INTRACITOPLASMÁTICA

Campo de la invención

La presente invención se encuadra en el campo de la fertilidad masculina y se refiere a una placa para la selección de espermatozoides, así como un método de uso para la selección de espermatozoides.

Antecedentes de la invención

La microinyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) es la tecnología más empleada en la actualidad en los centros de reproducción asistida en todo el mundo. Para la realización de la ICSI hay que disponer los ovocitos maduros y de espermatozoides capacitados en microgotas depositados en una placa de plástico de poliestireno (por ejemplo, USP class VI). Para su uso comercial, esta placa debe ser estéril y debe ser embriotestada. En general, estas placas de ICSI se transportan a un microscopio invertido y con ayuda de los sistemas de micro manipulación el ovocito es sujetado mientras el espermatozoide es introducido en el mismo.

Para depositar espermatozoides en la placa de ICSI, la muestra seminal debe estar previamente capacitada, es decir el semen se prepara para ser utilizado en las distintas técnicas de reproducción asistida (TRA). Para ello se utilizan principalmente dos técnicas de capacitación espermática: gradientes de densidad y swim-up, cuya finalidad es la obtención de espermatozoides con buena morfología y motilidad. Estas mejoras se han trasladado en el desarrollo de nuevas técnicas de selección espermática con el objetivo de seleccionar espermatozoides más competentes para mejorar los resultados de los tratamientos de reproducción asistida (TRA).

El documento ES1229586U describe un dispositivo para la selección de espermatozoides mediante la aplicación de un gradiente de temperatura.

El documento WO2018154169A1 describe un dispositivo para la selección de espermatozoides según su morfología y capacidad de movimiento.

Sin embargo, estos dispositivos para la selección de espermatozoides no seleccionan espermatozoides con buena capacidad fecundante ni genéticamente normales ya que, entre otras cosas, no consiguen imitar las condiciones naturales que ocurren en el interior del tracto femenino. En condiciones in vivo, los espermatozoides en el interior del tracto femenino sufren una serie de cambios a nivel de membrana necesarios para poder fecundar al ovocito. Por el contrario, los documentos del estado de técnica sobre la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), no tienen en cuenta las condiciones naturales o fisiológicas para la selección del espermatozoide, ya que éste se introduce directamente en el interior de un ovocito maduro (en fase de Meiosis II, Mil) con la ayuda de una micropipeta.

Durante la fecundación natural, el complejo de células del cúmulo oóforo (COC) y su matriz extracelular (MEC) rodean el ovocito y sólo los espermatozoides que atraviesan el COC tienen la oportunidad de alcanzar y penetrar en la zona pelúcida y consecuentemente fertilizar el ovocito. Si el ovocito ovulado está completamente desprovisto de COC, permanece sin fertilizar.

Diversos estudios han demostrado que los espermatozoides capaces de atravesar el complejo del cúmulo oóforo presentan un mayor patrón de capacitación, mejor motilidad y morfología y una menor tasa de fragmentación del ADN (Naknam et al. , Effect of sperm selection method by cumulus oophorus complexes and conventional sperm preparation method on sperm quality and DNA fragmentation for assisted reproduction techonology, European Journal of Obstetrics and amp; Gynecology and Reproductive Biology (2019)).

El artículo científico Wang et al 208 (https://doi.Org/10.1016/j.fertnstert.2017.12.026) describe un disco que comprende áreas utilizadas para la selección de espermatozoides donde se utilizan células de COC. El disco comprende 2 áreas alargadas situadas directamente encima del disco y una pequeña área P para depositar PVP el medio de limpieza y llenado de las áreas de la placa. Áreas A1 and A2 were used to place the prepared spermatozoa; whereas area B1 was filled with células de cúmulo oóforo (COCs) and médium and area B2 with médium only; dichas áreas comprenden las áreas A1 y A2 para donde se colocaron los espermatozoides preparados, una zona B1 que se llenó con células de cúmulo oóforo (AOC) y medio y una zona B2 que se llenó únicamente con medio. Dicho artículo no describe si las áreas B1 y B2 son surcos en las placas o canales encima de la superficie de la placa, tampoco describe como es la forma o las dimensiones de dichas áreas sobre la placa.

El disco de Wang tiene la desventaja que no comprende un área donde se pueda realizar la microinyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Tal como se indica en dicho documento, esta etapa (ICSI) se lleva a cabo mediante extracción de los espermatozoides que llegan al área C por medio de una aguja de inyección ICSI, los cuales son transferidos posteriormente a otro plato ICSI convencional para su inyección en el óvulo. Este diseño ralentiza el proceso de microinyección intracitoplasmática e incrementa las probabilidades de contaminación de la muestra espermática.

Por lo tanto, existe la necesidad de solucionar los problemas anteriormente mencionados y proporcionar una placa adecuada para realizar la selección y la microinyección y que además permita una buena selección de espermatozoides.

Breve descripción de los dibujos

Para complementar la descripción y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, se acompaña como parte integrante de dicha descripción un juego de dibujos en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:

Figura 1 : Vista frontal superior de la placa de selección, donde se observa la porción (1) o zona de microinyección (1), de diámetro (a) y dos carriles (2a y 2b).

Figura 2: Vista frontal superior de un carril, donde se observa el compartimento de carga de la muestra de espermatozoides (3), el compartimento donde se colocan las células del cúmulo oóforo (4), el compartimento de recolección (5) y el conducto (6) que une los 3 compartimentos.

Figura 3: En la parte superior se observa la vista frontal superior de un carril (2) con las señales indicativas de las vistas transversales de los compartimentos (3) y (5) mostradas en la parte inferior, también se puede observar parte del conducto (6).

Figura 4: En la parte superior se observa la vista frontal superior de un carril (2) con la señal indicativa de la vista transversal longitudinal del mismo en la parte inferior, también se aprecian los compartimentos (3), (4) y (5) y el conducto (6).

Figura 5: Vista de perfil de la placa de selección (1) que comprende una protuberancia (7) que la rodea.

Figura 6: Vista frontal superior, paralela al plano de la superficie de la placa (1) donde se describe una realización de un carril (2), que comprende el compartimento de carga de la muestra de espermatozoides (3), el compartimento donde se colocan las células del cúmulo oóforo (4), el compartimento de recolección (5) y el conducto (6) que une los 3 compartimentos, donde el compartimento (4) tiene una tamaño y amplitud superior a los compartimentos (3) y (5).

Descripción detallada de la invención

Tal como se usa en el presente documento, el término "ovocito" se refiere a un gameto femenino, que puede ser inmaduro (profase I, Pl, metafase I, MI) o maduro (metafase II, Mil). Dicho ovocito maduro está en condiciones de ser fecundado por un espermatozoide. Preferiblemente, los espermatozoides de la invención son espermatozoides de mamíferos. Mas preferiblemente los espermatozoides se seleccionan de una lista que consiste en humanos, ganado y animales de compañía (que incluyen, pero sin limitación, caninos y felinos). Los espermatozoides de ganado pueden se bovinos, porcinos y/o ovinos. Los espermatozoides de animales de compañía pueden ser, caninos y felinos.

La expresión " células del cúmulo oóforo " se refiere a células en los folículos ováricos en desarrollo que están en proximidad directa o cercana de un ovocito. Las células del cúmulo son células de la granulosa que rodean al ovocito tanto en el folículo ovárico como después de la ovulación.

Como se usa en el presente documento, el término "esperma" o "espermatozoide" se refiere a un gameto reproductivo masculino. Una célula espermática uniflagelar que es móvil o no móvil también se conoce como un espermatozoide.

Los términos “ensanchamiento” y “compartimento” son sinónimos y se emplean de forma intercambiable.

El primer aspecto de la invención se refiere a una placa de selección fisiológica de espermatozoides para la ICSI que comprende una placa de selección (1) con al menos 1 carril (2) situado en una porción de la placa, teniendo cada carril tres compartimentos (3, 4, 5) donde:

El compartimento (3) es adaptado para recibir una muestra seminal procesada;

El compartimento (4) está adaptado para depositar células del cúmulo de oóforo y el compartimento (5) está adaptado para hospedar y recuperar espermatozoides de la muestra seminal procesada; estando los compartimentos (3) y (5) situados en los extremos del carril, el compartimento (4) situado entre los compartimentos (3) y (5) y todos ellos comunicados mediante un conducto (6).

El conducto (6) tiene la función de ayudar a conducir fluidos de un lugar a otro, preferiblemente entre los compartimentos (3), (4) y (5)

El termino porción de la placa se refiere a una de las 2 porciones o mitades divididas mediante el diámetro o eje longitudinal (a) de la placa de selección (Figura 1). Las porciones no tienen por qué tener exactamente la misma área. La placa de selección del primer aspecto tiene la ventaja que comprende 2 porciones, en una de las porciones se sitúa al menos un carril (2), y en la otra porción se sitúa la zona de microinyección (1) (ICSI), opuesta a la zona o porción donde se sitúa el carril (2).

A diferencia del estado de la técnica, el carril (2) está configurado como hendiduras o surcos en la placa (1). Esto permite asegurar el manejo de la placa y del material biológico, tanto la muestra seminal como la muestra de células del cúmulo del oóforo de manera segura, sin perdidas, ni derrames, ni contaminación entre ellas. Consecuentemente se obtienen un mejor rendimiento en el número de espermatozoides que llegan al carril (5). Preferiblemente, el carril (2) tiene forma circular, elíptica u ovalada, esto permite un mejor aprovechamiento de la muestra seminal y de la muestra de células del cúmulo del oóforo, reduciendo perdidas de dichas muestras en partes irregulares del carril (2). Consecuentemente se obtienen un mejor rendimiento en el número de espermatozoides que llegan al carril (5). De la misma manera los compartimentos (3, 4 y 5) así como el conducto (6) también se forman mediante una hendidura o surco en dicha palca (1). Esta disposición facilita trabajar sobre la placa evitando la interacción de la muestra seminal con las células del cúmulo del oóforo proporcionando una mejor selección y reduciendo y/o eliminando la contaminación de los diferentes compartimentos.

La placa comprende una zona o porción de microinyección (1) (ICSI), opuesta a la zona o porción donde se sitúa el carril (2), tal como se ve en la figura 1. Esta porción (1) o zona de microinyección (1) es adecuada y suficientemente grande para depositar los ovocitos y realizar la microinyección (ICSI) de los espermatozoides seleccionados en la otra porción que comprende el carril (2). La palca del primer aspecto tiene la ventaja que está adaptada para llevar a cabo la selección de espermatozoides y para llevar a cabo la etapa (ICSI). Los espermatozoides no tienen que ser extraído y transportados a otro plato ICSI para su inyección en el ovulo. Este diseño aumenta la rapidez del proceso de microinyección intracitoplasmática y disminuye significativamente las probabilidades de contaminación o perdida de la muestra espermática seleccionada.

En una realización preferida del primer aspecto, la zona o porción de microinyección (1) (ICSI), tiene un área entre 40-3,5 cm ² , preferiblemente entre 32-8 cm ² . Dicho tamaño es adecuado para depositar diferentes tamaños de muestras de ovocitos, lo que permite usar la placa del primer aspecto de la invención para diferente tipología de pacientes. Según la tipología de pacientes, estos necesitaran usar mayores o menores muestras de células granulosas para llevar a cabo la microinyección (ICSI).

En una realización preferida la placa del primer aspecto la zona de microinyección (1) está adaptada para depositar los ovocitos, preferiblemente como microgotas, al menos 2 microgotas que contienen ovocitos, más preferiblemente no más 6 microgotas.

En una realización preferida la zona de microinyección (1) comprende una hendidura o surco comprende para depositar los ovocitos, preferiblemente como microgotas, al menos 2 microgotas que contienen ovocitos, más preferiblemente no más 6 microgotas.

La disposición del carril (2) o carriles y la zona de microinyección (1) en la placa agiliza la etapa de ICSI y evita contaminaciones de las células del cúmulo oóforo sobre los ovocitos depositados en la porción opuesta. Por lo tanto, la placa del primer aspecto, proporciona una mejor selección y reduce y/o elimina la contaminación entre los diferentes compartimentos y porciones.

El carril (2) está configurado para recibir la muestra seminal, siendo dicha muestra incorporada a en el compartimento (3), donde el compartimento (3) está situado preferiblemente en un extremo. El carril (2) también está configurado para depositar las células del cúmulo del oóforo (4) en el compartimento (4), situado el centro, y para recuperar los espermatozoides que han llegado al compartimento (5). En una realización preferida, el compartimento (5) está situado en un extremo del carril, por lo tanto, El carril (2) está configurado para que los espermatozoides alcancen el compartimento (5), situado en el del extremo opuesto al compartimento (3). En una realización preferida, la placa de selección (1) presenta 2 carriles (2a) y 2b), estando el carril (2a) o (2b) situado paralelamente al otro carril (2a) o (2b) y/o estando ambos carriles 2(a) y 2(b) situados en la misma porción de la placa. Siendo dicha porción la parte inferior según se ve en la figura 1), de una de las 2 porciones divididas mediante el diámetro o eje longitudinal (a) de la placa de selección

En otra realización preferida del primer aspecto, la placa (1) comprende 2 carriles (2a) y (2b) paralelos situados a una la distancia de separación de al menos 3 mm, evitar contaminaciones entre los compartimentos de dos carriles diferentes, preferiblemente para evitar contaminaciones del material biológico (células del cúmulo del oóforo) del compartimento (4) en el compartimento (3) (muestra seminal). Preferiblemente, la distancia de separación es de al menos 5 mm, más preferiblemente 7 mm. La distancia de separación entre carriles se mide tomando como punto de referencia el centro de cada carril. En ningún caso los carriles podrán estar en contacto entre ellos.

La placa de selección puede presentar cualquier geometría, en una realización preferida la placa de selección es circular u ovalada, ya que se facilita el agarre y su manejo. A efectos de una mejor claridad, en el caso de que la geometría de la placa no sea regular, el diámetro o eje longitudinal de la placa a considerar para identificar cada porción de la misma es aquel que conecte los 2 extremos más distantes.

En una realización particular, la placa de selección (1) puede reutilizarse. En una realización preferida la placa de selección (1) es un artículo desechable configurado para un solo uso. En una realización preferida la placa de selección es de poliestireno, más preferiblemente el poliestireno tiene una densidad desde 1 - 1.1 g/CC, resistencia a la tracción de 35 - 50 MPa y/o un módulo de elasticidad desde 2.7-3.5 GPa.

En otra realización preferida del primer aspecto, la longitud del carril (2) está en un rango entre 15 y 40 mm, más preferiblemente entre 20 y 30 mm. En otra realización preferida, los carriles (2a) y (2b) pueden tener la misma longitud.

En otra realización preferida del primer aspecto, la distancia entre el eje longitudinal o diámetro de la placa de selección (a) y el carril más cercano al mismo es de al menos 3 mm, preferiblemente 5 mm, más preferiblemente 7 mm.

El carril de la placa de selección comprende al menos los compartimentos (3) (4), (5) comunicadas entre sí por un conducto (6), tal como se describe en las Figuras 2 y 3. El compartimento (3) es adecuado o configurado para para recibir una muestra seminal procesada, es decir donde se depositan los espermatozoides y está situado en los extremos del carril (2). El compartimento (3) también puede ser referido como compartimento de carga.

El compartimento (4) está configurado para depositar las células del cúmulo de oóforo y está situado entre los compartimentos de los extremos (3) y (5)

El compartimento (5), corresponde con el compartimento de recuperación, es decir, al área final donde llegaran los espermatozoides que han conseguido atravesar el compartimento (4). Los espermatozoides contenidos en el compartimento (5) podrán ser recuperados mediante medios de extracción, preferiblemente mediante microinyección ICSI con una micropipeta, para ser inyectados en etapas posteriores en el interior del ovocito.

En una realización preferida, la sección de los compartimentos (3), (4) y (5) está definida por un plano paralelo a la superficie de la placa (1). Dicha sección puede tener forma circular, ovalada, elíptica, cuadrada o rectangular. Preferiblemente, dicha sección puede tener forma circular, ovalada o elíptica.

En una realización más preferida, la sección de los compartimentos (3), (4) y (5) paralela al plano de la superficie de la placa (1) tiene una anchura o diámetro que puede ser idéntica o diferente. El termino anchura corresponde con el ancho o longitud más larga de esta sección de os compartimentos cuando estos no tienen una forma circular o de circunferencia, es decir cuando los compartimentos tienen por ejemplo forma, rectangular, cuadrada, elíptica u ovalada.

El termino diámetro se corresponde con la anchura de dicha sección cuando el compartimento tiene forma circular.

En una realización preferida, la anchura o diámetro de la sección de los compartimentos

(3), (4) y (5) paralela al plano de la superficie de la placa (1) está comprendida en un intervalo entre 2,2-6 mm, preferiblemente entre 2,2 - 5 mm, más preferiblemente entre 2,5 - 4 mm. (Figura 3 y 6).

En una realización más preferida, la anchura o diámetro de la sección del compartimento

(4), paralela al plano de la superficie de la placa (1) también referida como (4b), está comprendida en un intervalo entre 2 - 5 mm, proporcionado simultáneamente una buena eficacia, así como un buen rendimiento. Cuando la anchura o diámetro (4b) es inferior a 2,2 mm el rendimiento disminuye. Asimismo, cuando la anchura o diámetro es (4b) es superior a 5 mm la eficacia disminuye. Las dimensiones del compartimento (4) también lo hacen adecuado para para depositar las suficientes células del cúmulo de oóforo, ya que si las dimensiones son inferiores no se pueden depositar suficientes células de oóforo para llevar a cabo la selección de espermatozoides.

En otra realización preferida, la anchura o diámetro de la sección del compartimento (5), paralela al plano de la superficie de la placa (1) también referida como (5b), está comprendida en un intervalo entre 2-5 mm, preferiblemente entre 2,2-4 mm. Las dimensiones del compartimento (5) y su posición en el carril lo hace adecuado para recibir los espermatozoides que han atravesado el compartimento (4) y para poder recuperarlos mediante medios de extracción, preferiblemente mediante microinyección ICSI con una micropipeta, para ser inyectados en etapas posteriores en el interior del ovocito.

En otra realización preferida, la anchura o diámetro de la sección del compartimento (3), paralela al plano de la superficie de la placa (1), también referida como (3b), está comprendida en un intervalo entre 2-5 mm, preferiblemente (3b) está entre 2,2 - 4 mm, más preferiblemente entre 2,5-3 mm. Las dimensiones del compartimento (3) lo hace adecuado para recibir y depositar la muestra seminal procesada, así como para optimizar el rendimiento en relación al número de espermatozoides que llegan al compartimento (5).

En otra realización particular los compartimentos de los extremos (3) y (5) son idénticos o diferentes, preferiblemente son idénticos y pueden adoptar cualquier conformación poligonal. En una realización preferida de la placa de selección, la sección del plano paralelo a la superficie de la placa (1) de los compartimentos de los extremos (3) y (5) y el compartimento (4), es circular, elíptica u ovalada.

En otra realización preferida de la placa de selección, el compartimento central (4) está situado entre los compartimentos de los extremos (3) y (5) a la misma distancia de los compartimentos de los extremos (3) y (5) (Figura 4).

En otra realización preferida, la placa de selección del primer aspecto además comprender una tapa que cubre toda la superficie de la misma. De este modo la placa del primer aspecto presenta la ventaja de que evita la evaporación de los líquidos en la muestra seminal, en las células del cúmulo del oóforo y durante la etapa de selección de espermatozoides, preservando la calidad y las concentraciones tanto la muestra seminal como de las células de cumulo y mejorando el rendimiento en relación al número de espermatozoides recuperados en el compartimento (5) y la selección de espermatozoides apropiados en tanto a su morfología y motilidad, para la microinyección posterior.

En otra realización preferida, la profundidad del carril (2), corresponde con la profundidad (6a) del conducto (6) y la profundidad de los compartimentos (4), (3) y (5), por lo tanto (3a), (4a) y (5a) respectivamente.

La profundidad del carril (2), el conducto (6) y los compartimentos (4), (3) y (5), es la distancia entre la superficie de la placa y el fondo del carril (2)

Por lo tanto, la profundidad del conducto (6) y la profundidad de los compartimentos (4), (3) y (5) está en un rango entre 0,3-1 , 2 mm, preferiblemente entre 0,4-0, 9 mm, más preferiblemente entre 0,5-0, 7 mm. En otra realización preferida, la anchura o amplitud o diámetro de la sección definida por el plano del conducto (6), paralela al plano de la superficie de la placa (1), también referida como (6b), está en un rango entre 0,8-2 mm, preferiblemente entre 1-2 mm, más preferiblemente entre 1,2-1 , 6 mm. Estos rangos permitan trabajar con diferentes tipos de muestras seminales, en tanto a su calidad, mejorando así la versatilidad y aplicabilidad de la palca a su uso con muestras seminales de diferentes sujetos. Además, permitan la correcta trasferencia de calor a las muestras. Si la esta profundidad del conducto es inferior a 2 mm no se produce la adecuada trasferencia de calor a la placa para la realización de la selección de espermatozoides.

Igualmente, en el caso el compartimento (4) permitan trabajar con diferente tamaño de muestra de las células de cumulo, adaptándose a diferente tipología de pacientes que pueden necesitar una mayor cantidad de células de cumulo para llevar a cabo la selección de espermatozoides.

En otra realización preferida, la placa de selección de espermatozoides de primer aspecto tiene una altura o profundidad entre 0,5-20 mm. Mas preferiblemente la profundidad del carril (6), lo que incluye la profundidad del del conducto (6) y los compartimentos (4), (3) y (5), está en un rango entre el 20-80% de la altura o profundidad de la placa, más preferiblemente entre el 40-60 % de la altura o grasos de la placa. De esta manera se asegura la correcta trasferencia de calor de la placa a las muestras para la realización de la selección de espermatozoides. En otra realización más preferida el compartimento (4) tiene un área superior a los compartimentos (3) y (5). Mas preferiblemente, la anchura o diámetro (4b) del compartimento (4) es superior a los compartimentos (3) y (5) y está en un rango entre 2,2-6mm, preferiblemente ente 2,5-5 mm y la anchura o diámetro de los compartimentos (3) y (5) está en un rango entre 2,2-3 mm. En esta realización se obtiene una mejor selección y se reduce y/o elimina la contaminación entre los diferentes compartimentos y porciones. En el caso del compartimento (4), estas dimensiones permiten trabajar con diferente tamaño de muestra de las células de cumulo, adaptándose a diferente tipología de pacientes que pueden necesitar una mayor cantidad de células de cumulo para llevar a cabo la selección de espermatozoides.

En otra realización preferida del primer aspecto, la placa comprende, además, una protuberancia (7) que rodea al contorno, como se ve en la figura 5. Dicha protuberancia (7) facilita el agarre y la manipulación de la placa. Además, permite el intercambio gaseoso entre el interior de la placa y el exterior al dejar un pequeño espacio entre la porción donde se sitúa el carril (2) y la tapa, lo que mejora la extracción de los espermatozoides del compartimento (5) y la microinyección de los espermatozoides en los ovocitos en la zona de microinyección (1), ayudando a mantener un pH estable, en particular cuando no se use un medio tamponado, reduciendo fallos en la fecundación.

El segundo aspecto de la invención está relacionado con un método para la selección fisiológica de espermatozoides que comprende el uso la placa de selección de acuerdo al primer aspecto de la invención a partir de una muestra seminal procesada. Dicho método proporciona una buena y eficiente selección de espermatozoides, así como un buen rendimiento. La palca y el método del segundo aspecto, son adecuado para la selección de espermatozoides para la fecundación de ovocitos y/o óvulos de mujeres de edad madura, preferiblemente en mujeres con edades entre 34 y 44 años, más preferiblemente en mujeres entre 34-40 años.

El segundo aspecto de la invención está relacionado con un método para la selección fisiológica de espermatozoides que comprende el uso de la placa del primer aspecto y comprende por lo menos las siguientes etapas: a) proporcionar una muestra que comprende células del cúmulo de oóforo en el compartimento (4) de la placa del primer aspecto, b) proporcionar una muestra seminal procesada en el compartimento (3) de la placa del primer aspecto, c) incubar la placa del primer aspecto a una temperatura en un rango entre 30- 45 °C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 10 min y 3 horas, y d) extraer los espermatozoides que se encuentren en el compartimento de recuperación (5).

El método del segundo aspecto no se lleva a cabo dentro del cuerpo humano o animal. En el contexto de la presente invención, el termino muestra seminal procesada se refiere a una muestra seminal a la que se le ha eliminado el plasma seminal, por lo tanto, dicha muestra seminal no comprende sustancias descapacitantes, prostaglandinas y/o leucocitos La muestra seminal procesada se puede obtener siguiendo procesos del conocimiento general del estado de la técnica, conocidos por el experto en la materia. La muestra seminal procesada se puede obtener mediante un proceso que comprende: la realización de un seminograma de dicha muestra, seguido de la realización de un procedimiento para el tratamiento de la muestra seminal, por gradiente de densidad o swim-up. Una vez finalizado el gradiente de densidad se ajusta la muestra seminal procesada para obtener la muestra seminal con en una concentración de espermatozoides/ml en un medio de lavado específico de espermatozoides, como por ejemplo el método conocido en el estado de la técnica como sperm-washing, en un rango entre 5 y 20 millones/ml, preferiblemente 10 millones/ml. Preferiblemente, la muestra seminal procesada se añade en la etapa b) una cantidad de entre 1 y 10 pL, preferiblemente en un rango entre 2-5 pL.

Las células del cúmulo de oóforo de la etapa a) se obtienen previamente a partir de los complejos cúmulo-ovocitos. Los complejos cúmulo-ovocitos se obtienen mediante punción folicular. Con el uso de jeringas se retiran parte de los cúmulos y se guardan para su posterior utilización. Preferiblemente, se seleccionarán los cúmulos de aspecto laxo. Dicha característica morfológica se puede determinar por un experto en la materia mediante el uso de una lupa. A continuación, se procede a la decumulación por la acción de la enzima hialuronidasa, el componente principal del ECM (matriz extracelular), que es sintetizado por las células cúmulos después de la oleada de LH (hormona luteinizante), según un protocolo habitual en el estado de la técnica. Brevemente, el protocolo de decumulación comprende la eliminación de las células del cúmulo mediante el empleo de hialuronidasa. Los complejos cúmulo-ovocito no deben de estar más de 30 segundos en contacto con la hialuronidasa. Durante este proceso los complejos se manipulan con unos capilares de diferentes diámetros que ayudan a la eliminación, por acción mecánica, de las células de la granulosa que quedan más adheridas a los ovocitos. Este proceso se realiza fuera de la incubadora durante un periodo de tiempo de 10 minutos. Preferiblemente, dicho periodo de tiempo no se extienda más de 10 min. Tras este procedimiento se obtienen los Mil disponibles para la microinyección y las células del cúmulo oóforo para la selección de espermatozoides.

En una realización preferida del método segundo aspecto, la muestra seminal procesada es humana.

En una realización preferida del método segundo aspecto, el proceso de incubación de la etapa c) se lleva a cabo mediante el uso de unos medios adecuados para proporcionar una temperatura a la placa en un rango entre 30-45°C, preferiblemente entre 36-38°C. Preferiblemente, los medios adecuados para proporcionar una temperatura se seleccionan de la lista que consiste en, una estufa, una incubadora, una lámpara de calor o un horno de convección.

Durante el proceso de incubación, lo espermatozoides depositados en el compartimento (3) migran hacia las células del cúmulo del oóforo previamente depositadas en el compartimento (4) a través del canal (2), preferiblemente a través de 2 canales (2b) y (2b), y solo aquellos que consigan atravesarlas pasaran al compartimento (5), preferiblemente situado en el extremo del carril.

En una realización preferida del método segundo aspecto, el periodo de incubación, de la etapa c) tiene lugar en un periodo de tiempo comprendido en un rango entre 10 min y 3 horas, preferiblemente entre 30 min y 120 min, más preferiblemente entre 45 min y 75 min, aún más preferiblemente 60 min. Estos rangos de tiempo utilizados, mejoran el número de espermatozoides que se encuentran en el compartimento (5) así como la calidad de los espermatozoides que presentarán una mayor capacitación para la posterior microinyección intracitoplasmática del ovocito.

En una realización particular, el método de selección del segundo aspecto comprende una etapa adicional e), previa a la etapa a), que comprende la adición de medio de lavado específico de espermatozoides al carril (2), preferiblemente el medio de lavado es el método sperm-wash. Dicha etapa mejora número de blastocistos obtenidos y su calidad, así como la selección de los espermatozoides.

El tercer aspecto de la presente invención está relacionado con el uso de la placa de selección de acuerdo al primer aspecto de la invención en un método para la selección de espermatozoides. El cuarto aspecto de la presente invención está relacionado con el uso de la placa de selección de acuerdo al primer aspecto un método de fecundación in vitro. Placa del primer aspecto para su uso en método de fecundación in vitro, preferiblemente el método de fecundación in vitro es mediante Inyección Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI).

El quinto aspecto de la presente invención comprende un método de fecundación in vitro que comprende por lo menos las etapas del método de selección de espermatozoides del segundo aspecto y adicionalmente una etapa que comprende la fecundación mediante microinyección de la muestra de espermatozoides obtenida en la etapa d) del método del segundo aspecto en una muestra de ovocitos, estando dichos ovocitos depositados en microgotas de un medio tamponado. En una realización más preferida, las microgotas que comprenden ovocitos, se han depositado en la zona de microinyección (1) de la placa del primer aspecto.

En una realización preferida del método del quinto aspecto, se depositan desde 2 microgotas de ovocitos hasta 6 microgotas. Las microgotas comprenden, preferiblemente un medio tamponado que comprenden ovocitos.

Ejemplo de placa según el primer aspecto y método del segundo aspecto para la selección fisiológica de espermatozoides

Evaluación de la efectividad de la placa del aspecto 1 y el método de acuerdo al primer aspecto para la selección de espermatozoides para la terapia ICSI.

Se utilizó la placa de primer aspecto con 1 solo carril (2). La placa usada correspondía a la de la figura 4. Anchura del compartimento (3): 2-4 mm, anchura del compartimento (4): 3-4 mm y anchura del compartimento (5): 4 mm. Amplitud del conducto (6) 1,5 mm. Placa de poliestireno.

La placa correspondiente a la figura 6, también fue testada y proporcionaron muy buenos resultados de selección.

Método de selección de espermatozoides

Se proporciono una muestra de del cúmulo de oóforo, obtenidas previamente a partir de los complejos cúmulo-ovocitos tal como se describe en el segundo aspecto de la invención. Dicha muestra se depositó en el compartimento (4) de la placa. Seguidamente, se proporcionó 4 pL de una muestra seminal procesada y se depositó en el compartimento (3) de la placa.

A continuación, se incubo la placa a una temperatura en un rango entre 37 °C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 60 min. Una vez completado el proceso de incubación, se observaron los espermatozoides que consiguieron llegar al compartimento de recuperación (5). Finalmente se extrajeron dichos espermatozoides del compartimento 5 con una micropipeta para ser ¡inyectados posteriormente en los ovocitos que se encuentran en las microgotas en la porción (1) o zona de microinyección.

Para el estudio se evaluó el efecto en el desarrollo embrionario hasta el estadio de blastocito y su calidad.

Para ello se realizó un estudio prospectivo randomizado en el que se incluyeron 995 ovocitos procedentes de 90 pacientes que se sometieron a un tratamiento de FIV. Se generaron dos grupos: grupo control, 498 ovocitos, que fueron micro inyectados con espermatozoides seleccionados de manera convencional y grupo de estudio (n=497) que fueron micro inyectados con espermatozoides seleccionados mediante células de la granulosa en la placa. Todas las muestras seminales fueron procesadas mediante gradientes de densidad.

Casos válidos para la tasa de formación de blastocisto y calidad embrionaria=757 ovocitos fecundados. El grupo de estudio con la placa de primer aspecto y el método del primer aspecto se comparó con el grupo control. El grupo estudio se preparó con células de la granulosa. La preparación espermática en todos los casos fue realizada mediante métodos convencionales (gradientes de densidad).

Tabla 1: Resultado del estudio.

Los ovocitos fertilizados en la placa del primer aspecto, con los espermatozoides seleccionados de la placa del primer aspecto de la invención fue superior a los del grupo control. Este resultado es especialmente bueno, para los ovocitos de mujeres en edades maduras entre 34-44 años, más preferiblemente entre 34-40 años. La media de edad del estudio fue de 37 años. Los resultados con la placa y el método de la invención, mostraron mejoras significativas en relación a la tasa de formación de blastocitos, al porcentaje de blastocitos de buena calidad y a la fecundación los cuales fueron más altos con la placa de la invención comprado con el grupo control, como se ve en la tabla 1.