L'invention concerne un nouveau copolymère dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide, biorésorbable ou biodégradable et biocompatible, son procédé de préparation, les vésicules nrucellaires constituées de ce copolymère, et leur utilisation pour l'encapsulation, le transport, la vectorisation, et le ciblage de molécules d'intérêt, naturelles ou synthétiques, ayant ou non une activité thérapeutique.

Il existe naturellement chez les organismes vivants des structures vésiculaires résultant de l'assemblage de biomolécules amphiphiles formées à partir de lipides, de protéines et de carbohydrates. Ces vésicules naturelles sont de taille variable, les plus grandes jouant le rôle de membranes qui protègent le contenu intracellulaire de l'environnement extracellulaire, alors que les petites vésicules lipidiques jouent un rôle de transporteur de biomolécules à l'intérieur de la cellule.

Des structures vésiculaires stables ont pu être préparées par synthèse, en commençant par les liposomes dans les années 1960, obtenus par assemblage de phospholipides naturels ou synthétiques, jusqu'aux récentes vésicules de polymères formées par l'assemblage de copolymères à blocs synthétiques, appelées « polymersomes » (B.M.Discher et al., Science 1999, 284, 1143).

Les « polymersomes » semblent très prometteurs pour le développement d'applications biomédicales, notamment pour le transport d'agents thérapeutiques ou comme microréacteurs mimant le comportement des cellules vivantes.

De plus, les « polymersomes » présentent de nombreux avantages par rapport aux liposomes, notamment une concentration critique d'agrégation plus faible, une structure vésiculaire unilamellaire ou multilamellaire associée avec une faible dispersion de taille, et une stabilité membranaire plus élevée diminuant la fuite passive des molécules encapsulées.

De plus, la diversité chimique des copolymères à blocs permet d'envisager des possibilités infinies de modification des propriétés de la vésicule pour la conformer à l'application souhaitée.

La plupart des « polymersomes » rapportés dans la littérature ont été formés par assemblage de composés synthétiques amphiphiles, comme, par exemple, le polylactide-/3/oc-poly( oxyde d'éthylène), le poly(butadiène)-b/oc- poly(oxyde d'éthylène), la polycaprolactone-jb/oc-poly(oxyde d'éthylène) et la poly(2-méthyloxazoline)-Λ/oc-poly(diméthylsiloxane)-/?/oc -poly(2-méthyloxa- zoline), très étudiés du fait de la biocompatibilité ou de la biorésorbabilité de leurs blocs respectifs.

L'intérêt scientifique s'est ensuite porté sur des assemblages comportant des blocs naturels, tels que des polypeptides ou des polysaccharides. En particulier, l'intérêt pour des assemblages de polypeptides repose sur le fait qu'ils présentent des propriétés physicochimiques uniques : ils sont optiquement actifs par nature, biocompatibles et biodégradables dans certains cas, peuvent servir à mimer des séquences polypeptidiques naturelles, et sont capables de subir des transitions conformationnelles réversibles selon les conditions de pH et/ou de température.

Les copolypeptides à blocs représentent une sous-classe particulière associant deux blocs synthétiques polypeptidiques qui combinent une capacité d'auto-assemblage et de structures tridimensionnelles hautement ordonnées. Ils ont été décrits dans la littérature comme des matériaux prometteurs pour des applications telles que les biocapteurs, l'ingénierie tissulaire ou la libération sélective de principes actifs. La chimie des copolymères à blocs à base de polypeptides a été étudiée de manière approfondie dans la littérature, en utilisant la polymérisation par ouverture de cycle des monomères N-carboxyanhydrides (en anglais « NCA ») des acides aminés correspondants, amorcée par des dérivés aminés. En adaptant la technique de couplage par cycloaddition 1 ,3-dipolaire de Huisgen, communément appelée « chimie-click » (en anglais « click-chemistry »), dont le principe repose sur la formation d'une liaison 1 ,2,3 triazole-1 ,4 disubstituée, combinant des conditions opératoires douces, la tolérance des groupes fonctionnels et un rendement élevé, à ce type de copolymères, des copolymères à blocs à base de polypeptides ont été préparés, comme par exemple le poly(L-glutamate de γ-benzyle)-b/oc-poly(ε-trifluoroacetyl-L-l_ysine) (D. Taton et S. Lecommandoux, Macromolecular Rapid Communications, 2008, 29, 1147).

En utilisant des méthodes chimiques plus conventionnelles, d'autres copolypeptides à blocs ont pu être synthétisés, tels que le poly(L-acide glutamique)-b/oc-poly(L-lysine) (J. Rodriguez-Hernandez et S. Lecommandoux,

J.A.C.S, 2005, 127, 2026) ou le poly(L-lysine)-b/oc-poly(L-leucine) (E.G.

Bellomo et al., Nat. Mater., 2004, 3, 244) ou encore le poly(L-lysine)-/>/oc- poly(γ-benzyl-L-glutamate)-d/oc-poly(L-lysine) (H. latrou et al., Biomacro- molecules, 2007, 8, 2173). II est possible d'obtenir par cette chimie des tailles de vésicules très variables, allant de 100 nm à quelques μm, en faisant varier les conditions opératoires, jusqu'à des vésicules géantes allant jusqu'à 50 μm utilisées comme modèles des membranes de cellules vivantes.

La chimie des copolymères blocs à base de polysaccharides a fait l'objet de plus rares études, du fait de sa complexité. Récemment, un procédé de synthèse de copolymère dibloc dextrane-b/oc-polystyrène par polymérisation radicalaire contrôlées par transfert d'atome (en anglais « ATRP ») a été rapportée (C.Houga et al., Chem. Commun., 2007, 3063). Le nombre de systèmes copolymères à blocs basés sur des sucres qui a été étudié est limité, et il existe peu d'informations disponibles sur leur comportement en solution et leurs propriétés.

Par exemple, il a été décrit que le dextrane-ιb/oc-poly(ε- caprolactoπe) s'auto-assemble dans l'eau en structures micellaires polydisperses ayant un diamètre moyen d'environ 100 nm (J. Liu et al., Carbohydrate Polymers, 2007, 69, 196). Cependant, il n'a jamais été décrit ni suggéré dans la littérature de copolymères à blocs combinant dans une seule chaîne linéaire un segment polypeptidique et un bloc polysaccharide.

On a maintenant trouvé qu'il était possible, par la synthèse de structures associant, dans un copolymère, des blocs d'unités saccharidiques et des blocs d'unités peptidiques, de préparer des composés permettant de mimer les structures naturelles glycoprotéiques qui sont impliquées dans de nombreux mécanismes biologiques.

Une glycoprotéine est une protéine portant au moins un groupement polysaccharidique et une chaîne polypeptidique. Chez les organismes uni- ou multi-cellulaires, de nombreuses glycoprotéines se trouvent sur la face externe de la membrane plasmique, la partie glycosylée étant orientée vers le milieu extracellulaire. Les glycoprotéines sont présentes, en particulier, chez les microorganismes tels que les virus et les bactéries. Ainsi, beaucoup de microorganismes pathogènes ont évolué de façon à reconnaître les sucres présents à la surface des cellules et s'en servent comme points d'ancrage et d'entrée dans les cellules à infecter. Par exemple, le virus VIH pénètre dans les cellules du système immunitaire en se liant à des récepteurs membranaires tels que les récepteurs CXCR4 et CXCR5, qui sont des glycoprotéines.

Ainsi, il est particulièrement intéressant de disposer de structures synthétiques biomimétiques pouvant mimer les glycoprotéines et susceptibles de s'auto-assembler sous forme de vésicules. Ceci permet, par exemple, de former des « virus synthétiques » mimant la structure des virus et leur rôle fonctionnel, et permettant d'envisager une délivrance intracellulaire efficace de molécules d'intérêt.

Pour aboutir à la synthèse de telles structures complexes, il a été nécessaire de mettre en oeuvre des réactions chimiques modernes, qui doivent être particulièrement bien contrôlées, en particulier les réactions de « chimie- click » permettant un couplage efficace et quantitatif des différentes entités chimiques dans des conditions douces. L'invention a donc pour objet, selon un premier aspect, un copolymère dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide constitué d'un bloc d'unités saccharidiques naturelles ou synthétiques et d'un bloc d'unités peptidiques naturelles ou synthétiques. Par « copolymère à blocs », comme par « copolymère dibloc », on entend une structure linéaire dans laquelle un bloc polysaccharide et un bloc polypeptide sont reliés par leurs extrémités.

Leur structure linéaire est une caractéristique avantageuse des copolymères selon l'invention. En effet, la modification chimique de chaînes polymères (y compris des chaînes peptidiques) sur les groupements latéraux, qui conduit à des structures greffées, peut être effectuée par des réactions chimiques simples. Cependant, de telles modifications résultent souvent dans des structures mal définies : nombre de greffons variable, répartition homogène ou hétérogène le long de la chaîne, manque de reproductibilité, etc.

Ces inconvénients majeurs sont incompatibles avec un développement industriel, en particulier dans le domaine pharmaceutique. La structure linéaire des copolymères selon l'invention permet avantageusement d'avoir degré de contrôle et une reproductibilité élevés de la structure copolymère, assurant ainsi une régularité des propriétés.

Ce contrôle moléculaire, associé à une prédiction et un contrôle des propriétés interfaciales, permet de former des vésicules de façon reproductible et prédictible.

Avantageusement, le copolymère dibloc polysaccharide-b/oc- polypeptide selon l'invention est biorésorbable ou biodégradable et biocompatible.

Dans la suite de la description, les expressions « bloc d'unités saccharidiques », « bloc polysaccharide » ou « polysaccharide » peuvent être utilisées indifféremment pour désigner un enchaînement d'unités monomères saccharidiques formant un polysaccharide ou un dérivé de polysaccharide. De même, on utilisera indifféremment les expressions « bloc d'unités peptidiques », « bloc polypeptide » ou « polypeptide » pour désigner un enchaînement d'unités monomères peptidiques formant un polypeptide ou un dérivé de polypeptide.

Le copolymère dibloc selon l'invention peut comprendre tout type de polysaccharide naturel ou synthétique, ou d'un de ses dérivés, et tout type de polypeptide naturel ou synthétique, ou d'un de ses dérivés.

Par « dérivés de polysaccharide », on entend les composés issus d'une modification chimique d'un polysaccharide, susceptible de conférer, par exemple, un caractère hydrophobe à un polysaccharide naturellement hydrophile, ou, éventuellement, d'ajouter de nouveaux groupes fonctionnels sur la molécule.

De tels dérivés peuvent être, par exemple, des dérivés esters ou éthers, en particulier des esters organiques; des esters inorganiques tels que les phosphates ou les sulfates; des dérivés éthers non ioniques, tels que, par exemple, les dérivés alkyles, hydroxyalkyles ou les hydroxyalkylaryles ; les dérivés éthers ioniques, tels que, par exemple, les dérivés sulfopropyles, carboxyméthyles ou les (diéthylamino)éthyles ; ou encore d'autres dérivés tels que les conjugués de polysaccharides, les dérivés para-toluènesulfonate, thiols ou sylilés.

Des polysaccharides préférés peuvent être, par exemple, choisis parmi le dextrane, l'acide hyaluronique et leurs dérivés.

Des dérivés de polysaccharides et des procédés de modification de polysaccharides sont décrits, par exemple, dans les ouvrages de référence « Polysaccharides I », Adv. Polym. Sci. (2005), 186, et « Polysaccharides II », Adv. Polym. Sci. (2006), 205. Par « dérivés de polypeptide », on entend les composés issus d'une modification chimique d'un polypeptide, susceptible de conférer, par exemple, un caractère hydrophobe à un polypeptide naturellement hydrophile, ou, éventuellement, d'ajouter de nouveaux groupes fonctionnels sur la molécule. De tels dérivés peuvent être, par exemple, des dérivés esters ou éthers, en particulier des esters organiques; aliphatiques ou aromatiques, des esters inorganiques; des dérivés éthers, tels que, par exemple, les dérivés alkyles ou hydroxyalkyles, des dérivés amides ou imines, etc.

Selon un aspect préféré, le copolymère dibloc polysaccharide- fe/oc-polypeptide peut comprendre un bloc polysaccharide qui présente un caractère hydrophile et un bloc polypeptide qui présente un caractère hydrophobe en conditions physiologiques, soit par nature ou par modification chimique lui conférant une hydrophobicité.

Selon un autre aspect préféré, le copolymère dibloc polysaccharide-ib/oc-polypeptide peut comprendre un bloc polysaccharide qui présente un caractère hydrophobe, notamment par modification chimique susceptible de conférer une hydrophobicité à un polysaccharide naturellement hydrophile, et un bloc polypeptide qui présente un caractère hydrophile en conditions physiologiques.

De ce fait, les copolymères dibloc polysaccharide-fo/oc-polypeptide selon l'invention sont des composés amphiphiles aptes à s'auto-assembler pour former un nouveau type de vésicules micellaires assemblées à base de polymères naturels ou synthétiques. Par rapport aux vésicules existantes, notamment les liposomes, les applications de ces vésicules à base de copolymère dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide offrent de nouvelles possibilités grâce aux propriétés intrinsèques des polymères utilisés.

En effet, les vésicules à base de copolymère dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide présentent notamment les avantages suivants : un caractère biocompatible et biorésorbable ou biodégradable, une stabilité élevée en solution aqueuse, une capacité à encapsuler des espèces hydrophiles et hydrophobes, et une diversité de fonctions chimiques pouvant être aisément mise à profit pour modifier la surface des vésicules et leur conférer ainsi une propriété particulière telle que l'affinité pour un récepteur biologique.

L'utilisation de polysaccharides ou de polypeptides particuliers présentant la propriété d'être des ligands de récepteurs cellulaires permet également de préparer des vésicules micellaires permettant la libération ciblée de molécules d'intérêt, ledit polysaccharide pouvant, de par sa nature, être impliqué dans des mécanismes d'endocytose contrôlée par un récepteur (en anglais « Receptor mediated endocytosis » ou RME).

Les copolymères selon l'invention peuvent comprendre, en particulier, de 5 à 100 unités saccharidique et de 5 à 100 unités peptidiques, notamment de 10 à 100 unités saccharidique et de 10 à 100 unités peptidiques et, de préférence, environ 10 à environ 50 unités saccharidiques et environ 10 à 50 unités peptidiques. Le rapport massique polymère hydrophile/polymère hydrophobe peut être, par exemple, d'environ 1/1.

Des copolymères avantageux selon l'invention présentent une masse molaire de 1000 à 50000 g/mole.

Le polysaccharide peut être choisi, par exemple, parmi le dextrane, la chitine, le chitosane, l'acide hyaluronique, le pullulane, le fucane, le fucane sulfaté, le succinoglycane, le galactane, l'arabinogalactane, le galactane sulfaté, les alginates, le glucane, l'acide polysialique, l'héparine, l'héparane sulfate, le chondroitine sulfate, l'acharane sulfate, le kératane sulfate, le dermatane sulfate, le xanthane, la pectine, le xylane, l'amylose, l'amylopectine, la cellulose, l'agarose, le mannane, les galactomannanes, le curdlane, l'arabinane, les carraghénanes, le schizophyllane et leurs dérivés.

Le polypeptide, dans lequel l'acide aminé qui le constitue peut être sous forme optiquement active L ou D ou sous forme racémique DL, peut être choisi, par exemple, parmi la poly(alanine), la poly(arginine), le poly(acide aspartique), la poly(asparagine), le poly(aspartate), la poly(cystéine), le poly(acide glutamique), le poly(glutamate), la poly(glutamine), la poly(glycine), la poly(histidine), la poly(isoleucine), la poly(leucine), la poly(lysine), la poly(méthionine), la poly(phénylalanine), la poly(proline), la poly(pyrrolysine), la poly(sélénocystéine), la poly(sérine), la poly(thréonine), le poly(tryptophane), la poly(tyrosine), la poly(valine), le poly(glutamate de benzyle), le poly(glutamate d'alkyle), la poly(trifluoroacétyl-Lysine), la poly(sarcosine) la poly(hydroxyéthyl- asparagine), la poly(hydroxyalkyl-asparagine), la poly(hydroxyalkyl- aspartamide), le poly(aspartate de benzyle) et leurs dérivés. Dans un aspect préféré, ledit polypeptide est hydrophobe en conditions physiologiques.

Des polypeptides hydrophobes préférés sont, par exemple, le poly(L-glutamate de γ-benzyle) et la poly(ε-trifluoroacétyl-L-lysine). Selon un autre aspect avantageux, ledit polypeptide est hydrophile en conditions physiologiques.

Des polypeptides hydrophiles préférés sont, par exemple, le poly(L-acide glutamique), le poly(L-glutamate) et la poly(L-lysine).

Aux fins de l'invention, le polypeptide peut être obtenu par un procédé de polymérisation par ouverture de cycle du monomère N- carboxyanhydride (NCA) de l'acide aminé correspondant, cité plus haut.

L'invention concerne également, selon un aspect ultérieur, un procédé de préparation des copolymères dibloc polysaccharide-£>/oc- polypeptide biorésorbables ou biodégradables et biocompatibles décrits ci- dessus.

Comme indiqué plus haut, la synthèse des copolymères selon l'invention met en œuvre des réactions chimiques bien contrôlées, en particulier les réactions de « chimie-click » permettant un couplage efficace et quantitatif dans des conditions douces.

Parmi les réactions de « chimie-click », on peut citer, par exemple, les cycloadditions d'espèces insaturées (par exemple, les cycloadditions 1 ,3- dipolaires azide-alcyne, les réactions de Diels Aider entre un diène et un diènophile), les réactions impliquant un groupe carbonyle électrophile, de type non aldol (par exemple, formation d'éthers d'oxime à partir d'une oxyamine, d'hydrazones à partir d'une hydrazine, ou de thiosemicarbazones à partir d'une thiosemicarbazine), les réactions mettant en jeu un groupement thiol (formation de thioéthers à partir d'un alcène et de disulfures mixtes), les réactions impliquant des fonctions acides thiocarboxyliques ou thioesters (formation des liaisons thioesters et amides) et les ligations de Staudinger impliquant des fonctions phosphine et azide. Chacun des groupes fonctionnels cités ci-dessus peut être introduit indifféremment sur le groupement polypeptide ou sur le groupement polysaccharide pour le couplage.

Selon une alternative préférée, le procédé selon l'invention pour la préparation des copolymères dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide comprend les étapes consistant à :

- soumettre ledit polysaccharide à une amination réductive de manière à introduire une fonction alcyne à une extrémité de la chaîne polysaccharidique, - introduire une fonction azoture à une extrémité de la chaîne polypeptidique, et

- coupler la chaîne polysaccharidique et la chaîne polypeptidique dans un solvant commun.

Selon une autre alternative du procédé selon l'invention, ledit procédé comprend les étapes consistant à :

- introduire une fonction alcyne à une extrémité de la chaîne polypeptidique,

- soumettre ledit polysaccharide à une amination réductive de manière à introduire une fonction azoture à une extrémité de la chaîne polysaccharidique, et

- coupler la chaîne polypeptidique et la chaîne polysaccharidique dans un solvant commun.

Le couplage de la chaîne polypeptidique et de la chaîne polysaccharidique, ou inversement, ainsi que les copolymères dibloc à structure linéaire ainsi obtenus, sont représentés schématiquement sur la figure 1.

Les aspects préférés de l'invention relatifs aux copolymères dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide, tels que mentionnés plus haut, s'appliquent également à leur procédé de préparation. L'amination réductive peut être effectuée, par exemple, à l'aide d'une aminé telle que la propargylamine en présence d'un agent réducteur tel que le borocyanohydrure de sodium. La fonction azoturβ peut être introduite à l'extrémité de la chaîne polypeptidique à l'aide d'un agent bifonctionnel, tel que le 3- azidoaminopropane, la fonction aminé servant à amorcer la polymérisation par ouverture de cycle du monomère NCA de l'acide aminé correspondant. La longueur du bloc polypeptide peut ainsi être contrôlée par le rapport molaire monomère NCA/agent bifonctionnel.

En tant que solvant pour l'étape de couplage de la chaîne polysaccharidique et la chaîne polypeptidique, on peut utiliser, par exemple, un solvant organique tel que le diméthylsulfoxyde (DMSO). Cette réaction est, de préférence, catalysée par des dérivés de cuivre, tel que, par exemple,CuBr, en présence d'un ligand, par exemple le pentaméthyldiéthylènetriamine. La chaîne hydrophile, polypeptide ou polysaccharide, peut être ajoutée en léger excès, de l'ordre de 2 équivalents molaire, puis éliminée par dialyse, afin d'assurer une réaction de couplage quantitative et la formation de copolymères à blocs purs. L'invention concerne également, selon un aspect ultérieur, de nouvelles vésicules micellaires formées à partir de copolymères dibloc polysaccharide-fe/oc-polypeptide constitués d'un bloc d'unités saccharidiques naturelles ou synthétiques et d'un bloc d'unités peptidiques naturelles ou synthétiques, reliés par leur extrémité dans une structure de chaîne linéaire, tel que décrits plus haut.

De préférence, lesdits copolymères comprennent de 5 à 100 unités saccharidiques et de 5 à 100 unités peptidiques, notamment de 10 à 100 unités saccharidiques et de 10 à 100 unités peptidiques, et, de préférence, environ 10 à environ 50 unités saccharidiques et environ 10 à environ 50 unités peptidiques.

Avantageusement, lesdits copolymères sont biorésorbables ou biodégradables, et biocompatibles.

En tant que polysaccharide et polypeptide préférés, il y a lieu de se référer aux aspects préférés de l'invention relatifs aux copolymères dibloc polysaccharide-fo/oc-polypeptide, tels que mentionnés plus haut, qui s'appliquent également auxdites vésicules micellaires. Les vésicules micellaires selon l'invention peuvent être préparées par différents procédés usuels tels que, par exemple, la dissolution directe, l'hydratation de film, le procédé d'émulsification/diffusion ou la nanoprécitation. On utilisera de préférence la nanoprécipitation, qui consiste à mélanger une solution de polymère dans un solvant organique miscible à l'eau. L'introduction d'une solution organique du copolymère dibloc selon l'invention dans l'eau sous agitation modérée induit simultanément une séparation de phases et un procédé d'auto-assemblage qui progresse au fur et à mesure que le solvant organique diffuse dans la phase aqueuse, celle-ci étant en excès par rapport à la phase organique. Un solvant organique approprié est, par exemple, le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou le formamide. Après élimination du solvant organique par évaporation et/ou dialyse, on récupère les vésicules directement en solution aqueuse. Elles peuvent ensuite être lyophilisées afin de les obtenir sous la forme d'un extrait sec redispersable. Leur taille peut être modulée en ajustant le procédé d'émulsification/diffusion ou de nanoprécitation (sens d'ajout, nature du solvant organique, volume des phases, concentration en copolymère...).

Leur taille peut aussi être facilement contrôlée et adaptée en fonction de l'application souhaitée. Elle peut être notamment réduite jusqu'à environ 100nm après formation par action d'ultrasons ou par extrusion sur des membranes de porosité contrôlée lorsqu'on envisage une application biomédicale. Dans d'autres applications, par exemple dans le domaine de la cosmétique, de l'hygiène, du nettoyage ou autres, les vésicules selon l'invention peuvent présenter une taille de l'ordre du μm ou de plusieurs dizaines de μm. Les vésicules micellaires selon l'invention peuvent être caractérisées par diffusion dynamique et statique de la lumière, diffusion de neutrons aux petits angles et microscopie électronique en transmission. De telles techniques pour la caractérisation des systèmes micellaires sont décrites, par exemple, dans G.Riess, Progress in Polymer Science, 2003, 28, 1107. Dans un aspect avantageux, ladite vésicule micellaire formée à partir de copolymères dibloc polysaccharide-6/oc-polypeptide contient au moins une molécule d'intérêt, naturelle ou synthétique, ayant ou non une activité thérapeutique. Cette molécule peut être introduite, en fonction de sa polarité, dans la phase aqueuse ou dans la phase organique avant le procédé de nanoprécipitation. Elle est ainsi encapsulée durant le processus de fabrication de la vésicule. Elle peut aussi être introduite après la formation des vésicules par des méthodes de gradient de pH ou d'émulsification/diffusion.

Par « molécule ayant une activité thérapeutique », on entend, par exemple, une molécule naturelle ou synthétique utilisée pour la prévention ou le traitement d'une pathologie ou la restauration d'une fonction biologique, in vitro ou in vivo, en particulier chez l'animal, y compris l'être humain, ou encore sur des cellules isolées. De telles molécules peuvent être, par exemple, un principe actif de médicament, tel qu'un antibiotique, un antalgique, un antiinflammatoire, un antitumoral, etc. ou encore un peptide, une protéine, une hormone, une enzyme, un acide nucléique, un oligonucléotide, un antigène, un anticorps, un interféron, un facteur de croissance, un modulateur d'activité enzymatique, un activateur ou un inhibiteur de récepteur cellulaire, une vitamine etc.

De telles molécules ayant une activité thérapeutique peuvent être utilisées, par exemple, dans le domaine pharmaceutique ou médical.

Le cas échéant, l'encapsulation de ladite molécule ayant une activité thérapeutique dans une vésicule micellaire selon l'invention permet de diminuer significativement la toxicité de ladite molécule. En particulier la toxicité bien documentée des agents antitumoraux, telle que, notamment, leur cardiotoxicité, par exemple dans le cas de l'utilisation de la doxorubicine ou de la mitoxantrone ou leur neurotoxicité, par exemple dans le cas de l'utilisation de la vincristine, peuvent être significativement diminuées. Par « molécule d'intérêt n'ayant pas d'activité thérapeutique », on entend, par exemple, une molécule naturelle ou synthétique qui n'est pas utilisée pour la prévention ou le traitement d'une pathologie ou la restauration d'une fonction biologique, in vitro ou in vivo, en particulier chez l'animal, y compris l'être humain, ou encore sur des cellules isolées. Le cas échéant, une telle molécule peut néanmoins présenter une activité biologique, notamment vis-à-vis des végétaux ou des microorganismes. On peut citer, à titre d'exemples non limitatifs, les domaines d'application suivants : - l'imagerie médicale : agents de diagnostic, tels que, par exemple, des agents de contraste, des isotopes, des sondes fluorescentes

- la cosmétique et l'hygiène : molécules olfactives, pigments, colorants, antioxydants, agents antibactériens, agents antiseptiques, agents émollients, agents exfoliants, agents hydratants, etc;

- le nettoyage et la détergence : tensioactifs, colorants, antioxydants, antibactériens, antiseptiques, agents blanchissants, etc;

- la phytopharmacie : pesticides, fongicides, herbicides, insecticides, accélérateurs de croissance, etc, - l'agroalimentaire : agents colorants, exhausteurs de goût etc,

- la chimie organique : dérivés catalytiques organiques, métalliques ou inorganiques, etc, ou dans tout autre domaine d'activité dans lequel on souhaite encapsuler une molécule dans une vésicule micellaire, celle-ci présentant l'avantage d'être biorésorbable ou biodégradable et biocompatible.

L'utilisation des vésicules micellaires formées à partir de copolymères dibloc polysaccharide-fc/oc-polypeptide constitués d'un bloc d'unités saccharidiques naturelles ou synthétiques et d'un bloc d'unités polypeptidiques naturelles ou synthétiques, tel que décrits plus haut, en tant que véhicules pour l'encapsulation, le transport, la vectorisation et/ou le ciblage d'au moins une molécule d'intérêt, naturelle ou synthétique, ayant ou non une activité thérapeutique, représente un autre aspect de l'invention.

L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques comprenant les vésicules micellaires formées à partir de copolymères dibloc polysaccharide-/>/oc-polypeptide constitués d'un bloc d'unités saccharidiques naturelles ou synthétiques et d'un bloc d'unités polypeptidiques naturelles ou synthétiques, et contenant au moins une molécule d'intérêt, naturelle ou synthétique, ayant ou non une activité thérapeutique, telles que décrites plus haut, et un excipient pharmaceutiquement acceptable. Les excipients pharmaceutiquement acceptables, peuvent être choisis selon le mode d'administration envisagé parmi les excipients habituels dans le domaine pharmaceutique.

Par exemple, pour une administration orale sous forme de comprimés, les excipients peuvent être choisis parmi des liants, des charges, des agents de délitement, des adjuvants ou des agents retardateurs et pour une administration par voie orale sous forme de suspensions, solutions ou émulsions aqueuses ou huileuses, les compositions peuvent également contenir des agents de mise en suspension; des agents émulsionnants, des véhicules non aqueux ou des conservateurs

Pour une administration par voie parentérale, les compositions pharmaceutiques peuvent se trouver sous forme de solutions injectables stériles aqueuses et non aqueuses pouvant contenir des antioxydants, des tampons, des agents bactériostatiques et des solutés qui rendent la formulation isotonique avec le sang du receveur choisi ; ou sous forme de suspensions aqueuses ou non aqueuses stériles qui peuvent comprendre des agents de mise en suspension et des agents épaississants.

Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent également être administrées par d'autres voies, telles que la voie buccale ou sublinguale à l'aide d'un excipient adapté, la voie topique sur l'épiderme, sous forme de crème, de gel, de pommade, de lotion ou de timbre transdermique, la voie intranasale, sous forme d'un liquide d'atomisation, d'une poudre ou de gouttes ou par inhalation, au moyen d'un agent propulseur convenable.

Avantageusement, les vésicules micellaires selon l'invention sont utilisables aussi bien pour l'encapsulation de molécules hydrophobes que de molécules hydrophiles, car elles possèdent deux compartiments de polarité différente, à savoir la membrane qui est hydrophobe et la cavité interne qui est hydrophile. Par ailleurs, comme l'auto-assemblage des copolymères en vésicules se fait par des interactions faibles, la dissociation des vésicules et la libération concomitante de la molécule d'intérêt encapsulée peut être obtenue dans des conditions définies (salinité, température, pH, hydrolyse, etc.) Selon un aspect préféré de l'invention, ladite vésicule micellaire est formée à partir d'un copolymère dibloc polysaccharide-6/oc-polypeptide dans lequel le polysaccharide présente une affinité pour au moins un récepteur cellulaire. Selon un autre aspect préféré de l'invention, ladite vésicule micellaire est formée à partir d'un copolymère dibloc polysaccharide-b/oc- polypeptide dans lequel le polypeptide présente une affinité pour au moins un récepteur cellulaire.

Dans de tels cas, les vésicules micellaires pourront, avantageusement, être utilisées pour le ciblage d'une molécule d'intérêt.

Parmi les polysaccharides de ce type, on peut citer, par exemple, l'acide hyaluronique, qui présente une affinité pour les récepteurs CD44. Les récepteurs CD44 sont présents à des niveaux élevés dans les cellules tumorales de différents carcinomes, mélanomes, lymphomes etc (« Chemistry and Biology of Hyaluronan », H. G. Garg et CA. Haies Ed. (2004), Chapitre 5, Elsevier Ltd).

Des polypeptides intéressants à cet égard sont, par exemple, le poly(acide glutamique) ou le poly(glutamate). En effet, le poly(acide glutamique) ou le poly(glutamate) sont, par exemple, des ligands des récepteurs du glutamate (Mornet C, Briley M, Trends Pharmacol Sci. 1988;9:278-279) ou des récepteurs TLR4 (Poo et al. 22 (2) 517 - The FASEB Journal).

Dans un autre aspect préféré, ladite vésicule micellaire est formée à partir d'un copolymère dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide dans lequel ledit polysaccharide est susceptible d'être impliqué dans un mécanisme d'endocytose contrôlée par un récepteur (en anglais « Receptor mediated endocytosis » ou RME).

Alternativement, ladite vésicule micellaire est formée à partir d'un copolymère dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide dans lequel ledit polypeptide est susceptible d'être impliqué dans un mécanisme d'endocytose contrôlée par un récepteur.

L'endocytose contrôlée par un récepteur est un mécanisme biologique par lequel des molécules présentes dans l'espace extracellulaire se lient à des récepteurs cellulaires et sont internalisées, permettant également le ciblage d'une molécule d'intérêt.

Un polysaccharide intéressant aux fins de l'invention est l'arabinogalactane, qui interagit avec des récepteurs hépatocytaires intervenant dans des mécanismes d'endocytose contrôlée.

Des polysaccharides susceptibles d'être impliqués dans des mécanismes d'endocytose contrôlée par un récepteur sont mentionnés, par exemple, dans les brevets US 5 336 506 et 5 554386.

L'invention est illustrée de manière non limitative par les exemples ci-dessous.

Exemple 1 : préparation d'un copolymère dibloc acide hyaluronique-b/oc-poly (L-qlutamate de γ-benzyle)

Préparation du poly(L-glutamate de γ-benzyle) possédant une fonction azoture (PBLG-azoture)

6 g (22,81 mmol) de N-carboxyanhydride de L-glutamate de γ-benzyle sont introduits sous atmosphère d'argon dans un ballon de type schlenk préalablement flammé sous vide, et dissous dans 60 ml de DMF anhydre. La solution est agitée 10 min et 57 μL de 1-azido-3-aminopropane (570 μmol) sont ajoutés au moyen d'une seringue purgée à l'azote. La solution est agitée 40 h sous vide à température ambiante. Le polymère est récupéré par précipitation dans l'éther diéthylique puis séché sous vide. La masse de produit récupéré est 4,2 g (rendement : 70%) L'analyse par spectroscopie RMN du proton fournit un degré de polymérisation moyen en nombre de 23. Analyse ¹ H RMN (CDCI ₃ : acide trifluoroacétique deutéré, 85 : 15) : 1 ,8 ppm (N ₃ -CH2-CH2-CH2-, 2H) ; 1 ,9 et 2,1 ppm (-CH2-CH2-CH- , 2H); 2,5 ppm (-CH2-CO, 2H); 2,6 ppm (N ₃ - CH2-CH2-CH2- , 2H); 3,4 ppm (N ₃ -CH2-CH2-CH2- , 2H); 4,6 ppm (-NH-CH- CO- , 1H); 5,1 ppm (-CH2-C6H5 , 2H); 7,3 ppm (-C6H5 , 5H); 7,9 ppm (NH, 1H). Préparation de l'acide hyaluronique possédant une fonction alcyne (acide hyaluronique alcyné)

L'acide hyaluronique (2,2 g ; 6.10 ⁴ mol) possédant un degré de polymérisation moyen en nombre égal à 10 est solubilisé dans un tampon acétate (pH= 5,6) à une concentration massique de 2 %. 2,82 ml_ (4,4.10 ^"2 mol) de propargylamine et 2,77 g (4,4.10 ² mol) de borocyanohydrure de sodium sont ajoutés au milieu sous agitation. Après 5 jours de réaction à 50 ⁰ C et sous agitation le mélange réactionnel est concentré à l'évaporateur rotatif et précipité dans 400 ml_ de méthanol froid. Le solide est récupéré par centrifugation et lavé au méthanol refroidi pour éliminer l'excès de propargylamine et de borocyanohydrure de sodium. Le précipité est alors séché sous vide pendant 2 jours. La masse de produit récupéré est 2,2 g (rendement : 100 %). Analyse ¹ H RMN (D ₂ O) : 3,35 ppm (C(2)H, GIcA); 3,59 ppm (C(3)H, GIcA); 3,72 ppm (C(5)H, GIcA); 3,73 ppm (C(4)H, GIcA); 4,48 ppm (C(I)W, GIcA); 2,03 ppm (CH ₃ , 3H, GIcNAc); 3,50 ppm (C(5)H, GIcNAc); 3,55 ppm (C(4)H, GIcNAc); 3,72 ppm (C(Z)H, GIcNAc); 3,86 ppm (C(2)H, GIcNAc); 3,90 ppm (C(6)H, GIcNAc); 4,54 ppm (C(I)H, GIcNAc); 8,22 (NH, GIcNAc); 3,72 ppm (C(3)H, β, GIcNAc); 3,83 ppm (C(2)H, β, GIcNAc); 3,91 ppm (C(3)H, α, GIcNAc); 4,05 ppm (C(2)H, α, GIcNAc); 4,73 ppm (C(I )H, β, GIcNAc); 5,16 ppm (C(I )H, α, GIcNAc); 8,41 ppm (NH, α, GIcNAc); 8,47 ppm (NH, β, GIcNAc).

Préparation du copolymère acide hyaluronique-bloc-poly(L-glutamate de γ-benzyle)

Deux équivalents d'acide hyaluronique alcyné (2,1 g ; 4,2.10 ^"4 mol) et un équivalent de PBLG azoture (1 ,05 g ; 2.1.10 ^"4 mol) sont solubilisés dans 70 mL de DMSO anhydre. Le mélange est agité 20 min puis 87,04 μL de pentaméthyldiéthylènetriamine (4,1.10 ^"4 mol) sont ajoutés sous atmosphère d'azote. Le mélange est alors dégazé 3 fois par des cycles de congélation/décongélation et transféré sous azote dans un ballon de type schlenk contenant du CuBr (60 mg ; 4,18.10 ^"4 mol). Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à 60 ⁰ C pendant 3 jours puis dialyse contre de l'eau milliQ à pH 3,5 en utilisant une membrane de dialyse 6 Spectra/Por® caractérisée par un seuil de coupure de 5OkDa. Le copolymère est alors récupéré par centrifugation et séché sous vide pendant deux jours. La masse de produit récupéré est 1 ,5 g (rendement : 70%). Analyse ¹ H RMN (DMSO d ₆ - 60 ⁰ C) : 1,8 ppm (CH3, GIcNAc); 1 ,9 ppm (-N3-CH2-CH2-CH2-, 2H); 2,05 et 2,25 ppm (- CH2-CH2-CH-, 2H) ; 2,5 ppm (CH2-CO-, 2H) ; 2,65 ppm (-N3-CH2-CH2-CH2-, 2H) ; 3,1 ppm (C(2)W, GIcA) ; 3,2 ppm (C(3)H, GIcA) ; 3,1-3,7 ppm (C(3)H, C(A)H, C(5)H, 3H ₁ GIcNAc) ; 3,5 et 3,7 ppm (C(6)H, GIcNAc) ; 3,1-3,7 ppm (C(A)H, C(5)H, 2H, GIcA) ; 3,5 et 3,7 ppm (C(2)H, α et β, GIcNAc) ; 4,2 et 4,35 ppm (C(I)H, α et β, GIcA) ; 4,58 ppm (C(I)H, GIcNAc) ; 4,6 ppm (-NH-CH-CO, 1 H) ; 5 ppm (-CH2-C6H5, 2H) ; 7,25 ppm (-C6H5, 5H) ; 7,6 ppm (-N3- C(CH2)=CH-, 1H) ; 8,2 ppm (-NH-CH-CO- , 1 H).

Exemple 2 : préparation d'un copolvmère dibloc dextrane-b/oc- polvf L-qlutamate de γ-benzyle)

Préparation du dextrane possédant une fonction alcyne (dextrane alcyné)

3 g de dextrane (4,54.10 ^"4 mol) possédant un degré de polymérisation moyen en nombre égal à 40 sont introduits dans un ballon équipé d'un réfrigérant et dissous par agitation magnétique dans un tampon acétate ajusté à pH=5 à une concentration finale de polymère de 2% en masse. La propargylamine est ajoutée en large excès (2,5g ; 4,54.10 ^"4 mol) sous agitation. Une fois le milieu homogène, l'agent réducteur (NaBHβCN) est ajouté au milieu réactionnel en large excès (2,85g ; 4,54.10 ^"4 mol). La solution est laissée sous vive agitation dans un bain à 50 ⁰ C pendant 5 jours avec un ajout quotidien d'une quantité définie d'agent réducteur (25 équivalents molaires par rapport au dextrane). Le milieu réactionnel est ensuite concentré par évaporation rotative puis dialyse contre de l'eau en utilisant une membrane de dialyse 6 Spectra/Por® caractérisée par un seuil de coupure de 2kDa. Le polymère est enfin récupéré par lyophilisation. La masse de polymère obtenue est 2,24 g, soit un rendement massique de 74%. Analyse ¹ H RMN (DMSO d ₆ ) : 3,17 ppm (C(A)H); 3,2ppm(C(2)H) ; 3,42ppm (C(3)H) ; 3,5 et 3,75 ppm (C(6)W, 2H); 3,62ppm (C(5)H) ; 4,5 ppm (C(2)OH); 4,65 ppm (C(I)H) ; 4,85 ppm (C(3)OH) ; 4,95 ppm (C(4)OH).

Préparation du copolymère dextrane-bloc-poly(L-glutamate de γ-benzyle) Deux équivalents de dextrane alcyné (0,4 g ; 6,06.10 ⁵ mol) et un équivalent de PBLG-azoture (0,147 g ; 3,03.10 ⁵ mol) sont solubilisés dans 25mL de DMSO anhydre. Le mélange est agité 20 min puis 12,6 μl_ de pentaméthyldiéthylènetriamine (6,06.10 ⁵ mol) sont ajoutés sous atmosphère d'azote. Le mélange est alors dégazé 3 fois par des cycles de congélation/décongélation et transféré sous azote dans un ballon de type schlenk contenant du CuBr (9 mg ; 6,06.10 ⁵ mol). Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 3 jours puis dialyse contre de l'eau milliQ en utilisant une membrane de dialyse 6 Spectra/Por® caractérisée par un seuil de coupure de 5OkDa. Le copolymère est alors récupéré par lyophilisation. La masse de produit récupéré est 0,302 g (rendement : 87%). Analyse ¹ H RMN (DMSO d ₆ ) : 1,9 ppm (-N3-CH2-CH2- CH2-, 2H); 2 et 2,15 ppm (-CH2-CH2-CH-, 2H) ; 2,45 ppm (CH2-CO-, 2H) ; 2,65 ppm (-N3-CH2-CH2-CH2-, 2H) ; 3,1 ppm (N3-CH2-CH2-CH2, 2H); 3,15 ppm [C[A)H); 3,17 ppm (C(2)H); 3,42 (C(3)H) ; 3.5 et 3,75 ppm (C(6)H, 2H); 3,62 ppm (C(5)H) ; 4,5 ppm [C[I)OH) ; 4,65 ppm (C(I)H); 4,88 ppm (C(3)OH) ) ; 4,9-5 ppm [C[A)OH) ; 7.2 ppm (C6H5, 5H) ; 8,25 ppm (-NH-CH- CO- , 1H).

Exemple 3 : préparation d'un copolymère dibloc dextrane-b/oc- poly(ε-trifluoroacétyl-L-lvsine)

Préparation du poly(^trifluoroacétyl-L-lysine) possédant une fonction azoture (poly(e-trifluoroacétyl-L-lysine)-azoture)

2 g (7,46.10 ^'3 mol) de N-carboxyanhydride de ε-trifluoroacétyl-L-lysine sont introduits sous atmosphère d'argon dans un ballon de type schlenk préalablement flammé sous vide, et dissous dans 21 mL de DMF anhydre. La solution est agitée 10 min et 9 μL de 1-azido-3-aminopropane (94 μmol) sont ajoutés au moyen d'une seringue purgée à l'azote. La solution est agitée 40 h sous vide à température ambiante. Le polymère est récupéré par précipitation dans l'éther diéthylique puis séché sous vide. La masse de produit récupéré est 1 ,5 g (rendement : 75%). L'analyse par spectroscopie RMN du proton fournit un degré de polymérisation moyen en nombre de 64.

Analyse ¹ H RMN (DMSO d ₆ ) : 1 ,1-2 ppm (-CH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-, 6H); 3,12 ppm (CO-NH-CH2-, 2H); 3,8ppm ( CO-CH-NH, 1 H) ; 8,2 ppm (-Λ/H-CH- CO- , 1 H) ; 9,3 (CF3-CO-Λ/H-, 1 H)

Préparation du copolymère dextrane-bloc-poly(ε-trifluoroacétyl-L-lysine)

Deux équivalents de dextrane alcyné (0,4 g ; 6,06.10 ⁵ mol) et un équivalent de poly(ε-trifluoroacétyl-L-lysine)-azoture (0,271 g ; 3,03 10 ^"5 mol) sont solubilisés dans 3OmL de DMSO anhydre. Le mélange est agité 20 min puis 12,6 μL de pentaméthyldiéthylènetriamine (6,06.10 ⁵ mol) sont ajoutés sous atmosphère d'azote. Le mélange est alors dégazé 3 fois par des cycles de congélation/décongélation et transféré sous azote dans un ballon de type schlenk contenant du CuBr (9 mg ; 6,06.10 ⁵ mol). Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 3 jours puis dialyse contre de l'eau milliQ en utilisant une membrane de dialyse 6 Spectra/Por® caractérisée par un seuil de coupure de 5OkDa. La masse de produit récupéré après lyophilisation est 0,320 g (rendement : 67%). Analyse ¹ H RMN (DMSO d ₆ ) : 1 ,1-2 ppm (-CH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-, 6H); 3,12 ppm (CO-NH-CH2-, 2H) ; 3,15 ppm (C(A)H); 3,17 ppm (C(2)H); 3,42 (C(3)H) ; 3,5 et 3,72 ppm (C(6)H, 2H) ; 3,62 ppm (C(5)H) ; 3,8ppm (CO-CH-NH, 1 H) ; 4,5 ppm (C(2)OH) ; 4,65 ppm (C(I )H); 4,88 ppm (C(3)OH) ) ; 4,9-5ppm (C(A)OH) ; 8,2 ppm (-NH- CH-CO-, 1 H) ; 9,3 (CF3-CO-NH-, 1 H).

Exemple 4 : préparation de vésicules micellaires à base de copolvmère acide hvaluronique-b/oc-polv(L-qlutamate de γ-benzyle) Le copolymère acide hyaluronique-/5/oc-poly(L-glutamate de γ- benzyle) de l'exemple 1 est dissous dans le DMSO à 55°C à une concentration de 5 mg/mL et injecté au moyen d'un pousse seringue à 18mL/h dans un volume de tampon Tris (10 mM, pH=7,4 ; [NaCI] = 145 mM) jusqu'à atteindre une concentration finale en copolymère de 1mg/ml_. Le solvant organique est éliminé par dialyse contre un tampon tris (10 mM, pH=7,4 ; [NaCI] = 145 mM) en utilisant une membrane de dialyse (6 Spectra/Por®) possédant un seuil de coupure en masse molaire de 2kDa. Une solution de vésicules est ainsi obtenue et caractérisée par diffusion dynamique et statique de la lumière, diffusion de neutrons aux petits angles et microscopie électronique en transmission.

On obtient ainsi des vésicules polymères de 200nm de rayon avec une faible distribution en taille, et possédant une épaisseur de membrane d'environ 9nm.

La figure 2 représente la distribution en taille des vésicules (rayon hydrodynamique) obtenue par diffusion de la lumière. La figure 3 représente une image de microscopie électronique en transmission obtenue sur ces mêmes vésicules.

Exemple 5 : préparation de vésicules micellaires à base de copolymère dibloc dextrane-fr/oc-polv(L-glutamate de γ-benzyle)

Le copolymère dextrane-b/oc-poly(L-glutamate de γ-benzyle) de l'exemple 2 est dissous dans 1mL de DMSO à une concentration de 0,5mg/mL, puis 9mL d'eau milliQ sont ajoutés progressivement à l'aide d'un pousse seringue à 18mL/h sous agitation. Le DMSO est ensuite éliminé par dialyse contre de l'eau milliQ en utilisant une membrane de dialyse 6 Spectra/Por® caractérisée par un seuil de coupure de 2kDa. Les vésicules alors formées sont analysées par diffusion dynamique de la lumière et microscopie électronique à transmission.

On obtient ainsi des vésicules polymères de 40 nm de rayon avec une faible distribution en taille.

La figure 4 représente la distribution en taille des vésicules (rayon hydrodynamique) obtenue par diffusion de la lumière. La figure 5 représente une image de microscopie électronique en transmission obtenue sur ces mêmes vésicules. Exemple 6 : encapsulation d'un principe actif dans une vésicule micellaire

La doxorubicine et le docetaxel ont été encapsulés dans des vésicules micellaires à base du copolymère acide hyaluronique-b/oc-poly(L- glutamate de γ-benzyle) de l'exemple 1 par nanopréciptation.

Le principe actif a été dissous dans du DMSO ou du tampon Tris dans des rapports massiques principe actif : copolymère de 0,1 :1, 0,2 :1 et 0,3 :1. Le copolymère à blocs est solubilisé dans la phase organique de DMSO à 55°C. Cette solution est ajoutée à la solution aqueuse (tampon Tris pH = 7,4) sous agitation continue à 55°C, ou inversement. Le principe actif libre et le DMSO ont été éliminés par dialyse (seuil de coupure en masse molaire de 2kDa) contre du tampon Tris.

La quantité de doxorubicine encapsulée (dans la partie hydrophobe ou hydrophile des vésicules) et l'efficacité d'encapsulation ont été déterminées en brisant les vésicules chargées dans un mélange DMSO :Tris (80 :20). Après centrifugation pendant 1 h, l'échantillon a été filtré et mesuré par spectroscopie UV à 485 nm. La quantification a été effectuée à partir de la courbe de calibration de la doxorubicine dans le mélange DMSO :Tris (80 :20). La quantité de docetaxel encapsulé et l'efficacité d'encapsulation ont été déterminées à partir de la reconstitution d'un extrait sec de vésicule contenant du docetaxel dans de l'éthanol. Ensuite, l'échantillon filtré a été mesuré par spectroscopie UV à 230 nm. La quantification a été effectuée à partir de la courbe de calibration de la doxorubicine dans l'éthanol.

Quantité encapsulée = (masse de principe actif dans la vésicule chargée/masse de vésicule) x100

Efficacité d'encapsulation = (masse de principe actif dans la vésicule chargée/masse initiale de principe actif) x100

Les résultats sont rapportés dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1

Les résultats montrent des taux d'encapsulations élevés de l'ordre de 10% et une efficacité d'encapsulation aux alentours de 50%.

Exemple 7 : libération d'un principe actif encapsulé dans une vésicule micellaire

La quantité voulue (par exemple, un volume de 4mL à une concentration de 1mg/mL) de vésicules chargées en doxorubicine et docetaxel est versée dans un tube de dialyse (Spectra/Por ® Float-A-Lyzer ®, Dialysis

Tubes, seuil de coupure en masse molaire de 25kDa, diamètre 10mm, volume

1OmL). Le tube de dialyse est introduit verticalement dans un cylindre de mesure de 50 mL. Le système est maintenu à 37°C+2 et couvert de parafilm pour éviter l'évaporation. Afin de maintenir les conditions osmotiques requises,

2 mL ont été prélevés à l'extérieur du tube de dialyse pour chaque temps d'échantillonnage et remplacés par le même volume de tampon Tris.

Dans le cas de la doxorubicine, l'échantillonnage est réalisé dans le tube de dialyse, puis réinséré tel quel après analyse. Pour le docetaxel, l'échantillonnage est réalisé à l'extérieur du tube de dialyse. Le milieu de dialyse contenait 50 mL de tampon Tris (pH 7,4) avec 2% v/v d'éthanol pour augmenter la solubilité du docetaxel libéré et éviter l'agrégation du docetaxel libre.

La quantification est effectuée par la courbe de calibration des principes actifs libres dans leurs solvants respectifs. Les profils de libération exprimés en pourcentage de relargage cumulé en fonction du temps (en seconde ^1/2 ) sont représentés sur les figures 6 (doxorubicine) et 7 (docetaxel).

Le principe actif libre est représenté par symbole -o- (rond vide) et la libération du principe actif encapsulé est représentée par le symbole -•- (rond plein).

Les résultats montrent clairement que la libération de ces deux principes actifs peut être contrôlée sur plusieurs jours avec une cinétique beaucoup plus lente que celle du principe actif libre. La libération semble suivre un modèle de diffusion homogène.

Exemple 8 : libération et toxicité in vitro d'un principe actif encapsulé dans une vésicule micellaire

Les expériences de toxicité et de libération in vitro ont été réalisées à partir des vésicules à base de copolymère dibloc acide hyaluronique-/3/oc-poly(L-glutamate de γ-benzyle) préparées dans l'exemple 6, contenant 11 % de doxorubicine.

Les expériences in vitro ont été réalisées sur des cellules du gliome C6 du rat, dans un milieu de culture Dulbecco's modified Eagle's (DMEM) contenant 5% de sérum de veau foetal. Les cellules C6 (5.10 ⁵ cellules) sont placées dans des falcons de 10cm de diamètre et croissent dans 10ml du milieu de culture contenant de la pénicilline (10000 μg/mL), de la streptomycine (10000 μg/mL) et de l'amphotéricine B (25 μg/mL) [Invitrogen Corporation] dans un incubateur à 37 ⁰ C dans une atmosphère contrôlée à 5% CO ₂ . Pour les tests de viabilité (ou toxicité) cellulaire, les cellules C6 ont été incubées dans une plaque de 24 puits (15.10 ⁴ cellules par puits), pendant 24h. La viabilité a été déterminée par un test classique au sel de tétrazolium MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium). Le tétrazolium qu'il contient est réduit en fomnazan par la succinate déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes actives. La couleur du milieu passe alors du jaune au bleu-violacé. L'intensité de cette coloration est proportionnelle au nombre de cellules vivantes présentes lors du test. L'analyse est réalisée par spectrophotométrie (U-2800A, HITACHI) en mesurant l'absorbance à 570nm. Les mesures sont normées par une expérience de contrôle, pour lequel le test MTT est réalisé sans cellules. On détermine ainsi la valeur d'IC50 pour un temps de 48h, correspondant à la concentration pour laquelle la moitié des cellules restent viables.

Pour la doxorubicine libre, on obtient une valeur de 0,84 μM.

Pour les vésicules encapsulant la doxorubicine, une valeur 10 fois supérieure (IC50=8,4 μM) est obtenue. La vésicule seule (sans doxorubicine) n'a présentée aucune toxicité dans les conditions expérimentales (concentration jusqu'à 200 μM, temps jusqu'à 72h).

Exemple 9 : étude de l'internalisation cellulaire des vésicules micellaires contenant un principe actif

Le suivi de l'intemalisation cellulaire a été réalisé in vitro par microscopie de fluorescence. Pour cela, les cellules C6 ont été incubées (15.10 ⁴ cellules) dans une plaque de 4 puits de 16mm. Les vésicules contenant la doxorubicine à la concentration de 4,54 μM ont été incubées à des temps de 3h, 6h et 24h à 37°C dans une atmosphère contrôlée à 5% CO ₂ . Pour chaque temps d'observation, les cellules sont lavées 2 fois avec un tampon PBS, fixées sur un couvre-lame de microscope avec 4% de paraformaldéhyde (PF4) en tampon PBS, laissées dans le noir à température ambiante pendant 30min, puis lavées une fois au tampon PBS et une fois à l'eau pure. L'observation microscopique est réalisée avec un microscope de fluorescence Zeiss (grossissement x 63 ; λ _exC itation = 546nm et λ _ém issioπ = 590nm). Le suivi en microscopie de fluorescence in vitro sur les cellules C6 après 24h d'incubation en présence des vésicules contenant la doxorubicine est représenté sur la figure 8. Les vésicules contenant la doxorubicine sont internalisées par endocytose. Après 24h d'incubation, on observe une forte accumulation dans les endosomes provenant de l'internalisation des vésicules contenant la doxorubicine. Les cellules montrent des excroissances importantes, qui sont caractéristiques de cette internalisation. Exemple 10 : essai d'irritation cutanée chez le lapin

On a utilisé une dispersion à 1 % (p/v) de copolymère dibloc acide hyaluiOnique-fc/oc-poly(L-glutamate de γ-benzyle) de l'exemple 1.

Cette dispersion a été appliquée à une dose de O ₁ SmL ₁ sous pansement semi-occlusif, pendant 4h sur une zone de peau saine chez 3 lapins.

Le protocole expérimental est celui de la Directive OCDE n° 404 du 24 avril 2002 et de la méthode d'essai B.4 de la Directive EC 440/2008.

Aucune réaction cutanée (érythème ou œdème) n'a été observée sur la zone traitée, quel que soit le temps de l'examen (24h, 48h et 72h après l'enlèvement du pansement).

Exemple 11 : Etude du potentiel d'irritation cutanée chez la souris

On a utilisé une dispersion à 1 % (p/v) de copolymère dibloc acide hyaluronique-6/oc-poly(L-glutamate de γ-benzyle) de l'exemple 1.

La dispersion de copolymère a été appliquée sur la surface dorsale de l'oreille d'une lignée de souris femelles.

3 groupes de 4 animaux chacun ont été traités pendant trois jours consécutifs (J1 , J2, J3) avec 50 μl (25 μl par oreille) de dispersion de test non diluée (100%), d'une part, et de dispersion de test diluée dans du diméthyl formamide (DMF) à des concentrations de 25% et de 50% (v/v). Un groupe supplémentaire de 4 animaux a été traité avec du DMF.

Au 6 ^eme jour, la prolifération des lymphocytes dans les ganglions lymphatiques drainants de l'oreille a été déterminée par comptage cellulaire. Le protocole expérimental a été établi conformément à la Directive

OCDE n° 429 du 24 avril 2002 et à la méthode d'essai B. 42 de la Directive EC 440/2008.

Les résultats ont montré que : a) aucune mortalité ou signe de toxicité systémique n'ont été observés chez les animaux testés et les animaux témoins ; b) aucune réaction cutanée n'a été observée à des concentrations de 25%, 50% et 100%. Les résultats montrent que la dispersion de copolymère selon l'invention est non irritante aux trois concentrations testées.

Exemple 12 : Evaluation de la dose maximale tolérée par voie intraveineuse chez la souris

On a utilisé une dispersion à 1 % (p/v) de copolymère dibloc acide hyaluronique-b/oc-poly(L-glutamate de γ-benzyle) de l'exemple 1.

La dispersion de copolymère a été administrée par voie intraveineuse chez un mâle et une femelle souris Swiss à un volume d'administration de 10 mL/kg. Considérant la densité de la formulation, cette administration correspond à une dose de 10 g/kg.

Aucune mortalité n'a été observée durant les 14 jours de l'étude. L'examen macroscopique des animaux à la fin du traitement n'a montré aucune modification liée au traitement. Les résultats montrent que la dose maximale tolérée (en anglais

« maximal tolerated dose » ou MTD) de la dispersion de copolymère selon l'invention par voie intraveineuse est supérieure à 10 g/kg chez la souris.

Exemple 13 : Etude du ciblage des récepteurs CD 44 lié à l'acide hvaluronique par inhibition compétitive en présence d'acide hvaluronique libre

On a utilisé la lignée cellulaire humaine MCF-7 qui exprime de manière significative les récepteurs CD 44.

Pour confirmer l'internalisation cellulaire de la doxorubicine encapsulée par endocytose via les récepteurs spécifiques de l'acide hyaluronique, un essai d'inhibition compétitive a été réalisé en ajoutant préalablement de l'acide hyaluronique libre dans le milieu d'incubation de manière à bloquer dans une certaine mesure les récepteurs de l'acide hyaluronique à la surface des cellules.

Les cellules (0,1.1O ⁶ ) ont été incubées pendant 1h à 37°C avec de la doxorubicine pure ou de la doxorubicine encapsulée dans les vésicules micellaires de l'exemple 6 (concentration en doxorubicine = 10μM) dans des boîtes de 40mm de diamètre dans un milieu dépourvu de sérum, en présence ou en absence d'acide hyaluronique libre (PM=5000g/mol), à une concentration de 2mg/ml_.

Les cellules ont ensuite été lavées deux fois avec un tampon PBS et collectées par centrifugation (1000 rpm pendant 10min). Les cellules ont ensuite été remises en suspension dans 300μL de tampon PBS avant la mesure.

Les échantillons ont été collectés sur un cytomètre à flux FACS Calibur (Beckton Dickinson) et analysés en utilisant le logiciel CeII Quest fourni par le fabricant. Pour chaque analyse, au moins 10 000 cellules ont été comptées.

On observe que la présence d'acide hyaluronique libre diminue significativement l'intensité de fluorescence moyenne (IFM) de la doxorubicine libre.

La figure 9 représente l'intensité de fluorescence relative mesurée en unité arbitraire (UA) dans les cellules MCF-7 mesurée après l'incubation en présence de doxorubicine encapsulée (colonne en noir), de doxorubicine libre

(colonne en gris) et sans doxorubicine (colonne hachurée), en présence ou en absence d'acide hyaluronique libre.

Les résultats montrent que, pour la doxorubicine libre, l'incubation en présence d'acide hyaluronique libre n'a pas ou peu d'effet sur l'internalisation (pas de diminution significative de l'intensité de fluorescence moyenne).

Ceci s'explique par le fait que la doxorubicine libre diffuse librement dans les cellules, l'internalisation n'étant pas liée à la médiation des récepteurs CD 44.

En revanche, l'intensité de fluorescence en présence d'acide hyaluronique libre, diminue significativement pour la doxorubicine encapsulée.

Ces résultats montrent le rôle des récepteurs d'acide hyaluronique dans Pendocytose des vésicules micellaires à base d'acide hyaluronique selon l'invention permettant la délivrance intracellulaire de la doxorubicine. Exemple 14 : Evaluation in vivo de l'efficacité anti-tumorale de la doxorubicine encapsulée.

1/ Protocole expérimental Des femelles de rat Sprague-Dawley âgées de 8 semaines (120-

140g) ont été utilisées dans une étude de régression tumorale.

Du 7,12-diméthylbenz[α]anthracène (DMBA) a été administré par voie orale (dans de l'huile de soja) aux animaux en 3 doses de 45mg/kg à intervalle d'une semaine, pour générer la tumeur. Le traitement par la doxorubicine a été donné 10 semaines après la dernière dose de DMBA. La largeur de la tumeur (L) et sa longueur (I) ont été enregistrées avec un pied à coulisse et la taille de la tumeur a été calculée par la formule (L x I ² 12).

Après 10 semaines d'induction de tumeur, les animaux porteurs de tumeurs ont été séparés et divisés de manière aléatoire en différents groupes de traitement, puis traités avec une dose unique de 250μl par voie intraveineuse de doxorubicine à 5mg/kg, soit sous forme de doxorubicine libre, soit sous forme de doxorubicine encapsulée dans les vésicules micellaires de l'exemple 6 . Le groupe témoin a reçu une dose unique de 250μl de tampon

PBS (pH 7,4) par voie intraveineuse.

L'étude a été terminée 30 jours après le traitement. L'observation de la survie des animaux porteurs de tumeur ayant été traités a été poursuivie jusqu'à 60 jours après le traitement.

2/ Activité anti-tumorale de la doxorubicine encapsulée

La figure 10 rapporte la variation de volume de la tumeur en fonction du temps, suite au traitement par la doxorubicine libre (courbe représentée par le symbole -V-), la doxorubicine encapsulée (courbe représentée par le symbole -D-) ou le PBS (courbe représentée par le symbole -•-). Les résultats montrent que la doxorubicine libre et la doxorubicine encapsulée inhibent significativement la croissance de la tumeur en comparaison du groupe témoin traité au PBS. Cependant, la doxorubicine encapsulée provoque une suppression tumorale nettement supérieure à la doxorubicine libre.

En effet, après 15 jours de traitement, on observe que la tumeur continue à régresser avec la doxorubicine encapsulée, alors que la régression atteint un palier avec la doxorubicine libre.

Sur la courbe de survie de Kaplan-Meier rapportée sur la Figure 11 , dont chaque point représente la moyenne ± erreur type de la moyenne (n=6), on a représenté le temps de survie des animaux après le début du traitement, pour les animaux ayant reçu par administration intraveineuse la doxorubicine encapsulée (droite continue), de la doxorubicine libre (droite en tirets) et le groupe témoin (droite en pointillés). Les résultats montrent l'absence de mortalité à 60 jours pour les animaux traités par la doxorubicine encapsulée.

3/ Cardiotoxicité

Un des principaux effets secondaires bien connus de la doxorubicine est sa cardiotoxicité. Celle-ci peut être évaluée par la mesure de la production d'enzymes spécifiques, principalement la lactate déshydrogénase et la créatine kinase.

La mesure du taux sérique de lactate déshydrogénase et de créatine kinase des différents groupes d'animaux de l'expérimentation ci-dessus montre que l'induction de lactate déshydrogénase et de créatine kinase est inférieure chez les animaux traités par de la doxorubicine encapsulée en comparaison de ceux traités par la doxorubicine libre, comme rapporté sur les Figures 12A (créatine kinase) et 12B (lactate déshydrogénase).

Les résultats montrent que la doxorubicine encapsulée induit un faible niveau de lactate déshydrogénase et de créatine kinase ce qui implique une diminution de la cardiotoxicité de la doxorubicine encapsulée dans les vésicules micellaires selon l'invention. Cette baisse de la cardiotoxicité est en accord avec la réduction significative des effets secondaires et de la mortalité qui a été observée en utilisant la doxorubicine encapsulée.