本发明涉及分子病毒学和免疫学领域， 特别是乙型肝炎病毒

( Hepatitis B virus, HBV )感染治疗领域。 具体而言， 本发明涉及可 用于治疗乙型肝炎病毒感染的表位肽（或其变 体） ， 包含此类表位肽

(或其变体）以及栽体蛋白的重组蛋白， 以及此类表位肽（或其变体 ) 和重组蛋白的用途。 本发明还涉及针对此类表位肽的抗体， 产生所述 抗体的细胞林， 以及它们的用途。 本发明还涉及可用于治疗或减轻乙 型肝炎病毒感染相关的一种或多种症状的疫苗 或药物组合物， 它们分 别包含本发明的重组蛋白或抗体。 背景技术

乙型肝炎病毒感染， 尤其是慢性 HBV 感染是全球最为重要的公 共卫生问题之一（Dienstag JL. Hepatitis B virus infection. N Engl J Med 2008 Oct 2;359(14):1486-1500)。 慢性 HBV感染可导致慢性乙型 病毒性肝炎（ Chronic hepatitis B, CHB )、肝硬化（ Liver cirrhosis, LC ) 和原发性肝细胞癌 （ Hepatocellular carcinoma, HCC )等一系歹 ¹ J肝脏 疾病（Liaw YF， Chu CM. Hepatitis B virus infection. Lancet 2009 Feb 14;373(9663): 582-592)。 据报道， 目前全球约有 20亿人曾经感染过 HBV, 现约有 3.5亿的慢性乙型肝炎病毒感染者， 这些感染者最终死 于 HBV感染相关肝脏疾病的风险可达 15%-25%, 全球每年超过 100 万人死于此类疾病（Dienstag JL.， 同上； 和 Liaw YF等， 同上）。

当前针对慢性 HBV 感染的治疗药物主要可分为干扰素类 (Interferon, IFNs)和核苷 /核苷酸类似物 (nucleoside or nucleotide, NAs) (Dienstag JL., 同上； Kwon H, Lok AS. Hepatitis B therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2011 May;8(5): 275-284; 和 Liaw YF等， 同 上）。 前者包括普通干扰素 (IFN)和聚乙二醇干扰素 （ Peg-interferon， Peg-IFN, 又称为长效干扰素） ， 主要通过整体增强患者免疫能力来 达到抑制 HBV 和治疗 CHB 的效果； 后者主要包括拉米夫定 (lamivudine, LMV)、 阿德福韦酯（adefovir dipivoxil, ADV)、 恩替卡 韦（Entecavir, ETV)、 替比夫定（Telbivudine, LdT)、 替诺福韦 (Tenofovir)等 5种，主要通过直接抑制 HBV的聚合酶活性来抑制 HBV 复制。 对于 HBV感染者 (例如 CHB患者)来说， 上述药物的单独或联 合治疗， 已能较为有效地抑制体内病毒复制， 大幅降低 HBV DNA水 平； 特别地， 52周或延长的此类治疗后， 患者体内 HBV DNA水平低 于检测下限（病毒学应答）的应答率可达 40-80% ( Kwon H等，同上）。 然而，上述药物的单独或联合治疗均不能完全 清除感染者体内的 HBV 病毒，其导致的 HBsAg阴转或 HBsAg血清学转换（感染者体内 HBV 病毒彻底清除的标志） 的应答率通常小于 5% ( Kwon H等， 同上） 。 因此， 针对 HBV感染者发展创新的、 能更为有效地清除 HBV病毒、 尤其是清除 HBsAg的治疗方法和药物是迫切而必要的。

基于免疫学手段发展新的治疗慢性 HBV感染的药物是此领域的 重要研究方向之一。 慢性 HBV感染的免疫治疗通常通过被动免疫治 疗 （其对应药物形式如抗体等）和主动免疫治疗 （其对应药物形式如 疫苗等）等两种方式来进行。 被动免疫治疗 （以抗体为例）是指， 向 HBV感染者被动施用具治疗特性的抗体，并利用 抗体介导的病毒中和 作用阻断 HBV感染新生肝细胞， 或利用抗体介导的免疫清除作用清 除体内病毒和被感染的肝细胞， 从而起到治疗的效果。 目前， 从预防 性乙型肝炎疫苗免疫应答者或 HBV感染恢复者血清 /血浆中纯化获得 的 Anti-HBs多克隆抗体， 即高效价的乙肝免疫球蛋白 （HBIG ) 已广 泛应用于阻断 HBV的母婴垂直传播、预防慢性 HBV感染者肝移植后 的 HBV再感染、 以及预防意外暴露于 HBV的人群的感染。 然而， 将 HBIG直接用于 HBV感染者 (例如 CHB患者)的治疗无明显疗效， 且 其存在例如高效价血浆来源较少、 价格昂贵、 性质不稳定、 潜在的安 全性问题等诸多局限性。 主动免疫治疗则是指， 通过施用治疗性疫苗 (包括蛋白疫苗、 多肽疫苗和核酸疫苗等） ， 刺激慢性 HBV感染者 机体主动产生针对 HBV的细胞免疫应答（ CTL效应等）或 /和体液免 疫应答（抗体等） ， 从而达到抑制或清除 HBV 的目的。 目前尚无明 确显著有效的、可用于治疗慢性 HBV感染的主动免疫治疗药物 /疫苗。

因此， 针对 HBV感染者发展创新的、 能更为有效地治疗 HBV感 染的治疗方法和药物是迫切而必要的。 发明内容

尽管 HBV病毒的各种蛋白上存在多个 B细胞应答（抗体应答） 表位， 然而并非针对任意表位的抗体都能应用于 HBV感染的治疗。 因此，发展能有效地治疗 HBV感染的免疫治疗药物 /方法的关键在于， 鉴定能诱发有效清除体内病毒和被病毒感染的 细胞的抗体应答的靶标 (表位） ， 以及获得针对该靶标（表位） 的抗体。

本发明鉴定了此类靶标（表位）， 并基于此提供了可用于治疗乙型 肝炎病毒感染的表位肽（或其变体） ， 包含此类表位肽（或其变体）和 栽体蛋白的重组蛋白， 以及此类表位肽 (或其变体）和重组蛋白的用途。 本发明还提供了针对此类表位肽 /表位的抗体， 产生所述抗体的细胞林， 以及它们的用途。本发明还提供了可用于治疗 或减轻与乙型肝炎病毒感 染相关的一种或多种症状的疫苗或药物组合物 ， 它们分别包含本发明的 重组蛋白或抗体。 在本发明中， 除非另有说明， 否则本文中使用的科学和技术名词 具有本领域技术人员所通常理解的含义。 并且， 本文中所用的细胞培 养、 分子遗传学、 核酸化学、 免疫学实验室操作步骤均为相应领域内 广泛使用的常规步骤。 同时， 为了更好地理解本发明， 下面提供相关 术语的定义和解释。

如本文中所使用的， 术语 "HBsAg"是指， 乙型肝炎病毒 (HBV)的 表面抗原主蛋白， 其是本领域技术人员公知的 （参见， 例如 NCBI GENBANK数据库登录号： AAF24729.1 ) 。

如本文中所使用的， 当提及 HBsAg的 酸序列时，其使用 SEQ ID NO: 39所示的序列来进行描述。 例如， 表述 "HBsAg的第 119-125 位氨基酸残基，，是指， SEQ ID NO: 39所示的多肽的第 119-125位氨 基酸残基。 然而， 本领域技术人员理解， 在 HBsAg的赛 酸序列中， 可天然产生或人工引入突变或变异 （包括但不限于， 置换， 缺失和 / 或添加， 例如不同基因型或基因亚型的 HBsAg )， 而不影响其生物学 功能。 因此， 在本发明中， 术语 "HBsAg，，应包括所有此类序列， 包括 例如 SEQ ID NO: 39所示的序列以及其天然或人工的变体。 并且， 当描述 HBsAg的序列片段时， 其不仅包括 SEQ ID NO: 39的序列片 段， 还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。 例如， 表述 "HBsAg 的第 119-125位氨基酸残基，，包括， SEQ ID NO: 39的第 119-125位氨 基酸残基， 以及其变体（天然或人工） 中的相应片段。 根据本发明， 表述"相应序列片段，，或 "相应片段，，是指， 当对序列进行最优比对时， 即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时 ， 进行比较的序列中位 于等同位置的片段。

如本文中所使用的， 术语 "HBcAg"是指， 乙型肝炎病毒 (HBV)的 核心抗原蛋白， 其是本领域技术人员公知的 （参见， 例如 NCBI GENBANK数据库登录号： AA063517.1 ) 。

如本文中所使用的，当提及 HBcAg的 酸序列时，其使用 SEQ ID NO: 40所示的序列来进行描述。 例如， 表述 "HBcAg的第 79-81 位氨基酸残基，，是指， SEQ ID NO: 40所示的多肽的第 79-81位氨基 酸残基。 然而， 本领域技术人员理解， 在 HBcAg 的赛 酸序列中， 可天然产生或人工引入突变或变异 （包括但不限于， 置换， 缺失和 / 或添加， 例如不同基因型或基因亚型的 HBcAg )， 而不影响其生物学 功能。 因此， 在本发明中， 术语 "HBcAg，，应包括所有此类序列， 包括 例如 SEQ ID NO: 40所示的序列以及其天然或人工的变体。 并且， 当描述 HBcAg的序列片段时， 其不仅包括 SEQ ID NO: 40的序列片 段， 还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。 例如，表述 "HBcAg 的第 79-81位氨基酸残基，，包括， SEQ ID NO: 40的第 79-81位氨基酸 残基，以及其变体（天然或人工）中的相应片 段。根据本发明，表述"相 应序列片段"或"相应片段"是指， 当对序列进行最优比对时， 即当序列 进行比对以获得最高百分数同一性时， 进行比较的序列中位于等同位 置的片段。

如本文中所使用的， 术语" WHcAg"是指， 土拨鼠肝炎病毒核心蛋 白， 其是本领域技术人员公知的 （参见， 例如 NCBI GENBANK数据 库登录号： ADE19018.1 ) 。

如本文中所使用的，当提及 WHcAg的 酸序列时，其使用 SEQ ID NO: 41所示的序列来进行描述。 例如， 表述" WHcAg的第 79-81 位氨基酸残基，，是指， SEQ ID NO: 41所示的多肽的第 79-81位氨基 酸残基。 然而， 本领域技术人员理解， 在 WHcAg的赛 酸序列中， 可天然产生或人工引入突变或变异 （包括但不限于， 置换， 缺失和 / 或添加， 例如不同基因型或基因亚型的 WHcAg ) ， 而不影响其生物 学功能。 因此， 在本发明中， 术语" WHcAg，，应包括所有此类序列， 包 括例如 SEQ ID NO: 41所示的序列以及其天然或人工的变体。 并且， 当描述 WHcAg的序列片段时，其不仅包括 SEQ ID NO: 41的序列片 段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片 段。例如，表述" WHcAg 的第 79-81位氨基酸残基，，包括， SEQ ID NO: 41的第 79-81位氨基酸 残基，以及其变体（天然或人工）中的相应片 段。根据本发明，表述"相 应序列片段"或"相应片段"是指， 当对序列进行最优比对时， 即当序列 进行比对以获得最高百分数同一性时， 进行比较的序列中位于等同位 置的片段。

如本文中所使用的， 术语" CRM197 (Cross-Reacting Materials 197)，，是指， 白喉毒素 (DT)的一种无毒突变体， 其与野生型白喉毒素相 比， 差异在于第 52位的氨基酸残基由 Gly变为 Glu (G. Giannini, R.Rappuoli , G. Ratti et al" Nucleic Acids Research. 1984. 12： 4063-4070)。 白喉毒素是本领域技术人员熟知的（参见例如 ， Choe S, Bennett M, Fujii G, et al., Nature. 1992. 357:216-222), 其 JIS^酸序列 可见于例如 GenBank登录号 AAV70486.1。

如本文中所使用的， 当提及 CRM197 的 酸序列时， 其使用 SEQ ID NO: 42所示的序列来进行描述。 例如， 表述" CRM197的第 1-190位氨基酸残基，，是指， SEQ ID NO: 42所示的多肽的第 1-190位 酸残基。 然而， 本领域技术人员理解， 在 CRM197的氨基酸序列 中， 可天然产生或人工引入突变或变异（包括但不 限于， 置换， 缺失 和 /或添加） ， 而不影响其生物学功能。 因此， 在本发明中， 术语 "CRM197'，应包括所有此类序列， 包括例如 SEQ ID NO: 42所示的序 列以及其天然或人工的变体。 并且， 当描述 CRM197的序列片段时， 其不仅包括 SEQ ID NO: 42的序列片段， 还包括其天然或人工变体 中的相应序列片段。 例如， 表述" CRM197的第 1-190位氨基酸残基" 包括， SEQ ID NO: 42的第 1-190位氨基酸残基， 以及其变体（天然 或人工）中的相应片段。根据本发明， 表述"相应序列片段，，或"相应片 段"是指， 当对序列进行最优比对时， 即当序列进行比对以获得最高百 分数同一性时， 进行比较的序列中位于等同位置的片段。

如本文中所使用的， 术语"抗体"是指， 通常由两对多肽链（每对 具有一条"轻，，（L )链和一条"重，，（H )链）组成的免疫球蛋白分子。 抗体轻链可分类为 κ和 λ轻链。 重链可分类为 μ、 δ、 γ、 α或 ε， 并且 分别将抗体的同种型定义为 IgM、 IgD、 IgG、 IgA和 IgE。 在轻链和 重链内， 可变区和恒定区通过大约 12或更多个氨基酸的" J"区连接， 重链还包含大约 3个或更多个氨基酸的 "D"区。 各重链由重链可变区 (V _H )和重链恒定区（C _H )组成。 重链恒定区由 3个结构域 (C _H 1、 C _H 2和 C _H 3)组成。 各轻链由轻链可变区 (VL)和轻链恒定区 (CL)组成。 轻链恒 定区由一个结构域（^组成。抗体的恒定区可� �导免疫球蛋白与宿主组 织或因子， 包括免疫系统的各种细胞 (例如， 效应细胞)和经典补体系 统的第一组分 (Clq)的结合。 V _H 和 V _L 区还可被细分为具有高变性的区 域 (称为互补决定区 (CDR))， 其间散布有较保守的称为构架区 （FR ) 的区域。各 V _H 和 V _L 由按下列顺序： FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的 3个 CDR和 4个 FR组成。 各重链 /轻链对的可变区 (V _H 和 VL)分别形成抗体结合部位。 氨基酸至 各区域或结构域的分配遵循 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))，或 Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia等人 （1989) Nature 342:878-883的定义。 术语"抗体"不受任 何特定的产生抗体的方法限制。 例如， 其包括， 特别地， 重组抗体、 单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同 种型的抗体，例如， IgG (例如， IgGl , IgG2, IgG3 或 IgG4亚型）， IgAl , IgA2, IgD, IgE 或 IgM抗体。

如本文中所使用的， 术语抗体的"抗原结合片段，，是指包含全长� � 体的片段的多肽， 其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原 的能 力， 和 /或与全长抗体竟争对抗原的特异性结合， 其也被称为"抗原结 合部分，，。 通常参见， Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 第 2版， Raven Press, N.Y. (1989)， 其以其全文通过引用合并入本文， 用于所有目的。 可通过重组 DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学 断裂产生抗体的抗原结合片段。 在一些情况下， 抗原结合片段包括 Fab, Fab，、 F(ab，) ₂ 、 Fd、 Fv、 dAb 和互补决定区（CDR)片段、 单链 抗体（例如， scFv)、 嵌合抗体、 双抗体 (diabody)和这样的多肽， 其包 含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的 至少一部分。

如本文中所使用的， 术语" Fd片段"意指由 V _H 和 C _H 1结构域组成 的抗体片段； 术语 "Fv片段"意指由抗体的单臂的 V _L 和 V _H 结构域组成 的抗体片段；术语" dAb片段"意指由 V _H 结构域组成的抗体片段 (Ward 等人， Nature 341:544-546 (1989)); 术语" Fab片段"意指由 V _L 、 V _H 、 CL和 C _H 1 结构域组成的抗体片段； 术语" F(ab') ₂ 片段"意指包含通过 铰链区上的二硫桥连接的两个 Fab片段的抗体片段。

在一些情况下， 抗体的抗原结合片段是单链抗体 (例如， scFv), 其 中 VL和 V _H 结构域通过使其能够产生为单个多肽链的 连接体配对形成 单价分子 (参见，例如， Bird等人， Science 242:423-426 (1988)和 Huston 等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988))。此类 scFv分子 可具有一般结构： NH ₂ -V _L -接头 -V _H -COOH 或 NH ₂ -V _H -接头 -V _L -COOH。 合适的现有技术接头由重复的 GGGGS氨基酸序列或其 变体组成。 例如， 可使用具有氨基酸序列（GGGGS) ₄ 的接头， 但也可 使用其变体 (Holliger 等人（1993)， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448)。 可用于本发明的其他接头由 Alfthan等人 (1995)， Protein Eng. 8:725-731 , Choi等人 (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu 等人 (1996)， Cancer Res. 56:3055-3061 , Kipriyanov等人 (1999)， J. Mol. Biol. 293:41-56和 Roovers等人 (2001)， Cancer Immunol.描述。

在一些情况下， 抗体的抗原结合片段是双抗体， 即， 双价抗体， 其中 V _H 和 V _L 结构域在单个多肽链上表达， 但使用太短的连接体以致 不允许在相同链的两个结构域之间配对， 从而迫使结构域与另一条链 的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位 (参见，例如， Holliger P. 等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)， 和 Poljak R. J. 等人， Structure 2:1121-1123 (1994))。

可使用本领域技术人员已知的常规技术（例如 ， 重组 DNA技术 或酶促或化学断裂法）从给定的抗体（例如本 发明提供的单克隆抗体 E6F6 )获得抗体的抗原结合片段（例如， 上述抗体片段） ， 并且以与 用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选 抗体的抗原结合片段。

在本文中， 除非上下文明确指出， 否则当提及术语"抗体"时， 其 不仅包括完整抗体， 而且包括抗体的抗原结合片段。

如本文中所使用的， 术语"单抗，，和"单克隆抗体"是指， 来自一群 高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一 个片段， 也即除可能自 发出现的自然突变外， 一群完全相同的抗体分子。 单抗对抗原上的单 一表位具有高特异性。 多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的， 其通 常包含至少 2种或更多种的不同抗体， 这些不同的抗体通常识别抗原 上的不同表位。单克隆抗体通常可采用 Kohler等首次报道的杂交瘤技 术获得（ Nature, 256:495，1975 )， 但也可采用重组 DNA技术获得 (如 参见 U.S.P 4,816,567)。

如本文中所使用的， 以编号提及的单克隆抗体与从相同编号的杂 交瘤获得的单克隆抗体相同。 例如， 单克隆抗体 HBs-E6F6(简称 E6F6)、 HBS-E7G11 (简称 E7G11 ) 、 HBs-G12F5 (简称 G12F5 )和 HBS-E13C5分别是与从杂交瘤细胞林 HBS-E6F6 (简称 E6F6 )或其亚 克隆或后代细胞、 HBS-E7G11 (简称 E7G11 )或其亚克隆或后代细胞、 HBS-G12F5 (简称 G12F5 )或其亚克隆或后代细胞， 和 HBs-E13C5 (简称 E13C5 )或其亚克隆或后代细胞获得的抗体相同的抗� �。

如本文中所使用的， 术语"嵌合抗体，，是指这样的抗体， 其轻链或 / 和重链的一部分源自一个抗体（其可以源自某 一特定物种或属于某一 特定抗体类或亚类），且轻链或 /和重链的另一部分源自另一个抗体（其 可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同 的抗体类或亚类） ， 但 无论如何， 其仍保留对目标抗原的结合活性（U.S.P 4,816,567 to

Cabilly et al.; Morrison et al" Pro Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 6855 (1984))。

如本文中所使用的，术语"人源化抗体"是指，� ��源免疫球蛋白（受 体抗体） 的全部或部分 CDR区被一非人源抗体（供体抗体） 的 CDR 区替换后得到的抗体或抗体片段， 其中的供体抗体可以是具有预期特 异性、 亲和性或反应性的非人源 （例如， 小鼠、 大鼠或兔）抗体。 此 外， 受体抗体的构架区（FR )的一些氨基酸残基也可被相应的非人源 抗体的氨基酸残基替换， 或被其他抗体的氨基酸残基替换， 以进一步 完善或优化抗体的性能。 关于人源化抗体的更多详细内容， 可参见例 如， Jones et al" Nature, 321:522 525 (1986); Reichmann et al" Nature, 332:323 329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593 596 (1992); 和 Clark, Immunol. Today 21: 397 402 (2000)。

如本文中所使用的， "中和抗体"是指， 能清除或显著降低目标病 毒的毒力 （例如， 感染细胞的能力） 的抗体或抗体片段。

如本文中所使用的， 术语"表位"是指， 抗原上被免疫球蛋白或抗 体特异性结合的部位。 "表位，，在本领域内也称为"抗原决定簇"。 表位 或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团 例如氨基酸或碳水化合 物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构 特征以及特定的电荷特 征。 例如， 表位通常以独特的空间构象包括至少 3， 4， 5， 6, 7， 8， 9， 10， 11， 12， 13， 14或 15个连续或非连续的氨基酸， 其可以是"线 性的，，或"构象的，，。参见，例如， Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, 第 66卷， G. E. Morris, Ed. (1996)。 在线性表 位中， 蛋白质与相互作用分子 （例如抗体）之间的所有相互作用的点 沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。 在构象表位中， 相互作用的 点跨越彼此分开的蛋白质 酸残基而存在。

如本文中所使用的， 术语"表位肽"是指， 抗原上能够用作表位的 肽段。 在一些情况下， 单独的表位肽即能够被针对所述表位的抗体特 异性识别 /结合。在另一些情况下，可能需要将表位肽� �栽体蛋白融合， 以便表位肽能够被特异性抗体识别。如本文中 所使用的，术语"栽体蛋 白，，是指这样的蛋白， 其可以充当表位肽的栽体， 即， 其可以在特定位 置处（例如蛋白内部， N端或 C端）插入表位肽， 以便该表位肽能够 呈现出来， 从而该表位肽能够被抗体或免疫系统识别。 此类栽体蛋白 是本领域技术人员熟知的， 包括例如， HPV L1蛋白 （可以将表位肽 插入在所述蛋白的第 130-131位氨基酸之间或在第 426-427位氨基酸 之间, 参见 Slupetzky, Κ·等 Chimeric p apilloma virus -like particles expressing a foreign epitope on capsid surface loops [J]. J Gen Virol, 2001， 82: 2799-2804； Varsani, A.等 Chimeric human papillomavirus type 16 (HPV-16) LI particles presenting the common neutralizing epitope for the L2 minor capsid protein of HPV-6 and HPV-16[J]. J Virol,2003, 77: 8386-8393 ) ， HBV核心抗原 （可以用表 位肽替换所述蛋白的第 79-81位氨基酸， 参见 Koletzki, D.， et al. HBV core particles allow the insertion and surface exposure of the entire potentially protective region of Puumala hantavirus nucleocapsid protein [J]. Biol Chem，1999， 380: 325-333 )， 土拨鼠肝炎病毒核心蛋白 (可以用表位肽替换所述蛋白的第 79-81位氨基酸，参见 Sabine Konig Gertrud Beterams and Michael Nassal, · Virol. 1998, 72(6) :4997 ) ， CRM197蛋白（可以将表位肽连接至该蛋白或其片 段的 N末端或 C末 端） 。 任选地， 可以在表位肽与栽体蛋白之间使用连接体（例 如柔性 或刚性连接体） ， 以促进二者各自的折叠。

可使用本领域技术人员已知的常规技术， 就与相同表位的结合竟 争性筛选抗体。 例如， 可进行竟争和交叉竟争研究， 以获得彼此竟争 或交叉竟争与抗原 （例如， HBsAg蛋白）的结合的抗体。 基于它们的 交叉竟争来获得结合相同表位的抗体的高通量 方法描述于国际专利申 请 WO 03/48731中。 因此， 可使用本领域技术人员已知的常规技术， 获得与本发明的单克隆抗体 (例如，单克隆抗体 E6F6)竟争结合 HBsAg 蛋白上的相同表位的抗体及其抗原结合片段（ 即， 抗原结合部分） 。

如本文中所使用的， 术语"分离的，，或 "被分离的，，指的是， 从天然 状态下经人工手段获得的。 如果自然界中出现某一种"分离"的物质或 成分， 那么可能是其所处的天然环境发生了改变， 或从天然环境下分 离出该物质， 或二者情况均有发生。 例如， 某一活体动物体内天然存 在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽， 而从这种天然状态下分离出来 的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为 分离的。 术语"分离的，， 或"被分离的"不排除混有人工或合成的物质， 也不排除存在不影响物 质活性的其它不纯物质。

如本文中所使用的， 术语"大肠杆菌表达系统，，是指由大肠杆菌 (菌 林)与栽体组成的表达系统， 其中大肠杆菌（菌林）来源于市场上可得 到的菌林， 例如但不限于： GI698, ER2566, BL21(DE3), B834(DE3)， BLR(DE3) _e

如本文中所使用的， 术语"栽体（vector ) ，，是指， 可将多聚核苷 酸插入其中的一种核酸运栽工具。 当栽体能使插入的多核苷酸编码的 蛋白获得表达时， 栽体称为表达栽体。 栽体可以通过转化， 转导或者 转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件 在宿主细胞中获得表达。 栽体是本领域技术人员公知的， 包括但不限于： 质粒； 噬菌粒； 柯斯 质粒； 人工染色体， 例如酵母人工染色体（YAC ) 、 细菌人工染色体 ( BAC )或 P1来源的人工染色体 ( PAC )； 噬菌体如 λ噬菌体或 M13 噬菌体及动物病毒等。 可用作栽体的动物病毒包括但不限于， 逆转录 酶病毒（包括慢病毒） 、 腺病毒、 腺相关病毒、 疱疹病毒（如单纯疱 奢病毒） 、 痘病毒、 杆状病毒、 乳头瘤病毒、 乳头多瘤空泡病毒（如 SV40 ) 。 一种栽体可以含有多种控制表达的元件， 包括但不限于， 启 动子序列、 转录起始序列、 增强子序列、选择元件及报告基因。 另外， 栽体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的， 术语"宿主细胞"是指， 可用于导入栽体的细 胞， 其包括但不限于， 如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞， 如酵母细 胞或曲霉菌等的真菌细胞， 如 S2果蝇细胞或 Sf9等的昆虫细胞， 或者 如纤维原细胞， CHO细胞， COS细胞， NSO细胞， HeLa细胞， BHK 细胞， HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

如本文中所使用的， 术语"同一性"用于指两个多肽之间或两个核 酸之间序列的匹配情况。 当两个进行比较的序列中的某个位置都被相 同的>^ ^或 酸单体亚单元占据时（例如， 两个 DNA分子的每一 个中的某个位置都被腺噪呤占据， 或两个多肽的每一个中的某个位置 都被赖氨酸占据） ， 那么各分子在该位置上是同一的。 两个序列之间 的"百分数同一性"是由这两个序列共有的匹配� ��置数目除以进行比较 的位置数目 xlOO的函数。 例如， 如果两个序列的 10个位置中有 6个 匹配，那么这两个序列具有 60%的同一性。例如， DNA序列 CTGACT 和 CAGGTT共有 50%的同一性 (总共 6个位置中有 3个位置匹配)。 通常， 在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比 较。 这样的比对 可通过使用，例如，可通过计算机程序例如 Align程序（ DNAstar, Inc. ) 方便地进行的 Needleman等人 ( 1970 ) J. Mol. Biol. 48: 443-453的方 法来实现。 还可使用已整合入 ALIG 程序 (版本 2.0)的 E. Meyers和 W. Miller (Comput. Appl Biosci. , 4:11-17 (1988))的算法， 使用 PAM120权重残基表 ( weight residue table ) 、 12的缺口长度罚分和 4 的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分 数同一性。 此外， 可 使用已整合入 GCG软件包 (可在 www.gcg.com上获得)的 GAP程序中 的 eedleman和 Wunsch (J Mol Biol. 48:444-453 (1970))算法， 使用 Blossum 62矩阵或 PAM250矩阵以及 16、 14、 12、 10、 8、 6或 4的 缺口权重 （gap weight )和 1、 2、 3、 4、 5或 6的长度权重来测定两 个 酸序列之间的百分数同一性。

如本文中使用的， 术语"保守置换"意指不会不利地影响或改变包 含氨基酸序列的蛋白 /多肽的必要特性的氨基酸置换。 例如， 可通过本 领域内已知的标准技术例如定点诱变和 PCR介导的诱变引入保守置 换。 保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸 残基替代氨基酸残 基的置换， 例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残 基相似（例 如具有相似大小、 形状、 电荷、 化学性质， 包括形成共价键或氢键的 能力等） 的残基进行的置换。 已在本领域内定义了具有相似侧链的氨 基酸残基的家族。 这些家族包括具有碱性侧链（例如， 赖氨酸、 精氨 酸和组氨酸） 、 酸性侧链（例如天冬氨酸、 谷氨酸） 、 不带电荷的极 性侧链（例如甘氨酸、 天冬酰胺、 谷氨酰胺、 丝氨酸、 苏氨酸、 酪氨 酸、 半胱氨酸、 色氨酸） 、 非极性侧链（例如丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨 酸、 异亮氨酸、 脯氨酸、 苯丙氨酸、 甲硫氨酸） 、 β分支侧链（例如， 苏氨酸、 缬氨酸、 异亮氨酸）和芳香族侧链（例如， 酪氨酸、 苯丙氨 酸、 色氨酸、 组氨酸） 的 酸。 因此， 优选用来自相同侧链家族的 另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。 鉴定氨基酸保守置换的方 法在本领域内是熟知的 （参见， 例如， Brummell 等人， Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi 等人 Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); 和 Burks等人 Proc. Natl Acad. Set USA 94:412-417 (1997), 其通过引用并入本文)。

如本文中使用的， 术语"免疫原性 （immunogenicity ) ，，是指， 能 够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能 力。 其既指， 抗原能刺 激特定的免疫细胞， 使免疫细胞活化、 增殖、 分化， 最终产生免疫效 应物质如抗体和致敏淋巴细胞的特性， 也指抗原刺激机体后， 机体免 疫系统能形成抗体或致敏 T淋巴细胞的特异性免疫应答。 免疫原性是 抗原最重要的性质， 一种抗原能否成功地诱导宿主产生免疫应答取 决 于三方面的因素： 抗原的性质、 宿主的反应性和免疫方式。

如本文中使用的， 术语"特异性结合"是指， 两分子间的非随机的 结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反 应。在某些实施方式中， 特异性结合某抗原的抗体（或对某抗原具有特 异性的抗体）是指， 抗 体以小于大约 10 ⁵ M， 例如小于大约 10 ⁶ M、 10 ⁷ M、 10 ⁸ M、 10 ⁹ M 或 10 ¹⁽⁾ M或更小的亲和力 （K _D ) 结合该抗原。

如本文中所使用的，术语 "K _D ，，是指特定抗体-抗原相互作用的解离 平衡常数， 其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。 平衡解离常数 越小， 抗体 -抗原结合越紧密， 抗体与抗原之间的亲和力越高。 通常， 抗体（例如， 本发明的单克隆抗体 E6F6 )以小于大约 10· ⁵ Μ， 例如小 于大约 10 ^-6 Μ、 10 ⁷ Μ, 10 ⁸ Μ, 10 ^-9 Μ或 1(T ^1G M或更小的解离平衡 常数（K _D )结合抗原 （例如， HBsAg蛋白）， 例如， 如使用表面等离 子体共振术 (SPR)在 BIACORE仪中测定的。

如本文中所使用的， 术语"单克隆抗体，，和"单抗"具有相同的含义 且可互换使用； 术语"多克隆抗体，，和"多抗"具有相同的含义 且可互换 使用； 术语"多肽"和"蛋白质"具有相同的含义且可互� �使用。 并且在 本发明中， 氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩 写来表示。 例如， 丙氨酸可用 A或 Ala表示。

如本文中所使用的，术语"杂交瘤，，和 "杂交瘤细胞林 "可互换使用， 并且当提及术语"杂交瘤，，和 "杂交瘤细胞林，，时， 其还包括杂交瘤的亚 克隆和后代细胞。 例如， 当提及杂交瘤细胞林 E6F6时， 其还指杂交 瘤细胞林 E6F6的亚克隆和后代细胞。

如本文中所使用的，术语"药学上可接受的栽� �和 /或赋形剂，，是指 在药理学和 /或生理学上与受试者和活性成分相容的栽体� � /或赋形 剂， 其是本领域公知的 (参见例如 Remington's Pharmaceutical

Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995 ) ， 并且包括但不限于： pH调节剂， 表面 活性剂， 佐剂， 离子强度增强剂。 例如， pH调节剂包括但不限于磷酸 盐緩冲液； 表面活性剂包括但不限于阳离子， 阴离子或者非离子型表 面活性剂， 例如 Tween-80; 离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

如本文中所使用的， 术语"佐剂"是指非特异性免疫增强剂， 当其 与抗原一起或预先递送入机体时， 其可增强机体对抗原的免疫应答或 改变免疫应答类型。 佐剂有很多种， 包括但不限于铝佐剂 （例如氢氧 化铝） 、 弗氏佐剂 （例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂） 、 短小棒 状杆菌、 脂多糖、 细胞因子等。 弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的 佐剂。 氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。

如本文中所使用的， 术语"蛋白疫苗"是指， 基于多肽的疫苗， 其 任选地还包含佐剂。 疫苗中的多肽可以是通过基因工程技术获得的 ， 也可以是通过化学合成方法获得的。如本文中 所使用的，术语"核酸疫 苗"是指， 基于 DNA或 RNA (例如质粒， 如表达盾粒）的疫苗， 其任 选地还包含佐剂。

如本文中所使用的， 术语"有效量 "是指足以获得或至少部分获得 期望的效果的量。 例如， 预防疾病（例如 HBV感染或与 HBV感染相 关的疾病）有效量是指， 足以预防， 阻止， 或延迟疾病 （例如 HBV 感染或与 HBV感染相关的疾病）的发生的量； 治疗疾病有效量是指， 足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的 疾病和其并发症的量。 测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能 力范围之内。 例如， 对 于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的 严重度、 患者自己的免 疫系统的总体状态、 患者的一般情况例如年龄， 体重和性别， 药物的 施用方式， 以及同时施用的其他治疗等等。

如本文中所使用的， 本发明的表位肽的生物学功能包括但不限于 选自下列的一种或多种：

1 ) 与抗体 E6F6、 E7G11、 G12F5或 E13C5的特异性结合；

2 )在受试者体内降低 HBV DNA和 /或 HBsAg的血清水平的能力 (任选地， 在将所述表位肽与栽体蛋白融合后） ；

3 )诱发有效清除体内的 HBV和被 HBV感染的细胞的抗体应答 的能力 （任选地， 在将所述表位肽与栽体蛋白融合后） ； 和

4 ) 治疗受试者的 HBV感染或与 HBV感染相关的疾病 （例如乙 肝） 的能力 （任选地， 在将所述表位肽与栽体蛋白融合后） 。 因此， 在一个方面， 本发明提供了一种分离的表位肽或其变体， 其由 HBsAg蛋白的第 119-125位氨基酸残基组成，且所述变体与其所 源自的表位 J fe异仅在于 1个或几个（例如， 1个， 2个， 3个或 4个） 氨基酸残基的保守置换， 且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。 在一个优选的实施方案中，所述 HBsAg蛋白的第 119-125位氨基酸残 基如 SEQ ID NO:l所示。在一个优选的实施方案中， 所述变体的氨基 酸序列如 SEQ ID NO: 2所示。

在另一个方面， 本发明提供了一种分离的表位肽或其变体， 其由 HBsAg蛋白的第 113-135位氨基酸残基组成， 且所述变体与其所源自 的表位肽相异仅在于 1个或几个（例如， 1个， 2个， 3个， 4个， 5 个， 6个， 7个， 8个或 9个）氨基酸残基的保守置换， 且保留了其所 源自的表位肽的生物学功能。 在一个优选的实施方案中， 所述 HBsAg 蛋白的第 113-135位 JIS^酸残基如 SEQ ID NO:6所示。

在另一个方面， 本发明提供了一种分离的表位肽或其变体， 其由 HBsAg蛋白的 4-38个连续 Jl^酸残基组成， 且包含 HBsAg蛋白的第 121-124位氨基酸残基， 并且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在 于 1个或几个（例如， 1个， 2个， 3个， 4个， 5个， 6个， 7个， 8 个或 9个）氨基酸残基的保守置换， 且保留了其所源自的表位肽的生 物学功能。在一个优选的实施方案中，所述 HBsAg蛋白的第 121 - 124 位 Jl^酸残基如 SEQ ID NO:10所示。

在一个优选的实施方案中，本发明的表位肽由 HBsAg蛋白的不多 于 38个的连续氨基酸残基组成， 例如， 其由 38个， 37个， 36个， 35 个， 34个， 33个， 32个， 31个， 30个， 29个， 28个， 27个， 26个， 25个， 24个， 23个， 22个， 21个， 20个， 19个， 18个， 17个， 16 个， 15个， 14个， 13个， 12个， 11个， 10个， 9个， 8个， 7个， 6 个， 5个或 4个的连续氨基酸残基组成。 例如， 本发明的表位肽或其 变体具有选自 SEQ ID ΝΟ:1-7和 10的氨基酸序列。

特别地， 可以将本发明的表位肽或其变体与栽体蛋白融 合， 以增 强表位肽或其变体的免疫原性， 使得表位肽或其变体能够被机体的免 疫系统识别， 并诱发有效清除体内病毒和被病毒感染的细胞 的抗体应 答。

因此， 在一个方面， 本发明还提供了一种重组蛋白， 其包含本发 明的分离的表位肽或其变体， 以及栽体蛋白， 并且所述重组蛋白不是 天然存在的蛋白或其片段。 在所述重组蛋白中， 所述表位肽或其变体 可以连接至栽体蛋白的 N末端或 C末端， 插入栽体蛋白的内部， 或替 换栽体蛋白的部分 酸序列，视所使用的具体栽体蛋白而定。此外 ， 任选地， 所述表位肽或其变体通过连接体（刚性或柔性 连接体， 例如 (GGGGS) ₃ ) 与栽体蛋白相连接。 本发明的重组蛋白不受其产生方式 的限定， 例如， 其可以通过基因工程方法（重组技术）产生， 也可以 通过化学合成方法产生。

在一个优选的实施方案中， 所述栽体蛋白选自 CRM197蛋白或其 片段、 HBcAg和 WHcAg。

在一个优选的实施方案中， 所述栽体蛋白是 CRM197蛋白或其片 段， 并且将本发明的表位肽或其变体， 任选地通过连接体， 连接至 CRM197蛋白或其片段的 N末端或 C末端。 在一个优选实施方案中， 所述 CRM197蛋白的片段包含 CRM197的 aa 1-190 ( aa表示 Jl^酸， 其置于数字 n前面时，表示第 n位氨基酸（例如， aa 1-190表示第 1-190 位氨基酸）；置于数字 n之后时，表示多肽长度为 n个氨基酸（下同））， 例如包含 CRM197 的 aa 1-389。 在另一个优选实施方案中， 所述 CRM197蛋白的片段由 CRM197的 aa 1-190或 aa 1-389组成（其在 本发明中分别被命名为 CRM A和 CRM 389 ) 。

在一个优选的实施方案中， 所述连接体的氨基酸序列如 SEQ ID NO:46所示。 在一个优选的实施方案中， 本发明的重组蛋白具有选自 下列的 酸序列： SEQ ID NO: 74-97。

在一个优选的实施方案中，所述栽体蛋白是 HBcAg或其片段，并 且用本发明的表位肽替换 HBcAg的第 79-81位氨基酸。在一个优选的 实施方案中， 所述表位肽与 HBcAg或其片段通过连接体连接。 在一 个优选的实施方案中， 所述 HBcAg的片段包含 HBcAg的 aa 1-149或 由 HBcAg的 aa 1-149组成。 在一个优选的实施方案中， 本发明的重 组蛋白具有选自下列的氨基酸序列： SEQ ID NO: 47-53, 56，和 58-65。

在一个优选的实施方案中， 所述栽体蛋白是 WHcAg或其片段， 并且用本发明的表位肽替换 WHcAg的第 79-81位氨基酸。 在一个优 选的实施方案中， 所述表位肽与 WHcAg或其片段通过连接体连接。 在一个优选的实施方案中， 所述 WHcAg 的片段包含 WHcAg 的 aa 1-149或由 WHcAg的 aa 1-149组成。 在一个优选的实施方案中， 本 发明的重组蛋白具有选自下列的氨基酸序列： SEQ ID NO: 66-73 在另一个方面， 本发明还提供了一种分离的核酸分子， 其包含编 码本发明的表位肽或其变体或本发明的重组蛋 白的核苷酸序列。 在另 一个方面， 本发明还提供了一种栽体， 其包含如上所述的分离的核酸 分子。 本发明的栽体可以是克隆栽体， 也可以是表达栽体。 在一个优 选实施方案中， 本发明的栽体是例如质粒， 粘粒， 噬菌体， 柯斯质粒 等等。 在一个优选实施方案中， 所述栽体能够在受试者 （例如哺乳动 物，例如人）体内表达本发明的表位肽或其变 体或本发明的重组蛋白。

在另一个方面， 还提供了包含本发明的分离的核酸分子或栽体 的 宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核 细胞例如大肠杆菌细胞， 以及真核细胞例如酵母细胞， 昆虫细胞， 植物细胞和动物细胞（如哺 乳动物细胞， 例如小鼠细胞、 人细胞等） 。 本发明的细胞还可以是细 胞系， 例如 293T细胞。

在另一个方面，还提供了制备本发明的重组蛋 白的方法， 其包括， 在合适的条件下培养本发明的宿主细胞， 和从细胞培养物中回收本发 明的重组蛋白。 在另一个方面， 本发明提供了一种蛋白疫苗， 其包含本发明的表 位肽（或其变体）或重组蛋白， 以及药学上可接受的栽体和 /或赋形剂 (例如佐剂） 。 在一个优选实施方案中， 所述蛋白疫苗包含一个或多 个本发明的表位肽， 且这些表位肽可以是单独的或串联的、 修饰的或 未经修饰的、 偶联至其他蛋白的或不偶联至其他蛋白的。

在另一个方面， 本发明提供了用于治疗受试者的 HBV 感染或与 HBV感染相关的疾病（例如乙肝）的方法， 其包括， 给有此需要的受 试者施用治疗有效量的本发明的表位肽（或其 变体）或重组蛋白或蛋 白疫苗。

在另一个方面， 提供了本发明的表位肽（或其变体）或重组蛋 白 在制备蛋白疫苗中的用途， 所述蛋白疫苗用于治疗受试者的 HBV感 染或与 HBV感染相关的疾病 （例如乙肝） 。

在另一个方面， 提供了本发明的表位肽（或其变体）或重组蛋 白， 其用于治疗受试者的 HBV感染或与 HBV感染相关的疾病 （例如乙 肝） 。

在另一个方面， 本发明提供了一种基因疫苗， 其包含本发明的分 离的核酸分子或栽体， 以及药学上可接受的栽体和 /或赋形剂（例如佐 剂） 。 在一个优选实施方案中， 所述基因疫苗包含 DNA或 RNA。 在 此类实施方案中，所述 DNA或 RNA可以是裸露的或可以包裹于具有 传递或 /和保护功能的外壳内。 在一个进一步优选的实施方案中， 所述 外壳可以是腺病毒、 腺相关病毒、 慢病毒、 逆转录病毒等的外壳， 也 可以是采用化学方法合成的能行使相似功能的 其他材料。

在另一个方面， 本发明提供了用于治疗受试者的 HBV 感染或与 HBV感染相关的疾病（例如乙肝）的方法， 其包括， 给有此需要的受 试者施用治疗有效量的本发明的基因疫苗或分 离的核酸分子或栽体。

在另一个方面， 提供了本发明的分离的核酸分子或栽体在制备 基 因疫苗中的用途， 所述基因疫苗用于治疗受试者的 HBV 感染或与 HBV感染相关的疾病 （例如乙肝） 。

在另一个方面， 提供了本发明的分离的核酸分子或栽体， 其用于 治疗受试者的 HBV感染或与 HBV感染相关的疾病 （例如乙肝） 。 在另一个方面， 本发明提供了一种药物组合物， 其包含本发明的 表位肽（或其变体）或重组蛋白或分离的核酸 分子或栽体， 以及药学 上可接受的栽体和 /或赋形剂 （例如佐剂） 。 在一个优选实施方案中， 所述药物组合物包含一个或多个本发明的表位 肽， 且这些表位肽可以 是单独的或串联的、 修饰的或未经修饰的、 偶联至其他蛋白的或不偶 联至其他蛋白的。 在另一个方面， 本发明提供了用于在受试者体内降低 HBV DNA 和 /或 HBsAg的血清水平的方法， 其包括给有此需要的受试者施用有 效量的本发明的药物组合物或表位肽（或其变 体）或重组蛋白或分离 的核酸分子或栽体。

在另一个方面， 提供了本发明的表位肽（或其变体）或重组蛋 白 或分离的核酸分子或栽体在制备药物组合物中 的用途， 所述药物组合 物用于在受试者体内降低 HBV DNA和 /或 HBsAg的血清水平。

在另一个方面， 提供了本发明的表位肽（或其变体）或重组蛋 白 或分离的核酸分子或栽体， 其用于在受试者体内降低 HBV DNA 和 / 或 HBsAg的血清水平。 在一个方面， 本发明提供了一种单克隆抗体及其抗原结合片 段， 其中， 所述单克隆抗体能够特异性结合本发明的表位 肽。

在一个优选的实施方案中， 所述单克隆抗体或其抗原结合片段选 自 Fab、 Fab，、 F(ab，) ₂ 、 Fd、 Fv、 dAb、 互补决定区片段、 单链抗体 (例如， scFv)、 小鼠抗体、 兔抗体、 人源化抗体、 全人抗体、 嵌合抗 体（例如， 人鼠嵌合抗体）或双特异或多特异抗体。

在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体 以小于大约 10· ⁵ Μ， 例如小于大约 10 ⁶ Μ、 10 ⁷ Μ、 10 ⁸ Μ、 10 ⁹ Μ或 10 ^1G M或更小的 K _D 结合本发明的表位肽或 HBsAg蛋白。

在一个优选的实施方案中， 所述的单克隆抗体包括非 -CDR 区， 且所述非 -CDR区来自不是鼠类的物种， 例如来自人抗体。

在一个优选的实施方案中， 所述的单克隆抗体能够在受试者体内 降低 HBV DNA和 /或 HBsAg的血清水平。

在一个优选的实施方案中， 所述的单克隆抗体衍生自选自下列的 单克隆抗体， 或是选自下列的抗体：

1 )杂交瘤细胞林 HBS-E6F6所产生的单克隆抗体， 其中， 杂交瘤 细胞林 HBS-E6F6保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC), 且具有 保藏号 CCTCC NO.C201270; 2 )杂交瘤细胞林 HBS-E7G11所产生的单克隆抗体， 其中， 杂交 瘤细胞林 HBS-E7G11保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC), 且 具有保藏号 CCTCC NO.C201271;

3 )杂交瘤细胞林 HBS-G12F5所产生的单克隆抗体， 其中， 杂交 瘤细胞林 HBS-G12F5保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC), 且 具有保藏号 CCTCC NO.C201272; 和

4 )杂交瘤细胞林 HBS-E13C5所产生的单克隆抗体， 其中， 杂交 瘤细胞林 HBS-E13C5保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC), 且 具有保藏号 CCTCC NO.C201273。 在另一个方面，本发明提供了一种单克隆抗体 及其抗原结合片段， 其能够阻断本发明的表位肽或 HBsAg 蛋白与由杂交瘤细胞林 HBs-E6F6, HBs-E7Gll、 HBs-G12F5或 HBs-E13C5所产生的抗体的 结合至少 50%， 优选至少 60%， 优选至少 70%， 优选至少 80%， 优 选至少 90%， 优选至少 95%或优选至少 99%， 其中， 所述杂交瘤细 胞林 HBs-E6F6、 HBs-E7Gll、 HBs-G12F5和 HBs-E13C5保藏于中国 典型培养物保藏中心（CCTCC) , 且分别具有保藏号 CCTCC NO.C201270, CCTCC NO.C201271 , CCTCC NO.C201272和 CCTCC NO.C201273。

此类单抗所识别的表位与单抗 E6F6、 E7G11、 G12F5或 E13C5 识别的表位相同， 或者在空间上存在重叠， 从而此类单抗能够降低单 抗 E6F6、 E7G11、 G12F5或 E13C5与本发明的表位肽或 HBsAg蛋白 的结合至少 50%， 优选至少 60%， 优选至少 70%， 优选至少 80%， 优选至少 90%， 优选至少 95%或优选至少 99%。

可以采用常规方法如 Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)中描述 的方法， 测定某一待测单抗降低某一已知单抗结合 HBsAg蛋白的能 力。 一个示例性的方法包括： 先把抗原预包被在微孔板上， 然后把系 列稀释的未标记的待测抗体以及特定浓度的经 标记的已知单抗共同加 入上述预包被后的微孔板中进行孵育， 然后在洗涤后测定在不同稀释 度的待测抗体下， 已知抗体结合到板上的数量。 待测抗体竟争已知抗 体结合抗原的能力越强， 已知抗体结合抗原的能力就越弱， 结合到板 上的已知抗体就越少。通常， 将抗原预包被在 96孔微孔板上， 并利用 放射标记法或酶标记法测定待测单抗阻断经标 记的已知单抗的能力。

可以采用 Kohler等在 Nature 256: 495 (1975)中报道的杂交瘤制备 方法来制备单抗。 首先用免疫原 （必要时候添加佐剂）免疫注射小鼠 或其它合适的宿主动物。 免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注 射或腹腔注射。 将免疫原预先偶联到某些已知蛋白 （如血清白蛋白） 上， 可能会有助于增强抗原在宿主内的免疫原性。 佐剂可以利用弗氏 佐剂或 MPL-TDM等。 动物在接受免疫后， 体内会产生分泌特异性结 合免疫原的抗体的淋巴细胞。 收集目的淋巴细胞， 并用合适的融合剂 (如 PEG ) 将其与骨髓瘤细胞融合， 从而获得杂交瘤细胞 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103, Academic Press, 1996)。

将上述制备的杂交瘤细胞接种到合适的培养基 中进行生长， 所述 培养基中含有一种或多种能够抑制未融合的、 母体骨髓瘤细胞生长的 物质。例如，对于缺乏次黄噪呤鸟噪呤磷酸转 移酶（ HGPRT或 HPRT ) 的母体骨髓瘤细胞， 在培养基中添加次黄噪呤、 氨基喋呤和胸腺嘧啶 ( HAT培养基）等物质将可以抑制 HGPRT-缺陷细胞的生长。

HAT 培养基敏感等能力。 ' 中 骨髓瘤细胞首选鼠源骨 瘤， 如 MOP-21 和 MC-11 小鼠肿瘤衍生林 ( THE Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA ) ， 以及 SP-2/0 或 X63-Ag8-653细胞林 ( American Type C lture Collection, Rockville, Md. USA ) 。 另外， 还可以利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞林 制 备人单抗（Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al"

Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)。 杂交瘤细胞生长的培养基用于检测针对特异抗 原的单抗的产生。 可以使用下列方法来测定杂交瘤细胞产生的单 抗的结合特异性： 免疫 沉淀或体外结合试验， 如放射免疫试验（RIA ) 、 酶联免疫吸附试验 ( ELISA )。 例如， 利用 Munson等在 Anal. Biochem. 107: 220 (1980) 中描述的 Scatchard分析法可测定单抗的亲和力。

在确定杂交瘤产生的抗体的特异性、 亲和力和反应性之后， 目的 细胞林可以通过 Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103， Academic Press, 1996描述的有限稀释法进行亚 克隆化。 合适的培养基可以是 DMEM或 RPMI-1640等。 另外， 杂交 瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。

利用传统的免疫球蛋白纯化方法， 如蛋白 A琼脂糖凝胶、 羟基磷 灰石层析、 凝胶电泳、 透析或亲和层析等， 可以将亚克隆细胞分泌的 单抗从细胞培养液、 腹水或血清中分离出来。

还可以通过基因工程重组技术获得单克隆抗体 。 利用特异性结合 单抗重链和轻链基因的核酸引物进行 PCR扩增，可以从杂交瘤细胞中 分离得到编码单抗重链和轻链基因的 DNA分子。将所得的 DNA分子 插入表达栽体内， 然后转染宿主细胞（如 E. coli细胞、 COS细胞、 CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细 胞）， 并在合适的条 件下进行培养， 可以获得重组表达的目标抗体。 本发明还提供了分离的核酸分子， 其编码本发明的单克隆抗体或 其抗原结合片段。 此类核酸分子可以从杂交瘤细胞中分离得到， 也可 以利用基因工程重组技术或化学合成方法获得 。

在一个方面， 本发明提供了分离的核酸分子， 其包含能够编码本 发明的单克隆抗体的重链可变区的核酸序列。

在另一个方面， 本发明提供了分离的核酸分子， 其包含能够编码 本发明的单克隆抗体的轻链可变区的核酸序列 。

在另一个方面， 本发明提供了一种栽体， 其包含本发明的分离的 核酸分子。 本发明的栽体可以是克隆栽体， 也可以是表达栽体。 在一个优选实施方案中， 本发明的栽体是例如盾粒， 粘粒， 噬菌 体， 柯斯质粒等等。

在另一个方面， 还提供了包含本发明的分离的核酸分子或栽体 的 宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核 细胞例如大肠杆菌细胞， 以及真核细胞例如酵母细胞， 昆虫细胞， 植物细胞和动物细胞（如哺 乳动物细胞， 例如小鼠细胞、 人细胞等） 。 本发明的细胞还可以是细 胞系， 例如 293T细胞。

在另一个方面， 还提供了制备本发明的单克隆抗体或其抗原结 合 片段的方法， 其包括， 在合适的条件下培养本发明的宿主细胞， 和从 细胞培养物中回收本发明的单克隆抗体或其抗 原结合片段。 在另一个方面， 本发明提供了一种杂交瘤细胞林， 其选自：

1 )杂交瘤细胞林 HBS-E6F6, 其保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC), 且具有保藏号 CCTCC NO.C201270;

2 )杂交瘤细胞林 HBS-E7G11 , 其保藏于中国典型培养物保藏中 心 (CCTCC), 且具有保藏号 CCTCC NO.C201271;

3 ) 杂交瘤细胞林 HBS-G12F5, 其保藏于中国典型培养物保藏中 心 (CCTCC), 且具有保藏号 CCTCC NO.C201272; 和

4 ) 杂交瘤细胞林 HBs-E13C5， 其保藏于中国典型培养物保藏中 心 (CCTCC), 且具有保藏号 CCTCC NO.C201273。

可通过常规方法，从单克隆抗体 E6F6、 E7G11、 G12F5和 E13C5 中获得各个抗体各自所包含的重链可变区、 轻链可变区、 重链可变区 CDR和轻链可变区 CDR的氨基酸序列和 /或核苷酸序列。 在另一个方面， 本发明提供了一种试剂盒， 其包括本发明的单克 隆抗体或其抗原结合片段。 在一个优选的实施方案中， 本发明的单克 隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记 。 在一个优选的实施方 案中， 所述试剂盒还包括第二抗体， 其特异性识别本发明的单克隆抗 体或其抗原结合片段。 优选地， 所述第二抗体还包括可检测的标记。 此类可检测的标记是本领域技术人员熟知的， 包括但不限于， 放射性 同位素， 荧光物质， 发光物质， 有色物质和酶（例如辣根过氧化物酶） 等。

在另一个方面，本发明提供了检测 HBsAg蛋白在样品中的存在或 其水平的方法， 其包括使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合 片段。 在一个优选的实施方案中， 本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还 包括可检测的标记。 在另一个优选的实施方案中， 所述方法还包括， 使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发 明的单克隆抗体或其抗 原结合片段。 所述方法可以用于诊断目的， 或者非诊断目的 （例如， 所述样品是细胞样品， 而非来自患者的样品） 。

在另一个方面， 本发明提供了诊断受试者是否感染了 HBV 的方 法， 其包括： 使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段检 测 HBsAg 蛋白在来自所述受试者的样品中的存在。 在一个优选的实施方案中， 本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括 可检测的标记。 在另一 个优选的实施方案中， 所述方法还包括， 使用携带可检测的标记的第 二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结 合片段。

在另一个方面， 提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段 在 制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测 HBsAg蛋白在样品中的存 在或其水平， 或用于诊断受试者是否感染了 HBV。 在另一个方面， 本发明提供了一种药物组合物， 其包含本发明的 单克隆抗体或其抗原结合片段， 以及药学上可接受的栽体和 /或赋形 剂。

在另一个方面， 本发明提供了用于预防或治疗受试者的 HBV感 染或与 HBV感染相关的疾病 （例如乙肝） 的方法， 其包括， 给有此 需要的受试者施用预防或治疗有效量的本发明 的单克隆抗体或其抗原 结合片段， 或者本发明的药物组合物。

在另一个方面， 提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段 在 制备药物组合物中的用途， 所述药物组合物用于预防或治疗受试者的 HBV感染或与 HBV感染相关的疾病 （例如乙肝） 。

在另一个方面， 提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段 ， 用于预防或治疗受试者的 HBV感染或与 HBV感染相关的疾病（例如 乙肝） 。 在另一个方面， 本发明提供了用于在受试者体内降低 HBV DNA 和 /或 HBsAg的血清水平的方法， 其包括， 给有此需要的受试者施用 有效量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片 段接触。在另一个方面， 提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段 用于制备药物的用途， 所述药物用于在受试者体内降低 HBV DNA和 /或 HBsAg的血清水平。 本发明所提供的疫苗 （蛋白疫苗和基因疫苗） 、 药物和药物组合 物可以单独使用或联合使用， 也可以与其他药学活性剂 （例如干扰素 类药物， 如干扰素或聚乙二醇干扰素）联合使用。 发明的有益效果

与现有技术相比， 本发明的表位肽和含有所述表位肽的重组蛋白 具有显著的有利方面。 特别地， 本发明的表位肽和重组蛋白能够诱发 有效清除体内的 HBV和被 HBV感染的细胞的抗体应答，从而能够在 受试者体内降低 HBV DNA和 /或 HBsAg的血清水平， 且能够用于治 疗受试者的 HBV感染或与 HBV感染相关的疾病 （例如乙肝） 。

此外， 本发明还提供了能够特异性识别 /结合本发明的表位肽的单 克隆抗体及其抗原结合片段。 此类单克隆抗体及其抗原结合片段能够 在受试者体内降低 HBV DNA和 /或 HBsAg的血清水平， 能够有效清 除体内的 HBV和被 HBV感染的细胞， 从而能够用于治疗受试者的 HBV感染或与 HBV感染相关的疾病 （例如乙肝） 。

本发明的表位肽的优势还在于， 针对该表位肽的单克隆抗体及多 克隆抗体能够在受试者（例如 HBV转基因小鼠）体内显著降低 HBsAg 水平和 HBV DNA水平， 且治疗有效的持续时间显著长于针对其它表 位的抗体。 本发明的表位肽的优势还在于， 以其为主要活性成分的疫 苗在免疫受试者 （例如 HBV转基因小鼠）后， 可持久降低受试者体 内的 HBsAg水平和 HBV DNA水平。 下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案 进行祥细描述， 但 是本领域技术人员将理解， 下列附图和实施例仅用于说明本发明， 而 不是对本发明的范围的限定。 根据附图和优选实施方案的下列详细描 述， 本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术 人员来说将变得显 然。 附图说明

图 1: 不同小鼠单克隆抗体治疗 HBV转基因小鼠的疗效评估。 图 2: HBs-E6F6, HBs-E7Gll、 HBs-G12F5、 HBs-E13C5、 0.9%NS 和恩替卡韦 （ETV ) 治疗 HBV转基因小鼠的疗效评估。 其中， 显示 的数值为各实臉组 4只小鼠的平均值。 图 2A: 小鼠单克隆抗体和恩替 卡韦（ETV )治疗 HBV转基因小鼠后血清 HBsAg的下降幅度；图 2B: 小鼠单克隆抗体和 ETV治疗 HBV转基因小鼠后血清 HBV DNA的下 疗 HBV转基因小鼠后血

图 3: HBS-E6F6注射后 HBV DNA和 HBsAg的动力学变化。 图 3A: HBS-E6F6注射 HBV转基因小鼠后血清 HBsAg的下降幅度； 图 3B: HBS-E6F6注射 HBV转基因小鼠后血清 HBV DNA的下降幅度。

图 4: 嵌合抗体治疗 HBV转基因小鼠的疗效评估。

图 5: 9 种重组蛋白的构建、 表达、 纯化和电镜观察。 图 5A: pC149-SEQ克隆的构建的示意图； 图 5B: 9种重组蛋白的 SDS-PAGE 检测与电镜观察的结果。

图 6: HBs-E6F6, HBs-E7Gll、 HBs-G12F5、 HBs-E13C5抗体的 表位分析。

图 7: HBs-E6F6/HBs-E7Gll对表位肽 SEQ1的氨基酸突变的敏 感性的分析。 其中， "Ref."表示以 HBsAg作为体现抗体反应性的参照 抗原， "-"表示反应性与 HBsAg相同， "++，，表示反应性比 HBsAg低 2 个数量级（ loglO )， "++++，，表示反应性比 HBsAg低 4个数量级（ logxo )。

图 8: 5种包含表位肽的重组蛋白的制备及其免疫原� �的评价。 图 8A: 5种重组蛋白的 SDS-PAGE检测与电镜观察的结果。 图 8B: 5 种重组蛋白免疫 BALB/C小鼠后血清抗体滴度的变化。

图 9: 小鼠血源多克隆抗体的治疗效果的评估。

图 10: 5种重组蛋白治疗 HBV转基因小鼠的效果评估。

图 11: 3种包含表位肽的重组蛋白的制备及其治疗效� �的评估。 图 11A: 3种重组蛋白的 SDS-PAGE检测与电镜观察的结果。 图 11B: 3种重组蛋白免疫 HBV转基因小鼠后， 小鼠血清 HBsAg水平、 血清 HBV DNA 7J平、 Anti-HBsAg抗体水平和抗-栽体蛋白抗体水平的变 化。

图 12: CRM197-SEQ6, CRM389-SEQ6, CRMA-SEQ6 重组蛋 白的示意图。 Linker, 连接体。 序列信息

本发明涉及的序列的信息提供于下面的表 1中。

SEQ ID

名称 序列信息

NO

1 SEQ1 GPCKTCT

2 SEQ2 GPCRTCT

3 SEQ3 STTTSTGPCKTCTTP

4 SEQ4 TTSTGPCKTCT

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关于生物材料保藏的说明

本发明涉及下列已在中国典型培养物保藏中 心 (CCTCC, Wuhan University, Wuhan, China)进行保藏的生物材料：

1 )杂交瘤细胞林 HBS-E6F6，其具有保藏号 CCTCC NO.C201270， 且保藏时间为 2012年 6月 7日；

2 ) 杂交瘤细胞林 HBS-E7G11 , 其具有保藏号 CCTCC NO.C201271 , 且保藏时间为 2012年 6月 7日；

3 ) 杂交瘤细胞林 HBS-G12F5， 其具有保藏号 CCTCC NO.C201272, 且保藏时间为 2012年 6月 7日； 和

4 ) 杂交瘤细胞林 HBS-E13C5， 其具有保藏号 CCTCC NO.C201273 , 且保藏时间为 2012年 6月 7日。 具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明 （而非限定本发明） 的实施例来 描述本发明。

除非特别指明， 本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫 检 测法， 基本上参照 J. Sambrook等人， 分子克隆： 实臉室手册， 第 2 版， 冷泉港实臉室出版社， 1989， 以及 F. M. Ausubel等人， 精编分子 生物学实臉指南， 第 3版， John Wiley & Sons, Inc., 1995中所述的 方法进行； 限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条 件。 实施例 中未注明来源的试剂均是本领域的常规试剂或 市售可得的试剂。 本领 域技术人员知晓， 实施例以举例方式描述本发明， 且不意欲限制本发 明所要求保护的范围。 实施例 1: 小鼠单克隆抗体的制备及性质分析

目的： 获得对 HBsAg具有特异性的小鼠单克隆抗体。

1.1 Anti-HBsAg小鼠单克隆抗体的制备

1.1.1小鼠免疫

1.1.1.1免疫原的准备： 免疫原为 CHO表达的重组乙型肝炎病毒 表面抗原主蛋白 （HBsAg, 购自北京万泰生物药业股份有限公司） 。 取重组蛋白稀幹至 0.4 mg/mL, 与弗氏佐剂等体积混合， 使其成油包 水状乳剂 （判断混合液是否乳化完全的方法： 可将一小滴混合液滴在 清水的液面上， 若混合液凝聚不散， 则可认为已基本上混匀） 。 初次 免疫使用弗氏完全佐剂， 后续加强免疫使用弗氏不完全佐剂， 并且融 合前 72 h的最后一次加强免疫不加佐剂。

1.1.1.2小鼠的基础免疫： 使用上述免疫原对 6-8周龄 BALB/c雌 鼠进行皮下多点注射免疫， 注射剂量为 400 只 /次， 每次免疫前采 集 200 眼球静脉血以备滴度测定。每隔 2周加强免疫一次。用间接 ELISA测定血清滴度， 当小鼠血清滴度达到平台期后， 小鼠停止免疫 并休息两个月后进行融合。

1.1.1.3融合前 72小时的免疫加强（Final boost )： 小鼠脾脏细胞 与小鼠骨髓瘤细胞融合前 72 h进行脾脏免疫加强，此次加强的免疫原 不含佐剂， 取 100 l 0.5 mg/mL的重组蛋白进行注射。 其中脾脏免疫 前， 需先用乙醚麻醉小鼠， 剖开腹腔外皮取出脾脏， 沿脾脏纵向注射 ΙΟΟ μί抗原， 迅速手术缝合腹皮切口。

1.1.2融合杂交瘤的制备与筛选

融合前 72 h加强免疫后，取小鼠脾脏制成细胞悬液与小� �骨髓瘤 细胞 Sp2/0进行细胞融合， 以获得杂交瘤细胞。 在此之前先制备饲养 细胞。 在杂交瘤细胞的培养过程中， 融合后的大量骨髓瘤细胞和脾细 胞在 1640-HAT培养液中相继死亡， 单个细胞或少数分散的细胞不易 存活， 必须加入其他细胞方能使之生存， 这种被加入的活细胞称为饲 养细胞。本实验室使用小鼠腹腔巨噬细胞或 13天龄的小鼠胸腺细胞作 为饲养细胞。

1.1.2.1小鼠巨噬细胞的制备： 分如下步骤进行： ( i )将一只 6周 龄左右的 BALB/c小鼠引颈处死， 自来水冲洗， 浸泡于 75 %乙醇溶液 中 5 min; 放入超净工作台， 使小鼠腹部朝上； 用镊子 ^^小鼠腹部 皮肤， 剪一小口， 用大镊子向上下方向撕拉开皮肤， 充分暴露腹部。

( ii )用无菌眼科镊子提起腹膜， 换一把剪刀将腹膜中央处剪一小口， 然后用 1 mL吸管通过小口向腹腔内注入适量培养液， 用吸、 管小心 在腹腔内搅动， 最后吸出培养液于离心管中。 （iii )将腹腔细胞液溶 解于 HAT培养液或 HT培养液中， 使成浓度为 2xl0 ⁵ /mL的巨噬饲养 细胞。 （iv )加入 96孔细胞培养板， 每孔 O.l mL, 置培养箱培养； 也 可直接与融合细胞混合后添加到 96孔细胞培养板中。

1.1.2.2小鼠胸腺细胞的制备： 分如下步骤进行 ( i )将一只 13天 龄左右的 BALB/c小鼠引颈处死， 自来水冲洗， 浸泡于 75 %乙醇溶液 中 5 min; 放入超净工作台， 使小鼠腹部朝上； （ii )用镊子提起小鼠 腹部皮肤， 将腹部和胸部的外皮剪开。 （iii ) 用另一把干净的剪刀剪 开胸腔， 用镊子取出乳白色的胸腺， 经研磨后通过 200目细胞筛， 得 到胸腺饲养细胞液。

1.1.2.3小鼠骨髓瘤细胞的制备： 分如下步骤进行。 （i )小鼠骨髓 瘤细胞林 Sp2/0-Agl4(Sp2/0)易培养， 融合率高， 是目前最理想的融合 细胞，但 Sp2/0杂交瘤细胞系对培养条件的变化比 NS-1敏感，过度稀 释（密度低于 3xl0 ⁵ /mL )和 pH碱性（ pH高于 7.3 )时生长不良。 （ ii ) 选择对数生长期的细胞进行融合。 （ iii ) 融合前从培养瓶移出骨髓瘤 细胞于离心管， 用 RPMI-1640培养液洗 3次（ 1000 rpmx5min ) 。 用 RPMI-1640培养液重悬细胞， 计数。 （ iv )—般融合前 5天开始复苏 小鼠骨髓瘤细胞， 每次融合约需 6瓶 35 cm ² Sp2/0细胞。

1.1.2.4 免疫脾细胞的制备： 分如下步骤进行。 （i )取待融合的 BALB/C小鼠， 摘除眼球放血致小鼠死亡， 收集的血液制成抗血清， 可作抗体检测的阳性对照。 自来水冲洗， 浸泡于 75 %乙醇溶液中 5 min, 随即放入超净台内小鼠解剖板上， 右侧卧位。 （ii )无菌手术打 开腹腔取出脾脏， 用剪刀剪成小块放于 200目细胞筛网上， 再用研磨 棒（注射器内芯）挤压研磨，同时用吹管滴加 RPMI-1640培养液。（iii ) 补加适量 RPMI-1640培养液， 静置 3-5 min, 取上 2/3部分悬液移入 50 mL塑料离心管中。 上述过程反复 2-3次。 （ iv )用 RPMI-1640 培 养液洗细胞 3次（ 1000 rpmxlO min ) 。 （ v ) 用 RPMI-1640 培养液 重悬细胞， 计数。

1.1.2.5使用 PEG促融剂融合制备杂交瘤： 分如下步骤进行。 （1 ) 融合前先将 1 mL的 PEG-1500和 10 mL的 RPMI-1640无血清培养基 和和 220000 mmLL完完全全培培养养基基预预温温至至 3377。。CC。。 （（ iiii )) *

细细胞胞混混合合于于 5500 mmLL 离离心心管管内内 （（ llxxllOO ⁸⁸ 脾脾细细胞胞 ++ llxxllOO ⁷⁷ 骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞，， 约约 1100::11 )) ，， 离离心心 11550000 rrppmmxx88 mmiinn，， 离离心心后后，， 轻轻轻轻弹弹击击管管底底，， 使使细细胞胞疏疏松松 成成糊糊状状。。 （（ iiiiii )) 11 mmLL吸吸管管吸吸取取 00..88 mmLL ((按按 llxxllOO ⁸⁸ 脾脾细细胞胞 ++ 00..88 mmLL PPEEGG )) 加加入入离离心心管管内内，， 边边加加边边轻轻轻轻搅搅拌拌，， PPEEGG平平均均在在 6600 ss内内加加完完，， 随随即即加加入入 1100 mmLL预预温温至至 3377 VV的的 RRPPMMII--11664400完完全全培培养养液液，， 搅搅拌拌要要温温和和。。 最最后后补补 加加 RRPPMMII--11664400培培养养液液至至 4400 mmLL，， 离离心心 11000000 rrppmmxx55 mmiinn。。 （（ iivv ))弃弃上上清清 液液，， 取取少少量量 HHTT培培养养液液将将细细胞胞小小心心吹吹� �散，， 将将细细胞胞移移入入准准备备好好的的 HHTT培培 养养液液中中，， 加加入入 9966孔孔细细胞胞培培养养板板，， 每每孔孔 OO..ll mmLL,, 放放入入 CC0022孵孵育育箱箱中中培培 养养。。（（ vv ))1122 hh后后，，配配置置适适量量的的 HHAATT完完全全培培养养基基，，每每个个孔孔 中中滴滴加加 00..11 mmLL ；； 55天天后后，， 用用 HHTT完完全全培培养养基基给给孔孔中中的的� �细胞胞上上清清进进行行 5500--110000 %%的的换换液液；； 大大约约 99--1144天天后后，， 吸吸取取上上清清检检测测。。

11..11..22..66杂杂交交瘤瘤的的筛筛选选：：间� ��接接 EELLIISSAA筛筛选选，，包包被被重重组组抗抗� �原 HHBBssAAgg 110000 nngg//wweellll,, 加加入入细细胞胞上上清清 5500 uuLL检检测测，， 并并挑挑选选出出阳阳性性克克隆隆孔孔。。

11..11..22..77杂杂交交瘤瘤细细胞胞的的克克隆� ��化化：： 采采用用有有限限稀稀幹幹法法，， 先先把把细细胞胞按按一一定定 浓浓度度进进行行梯梯度度稀稀释释，， 然然后后接接种种到到 9966孔孔细细胞胞培培养养板板的的每每个个� �孔中中，，尽尽可可能能 使使孔孔内内只只有有一一个个细细胞胞生生 长长。。 杂杂交交瘤瘤单单克克隆隆阳阳性性细细胞胞 林林一一般般需需要要重重复复克克 隆隆 22--33次次，， 直直到到 110000 %%阳阳性性后后确确认认为为稳稳定定克克隆� ��林林。。

11..11..33单单抗抗腹腹水水的的生生产产

取取 BBAALLBB//cc小小鼠鼠 22--33只只，， 经经腹腹腔腔注注入入 00..55 mmLL液液体体石石蜡蜡油油。。 11周周后后，， 将将对对数数生生长长期期的的杂杂交交瘤瘤 细细胞胞以以 11000000 rrppmm 离离心心 55 mmiinn，， 弃弃上上清清液液。。 杂杂 交交瘤瘤细细胞胞用用无无血血清清培培养养 液液悬悬浮浮，， 并并将将细细胞胞数数调调至至 （（11--22 )) xxll00 ⁶⁶ //mmLL,, 每每 只只小小鼠鼠腹腹腔腔注注射射 00..55 mmLL。。 77--1100 dd后后，， 小小鼠鼠腹腹部部明明显显膨膨大大后后，， 引引颈颈处处死死 小小鼠鼠，， 自自来来水水冲冲洗洗，， 浸浸洗洗，， 浸浸泡泡于于 7755 %% 乙乙醇醇中中 55 mmiinn，， 使使小小鼠鼠腹腹部部朝朝 上上用用注注射射针针头头固固定定四四肢肢 于于小小鼠鼠解解剖剖台台板板。。 用用镊镊子子提提起起小小鼠鼠腹腹部部皮皮 肤肤，， 剪剪一一小小口口，， 然然后后从从两两边边向向小小鼠鼠背背部部 方方向向剪剪开开，， 用用大大镊镊子子向向上上下下方方向向撕撕 开开皮皮肤肤，， 充充分分暴暴露露腹腹部部。。 用用无无菌菌眼眼科科镊镊子子提提取取腹腹 膜膜，， 将将腹腹膜膜中中央央处处剪剪 一一小小口口，， 然然后后用用 llmmLL吸吸管管通通过过小小口口吸吸出出腹腹 腔腔内内全全部部腹腹水水。。收收集集的的 腹腹水水 可可以以混混合合，， 置置离离心心管管离离心心，， 33000000 rrppmm，， 2200 mmiinn。。 离离心心后后收收集集上上清清。。 1.1.4单抗腹水的纯化

经硫酸铵沉淀和 Protein A亲和层析纯化（购自美国 GE公司） ， 获得纯化的单克隆抗体。

1.2 Anti-HBsAg小鼠单克隆抗体的性质分析

1.2.1多肽合成

以 HBV序列 GenBank ID: AAF24729.1作为参考序列， 合成 27 条多肽(委托厦门精聚生物科技有限公司合成� �。这 27条多肽（ S1-S27 ) 一起覆盖了 HBsAg的全长 226个氨基酸。 S1-S27的多肽信息如表 2 所示， HBsAg的全长氨基酸序列如 SEQ ID NO: 42所示。

S1-S27的多肽信息

名称 酸位置 氨基 ^^列

S1 HBsAg-aal-aal5 MENIASGLLGPLLVL

S2 HBsAg-aa9-aa23 LGPLLVLQAGFFLLT

S3 HBsAg-aal7-aa31 AGFFLLTKILTIPQS

S4 HBsAg-aa25-aa39 ILTIPQSLDSWWTSL

S5 HBsAg-aa33-aa47 DSWWTSLNFLGGTPV

S6 HBsAg-aa41-aa55 FLGGTPVCLGQNSQS

S7 HBsAg-aa49-aa63 LGQNSQSQISSHSPT

S8 HBsAg-aa57-aa71 ISSHSPTCCPPICPG

S9 HBsAg-aa65-aa79 CPPICPGYRWMCLRR

S10 HBsAg-aa73-aa87 RWMCLRRFIIFLCIL

S11 HBsAg-aa81-aa95 IIFLCILLLCLIFLL

S12 HBsAg-aa89-aal03 LCLIFLLVLLDYQGM

S13 HBsAg-aa97-aalll LLDYQGMLPVCPLIP

S14 HBsAg-aal05-aall9 PVCPLIPGSSTTSTG

S15 HBsAg-aall3-aal27 SSTTSTGPCKTCTTP

S16 HBsAg-aal21-aal35 CKTCTTPAQGTSMFP

S17 HBsAg-aal29-aal43 QGTSMFPSCCCTKPT

S18 HBsAg-aal37-aal51 CCCTKPTDGNCTCIP

S19 HBsAg-aal45-aal59 GNCTCIPIPSSWAFA

S20 HBsAg-aal53-aal67 PSSWAFAKYLWEWAS

S21 HBsAg-aal61-aal75 YLWEWASVRFSWLSL

S22 HBsAg-aal69-aal83 RFSWLSLLVPFVQWF

S23 HBsAg-aal77-aal91 VPFVQWFVGLSPTVW

S24 HBsAg-aal85-aal99 GLSPTVWLSVIWMMW 525 HBsAg-aal93-aa207 SVIWMMWFWGPSLYN

526 HBsAg-aa201-aa215 WGPSLYNILSPFMPL

527 HBsAg-aa209-aa226 LSPFMPLLPIFFCLWVYI

1.2.2 Anti-HBsAg小鼠单克隆抗体与多肽 S1-S27的反应性分析 ( 1.2.2.1 )反应板的制备。

将多肽用 pH9.6的 50 mM CB緩冲液（ NaHC0 ₃ /Na ₂ C0 ₃ 緩冲液， 终浓度为 50mM， pH值为 9.6 )稀释， 终浓度为 g/mL; 在 96孔酶 标板每孔中加入 ΙΟΟμΙ^的包被液， 2 ~ 8。C包被 16 ~ 24小时后再 37。C 包被 2小时； 用 PBST洗涤液（ 20 mM PB7.4, 150 mM NaCl, 0.1 % Tween20 )洗涤 1次； 然后每孔加入 200μί的封闭液（含有 20%小牛 血清及 1 %酪蛋白的 pH值为 7.4的 20 mM Na ₂ HP0 ₄ /NaH ₂ P0 ₄ 緩冲液 溶液），放入 37 ^e C封闭 2小时； 弃去封闭液。干燥后装入铝箔袋 2-8 ^e C 保存备用。

( 1.2.2.2 ) Anti-HBsAg小鼠单克隆抗体的 ELISA检测

取 1.1中获得的 25林 Anti-HBsAg小鼠单克隆抗体以含 20%新生 牛血清的 PBS溶液稀释至 l g/mL， 进行定性 ELISA检测。

样品反应： 取 27种已包被多肽的酶标板， 每孔加入 ΙΟΟμ 已稀 释的样品， 置于 37。C温箱反应 30分钟。

酶标记物反应： 完成样品反应步骤后， 将酶标板用 PBST 洗液 ( 20mM PB7.4, 150mM NaCl, 0.1 %Tween20 )洗涤 5遍， 每孔加入 100μL· HRP标记的羊抗鼠 IgG ( GAM )反应液， 置于 37。C温箱反应 30分钟。

显色反应： 完成酶标记物反应步骤后， 将酶标板用 PBST 洗液 ( 20mM PB7.4, 150mM NaCl, 0.1 %Tween20 )洗涤 5遍， 每孔加入 TMB显色剂 （购自北京万泰生物药业股份有限公司）各 50μ ， 置于 37。C温箱反应 15分钟。

终止反应及读值测量： 完成显色反应步骤后， 在反应完的酶标板 中每孔加入终止液（购自北京万泰生物药业股 份有限公司） 50μ ， 并 于酶标仪上检测各孔的 OD450/630值。 Anti-HBsAg小鼠单克隆抗体与 27种多肽的反应性判定： 根据反 应后的读值进行判定。 若检测值 /本底值大于 5， 则判定为阳性。

( 1.2.2.3 ) Anti-HBsAg小鼠单克隆抗体的识别性质分析

结果如表 3所示。 所获得的 25林 Anti-HBsAg小鼠单克隆抗体的 识别类型可分为 5组（根据其识别性质）， 分别为： sA、 sB、 sC、 sD、 sE, 其中 sA组抗体识别的多肽为 S15和 S16; sB组抗体识别的多肽 为 S16; sC组抗体与 27条多肽的反应均为阴性； sD组抗体识别的多 肽为 S18; 和， sE组抗体识别的多肽为 S8。

表 3: Anti-HBsAg小鼠单克隆抗体的性质分析

分組 识别的多肽 抗体名称 抗体亚型 sA S15, S16 HBS-E7G11 IgGl sA S15, S16 HBS-G12F5 IgGl sA S15, S16 HBS-E6F6 IgGl sA S15, S16 HBS-E13C5 IgGl sA S15, S16 HBS-3E9 IgGl sA S15, S16 HBS-77D1 IgG2a sA S15, S16 HBS-86H6 IgG2b sA S15, S16 HBS-4D12 IgG2b sA S15, S16 HBS-32H10 IgGl sA S15, S16 HBS-70A6 IgGl sA S15, S16 HBS-6C10 IgM sA S15, S16 HBS-61B1 IgGl sA S15, S16 HBS-37E12 IgG2b sA S15, S16 HBS-85D12 IgGl sA S15, S16 HBS-H8D9 IgGl sA S15, S16 HBS-E11E4 IgG2a sA S15, S16 HBS-83H12 IgGl sB S16 HBS-127D7 IgGl sC 无 HBS-2C1 IgGl sC 无 HBs-SIA IgG2a sC 无 HBS-5F11 IgG2a sC 无 HBS-20A2 IgG2b sD S18 HBS-42B6 IgGl S18 HBs-A13A2 IgG2b

S8 HBs-45E9 IgG3 实施例 2: Anti-HBsAg小鼠单克隆抗体治疗 HBV转基因小鼠的 疗效的评估

目的：评估 Anti-HBsAg小鼠单克隆抗体治疗 HBV转基因小鼠的 疗效。

2.1 HBsAg变性 -化学发光检测方法的建立

由于治疗后血清中存在大量的抗体，在 HBsAg的检测过程中可能 受到抗原抗体复合物的干扰， 因此， 需建立一个不受抗体干扰的定量 检测 HBsAg的方法。本发明的研究者采用变性的方法� ��样品中的抗原 抗体复合物裂解，从而可排除抗体的干扰，进 行准确的 HBsAg定量检 测。

2.1.1反应板的制备

将小鼠单克隆抗体 HBS-45E9 用 pH7.4 的 20mM PB 緩冲液 ( Na ₂ HP0 ₄ /NaH ₂ P0 ₄ 緩冲液， 终浓度为 50mM， pH值为 7.4 )稀幹， 终浓度为 2 g/ml;在 96孔酶标板每孔加入 ΙΟΟμΙ的包被液， 2 ~ 8。C包 被 16 ~ 24小时后再 37。C包被 2小时；用 PBST洗涤液（ 20mM PB7.4, 150mM NaCl, 0.1%Tween20 ) 洗涤 1次； 然后每孔加入 200μ1的封 闭液（含有 20%小牛血清及 1%酪蛋白的 pH 值为 7.4 的 20mM Na2HP04 /NaH2P04緩冲液溶液） ， 放入 37。C封闭 2小时； 弃去封 闭液。 干燥后装入铝箔袋 2-8。C保存备用。

2.1.2 HBsAg的变性 -化学发光定量检测

样品稀释：将小鼠血清以含 20%新生牛血清的 PBS溶液稀释成 1: 30、 1: 150共 2个梯度进行定量检测。

样品变性处理： 将上述已稀幹的样品 15 L 与变性緩冲液 7.5μί ( 15%SDS, 溶于 20mM PB7.4 ) 混合均匀， 放入 37。C温育 1小时。 后往混合液中加入 90μί 中和緩冲液 （4% CHAPS , 溶于 20mM PB7.4 ) ， 混合均匀。

样品反应：将上述变性处理获得的混合液样品 ΙΟΟμΙ^加入反应板。 置于 37。C温箱反应 60分钟。

酶标记物反应：完成样品反应步骤后，将化学 发光反应板用 PBST 洗液（20mM PB7.4， 150mM NaCl, 0.1%Tween20 )洗涤 5遍， 每孔 加入 ΙΟΟμΙ^ HBS-A6A7-HRP反应液（由北京万泰生物药业股份有 限公 司提供） ， 置于 37。C温箱反应 60分钟。

发光反应和测量： 完成上述酶标记物反应步骤后， 将化学发光反 应板用 PBST洗液（20mM PB7.4， 150mM NaCl, 0.1%Tween20 )洗 涤 5遍， 后加入发光液（由北京万泰生物药业股份有限 公司提供） ， 进行光强检测。

待检样品 HBsAg浓度的获得：使用标准品进行同样的实验� �� 并基 于标准品的测定结果绘制标准曲线 （光强测量值与浓度值的线性回 归） ； 根据标准曲线， 计算出待检样品的 HBsAg浓度。

2.2 HBV DNA的实时荧光定量检测

HBV DNA的实时荧光定量检测试剂盒购于上海科华生 物工程股 份有限公司， 按试剂盒说明书进行 HBV DNA的实时荧光定量检测。

2.3 Anti-HBsAg小鼠单克隆抗体治疗 HBV转基因小鼠的疗效 将实施例 1中获得的 25林抗体以 20 mg/kg的剂量单剂尾静脉注 射的方式注入 HBV转基因小鼠体内。 以生理盐水（0.9%NS )注射作 为对照组。 每组 4只 HBV转基因小鼠， 雄性和雄性各 2只。 通过眼 眶后静脉丛取血的方式采集小鼠血，监测小鼠 血清中的 HBsAg水平和 HBV DNA 7J平的变化。

检测结果示于图 1。结果显示，用 5组针对不同表位的 Anti-HBsAg 小鼠单克隆抗体治疗 HBV转基因小鼠后， 其中 sA、 sD两组抗体显示 出明显的病毒清除效果： 使用这两组抗体的治疗组中的小鼠血清 HBsAg和 HBV DNA的水平均出现明显下降；用其它三组抗体治 疗后， 小鼠血清 HBsAg和 HBV DNA的水平未显示出明显下降。 在 sA、 sD 两组抗体中， 用 sA组抗体治疗后， HBsAg和 HBV DNA的血清水平 的下降幅度大于 sD组抗体， 且持续抑制时间最长的四林抗体均为 sA 组抗体， 分别是 HBs-E6F6、 HBs-E7Gll、 HBs-G12F5、 HBs-E13C5。 实施例 3: sA组小鼠单克隆抗体治疗 HBV转基因小鼠的疗效和 副作用

目的： 评估 sA组小鼠单克隆抗体治疗 HBV转基因小鼠的疗效和 副作用，监测单剂抗体治疗后有效抑制病毒的 持续时间，并监测 ALT。

挑选出实施例 2筛选得到的治疗效果最优的四林抗体 HBs-E6F6、 HBs-E7Gll、 HBs-G12F5、 HBs-E13C5进行实臉。 以 20 mg/kg的剂 量单剂尾静脉注射的方式注入 HBV 转基因小鼠体内。 以生理盐水 ( 0.9%NS )作为阴性对照组，并且以通过灌胃的方式给� � 3.2 mg/kg/d 恩替卡韦 （ETV ) 治疗的 HBV转基因小鼠作为有效药物对照组。 每 组 4只 HBV转基因小鼠， 雄性和雌性各 2只。 通过眼眶后静脉丛取 血的方式采集小鼠血， 监测小鼠血清中的 HBsAg、 HBV DNA、 ALT 的水平。

按实施例 2中所述方法检测 HBsAg和 HBV DNA的水平，并且利 用北京万泰生物药业股份有限公司提供的丙氨 酸氨基转移酶（ ALT ) 检测试剂盒进行 ALT的检测。

用 HBs-E6F6、 HBs-E7Gll、 HBs-G12F5、 HBs-E13C5、 0.9%NS 或恩替卡韦 （ETV ) 治疗 HBV转基因小鼠的结果示于图 2中 （显示 的数值为各实臉组 4只小鼠的平均值） 。 结果显示， 单抗 HBs-E6F6、 HBs-E7Gll、 HBS-G12F5或 HBS-E13C5的单剂治疗后， HBV转基因 小鼠血清中 HBsAg和 HBV DNA的水平均出现明显下降， 其中 HBV DNA的下降幅度与 ETV治疗组相当。 相比之下， ETV治疗组小鼠血 清中的 HBsAg水平未出现明显下降， 而抗体治疗组的 HBsAg血清水 平则显著降低。 此外， 在任一抗体的治疗过程中， 均未观察到 ALT 的升高。 实施例 4: HBS-E6F6注射后小鼠血清中 HBV DNA和 HBsAg的 动力学变化过程

目的： 探索单克隆抗体治疗发挥最大疗效所需的最短 时间。 从实施例 3的四林抗体中挑选出治疗效果最好的小鼠单� �隆抗体

HBS-E6F6,以 20 mg/kg的剂量单剂尾静脉注射的方式注入 HBV转基 因小鼠体内。本组实臉取用 4只雄性小鼠，监测小鼠血清中 HBV DNA 和 HBsAg的动力学变化过程。

按实施例 2中所述方法检测 HBsAg、 HBV DNA的血清水平。 检测结果示于图 3。结果显示，小鼠血清中的 HBsAg和 HBV DNA 的水平均可在注射后 1至 24小时内降低至最大抑制水平。 实施例 5: 人鼠嵌合 HBS-E6F6和 HBs-E7Gll抗体的治疗效果评 估

目的： 评价嵌合抗体的治疗效果。

将 HBS-E6F6和 HBS-E7G11抗体的 Igv基因与编码人抗体恒定区 的 Igc 基因连接， 在 CHO 细胞中重组表达并纯化获得嵌合抗体 HBS-E6F6和嵌合抗体 HBs-E7Gll。将嵌合抗体以 10 mg/kg的剂量单 剂尾静脉注射的方式注入 HBV 转基因小鼠体内， 监测小鼠血清中 HBV DNA和 HBsAg的动力学变化过程。 检测结果示于图 4。 结果显 示，嵌合抗体 HBS-E6F6和嵌合抗体 HBS-E7G11均能够有效清除小鼠 体内的 HBsAg和 HBV DNA。 实施例 6: sA组抗体识别的表位的鉴定

目的：鉴定 sA组抗体识别的表位，确定其识别的核心氨基� ��序列。 6.1 构建 pC149-SEQ克隆

将 HBcAg用作栽体蛋白时， 可以使用全长 HBc Ag蛋白或其片段 (例如， HBcAg蛋白的 N端 aa 1-149 ) (参见， 杨海杰等人， 基于乙 型肝炎病毒核心蛋白的颗粒性肽展示栽体的构 建，厦门大学学报(自然 科学版 )2004.05 Vol. 43.No. 4 ) 。 在本实臉中， 以 HBcAg蛋白的片段 ( aa 1-149 )为栽体蛋白， 构建了一系列克隆。

用定点突变的方法将编码 HBcAg蛋白片段（aa 1-149 ) 的核苷酸 序列中编码 HBcAg aa79-81的序列缺失， 并在缺失两端各引入一个连 接体， 并且在 2个连接体之间设计 BamH I/EcoR I酶切位点， 从而获 得栽体蛋白 C149/mut的编码序列（ C149/mut的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 43所示，其结构为 HBc( 1-78 )-G ₄ SG ₄ T-GS-G ₄ SG ₄ -HBc( 82-149 )； 在 C149/mut中， HBcAg的 3个 Jl^酸（ aa 79-81 )被富含甘氨酸的 柔性连接体 G ₄ SG ₄ T-GS-G ₄ SG ₄ 替代 )； 将 C149/mut的编码序列克隆 入 pTO-T7原核表达栽体（罗文新等，生物工程学报 ， 2000， 16:53-57 )， 获得重组质粒 pC149/mut，其编码蛋白 C149/mut。之后，利用将 BamH I/EcoR I酶切位点， 将目的多肽的编码序列 （图 5A中以 SEQ表示） 克隆入柔性连接体之间， 从而获得重组栽体 pC149-SEQ， 其编码重组 蛋白 C149-SEQ (包含栽体蛋白 C149/mut和目的多肽 SEQ ) 。 重组 栽体 pC149-SEQ的克隆设计和结构如图 5A所示。

将表 4 中所列的 9 段多肽的基因序列分别连接入重组质粒 pC149/mut, 从而获得 9个 pC149-SEQ重组栽体（ pC149-SEQl， 3， 4， 5， 6, 8， 9， 10， 11 )，其分别编码重组蛋白 C149-SEQ1, 3， 4， 5， 6, 8， 9， 10， 11。

表 4: 用 C149/mut展示的目的多肽

多肽名称 多肽位置 ^列

SEQ1 HBsAg-aall9-aal25 GPCKTCT

SEQ3 HBsAg-aall3-aal27 STTTSTGPCKTCTTP

SEQ4 HBsAg-aall5-aal25 TTSTGPCKTCT

SEQ5 HBsAg-aal21-aal29 CKTCTTPAQ

SEQ6 HBsAg-aall3-aal35 STTTSTGPCKTCTTP AQGNSMFP

SEQ8 HBsAg-aall3-aal21 STTTSTGPC

SEQ9 HBsAg-aall7-aal23 STGPCKT

SEQ10 HBsAg-aal21-aal24 CKTC

SEQ11 HBsAg-aal23-aal37 TCTTPAQGNSMFPAQ

6.2 表达并纯化 C149-SEQ蛋白

下面以 C149-SEQ6为例， 阐述重组蛋白的表达和纯化过程。 ( 6.2.1 ) 高效表达菌林的获得： 按 6.1 中所述方法构建目的栽体 PC149-SEQ6, 经 DNA测序鉴定正确后， 将目的栽体转化入大肠杆菌 ER2566菌林 ER2566 ) ， 获得表达菌林。

( 6.2.2 ) C149-SEQ6蛋白的表达： 将表达菌林接种至 500 mL三 角瓶，于 37摄氏度定温摇床培养至 OD=1.0左右，加入异丙基 -beta-D- 硫代半乳糖苷（ IPTG )至终浓度 0.5 mM, 于 25摄氏度摇晃诱导表达 6小时。

( 6.2.3 ) C149-SEQ6蛋白的纯化：

( 6.2.3.1 )菌体超声破碎： 离心收取 6.2.2中的菌体， 超声破碎菌 体， 超声緩冲液成分为： 20 mM磷酸盐緩冲液 ( PH6.0 ) +300 mM NaClo

( 6.2.3.2 ) 目的蛋白的初步纯化： 由于目的蛋白具有耐热的性质， 因此， 将超声破碎后的混合物于 65摄氏度水浴 30分钟， 离心收取上 清； 按体积比 1: 1向上清中加入饱和硫酸铵， 离心收取沉淀； 加入适 当体积的緩冲液将沉淀重悬， 緩冲液成分为： 20 mM 磷酸盐緩冲液 ( ρΗ=7·4 ) +150 mM NaCl, 获得初步纯化的目的蛋白。

( 6.2.3.3 ) 目的蛋白的层析纯化： 利用 Sepharose 4FF ( GE )分 子筛柱层析进一步纯化 6.2.3.2中获得的蛋白，从而获得经纯化的目的 蛋白。对经纯化的目的蛋白进行 SDS-PAGE检测， 并用透射电镜鉴定 目的蛋白颗粒的组装状态。

图 5B显示了 9种重组蛋白的 SDS-PAGE检测结果和透射电镜观 察结果。 结果显示， 所获得的 9种重组蛋白的纯度均大于 95%， 并且 均能够组装成大小均一的蛋白颗粒。

6.2 评价 sA组抗体与 9种重组蛋白的反应性

6.2.1反应板的制备

按实施例 1-1.2节中的方法制备反应板，包被抗原为展示� ��的多肽 的 9种重组蛋白。

6.2.2 HBs-E6F6, HBs-E7Gll、 HBs-G12F5、 HBs-E13C5与各重 组蛋白的反应性的 ELISA检测

按实施例 1-1.2 节中的方法检测 HBs-E6F6、 HBs-E7Gll、 HBs-G12F5、 HBs-E13C5与各重组蛋白的反应性。

6.2.3 HBs-E6F6, HBs-E7Gll、 HBs-G12F5、 HBs-E13C5所识别 的表位的分析

6.2.2 的 ELISA检测结果如图 6所示。 结果显示， HBs-E6F6、 HBs-E7Gll、 HBs-G12F5、 HBs-E13C5 与展示多肽 SEQ1、 SEQ3、 SEQ4、 SEQ5、 SEQ6、 SEQ10 的重组蛋白具有良好反应性， 而与展 示多肽 SEQ8、 SEQ9、 SEQ11的重组蛋白无反应。 这些多肽的序列分 析显示， 多肽 SEQ1、 SEQ3、 SEQ4、 SEQ5、 SEQ6、 SEQ10的共同 特征是包含 HBsAg aal21-aal24，多肽 SEQ8、 SEQ9、 SEQ11的共同特 征是不包含完整的 HBsAg aal21-124 _e 因此， 可确定 HBs-E6F6、 HBs-E7Gll、 HBs-G12F5、 HBs-E13C5识别相同的表位， 并且它们所 识别的最小表位的赛羞酸序列为 HBsAg aal21-124,即 CKTC。 ELISA 检测结果还显示，重组蛋白 C149-SEQ1和 3-6具有相当的与抗体的反 应活性，且它们的反应活性均比 C149-SEQ10更高。 因此，多肽 SEQ1 和 3-6是抗体 HBs-E6F6、 HBs-E7Gll、 HBs-G12F5、 HBs-E13C5识 别的优选表位肽。 此外， 由于 SEQ1的序列比 SEQ3-6更短， 因此， SEQ1被认为是优选的核心表位。 实施例 7: HBS-E6F6和 HBs-E7Gll对表位肽 SEQ1的氨基酸突 变的敏感性的分析

对 SEQ1 ( GPCKTCT )进行氨基酸点突变，共制备了 7种突变体。 这 7种突变体多肽的氨基酸序列如表 5所示。 按实施例 6所述的方法 制备包含突变体多肽和 C149/mut的重组蛋白， 并评价 HBS-E6F6和 HBS-E7G11与这 7种突变体多肽的反应性。 表 5: 突变体多肽的氨基酸序列

名称 突变氨基酸 氨基酸序列 Ml P120S GSCKTCT

M2 P120T GTCKTCT

M3 cms GPSKTCT

M4 K122R GPCRTCT

M5 T123I GPCKICT

M6 C124S GPCKTST

M7 C121S/C124S GPSKTST

SEQ1 HBsAg aall9-aal25 GPCKTCT 检测结果如图 7所示。 结果显示， 突变体 Ml (P120S)、 突变体 M2 (P120T)、 突变体 Μ4 (K122R)对抗体 HBs-E6F6和 HBs-E7Gll的 结合与表位肽 SEQ1相当， 而其他突变体与抗体的结合则显著下降。 这表明， P120S、 P120T、 K122R突变不影响 HBs-E6F6和 HBs-E7Gll 与表位肽 SEQ1的反应性， 而 C121S、 C124S、 C121S/C124S, T123I 突变则显著降低了 HBS-E6F6和 HBS-E7G11与表位肽 SEQ1的反应 性。 实施例 8: 包含表位肽的重组蛋白的制备及其免疫原性评 价

8.1 包含表位肽的重组蛋白的制备

按实施例 6中的方法， 用 C149/mut作为蛋白栽体来展示表位肽 SEQ1、 SEQ3、 SEQ4、 SEQ6、 SEQ7, 其中 SEQ3、 SEQ4、 SEQ6、 SEQ7均为在优选核心表位 SEQ1的 N和 /或 C端延伸后获得的多肽 (即， 包含核心表位表位 SEQ1 ) ， 由此制备 5种可以形成核壳样颗 粒（CLP ) 的重组蛋白 （用作免疫用的抗原） 。

如实施例 6所述， 制备 5种重组蛋白 C149-SEQ1、 SEQ3、 SEQ4、 SEQ6、 SEQ7, 并对这 5种重组蛋白进行 SDS-PAGE检测和透射电镜 观察。 检测结果如图 8A所示。 结果显示， 所获得的 5种重组蛋白的 纯度均大于 95%， 并且都能够组装成大小均一的蛋白颗粒。 8.2 包含表位肽的重组蛋白的免疫原性的评价

8.2.1小鼠免疫

用上述 5种重组蛋白以及栽体蛋白 C149/mut (用作对照 )分别免 疫 BALB/C小鼠，免疫佐剂选用氢氧化铝佐剂，免疫 剂量为 3ug/dose， 采用后肢大腿外侧肌肉注射的免疫方式， 免疫程序为初次免疫后每隔 2周加强免疫， 共免疫 4次。

8.2.2血清 Anti-HBs抗体滴度的检测

8.2.2.1反应板的制备

按实施例 1-1.2节中的方法制备反应板， 包被抗原为 CHO细胞重 组表达的乙型肝炎病毒表面抗原主蛋白 （HBsAg ) 。

8.2.2.2血清 Anti-HBs抗体滴度的 ELISA检测

样品稀释：将小鼠血清以含 20%新生牛血清的 PBS溶液稀释成 1 : 100、 1 : 500、 1 :2500、 1 : 12500、 1 :62500、 1 : 312500、 1: 1562500 共 7个稀释梯度。

样品反应：取出已包被的反应板，每孔加入 ΙΟΟμ 已稀释的样品， 置于 37。C温箱反应 30分钟。

酶标记物反应： 完成样品反应步骤后， 将酶标板用 PBST 洗液 ( 20mM PB7.4, 150mM NaCl, 0.1 %Tween20 )洗涤 5遍， 每孔加入 ΙΟΟμΣ GAM-HRP反应液， 置于 37。C温箱反应 30分钟。

显色反应： 完成酶标记物反应步骤后， 将酶标板用 PBST 洗液 ( 20mM PB7.4, 150mM NaCl, 0.1 %Tween20 )洗涤 5遍， 每孔加入 TMB显色剂 （由北京万泰生物药业股份有限公司提供）各 50μ ， 置 于 37。C温箱反应 15分钟。

终止反应及读值测量： 完成显色反应步骤后， 在反应完的酶标板 中每孔加入终止液（由北京万泰生物药业股份 有限公司提供） 50μL _f 并于酶标仪上检测各孔的 OD450/630值。

血清 Anti-HBsAg抗体滴度的计算： 取读值范围在 0.2-2.0之间的 样品稀释倍数与读值作出回归曲线， 计算出读值等于 2倍本底值时的 样品稀释倍数， 并将该样品稀释倍数作为血清 Anti-HBsAg抗体滴度。 8.2.3血清 Anti-C149/mut抗体滴度的检测

8.2.3.1反应板的制备

按实施例 1-1.2节中的方法制备反应板，包被抗原为融合� ��体蛋白 C149/mut。

8.2.3.2血清 Anti-C149/mut抗体滴度的 ELISA检测

按本实施例 8.2.2.2中的方法进行样品稀释、 样品反应、 酶标记物 反应、 显色反应、 终止反应及读值测量， 并计算血清 Anti-C149/mut 抗体滴度。

8.2.4包含表位肽的重组蛋白的免疫原性分析

通过上述步骤获得免疫后的血清 Anti-HBsAg 抗体滴度和血清 Anti-C149/mut抗体滴度， 结果如图 8B所示。 结果显示， 包含表位肽 SEQ1、 SEQ3、 SEQ4、 SEQ6、 SEQ7的重组蛋白均能在 BALB/C小 鼠中诱导产生高滴度的 Anti-HBsAg, 而单独的 C149/mut不能诱导产 生高滴度的 Anti-HBsAg。 实施例 9: 小鼠血源 Anti-SEQ6多克隆抗体的治疗效果评价

9.1小鼠血源 Anti-SEQ6多克隆抗体的制备

9.1.1小鼠免疫

用实施例 8-8.2.1中所述的方法免疫 BALB/C小鼠，免疫原为包含 SEQ6的重组蛋白 （C149-SEQ6 ) 。

9.1.2小鼠血源 Anti-SEQ6多克隆抗体的纯化

完成免疫程序后， 小鼠血清 Anti-HBsAg抗体滴度达到较高水平， 多次采集眼眶后静脉丛血。 经硫酸铵沉淀和 Protein A亲和层析纯化 获得纯化后多克隆抗体。

9.2小鼠血源 Anti-SEQ6多克隆抗体的治疗效果评价

将小鼠血源 Anti-SEQ6 多克隆抗体以尾静脉注射的方式注入 HBV转基因小鼠体内， 监测其血清中 HBV DNA和 HBsAg的变化。 检测结果如图 9所示。结果显示，用 C149-SEQ6免疫小鼠后获得的多 克隆抗体在 HBV转基因小鼠体内能够显著降低 HBV DNA和 HBsAg 的水平， 具有艮好的清除 HBV的效果。 实施例 10: 重组蛋白治疗 HBV转基因小鼠的效果

10.1小鼠免疫

利用 HBV转基因小鼠模型评价实施例 8中获得的 5种重组蛋白 ( C149-SEQ1, C149-SEQ3, C149-SEQ4, C149-SEQ6, C149-SEQ7 ) 的治疗效果， 以栽体蛋白 C149/mut作为对照组； 免疫佐剂为氢氧化 铝佐剂，免疫剂量为 12 g/dose，采用后肢大腿外侧肌肉注射的免疫方 式， 免疫程序为初次免疫后 2周加强免疫， 之后每周加强免疫一次， 即 0、 2、 3、 4、 5周各免疫一次， 共免疫 5次。

10.2血清抗体滴度的检测

按实施例 8-8.2.2和 8.2.3 中描述的方法进行血清 Anti-HBsAg、 Anti-C149/mut 抗体滴度的检测， 并监测小鼠血清中的病毒学指标， HBV DNA和 HBsAg的水平。

10.3重组蛋白的治疗效果分析

检测结果如图 10所示。结果显示，在用重组蛋白进行免疫治� ��的 组中， 小鼠血清中均可检出 Anti-HBsAg和 Anti-C149/mut， 并且小鼠 血清中 HB V DNA和 HBsAg的水平均出现了不同程度的下降。相比之 下，对照组的小鼠血清中没有产生 Anti-HBsAg,并且血清中 HBV DNA 和 HBsAg的水平均未出现下降。本实施例表明，本� ��明所鉴定的表位 和表位肽是 HBV感染的有效治疗靶标。 基于这些表位和表位肽所获 得的重组蛋白具有治疗慢性 HBV感染的潜力。 特别地， 包含表位肽 SEQ1-SEQ7的重组蛋白可用作蛋白疫苗， 用于打破 HBV转基因小鼠 对于 HBV的免疫耐受状态， 诱发有效的、 特异的、 治疗性的抗 HBV 免疫应答。 实施例 11: 基于不同栽体蛋白和 SEQ6的重组蛋白的构建和评价 11.1构建 3种融合表达栽体

按实施例 6 中描述的方法构建 3种栽体蛋白， 分别为 C149/mut ( SEQ ID NO: 43 ) 、 C183/mut ( SEQ ID NO: 44 ) 、 WHC149/mut ( SEQ ID NO: 45 ) ， C149/mut是由乙型肝炎病毒核心蛋白 N端的 149个氨基酸残基改造而来， C183/mut是由乙型肝炎病毒核心蛋白全 长 183个氨基酸残基改造而来， WHC149/mut是由土拨鼠肝炎病毒核 心蛋白 N端的 149个氨基酸残基改造而来， 改造方法如 6.1所述。 将 SEQ6 分别连接入三种栽体中， 获得重组蛋白 C149-SEQ6、 C183-SEQ6, WHC149-SEQ6o

11.2表达并纯化 3种不同栽体重组 SEQ6疫苗

按 6.2 中所述方法表达并纯化 3 种重组蛋白 （C149-SEQ6、 C183-SEQ6, WHC149-SEQ6 ) 。 对获得的目的蛋白进行 SDS-PAGE 检测， 并用透射电镜鉴定目的蛋白颗粒的组装状态。 结果如图 11A所 示。 结果显示， 所获得的 3种重组蛋白的纯度均大于 95%， 并且均能 够组装成大小均一的蛋白颗粒。

11.3 三种重组蛋白用于治疗 HBV转基因小鼠的效果

利用 HBV转基因小鼠模型评价 11.2中获得的 3种重组蛋白用作 蛋白疫苗的治疗效果。 免疫佐剂为氢氧化铝佐剂， 免疫剂量为 12 g/dose， 免疫程序为初次免疫后 2周加强免疫， 之后每周加强免疫 一次， 即 0、 2、 3、 4、 5周各免疫一次， 共免疫 5次。

按实施例 8-8.2.2和 8.2.3中描述的方法进行血清 Anti-HBsAg、抗 -栽体的抗体滴度检测， 并监测小鼠血清中的病毒学指标， HBV DNA 和 HBsAg的水平。

检测结果如图 10所示。 结果显示，在用重组蛋白进行免疫治疗的 组中， 小鼠血清中均可检出 Anti-HBsAg和抗 -栽体抗体， 并且小鼠血 清中 HB V DNA和 HBsAg的水平均出现了不同程度的下降。相比之� ��， 对照组的小鼠血清中没有产生 Anti-HBsAg,并且血清中 HBV DNA和 HBsAg的水平均未出现下降。 本实施例表明， 可以利用不同的栽体蛋 白来呈现本发明所鉴定的表位和表位肽， 并且由此所制备的重组蛋白 具有治疗慢性 HBV感染的潜力。 此类重组蛋白可用作蛋白疫苗， 用 于打破 HBV转基因小鼠对于 HBV的免疫耐受状态， 诱发有效的、 特 异的、 治疗性的抗 HBV免疫应答。

类似地， 还以 C149/mut ( SEQ ID NO: 43 )、 C183/mut ( SEQ ID NO: 44 )或 WHC149/mut ( SEQ ID NO: 45 ) 以及 SEQl-5，7和 10 为基础，设计并构建了重组蛋白 C149-SEQ1-5, 7， 10； C183-SEQ1-5, 7， 10； 和 WHC149-SEQ1-5, 7， 10。 这些重组蛋白的 Jl^酸序列参 见表 1。 实施例 12:以 CRM197或其片段为基础的重组蛋白的构建和表达 本实施例以 CRM197或其片段和 SEQ6为基础，设计并构建了一 系列重组蛋白。

CRM197的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 42所示， 其由 535个氨基 酸组成。 CRM197的一个示例性片段是 CRM 389， 其由 CRM197的 端 389个氨基酸组成。 CRM197的另一个示例性片段是 CRM A， 其由 CRM197的 N端 190个氨基酸组成。

如图 12所示， 将 SEQ6经由连接体连接至 CRM197, CRM389 或 CRMA 的 C 末端， 其中所述连接体的氨基酸序列为 GGGGSGGGGSGGGGS ( SEQ ID NO: 46 )。 连接体的主要功能是， 促进其所连接的 2个肽相对独立地折叠， 以获得较高的生物学活性。 所获得的重组蛋白分别命名为 CRM197-SEQ6 , CRM389-SEQ6 和

构建编码 CRM197-SEQ6, CRM389-SEQ6和 CRMA-SEQ6的目 的基因， 然后将目的基因分别与 pTO-T7原核表达栽体（罗文新等， 生物工程学报， 2000， 16:53-57 )相连接， 并转入 ER2566细菌； 提取 质粒， 经 Ndel/Sall酶切鉴定得到含有目的基因片段的阳性 表达克隆。

按实施例 6-6.2 中 的方法表达并纯化 3 种重组蛋白 CRM197-SEQ6, CRM389-SEQ6和 CRMA-SEQ6, 并用实施例 11中 描述的方法对这 3种重组蛋白的治疗效果进行评价。

类似地， 还以 CRM197或其片段以及 SEQl-5，7和 10为基础， 设 计并构建了重组蛋白 CRM197-SEQ1-5, 7, 10； CRM389-SEQ1-5, 7， 10； 和 CRMA-SEQ1-5, 7， 10。 这些重组蛋白的氣基酸序列参见表 1。 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描 述， 但本领域技术 人员将理解： 根据已经公开的所有教导， 可以对细节进行各种修改和 变动， 并且这些改变均在本发明的保护范围之内。 本发明的全部范围 由所附权利要求及其任何等同物给出。