimmtes Zell-

organell sicherzustellen oder zwecks späterer Isolation durch Affin itätschromatogra- phie.

Dem Fachmann stehen verschiedenste Expressionssysteme, von Mikroorganismen 5 wie E. coli K12 und Bacillus subtilis oder filamentöse Pilze (Aspergillus, Pichia pasto- ris, Saccharomyces cerevisiae) bis zu Insekten-, Pflanzen- oder Säugerzellen (tierische Tumorzelllinien , wie z. B . CHO-Zelllinien (Chinese hamster ovarian) oder MausMyelomzellen [NSO-GS]), zur Verfügung, welche je nach Bedarf verwendet werden. I O

Soll ein Polypeptid zwecks Isolation und Verwendung als Bestandteil eines Arzneimittels bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels produziert werden, so wird ein Expressionssystem gewählt, welches ausreichende Expression und eine passende Prozessierung des Polypeptids erlaubt. Letzteres beinhaltet nicht nur die korrekte 15 Bearbeitung durch Proteasen sondern beispielsweise auch Modifikationen wie Acety- lierung, Carboxylierung, Glykosylierung, Phosphorylierung etc. Eine Vielzahl solcher Expressionssysteme, einschließlich der Expressionsvektoren, der Zellen und der Handhabungshinweise, wie Transformationsanleitungen, sind im Handel erhältlich.

.0 Die Expression erfolgt in bekannter Weise beispielsweise unter Zuhilfenahme eines mittels bekannter rekombinanter in vitro DNA Techniken (recombinant DNA techni- ques), der synthetischen Chemie oder der genetischen in vivo Rekombination (gene- tic recombination) hergestellten Expressionsvektors, der die kodierende Nukleotidse- quenz sowie für die Transkription und Translation notwendige Kontrollelemente wie

.5 Verstärkerelemente (enhancer), Promotoren oder 5' oder 3' nicht-translatierte Regionen beinhaltet.

Die Isolation der produzierten Polypeptide aus Wirtszellen kann beispielsweise mittels Affinitätschromatographie erfolgen. Dem Fachmann sind aber auch diverse an- JO dere Methoden geläufig, beispielsweise Gelfiltrationschromatographie, lonenaus- tauschchromatographie, Ammoniumsulfat-Fraktionierung oder präparative Gelelektrophorese usw.

Das wirksame Agens der vorliegenden Erfindung wird den Patienten (vorzugsweise im Rahmen eines Therapieverfahrens), als Teil einer pharmazeutisch akzeptablen Komposition entweder oral, rektal, parenteral intravenös, intramuskulär oder subkutan, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, intravasculär, lokal (Puder, Salbe oder Tropfen) oder in Sprayform verabreicht. Pharmazeutisch akzeptable Kompositionen können die Modifikationen als Salze, Ester, Amide und "Prodrugs" beinhalten, sofern sie nach zuverlässiger medizinischer Beurteilung keine übermäßige Toxizität, Irritationen oder allergische Reaktionen am Patienten auslösen. Der Terminus "Prodrug" bezieht sich auf Verbindungen, die zur Verbesserung der Aufnahme transformiert werden, wie beispielsweise durch Hydrolyse im Blut. Dosierungsformen für die örtliche Administration des Impfstoffes dieser Erfindung schließen Salben, Puder, Sprays oder Inhalationsmittel ein. Die aktive Komponente wird unter sterilen Bedingungen, mit einem physiologisch akzeptablen Trägerstoff und möglichen Preservativen, Puffern oder Treibmitteln, je nach Bedarf, vermischt.

Bevorzugt findet die Verabreichung des Arzneimittels (vorzugsweise im Rahmen eines Therapieverfahrens) inhalativ statt, beispielsweise über eine Trockenvernebe- lung wie in WO 2006/108557 beschrieben, und zwar bevorzugt am spontan atmenden Patienten. Dies geschieht vorzugsweise unter Nutzung koapplizierter, spreitung- sfähiger Carrier wie Lipid/Surfactantprotein-Mischungen, ggf. auch nach Inkorporation eines der genannten Wirkstoffe, vorzugsweise eines Polypeptids, in das Innere der Surfactantmizellen. So kann die Aufnahmefähigkeit alveolärer Typ Il Zellen für kleine Surfactant-Aggregate (small Surfactant aggregates) und somit auch für exogen verabreichte Surfactantgemische, die einen der in dieser Anmeldung genannten Wirkstoffe, vorzugsweise ein Polypeptid, enthalten, ausgenutzt werden. Eine solche Aufnahme führt bereits in das frühe lysosomale Kompartiment.

Außerdem besteht die Möglichkeit der Herstellung eines Fusionsproteins, beispielsweise unter Verwendung von Surfactantprotein B und unter Einarbeitung einer Brü- cke zwischen SP-B und Zielprotein (Wirkstoff bzw. Effektor) die im sauren Milieu oder in Gegenwart der lysosomalen Proteasen schnell aufgelöst wird. Das HIV-Protein TAT ist beispielsweise in der Lage, eine effiziente Transduktion fusionierter Proteine in Effektorzellen bzw. deren Translokation in subzelluläre Kompartimente zu vermitteln. Nähere Angaben zur Verwendung solcher Methoden zur Einschleusung eines

Zielproteins bzw. zur Herstellung von Fusionsproteinen finden sich unter anderem in den Quellen [8], [9], [10] und [11]. Im Falle lysosomaler Speicherkrankheiten können lysosomale Enzyme effektiv über den Mannoserezeptor in die Zelle aufgenommen werden, was eine Anpassung der Glykosylierung des Fusionsproteins umfasst und 5 beispielsweise in den Quellen [12] und [13] erläutert wird.

Die Verwendung viraler Vektorsysteme ist ebenfalls denkbar, geht aber nicht selten mit unerwünschten inflammatorischen Prozessen einher. Dies wird im Falle rekonstituierter virus-ähnlicher Systeme vermieden. Jedoch können auch diese zur Immuni- I O sierung führen.

In Anbetracht des schnellen technologischen Fortschritts auf diesem Gebiet und in Abhängigkeit des einzubringenden Wirkstoffs, haben aber auch virenbasierte und andere bekannte Verabreichungstechniken ihre Bedeutung (vgl. auch Ausführungen 15 zu virenbasierten Systemen im Zusammenhang mit Polynukleotiden weiter unten).

Beim gegenwärtigen Wissensstand erscheint für die vorliegende Erfindung die Applikation eines Wirkstoffs in Form eines Polypeptids vorzugsweise in Verbindung mit Lipid/Surfactantprotein Mischungen am vorteilhaftesten. Bei diesem Ansatz ist eine .0 gute Steuerung der Dosis möglich.

Wenn von einem beliebigen „Polynukleotid X" die Rede ist, so soll darunter ein bestimmtes Polynukleotid, vorzugsweise die isolierte Wildtyp-Form im betrachteten Organismus, und/oder eine Menge an Polynukleotiden verstanden werden, deren EIe-

.5 mente für ein „Polypeptid X" wie oben definiert kodieren. Vorzugsweise hybridisieren die Elemente untereinander unter stringenten Voraussetzungen und/oder unterscheiden sich in ihrer Sequenz im Wesentlichen nur im Umfang der Degeneration des genetischen Codes. Beim fraglichen „Polynukleotid X" handelt es sich nicht um die Wildtyp-Form in ihrer natürlichen Umgebung, sondern um ein hergestelltes bzw.

50 verändertes Polynukleotid und/oder ein isoliertes Wildtyp-Polynukleotid.

Hybridisierung unter „stringenten Voraussetzungen" bedeutet die Hybridisierung von substanziell verwandten Nukleinsäuresequenzen, beispielsweise solche mit mindestens 85%, vorzugsweise mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95%

Sequenzübereinstimmung, bei 50-65 ⁰ C in einem Puffer beinhaltend 50% (v/v) For- mamid, 4 mM EDTA, 0.5 M NaH ₂ PO ₄ , 0.7 M NaCI, (pH 7.2) und 2% (w/v) SDS.

Die Herstellung von Polynukleotiden gehört zum Stand der Technik. Dem Fachmann stehen dazu nicht nur die synthetische Chemie, sondern insbesondere auch rekom- binante DNA Techniken zur Verfügung. Diese erlauben es ihm, Nukleotidsequenzen zu identifizieren, zu isolieren, zu vervielfältigen, zu verändern - beispielsweise durch Mutation -, mit anderen Nukleotidsequenzen zu verbinden etc. Die Verwendung von Restriktionsenzymen und Nukleotidsonden zur Isolation von Polynukleotiden, sowie der Einsatz von Standardaufreinigungsverfahren und Amplifikationstechniken wie der PCR sind ebenso bekannt wie die Verwendung von Klonierungsvektoren wie z.B. Plasmiden, Cosmiden, Abkömmlingen des Lambda Phagen, Phagmiden etc. Die Herstellung von Expressions- oder Replikationsvektoren etc. beinhaltend Standardelemente wie Origins of Replication (Replikationsursprung), Schnittstellen für Nuk- leasen, selektierbare Marker etc. ist im Stand der Technik ebenfalls ausführlich beschrieben.

Natürlich gibt es auch einige dem Fachmann geläufige regulatorische Nukleotidsequenzen, welche die Expression eines bestimmten Polynukleotids in der Wirtszelle fördern oder spezifisch zu einer Expression in einem bestimmten Zelltyp, einem Gewebe oder sogar zu einem spezifischen Zeitpunkt führen. Von besonderer Bedeutung ist diesbezüglich der SP-C Promotor, da mit dessen Hilfe eine spezifische Expression in Typ-Il Zellen erreicht werden kann. Sogenannte Verstärkerelemente (en- hancer) sind ein weiteres Beispiel für regulatorische Nukleotidsequenzen, wobei in diesem Zusammenhang besonders dasjenige des humanen Cytomegalovirus (CMV- enhancer) erwähnenswert ist, welches zusammen mit einem SP-C Promotor eine starke Expression in alveolären Typ-Il Zellen ermöglicht. Jedoch soll sich die vorliegende Erfindung nicht auf diese regulatorischen Nukleotidsequenzen beschränken, denn der Fachmann ist mit Hilfe weiter oben genannter Techniken in der Lage, ande- re passende Promotoren bzw. regulatorische Sequenzen zu finden, welche ebenfalls eine gezielte Expression in alveolären Typ-Il Zellen erlauben.

Um dem Arzneimittel Wirksamkeit zu verleihen, muss das zu dessen Herstellung verwendete Polynukleotid in einer Form im Arzneimittel vorhanden sein, die die Ein-

Schleusung des Polynukleotids in die Zellen des Patienten erlaubt. Deshalb sind für die Herstellung eines Arzneimittels auf Säuger angepasste Expressionssysteme von besonderer Bedeutung, bei Arzneimitteln auf Nukleinsäurebasis sind dies insbesondere virenbasierte Expressionssysteme. Dabei hat die Einschleusung von Polynuk- leotiden - verglichen mit derjenigen von Polypeptiden - den Vorteil, dass eine bessere Zellspezifität erreicht werden kann. Unter Verwendung des SP-C Promotors, unterstützt durch CMV-Elemente, erfolgt beispielsweise eine starke Expression exklusiv im alveolären Epithel.

Unter anderem wird ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet, wobei das zu exprimierende kodierende Polynukleotid in den adenoviralen Transkriptions- /Translations-Komplex ligiert wird, welcher den späten Promotor (late promotor) und die dreiteilige Leitpeptidsequenz (leader sequence) enthält. Die Insertion in eine nicht-essentielle E1 oder E3 Region des viralen Genoms erhält die Funktionsfähig- keit des Virus und führt zur Expression des zu exprimierenden Polynukleotids in der infizierten Wirtszelle.

Für eine Anwendung in der Säugerlunge ist die Virushülle des Japanischen Sendai Virus (SeV), bekannt auch unter dem Synonym Hemagglutinating Virus of Japan (HVJ), besonders geeignet, wie es beispielsweise im GenomONE™-Neo EX, HVJ Envelope VECTOR KIT ₁ (ISK, Ishihara Sangyo Kaisha, LTD., Japan), zum Einsatz kommt [14, 15].

Vorteilhaft ist deshalb ein genanntes Arzneimittel wenn es einen viralen Vektor oder Teile davon, vorzugsweise Hüllproteine des Japanischen Sendai Virus oder Teile davon, beinhaltet.

Die Einschleusung von Polynukleotiden erfolgt bevorzugt gekoppelt an Sendai Virus Hüllproteine oder TAT-Proteine und über eine inhalative Verabreichung, in Verbin- düng mit oder ohne Surfactantgemisch, wie oben beschrieben, um die Aufnahme ins respiratorische Epithel zu steigern. Dies führt zu einer unspezifischen Aufnahme durch Epithel und Alveolarmakrophagen, d.h..die Aufnahme von Surfactant- Komponenten (small Surfactant aggregates) ist insofern unspezifisch, als dass keine spezifischen Rezeptoren bekannt sind. Die aufgenommenen Surfactant-Komponenten wer-

den aber im Sinne eines Recyclings direkt in das lysosomale Kompartiment eingeschleust. Somit können Wirkstoffe bevorzugt in die Zelle und ins lysosomale Kompartiment eingebracht werden. Die Nukleotide können dabei über Sendai Virus Proteine alleine oder gegebenenfalls in Kombination mit Surfactant eingeschleust werden. 5 Alternativ kann ein adenoviraler, lentiviraler oder retroviraler Gentransfer stattfinden, wobei auch hier gegebenenfalls in Kombination mit einem Surfactantgemisch wie oben beschrieben gearbeitet wird.

Retroviren können nur proliferierende Zellen infizieren, weshalb sie vor allem für die 10 ex wVo-Therapie geeignet sind. Sie können jedoch in zahlreiche Zelltypen eindringen und besitzen darüber hinaus einen effizienten Mechanismus zur Integration des viralen Genoms, so dass eine stabile Expression der therapeutischen Gene erreicht werden kann.

15 Eine Transfektion von nicht-prolifeherendem Gewebe wird mit lentiviralen Vektoren, wie z.B. HIV-1 erzielt [16]. Grosse Bestandteile des viralen Genoms und die meisten viralen Gene können durch heterologe Sequenzen ersetzt wurden so dass das Sicherheitsrisiko einer Bildung pathogener Viren durch Rekombination der Vektoren reduziert wird [17].

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Für in s/fu-Gentherapieprotokolle sind auch die vorgenannten adenoviralen Vektoren von besonderer Bedeutung. Deren Vorteile sind hohe Virustiter, hohe Transfektion- seffizienzen und das Einbringen großer DHA-Inserts. Außerdem besitzen Adenoviren die Fähigkeit, spezifisch Atemwegsepithelien zu infizieren. Bei Vektoren der neues-

.5 ten Generation werden keine viralen Gene mehr exprimiert, dennoch muss die Im- munogenität noch reduziert werden [18-21].

Ein anderes DNA-Virus, das bereits in klinischen Studien getestet wird, ist das Ade- noassoziierte Virus [22, 23-26]. AAV-Vektoren sind besonders interessant, da sie JO einen effizienten Mechanismus zur ortsgerichteten Insertion in das humane Chromosom 19 besitzen. Auf diese Weise wird eine lang andauernde, stabile Expression des Transgens erreicht [27, 28].

Nichtvirale Gentransfer-Systeme bieten gegenüber viralen Systemen gewisse Vortei- 55 Ie, vor allem im Hinblick auf ihre Sicherheit und Herstellung. Vollständig synthetische

Gentransfer-Systeme vermeiden die Gefahr der Rekombination des Virus oder toxische Effekte, die durch Verunreinigungen mit biologisch aktiven Viruspartikeln auftreten können [22]. Kritisch für einen erfolgreichen Einsatz von DNA als Therapeutikum ist jedoch die Transfektionseffizienz, die bei synthetischen Gentransfer-Systemen 5 noch verbessert werden muss.

Liposomen sind beispielsweise geeignete Vektoren. Deren Herstellung wird u.a. in US 4,522,811 beschrieben. Im Gegensatz zu den viralen Systemen haben Liposomen weniger antigene Wirkungen auf den Organismus. Zudem besteht bei der virus-

I O freien übertragung keine Gefahr einer Rekombination. Die mizellenartigen Fettemulsionen sind positiv geladen und verbinden sich mit der negativ geladenen DNA zu einem zellmembrangängigen Komplex. Helferlipide, z.B. Dioleoylphosphatidylethano- lamine (DOPE), erleichtern das Eindringen der DNA in die Zielzelle durch Membranfusion oder Endozytose [29-31].

15

Alternativ zur genannten Ursachenbekämpfung durch Hebung der Napsin A bzw. Kathepsin H Konzentration in den alveolären Typ-Il Zellen, bietet sich zur Lösung der gestellten Aufgaben auch die Unterbindung der maladaptiven ER-Stressantwort und die Blockierung von Apoptose-Signaltransduktionspfaden an. Auf diese Weise kann

.0 der UPR in Bezug auf ihre anderen Funktionen, d.h. die Erhöhung der Proteinfaltungskapazität, mehr Zeit gegeben werden, um das Gleichgewicht in der Zelle wiederherzustellen.

Vorteilhaft ist diesbezüglich ein genanntes Arzneimittel wenn es sich bei den die .5 maladaptive ER-Stressantwort regulierenden Agenzien um die Apoptose der alveolären Typ-Il-Zellen blockierende Agenzien handelt.

Im Prinzip kommen als Ansatzpunkte für eine Blockierung des programmierten Zelltods alle Elemente der Signaltransduktionspfade in Frage, welche durch den oben JO beschriebenen ER-Stress aktiviert werden und zur Apoptose der Typ-Il-Zellen führen. Es kann hier ebenfalls sowohl auf DNA- RNA- als auch auf Protein-Basis angesetzt werden. Dem Fachmann ist bekannt, wie er solche Zielmoleküle identifizieren bzw. auffinden und ihre Tauglichkeit im Sinne der Regulation der Napsin A bzw. Kathepsin H Menge in Typ-Il-Zellen bzw. im Zusammenhang mit der Blockierung der

proapoptotischen Signaltransduktionswege testen kann - zu den Methoden sei auf obige Ausführungen verwiesen.

Besonders vorteilhaft ist ein genanntes Arzneimittel, wenn es sich bei den die Apop- 5 tose blockierenden Agenzien um Stoffe handelt, von denen jeder einzelne die Menge eines oder mehrerer in den alveolären Typ-Il-Zellen vorhandener Moleküle, vorzugsweise Polypeptide, der folgenden Art reguliert: BiP/GRP78, ATF4, ATF6, XBP-1 , BAX, Caspase 4, CHOP, p53, Caspase-3.

Da das CHOP-Gen ausschließlich bei der maladaptiven ER Stressantwort in alveolä- I O ren Typ Il-Zellen von IPF-Lungen exprimiert wird und zur Einleitung des programmierten Zelltods führt, ist es besonders bevorzugt. In einer vorteilhaften Ausgestaltungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Blockierung der Apoptose deshalb mittels Silencing des CHOP-Gens unter Verwendung von RNAi (siRNA oder shRNA). Der Einsatz von CHOP-knock-outs zur Verhinderung der ER-Stress-induzierten 15 Apoptose wurde beispielsweise bereits durch Oyadomari et al. 2002 [32] beschrieben. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das CHOP-targeting RNAi (z.B. im Rahmen einer Therapie) vorzugsweise im 7-tägigen Intervall durch Verneblung, bevorzugt mit rSP-C Surfactant als „Carrier", in den Alveolarraum von Lungen der IPF- Patienten eingebracht, um die Typ-Il Zellen zu transfizieren bzw. die Expression des .0 CHOP-Gens in diesen zu inhibieren. Oben genanntes kann auch mit Caspase-3 bzw. Caspase-4 (murines Pendant: Caspase-12) durchgeführt werden. Um eine Zellspezi- fität für alveoläre Typ-Il Zellen zu erreichen kommt bei genannten Ansätzen vorzugsweise ein SP-C Promotor zum Einsatz.

Verschiedene siRNA werden dadurch getestet, dass Cy5-(Carbocyanin-Farbstoff) .5 oder Cholesterol-gelabelte (markierte) siRNA bzw.ungelabelte siRNA (wie z.B. in Fougerolles et al beschrieben) gegen CHOP in Lungen von Wildtyp-Mäusen durch Surfactant-Verneblung eingebracht werden. Der Cy5-Fluoreszenzlabel bzw. der Cho- lesterol-Label an der si-RNA ermöglichen hierbei eine Detektion der siRNA im Mauslungengewebe entweder durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie oder immunhisto- 50 chemisch durch Anfärbung von Gewebeschnitten mit einem spezifischen Antikörper gegen Cholesterin (wie z.B. in Fougerolles et al, 2007 beschrieben [33]). Als Nachweis für das Silencing des CHOP-Gens wird die Genexpression in Lungengewebe der behandelten Mäuse bzw. in isolierten alveolären Typ Il Zellen durch semiquanti-

tative RT-PCR mit spezifischen Primern bestimmt. Dem Fachmann sind die Gen bzw. cDNA-Sequenzen des humanen und murinen CHOP [human: NM_004083 (NCBI), mouse: NM_007837 (NCBI)] bekannt. Des Weiteren ermöglicht der Choles- terol-Label an der siRNA eine bessere elektrostatische Interaktion mit den Surfac-

5 tant-spezifischen Phospholipiden, was eine Inkorporation in die alveoläre Typ Il Zelle erleichtert. Ebenso ermöglicht eine elektrostatische Wechselwirkung des polaren Carbocyanin Cy5-Label eine nicht-kovalente Komplexbildung mit den Surfactantlipi- den. Nach einer weiteren Aus-gestaltung kann auch eine RNAi eingesetzt werden, die für die am ER lokalisierte Caspase 4 spezifisch ist.

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Die Gensequenzen bzw. Aminosäuresequenzen der genannten Polypeptide sind in der Proteindatenbank „SwissProt" verfügbar und werden im Folgenden aufgeführt:

- ATF-4 (Activating transcription factor 4), Accession No P18848

- ATF-6 alpha (Activating transcription factor 6 alpha), Accession No P18850 15 - XBP1 (X-box binding protein 1 ), Accession No P17861

- CHOP (C/EBP-homologous protein), Synonym (Growth arrest and DNA-damage- inducible protein GADD153), Accession No P35638

- IRE1 alpha (Inositol-Requiring Protein 1 ), Accession No O75460

- PERK (PKR-like ER Kinase, Pancreatic elF2-alpha-Kinase), Accession No >0 Q9NZJ5)

- Bax alpha, Accession No Q07812

- Bax beta, Accession No Q07814

- Caspase 4, Accession No P49662 I - p53, Accession No P04637

.5 - Caspase 3, Accession No P42574

Da es sich bei BiP um den Hauptregulator für die drei proximalen ER-Stress Signalproteine IRE1 , PERK und ATF6 handelt, der diese durch seine Dissoziation aktiviert, kann durch eine Erhöhung der in der alveolären Typ-Il Zelle vorhanden BiP-Menge 50 eine ER-Stressantwort abgeschwächt oder unterbunden werden. Dies kann beispielsweise durch die Zuführung des BiP Polypeptids selbst, oder durch Einführung des für BiP kodierenden Polynukleotids zwecks überexpression in der Zielzelle erfolgen.

Eine Arzneimittel der genannten Art zeichnet sich also bevorzugt dadurch aus, dass das die Menge an in den alveolären Typ-Il-Zellen vorhandenem BiP/GRP78 regulierende Agens ein BiP/GRP78 Polynukleotid und/oder ein BiP/GRP78 Polypeptid enthält oder ist.

In Bezug auf eine Inhibition bzw. mengenmäßige Reduzierung der maladaptiven, proapoptotischen ER Stress-Polynukleotide (beispielsweise ATF-4, CHOP, Caspa- se-4), der Apoptose-Markerpolynukleotide (BAX, Caspase-3) und/oder der Polypeptide für die die genannten Polynukleotide kodieren und/oder des zellulären Wächter- moleküls p53 kommen verschiedene Ansätze in Betracht. Ist das Zielmolekül ein Polynukleotid, beispielsweise eine CHOP-DNA bzw. ein CHOP-RNA-Transkript so bieten sich für dieses Zielmolekül spezifische Antisense-Oligonukleotide bzw. RNAi- Konstrukte, insbesondere siRNA, oder Ribozyme an. Ist das Zielmolekül ein ATF4- Signalprotein so kann beispielsweise mit Antikörpern, Peptidinhibitoren oder „small molecules" (niedermolekulare synthetische Moleküle) gearbeitet werden. Diese Antagonisten können wiederum als solche in die Zielzelle eingebracht werden oder in der Form von DNA, welche anschließend transkribiert und gegebenenfalls translatiert werden muss, um den eigentlichen Effektor zu ergeben.

Bevorzugt ist ein genanntes Arzneimittel folglich dann, wenn die Stoffe, welche die Menge der genannten Moleküle, vorzugsweise Polypeptide, regulieren, von einer oder mehreren der folgenden Arten und für ihr jeweiliges Zielmolekül spezifisch sind:

- eine RNAi

- ein Ribozym - ein Antisense-Oligonukleotid,

- ein Antikörper

- ein kompetitiv antagonisierendes small molecule

- ein Polynukleotid, welches zur Herstellung der genannten spezifischen RNAi, Ribozym, Antisense-Oligonukleotid, Antikörper und/oder small molecule in der Zelle führt oder für dieses kodiert, wobei es sich beim oben genannten Zielmolekül um das Polypeptid handelt, dessen Menge reguliert werden soll oder um das für dieses Polypeptid kodierende Polynukleotid oder um ein Signalmolekül, vorzugsweise ein Polypeptid, welches upstream bzw. downstream im proapoptotischen Signaltransduk-

tionspfad vom Polypeptid, dessen Menge reguliert werden soll, wirkt oder um ein für genanntes Signalmolekül kodierendes Polynukleotid.

Die organische Substanz 4-Phenylbutyrat (4-PBA) ist in vitro und teilweise auch in

5 vivo als Faltungshelfer für missgefaltete Proteine und daher als ER Stressreduzierendes Agenz bei den Konformationserkrankungen Zystische Fibrose, αr Antitrypsin-Mangel und Diabetes mellitus in der Literatur (vgl. Rubenstein et al. 1997 [34]) beschrieben worden. Im Zusammenhang mit ER Stress-Erkrankungen ist dieser Stoff ebenfalls interessant. Er erhöht zudem die Expression der Chaperone Hsc-70

I O und Hsp-70, die zu der Familie der Hitze-Schock-Proteine gehören. Diese chemische Substanz ermöglicht die Faltung von intrazellulär akkumulierten, missgefalteten Proteinen und damit ein korrektes intrazelluläres targeting dieser Proteine, was zur „Clearance" im gestressten ER führt und damit die potentielle Einleitung von Apopto- se unter schweren ER-Stress-Bedingungen verhindert.

15

Ebenso wurde für das Antioxidanz Butylhydroxyanisol (BHA) in der Literatur eine an- tiapoptotische Funktion beschrieben, da es maladaptive ER Stress-Konditionen, die aufgrund der Hochregulation der oxidativen Faltungsmaschinerie durch den pro- apoptotischen Transkriptionsfaktor CHOP unter schwerem ER Stress zudem noch

.0 mit der Entstehung von reaktiven Sauerstoffverbindungen (ROS) verbunden sind, auflösen kann [35]. Es ist ebenfalls bereits beschrieben worden, dass BHA in vitro und in vivo die Faltung und das korrekte Targeting von missgefalteten sekretorischen Proteinen weitreichend verbessern konnte, was zur Auflösung von ER Stress und apoptotischen Vorgängen führte [35].

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Aus der Literatur ist bekannt, dass die organische Substanz Salubrinal (vgl. z.B. Boyce et al. 2005 [36]) (C ₂ IHi ₇ N ₄ OSCI ₃ , erhältlich bei Tocris Bioscience, LD ₅ O >100μM) in einer Konzentration von 15 μM Schutz gegen ER Stress-induzierten Zelltod durch den Protein-N-glykosylierungshemmstoff Tunicamycin bietet. Es aktiviert

50 nicht die kanonischen transkriptionsaktivierenden UPR-Zielproteine, sondern selektiv die ER-Iokalisierte Kinase PERK, so dass elF2α dosisabhängig rasch und widerstandsfähig phosphoryliert wird, dem folgend die globale Proteinsynthese am gestressten ER herunterreguliert wird, und so die durch den apoptotischen Transkriptionsfaktor CHOP induzierte Dephosphorylierung von elF2α unter maladaptiven ER

Stress-Bedingungen durch Salubrinal gegenreguliert wird. Dadurch kann Salubrinal die Anhäufung m issgefalteter Proteine korrigieren. Salubrinal verhindert damit auch die Synthese und Anhäufung von mutanten missgefalteten Proteinen (wenn eine Genmutation der Ursprung für Missfaltung und ER Stress ist.)

Als Agentien, die die in den alveolären Typ-Il Zellen auftretende ER-Stressantwort regulieren, sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung außerdem Caspase- Inhibitoren von Bedeutung. Vorteilhaft sind kleine Peptide mit Sequenzen von Cas- pase-Substraten, die sich an das aktive Zentrum der Proteasen anlagern und damit deren proteolytische Aktivität blockieren. Bevorzugt ist hierbei der Pancaspase- Inhibitor IDN-6556 (oder auch Z-VAD-FMK = Z-Val-Ala-Asp-Fluoromethylketon, Ka- miya Biomedical Company), der mehrere Initiator- und Effektor-Caspasen blockieren kann. Wie in der Literatur beschrieben, kann damit die Wirksamkeit einer Caspase- Blockade bzw. die Reduktion von Apoptose bei chronischer Virushepatitis C, welche mit einer Zelldestruktion der Hepatocyten und einer Fibrose verbunden ist, erreicht werden. Ebenso wird auch eine Reduktion der laborchemischen Transaminasener- höhung festgestellt. In Tiermodellen der Leberfibrose ist die erfolgreiche Anwendung des Pancaspase-Inhibitors seit längerem bekannt [37]. Von Bedeutung für die vorliegende Erfindung ist beispielsweise die inhalative Applikation des Pancaspase- Inhibitors Z-VAD an Patienten mit sporadischer und familiärer IPF wie in Beispiel 3 (mit rSP-C Surfactant „als Carrier").

Weiterhin von Bedeutung als Agens, das die in den alveolären Typ-Il Zellen auftretende ER-Stressantwort reguliert, ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung außer- dem der Caspase-4-lnhibitor Z-LEVD-FMK (Z-Leu-Glu-Val-Asp-Fluoromethylketon, BioVision Research Products), um dadurch vorzugsweise die als einzige am ER lokalisierte Caspase-4 in alveolären Typ-Il Zellen zu inhibieren.

Bei den beschriebenen Agentien, die die in den alveolären Typ-Il Zellen auftretende ER-Stressantwort regulieren, handelt es sich um Inhibitoren der maladaptiven ER Stressantwort und/oder um eine oder mehrere der folgenden niedermolekularen organischen Substanzen: 4-PBA und/oder BHA und/oder Salubrinal und/oder es handelt sich um einen Pancaspaseinhibitor und/oder einen Caspase-4-lnhibitor.

Von besonderer Bedeutung für die vorliegende Erfindung (z.B. im Rahmen einer Therapie) ist eine inhalative Applikation von chemischen Chaperonen wie 4-PBA und BHA und/oder von Salubrinal und/oder von Pancaspase-Inhibitoren an Patienten mit sporadischer und familiärer IPF (missgefaltetes SP-C, Telomerase-Mutationen). Zu diesem Zweck werden die genannten Agenzien (vorzugsweise im 7-tägigen Intervall) bevorzugt durch Verneblung mit rSP-C Surfactant „als Carrier" appliziert, d.h. bevorzugt in den Alveolarraum von Lungen der IPF-Patienten eingebracht, um speziell die Typ Il Zellen zu erreichen bzw. den ER Stress aufzulösen. Alternativ wird statt des rSP-C Surfactant oder zusätzlich dazu auch mit 0.9% NaCI-Lösung als Carrier gear- beitet, da diese organischen Substanzen relativ leicht die Zellmembranen durchdringen.

Unter dem Begriff „Antikörper" sind sowohl intakte Immunoglobulin-Moleküle als auch Fragmente davon, welche an ein Epitop binden können, zu verstehen, einschließlich solche, die nur aus einer Kette bestehen.

Die Herstellung von monoklonalen wie auch polyklonalen Antikörpern ist Stand der Technik, was auch für chimere Antikörper, beispielsweise solche, die durch ein SpIi- cing von Maus-Antikörpergenen in menschliche Antikörpergene entstanden sind, gilt. Auch die Techniken zur Anpassung von Antikörpern auf den Menschen zwecks Verminderung einer Immunantwort sind bekannt. Des Weiteren kennt der Fachmann diverse immunologische Testmethoden, um die Bindungsspezifität dieser Antikörper zu prüfen, und ihre inaktivierende Wirkung kann ebenfalls in Standardverfahren, beispielsweise Aktivitätstests festgestellt werden, wie dies weiter oben beschrieben wurde.

Bei den Antisense-Oligonukleotiden handelt es sich um ca. 11 - 50 Nukleotide lange DNA- oder RNA-Moleküle, welche zu einer bestimmten DNA- oder RNA-Sequenz komplementär sind und in der Zelle mit dieser hybridisieren, was die Transkription bzw. Translation behindert.

„Small molecule" ist die Bezeichnung für kleine Oligo- oder Polypeptide oder chemisch synthetisierte peptidartige Moleküle, welche bevorzugt die aktive Stelle eines Ziel-Polypeptids binden und dieses dadurch inaktivieren. Alternativ kann das small

molecule auch an einer vom Substrat verschiedenen Bindungsstelle binden (alloster- ische nicht-kompetitive Hemmung). Außerdem kann die Bindung von small molecu- les an einen Rezeptor erfolgen, wodurch eine agonistische oder antagonistische Wirkung ausgelöst wird. „Small molecules" können aber auch organische Substanzen 5 sein, die ein Targetmolekül (z. B. ein missgefaltetes Protein) günstig in der Struktur/Konformation verändern und damit dessen korrektes intrazelluläres targeting ermöglichen (z. B. chemische Chaperone).

Der Fachmann ist mit den Methoden zur Herstellung bzw. zum Auffinden genannter 10 Effektoren vertraut, wie sie beispielsweise in [38] beschrieben werden. Bindungsund Aktivitäts-Tests zur Identifikation bzw. zum Auffinden passender Effektoren sind weiter oben beschrieben.

Zusammenfassend eröffnet die Erfindung einen neuen Behandlungsansatz unter anderem bei Patienten mit sporadischer Idiopathischer Pulmonaler Fibrose, der als 15 wesentlichen Teil die Wiederherstellung einer korrekten Prozessierung des hydrophoben Surfactant Proteins B und/oder die Blockade der epithelialen maladaptativen ER-Stress-Antwort bzw. der Apoptose umfasst.

Kurze Beschreibung der Abbildungen: >0

Abb. 1 : Gezeigt sind hier bronchoalveoläre Lavagen (BALF) von Patienten mit

IPF bzw. gesunden Probanden. Es wurden gleiche Volumina an BALF aufgetragen, gelelektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und mittels spezifischer Antikörper im Immunoblot nachgewiesen. Erkennbar ist der .5 weitreichende Verlust maturen SP-Bs und SP-Cs, bei gleichzeitigem

Auftauchen des nichtprozessierten Pro-SP-Cs (21 kDa).

Abb. 2: Bioinformatische Promotoranalyse von Napsin A und Cathepsin H, durchgeführt mittels der Computerprogramme „Matlnspektor vertebrate 50 matrix l ibrary (Genomatix)" u nd der „TFS EARCH " Software

(www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH). Angezeigt ist der Transkriptionsstart (+1 ) und der Translationsstart (ATG) des NAPSA- und CTSH Gens, sowie Bindungsstellen für putative Transkriptionsfaktoren (das Startnukleotid der Konsensus-Sequenz ist angegeben). In dieser Analy-

se wurden nur Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen mit einem hohen Score berücksichtigt. Bei beiden Genen wurde keine TATA-Box gefunden.

5 Abb. 3: Vektorkarte für die Klonierung von CMV Enhancer Elementen p1#_CMV SPC-pro_EGFP/u-PA: ca 530bp Enhancer Element p2#_CMV SPC-pro_EGFP/u-PA: ca 330 bp Enhancer Element

Abb. 4: Fluoreszenzsignale: Transfektion von Chinesischen Hamster Ovarial-

I O zellen (CHO-Zellen, A-E) und murinen Lungenepithelzellen (MLE-12

Zellen, F-J) mit den klonierten Vektorkonstrukten aus Abb. 1 im Vergleich zu reinen SP-C- bzw. CMV Promotorvektoren.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert, wobei diese 15 Erfindung nicht auf besagte Ausführungsformen beschränkt ist. Der Inhalt aller in dieser Anmeldung genannten Schriften, beinhaltend wissenschaftliche Abhandlungen, Patente und Patentanmeldungen, sind als Teil des Inhalts dieser Anmeldung anzusehen, da es nicht zweckdienlich ist, den Stand der Technik in Bezug auf theoretische Erkenntnisse und hinsichtlich der praktischen Umsetzung von dem Fach- .0 mann bestens bekannten Techniken, zu wiederholen.

Beispiel 1 : Expression von Transgenen mittels SP-C Promotor/CMV Enhancer Elementen in epithelialen Zellen:

.5 Zur Optimierung des zellspezifischen Gentransfers in alveolären Typ Il Zellen wird der den SP-C Promotor enthaltenden Expressionsvektor um CMV-Enhancer Elemente ergänzt.

Hierzu werden 2 Fragmente des CMV Enhancers unterschiedlicher Größe mittels 50 PCR amplifiziert und in den Expressionsvektor upstream vom SP-C Promotor klo- niert. Als Template zur Amplifikation der Enhancer Elemente dient der den CMV- Promotor enthaltende Vektor pcDNA 3.1. Als Expressionsvektor dient ein modifizierter pUC 18 Vektor, der neben dem SP-C Promotor die cDNA für Urokinase (uPA) und EGFP (enhanced green fluorescent protein) enthält. Man vergleiche dazu die

Abb. 3, auf der die Vektorkarte für die Klonierung von CMV Enhancer Elementen gezeigt wird, wobei:

p1#_CMV SPC-pro_EGFP/u-PA: ca 530bp Enhancer Element 5 p2#_CMV SPC-pro_EGFP/u-PA: ca 330 bp Enhancer Element

Mit den so hergestellten Vektoren werden CHO-K1 (Chinese Hamster Ovarian) Zellen und murinen Lungenepithelzellen (MLE-12 Zellen) transfiziert.

I O Abb. 4 zeigt die Transfektion der Chinesischen Hamster Ovarialzellen (CHO-Zellen, A-E) und murinen Lungenepithelzellen (MLE-12 Zellen, F-J) mit den klonierten Vek- torkonstrukten aus Abb. 3 im Vergleich zu reinen SP-C- bzw. CMV Promotorvektoren. Die Transfektion erfolgt auf 24-well Platten (2,5x10 ⁴ CHO Zellen, 6x10 ⁴ MLE12 Zellen) unter Verwendung von Lipofectamin (Lipo) bzw. Polyethylenimmin (PEI) als

15 Transfektionsreagenzien (0.8μg Plasmid + 2μl Lipofectamin 2000, bzw. PEI in einem N/P Verhältnis von 12.5). Die erfolgreiche Transfektion wird durch Detektion der Fluoreszenz des exprimierten GFP Proteins dokumentiert.

Unter Verwendung eines SP-C Promotorvektors ohne Enhancer Elemente wird in .0 MLE-12 Zellen nur eine geringe Transfektionsraten erzielt (Abb. 4, Nr H). Durch die CMV enhancer Elemente wird die Transfektionseffizienz gesteigert (Abb. 4, Nr I, J) und liegt im Bereich dessen was mit einem reinen CMV- Promotorvektor erreicht wird (Abb. 4, Nr G).

Wie die Ergebnisse aus Abb. 4 Nr D und E zeigen, bleibt auch die Zellspezifität des .5 SP-C Promotorvektors erhalten: im Gegensatz zum reinen CMV Promotorvektor (Abb. 4, Nr B), mit dem sich auch die nicht alveolär-epithelialen CHO Zellen transfi- zierten Hessen, wird mit dem reinen SP-C Promotorvektor (Abb. 4, Nr C) und den SP- C Promotor/Enhancerkonstrukten keine Expression in CHO Zellen beobachtet.

50

Beispiel 2: Herstellung und Reinigung von rekombinanten therapeutischen Proteinen:

Dem Fachmann sind die cDNA-Sequenzen des humanen Napsin A [NM_004851 (NCBI)], des Kathepsin H [NM_004390 (NCBI)] und des humanen Grp78 5 [NM_005347 (NCBI)] bekannt.

Für die Expression humaner Proteine in Bakterien (Escherichia coli), filamentösen Pilzen (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae) und Insektenzellen stehen dem Fachmann verschiedene Expressionssysteme zur Verfügung.

Das Expressionssystem „QIAexpress" der Fa. Qiagen (Hilden, Deutschland) sieht die I O Klonierung der cDNA in sogenannte pQE-Vektoren vor, wodurch dem rekombinanten Protein amino- oder carboxyterminal eine Sequenz von sechs (oder acht) Histidinres- ten angefügt wird. Mit diesem 6χHis-Tag (8χHis-Tag) ist eine schnelle Reinigung des exprimierten Proteins über Affinitätschromatographie an Ni ²⁺ -NTA-Agarose möglich. An die Säulenmatrix ist Nitrilotriessigsäure (NTA) gebunden, welche vier der sechs 15 Koordinationsstellen der Ni ²⁺ -lonen besetzt und damit immobilisiert. Proteine mit che- latbindenden Seitengruppen wie Histidin können die freien Koordinationsstellen besetzen und binden so an die Säule. Besonders fest ist die Bindung von Hisβ- bzw. Hiss-Proteinen, sie ist stärker als die von Antigen/Antikörper-Komplexen. Die Elution der Proteine erfolgt durch das Anlegen eines Gradienten von 10 bis 250 mM Imida- .0 zol, das an die Nickelmatrix bindet und das Fusionsprotein verdrängt. Mit dem „QIAexpress"-System können humane Proteine in E. coli, aber auch in Insektenzellen überexprimiert werden. Zusätzlich wird für die Herstellung von rekombinanten humanen Hisβ-Fusionsproteinen auch das „Bac-N-Blue™ Baculovirus Expression System" der Fa. Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland) verwendet.

.5 Desweiteren stehen dem Fachmann sogenannte pGEX-Vektoren der Fa. Amersham Biosciences (USA) zur Verfügung. Hierbei wird ein Fusionsprotein zwischen dem C- Terminus der Glutathion-S-Transferase (GST, ca. 26 kDa) aus Schistosoma japoni- cum und dem N-Terminus des zu exprimierenden Proteins hergestellt. Dieses System bietet den Vorteil, dass die Bildung von Proteinen in unlöslicher Form während

50 der bakteriellen Expression, sogenannten inclusion bodies, seltener vorkommt, als bei der Verwendung des stark geladenen His-Tags. GST-Fusionsproteine können in Bakterien, Hefen, Insektenzellen und Säugerzellen exprimiert werden. Dem Fach-

mann stehen für die Expression von humanen GST-Fusionsproteinen in Insektenzellen das „Bac-to-Bac ^® Baculovirus Expression System" der Fa. Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland) zur Verfügung. Die Reinigung des GST-Fusionsproteins erfolgt über Affinitätschromatographie an Glutathion-Agarose. Eluiert wird mit 50 mM reduziertem Glutathion. Wegen der Größe des Tags (26 kDa) muß selbiger vom Protein abgespalten werden. Die pGEX-Vektoren besitzen zwischen dem kodierenden Abschnitt für die GST-Transferase und den Restriktionsschnittstellen zur Klonierung von gewünschten cDNA-Fragmenten noch eine DNA-Sequenz, die für eine kurze Amino- säure-sequenz kodiert und je nach verwendetem pGEX-Vektor eine Schnittstelle für die Protease Thrombin (pGEX-4T-1 , -4T-2, -4T-3), für Faktor Xa (pGEX-5X-1 , -5X-2, -5X-3) oder für PreScission-Protease (pGEX-6P-1 , 6P-2, 6P-3) darstellt. Nach der Spaltung müssen Proteasen, der GST-Tag und das Zielprotein durch Gelfiltrationschromatographie voneinander getrennt werden. Am einfachsten gelingt dies mit der PreScission-Protease. Diese besitzt ebenfalls einen GST-Tag und spaltet das Fusi- onsprotein direkt auf der Glutathion-Säule: Das Protein eluiert, die Protease bleibt auf der Säule.

In der Regel sind alle kommerziell erhältlichen GST-Vektoren mit DNA-Sequenzen versehen, die Schnittstellen für Proteasen darstellen, um den GST-Tag von den re- kombinanten Proteinen wieder zu entfernen.

Nach Aufreinigung werden die in E. coli, Hefen bzw. Insektenzellen hergestellten humanen rekombinanten Proteine mittels der Liposomentechnik und einer Verneb- lung in die Lunge eingebracht. Dabei dient ein auf rekombinanten SP-C (r-SP-C) basierender Surfactant (Venticute ^® ) als Liposomen-Präparation. Die Verneblung des rSP-C Surfactant an Mäusen ist seitens der Erfinder etabliert und erfolgt an spontan atmenden Mäusen mittels Trockenverneblers. Diese wird an SP-C knock out Mäusen durchgeführt mit dem Ergebnis, dass das exogen applizierte Surfactantmaterial innerhalb von zwei Tagen aus dem Alveolarraum in die Typ Il Zellen aufgenommen wird und damit der Beweis erbracht ist, dass die inhalative Verabreichung von Surfactant zu einer Aufnahme des rekombinanten SP-C Proteins, wahrscheinlich durch Pinocytose und nachfolgendem endosomalen Transfer in das lysosomale Komparti- ment, durch die alveolären Typ Il Zellen führt. Als Nachweis dient die Western Blot- Analyse von Lungengewebe der behandelten SP-C knock out Mäuse mit einem spezifischen Antikörper gegen SP-C.

Die rekombinant hergestellten, aufgereinigten therapeutischen Proteine Napsin A, Kathepsin H und Grp78 werden durch Verneblung mit rSP-C Surfactant als „Carrier" in die alveolären Typ Il Zellen eingebracht. Zuvor wird das therapeutische Protein mit dem Lipid/Surfactantprotein C-Gemisch bei 25°-37°C inkubiert, um eine Aufnahme dessen (durch elektrostatische Wechselwirkungen, nicht-kovalente Bindungen wie Wasserstoffbrückenbindungen, Van der Waals-Kräfte) oder sogar dessen Inkorporation in das Innere der Surfactantmizellen zu erreichen.

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