Sector técnico

La presente invención se relaciona con la industria farmacéutica, en particular permite entregar estabilidad al fármaco durante su almacenamiento, además de lograr su liberación controlada.

Técnica anterior

Los productos farmacéuticos basados en nanopartículas están actualmente llegando al mercado como una estrategia para mejorar la eficacia terapéutica de numerosas moléculas activas tanto para patologías agudas como crónicas, que requieren tratamientos selectivos. Las nanopartículas de polímeros y lípidos cargadas con fármacos se producen típicamente mediante métodos basados en disolventes y dan como resultado suspensiones coloidales, que a menudo sufren de inestabilidad física y química (por ejemplo, formación de agregados) dando como resultado la pérdida de funcionalidad. Por otro lado debido a su pequeño diámetro son rápidamente depuradas en el organismo al ser administradas ya sea en el sitio de acción o a nivel sistémico, liberando rápidamente el contenido, sin otorgar propiedades reales de un sistema de liberación controlada, a pesar de su composición.

El primer preparado tipo microcarrier de nanopartículas obtenido a la forma de polvo por secado por pulverización fue desarrollado por Tsapis y col. el año 2002. En este caso, la cápsula de la partícula estaba conformada por nanopartículas de poliestireno, material no biodegradable, y otros componentes de matriz como son fosfolípidos, lactosa y un derivado de celulosa. Si bien fue el primer sistema de este tipo, potencial mente sólo serviría como sistema de liberación controlada de nanopartículas, puesto que estas se encuentran sólo a nivel superficial [1].

Años más tarde, Gómez-Gaete y col. el 2008, desarrollaron el primer microcarrier de nanopartículas elaborado con materiales biodeg rada bles (fosfolípido y ácido hialurónico) y PLGA en el caso de las nanopartículas, las cuales encapsulaban un corticosteroide. Al igual que en el estudio de Tsapis, las nanopartículas se distribuyeron sólo en la cápsula, resultando partículas huecas, lo cual no garantiza protección de las nanopartículas ni tampoco una liberación controlada [2]. En 2014, Tewes y col, elaboraron por spray drying un microcarrier de nanopartículas óxido de hierro base de ciclodextrinas, carbonato de amonio y estearato de magnesio, excipientes útiles para el desarrollo de partículas porosas como estrategia para administración pulmonar. Las imágenes por microscopía electrónica de barrido también mostraron la distribución superficial de las nanopartículas, lo cual no garantiza protección ni previene la rápida salida de los activos nanoencapsulados [3].

El año 2015, Imperiale y col., desarrollaron un sistema a base de nanocristales encapsulados en micropartículas de alginato reticuladas con cloruro de calcio y quitosano, utilizando el método gelificación iónica. Las micropartículas fueron posteriormente recubiertas con películas de Eudragit®. Sin embargo, la elaboración de estas partículas es engorrosa pues incluye vahas etapas y procesos de secado. Además el recubrimiento debe hacerse en etapas separadas. Por otro lado el tamaño obtenido fue cercano a los 900 pm, limitando su uso sólo a la vía oral [4]. Un estudio similar fue desarrollado por Augustine y col, 2018, puesto que previamente se formó el microcarrier por spray dryer utilizando alginato como componente de matriz y posteriormente se le adicionó una cubierta de metacrilato para proteger a las nanopartículas del pH estomacal, tras su administración por vía oral [5].

Recientemente, como estrategia para terapia génica, Schulze J, et al, 2018, desarrollaron micropartículas de polivinilalcohol por spray dryer, encapsulando lipoplexes a base de polietanolamina, el objetivo fue la administración intrapulmonar. En este caso, al utilizar la boquilla convencional del equipo spray dryer, las nanopartículas se encuentran distribuidas en todo el polímero [6].

Como puede observarse, si bien existen publicaciones que describen la elaboración, caracterización y evaluación de microcarriers de nanopartículas, estos presentan inconvenientes. Por un lado las nanopartículas contenidas se encuentran a nivel superficial, ya sea formando parte de la misma cápsula, o bien dentro de la matriz completa de las micropartículas, teniendo como desventaja su poca protección y con ello la posibilidad de liberar rápidamente el activo encapsulado. Si bien recientemente se han tratado de contrarrestar estos inconvenientes recubriendo externamente al microcarrier, esto involucra etapas adicionales al proceso, empleo de solventes y/o etapas de lavado, que van encareciendo el proceso haciéndolo menos industrializable, pudiendo además reducir la cantidad encapsulada el activo en cuestión. Finalmente vahos de los sistemas mencionados en esta revisión no ofrecen la alternativa de ser utilizados por varias vías de administración, muchas veces limitándose sólo a la vía oral o pulmonar, debido a los diámetros medios obtenidos.

Una de las formas que permitiría simplificar el número de etapas en la confección de microcarriers de nanopartículas es el uso de boquillas especializadas en los equipos de secado por atomización. La boquilla convencional o de 2 fluidos (2FN) se usa comúnmente en la microencapsulación de activos en la industria o en la escala de investigación. Consiste en dos boquillas concéntricas donde la solución o suspensión de alimentación se bombea a través de la boquilla interna mientras el aire de atomización u otro gas inerte adecuado fluye a través de la boquilla externa (Figura la), además presenta una aguja de limpieza para eliminar los residuos de las soluciones utilizadas. Esta configuración de tobera permite el secado por pulverización de una única solución de alimentación y, por lo tanto, está limitada a soluciones de alimentación que contienen materiales y disolventes compatibles. Como resultado del uso de una solución o suspensión de alimentación, las micropartículas formadas generalmente consisten en una matriz de fármaco y polímero, sistema conocido como microesferas o microcápsulas convencionales, por lo tanto, el fármaco se distribuye dentro de la matriz polimérica que cumple la función de protección / estabilización. Como el activo en una estructura matricial de micropartículas se distribuye normalmente por toda la partícula, está presente en la superficie de la partícula y da lugar a una liberación rápida inicial o en ráfaga seguida por una liberación controlada dependiendo de las propiedades fisicoquímicas de los excipientes y su afinidad con el activo terapéutico. Estas boquillas de pulverización convencionales (boquillas rotativas y de dos fluidos) pueden pulverizar solo un disolvente o una mezcla de disolventes, en los que tanto el agente de recubrimiento como el fármaco están disueltos o suspendidos.

Por otra parte, existen las boquillas triplefluido o de tres fluidos (B3F), compuestas por tres boquillas concéntricas donde se pueden bombear dos mezclas de alimentación, una más interna que la otra y por fuera fluye el aire (Figura Ib). Gracias a esta conformación de pueden obtener partículas con una matriz central y una capa de recubrimiento dando origen a microcápsulas. Su uso no ha sido masificado debido a la falta de formulaciones que permitan obtener microcápsulas con las características deseadas. Referencias

[1] N. Tsapis, D. Bennett, B. Jackson, D. A. Weitz, and D. A. Edwards, "Trojan particles: large porous carriers of nanoparticles for drug delivery.," Proc. Nati. Acad. Sel. U. S. A., vol. 99, no. 19, pp. 12001-5, Sep. 2002.

[2] C. Gómez-Gaete, E. Fattal, L. Silva, M. Besnard, and N. Tsapis, "Dexamethasone acétate encapsulation into Trojan particles," J. Control. Re/ease, vol. 128, no. 1, pp. 41-49, May 2008.

[3] F. Tewes, C. Ehrhardt, and A. M. Healy, "Superparamagnetic ¡ron oxide nanoparticles (SPIONs)-loaded Trojan microparticles for targeted aerosol delivery to the lung," Eur. J. Pharm. Biopharm., vol. 86, no. 1, pp. 98-104, Jan. 2014.

[4] J. C. Imperiale, P. Nejamkin, M. J. del Solé, C. E. Lanusse, and A. Sosnik, "Novel protease inhibitor-loaded Nanoparticle-in-Microparticle Delivery System leads to a dramatic improvement of the oral pharmacokinetics in dogs," Biomaterials, vol. 37, pp. 383-394, Jan. 2015.

[5] R. Augustine, D. L. Ashkenazi, R. S. Arzi, V. Zlobin, R. Shofti, and A. Sosnik, "Nanoparticle-in-microparticle oral drug delivery system of a clinically relevant darunavir/ritonavir antiretroviral combination," Acta Biomater., vol. 74, pp. 344-359, Jul. 2018.

[6] J. Schulze, S. Kuhn, S. Hendrikx, M. Schulz-Siegmund, T. Polte, and A. Aigner, "Spray- Dried Nanoparticle-in-Microparticle Delivery Systems (NiMDS) for Gene Delivery, Comprising Polyethylenimine (PEI)-Based Nanoparticles in a Poly(Vinyl Alcohol) Matrix," Small, vol. 14, no. 12, p. 1701810, Mar. 2018.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Esquema de boquillas y morfología de las partículas que podrían obtenerse. En a) Boquilla tradicional de doble fluido y b) boquilla triple fluido; en el esquema se muestra i) fluido 1, ¡i) fluido 2, i¡¡) aire y iv) aguja de limpieza.

Figura 2: Esquema que muestra la alimentación y el flujo de aire de atomización a través de a) boquilla de doble fluido y b) boquilla concéntrica 3FN, para la configuración del secador por atomización.

Figura 3: Esquema de secado por atomización con boquilla de triple fluido: 1 : Sensor de T° de entrada de aire, 2: Filtro de ingreso de aire, 3: Calentador de aire, 4: Boquilla de triple fluido, 5: Soluciones de alimentación, 6: Cámara de secado, 7: Ciclón, 8: Receptáculo de muestras, 9: Filtro de aire, 10: Aspirador de aire.

Figura 4: Criterios de puntuación para la conformación corona-núcleo. 1) Exceso de solución formadora de núcleo, 2) exceso de solución formadora de corona, 3) mezcla amorfa de soluciones, 4) conformación corona-núcleo.

Figura 5: Diagrama de Pareto estandarizado para la recuperación.

Figura 6: Gráfica de efectos principales para la recuperación.

Figura 7: Gráfico de deseabilidad. La optimización multirrespuesta indicó los valores óptimos para cada factor con un índice de deseabilidad de 70,2%

Figura 8: Microcarrier con núcleo de nanopartículas, fotografías obtenidas por microscopía confocal.

Figura 9: Perfil de intensidad de marcadores fluorescentes a lo largo del microcarrier con núcleo de nanopartículas.

Figura 10: Distribución de tamaños para el microcarrier de nanopartículas.

Figura 11: Perfil de disolución del fármaco libre y liberación desde nanopartículas y microcarrier de nanopartículas durante 60 minutos.

Divulgación de la invención

La presente tecnología corresponde a una forma farmacéutica en polvo a base de microcápsulas que contienen nanopartículas en su interior o núcleo, es decir es un microcarrier de nanopartículas. Las nanopartículas pueden contener principios activos de diversa naturaleza química y terapéutica.

La mayor particularidad de esta tecnología es su conformación espacial, de forma capsular, y por lo tanto las nanopartículas se encuentran internamente rodeadas por una corona (cápsula) que las protege, protección que llega a todo principio activo que se encuentre nanoencapsulado. Otras tecnologías han intentado obtener formas de este tipo para lo cual emplean procesos que involucran vahas etapas (procesos de recubrimiento) y uso excesivo de solventes, sin lograr demostrar su conformación tridimensional. Las microcápsulas obtenidas comprenden:

a) una corona a base de polisacárido, particularmente del tipo quitosano; y b) un núcleo que contiene nanopartículas (pudiendo ser de PLGA u otro material polimérico o lipídico), el principio activo nanoencapsulado y un surfactante.

El agente surfactante, el cual es clave para la conformación tridimensional de la microcapsula, se puede seleccionar desde agentes surfactantes no iónicos (polisorbatos, ásteres de sorbitan, derivados polioxietilenados, polioxipropilenados); aniónicos (laurilsulfato de sodio); catiónicos (sales de amonio cuaternario); moléculas anfifílicas (fosfolípidos); coloides hidrofílicos; y derivados anfóteros (lecitinas y betaínas).

En la tabla 1 se presenta la composición de la microcapsula, donde se describen los componentes presentes en los dos fluidos incorporados al equipo de secado por atomización.

Tabla 1: Composición de las microcápsulas.

Componente Concentración

Corona polisacárido 0,5 a 2,0 % p/v

nanopartículas 0,25 a 1,0 % p/v

Núcleo surfactante 0,25 a 1,0 % p/v

agente activo Según requerimiento

El equipo Spray Dryer utilizado para la elaboración de este microcarrier de nanopartículas es acondicionado con una bomba peristáltica externa para incorporar una segunda solución de alimentación. En la figura 3 podemos ver las partes que componen este equipo: 1) Sensor de T° de entrada de aire; 2) Filtro de ingreso de aire; 3) Calentador de aire; 4) Boquilla de triple fluido; 5) Soluciones de alimentación; 6) Cámara de secado; 7) Ciclón; 8) Receptáculo de muestras; 9) Filtro de aire; y 10) Aspirador de aire.

Una particularidad de esta invención es la utilización de una boquilla de triplefluido, que permite obtener microcápsulas con un núcleo de nanopartículas y una corona de polímero que recubre al núcleo, tal como se puede ver en el esquema de la figura 2. La metodología de fabricación es totalmente industrializare. Esta disposición otorga gran versatilidad para escoger los polímeros y excipientes con los cuales se desea trabajar y permite muchas veces un mayor control en la liberación del fármaco. El uso de la tecnología de secado por atomización 3FN es una herramienta de gran potencial porque hace posible usar excipientes que no se pueden mezclar al usar la boquilla convencional (2FN). Al tener diferentes corrientes, la versatilidad de los componentes de la matriz que pueden usarse en la conformación de las microcápsulas aumenta, ya que no serán necesariamente solubles en el mismo disolvente, y pueden mejorarse en términos de liberación controlada.

Las condiciones de proceso se describen en la tabla 2:

Tabla 2: Condiciones y rangos de trabajo para el secado por atomización

Condiciones de secado Rangos de trabajo

Flujo bomba externa 1 a 3 mL/min

Flujo bomba interna 1,5 a 5 mL/min

Aspiración 90 a 100%

Gas de atomización 40 a 50 mm

Temperatura 120 a 140° C

Temperatura de salida 50 a 80 °C

Este microcarrier de nanopartículas puede expenderse como polvo estéril en vial de vidrio, para reconstitución a la forma de suspensión, pudiendo ser administrado por vía intraocular, intraarticular, intramuscular, subcutánea, intrapulmonar, intranasal. O bien, a la forma de polvo no estéril para reconstitución en un vehículo líquido o semisólido, o bien a la forma sólida para administración oral o tópica; dependiendo de la finalidad terapéutica.

La finalidad de esta forma farmacéutica es otorgar estabilidad fisicoquímica a las nanopartículas durante su almacenamiento y uso, además brindar propiedades de liberación controlada del fármaco nanoencapsulado. Todas estas ventajas se logran con un proceso productivo en una sola etapa, rápido y de bajo costo.

Dentro de los beneficios de esta metodología podemos mencionar que las nanopartículas incluidas en microcápsulas son de fácil manipulación y almacenamiento, ya que están protegidas durante el almacenamiento de factores externos que pudieran inestabilizarlas, gracias a la microcápsula que las rodea. Las nanopartículas se encuentran protegidas de la acción enzimática en el sitio de administración por la corona de la microcápsula. Las nanopartículas no son depuradas rápidamente debido al clearance propio del sitio de inyección. Por el tamaño del microcarrier este sistema puede ser administrado por vía intramuscular, intraarticular, intrapulmonar, intraocular, intranasal, oral o tópica.

Al contacto con un fluido biológico será necesario que se degrade primero la cápsula, para que luego las nanopartículas se liberen y con ello se libere el principio activo que se encuentra nanoencapsulado, por lo que se promueve el efecto de "liberación controlada". Se asocian las propiedades de las micropartículas (liberación controlada de los fármacos) con las ventajas de las nanopartículas (mayor penetración en tejidos).

El proceso permite obtener el sistema nano/microcapsular como polvo seco en una sola etapa prescindiendo de una etapa de secado posterior, como ocurre en la actualidad, por ejemplo, con liofilización.

Versatilidad en los materiales a utilizar gracias al método de obtención, lo cual amplía las posibilidades de innovar en la formulación a fin de lograr el objetivo terapéutico. En estos sistemas se pueden incorporar principios activos que poseen baja solubilidad, una pobre permeabilidad, problemas de estabilidad, entre otros, con el fin de alterar las características farmacocinéticas y farmacodinámicas de estas sustancias.

Además desde el punto de vista biofarmacéutico, esta tecnología posee múltiples ventajas tales como:

• Reducción en la dosis de administración

• Aumento de la biodisponibilidad de sustancias poco solubles

• Prolongar la acción de fármacos después de su administración

• Mejorar la eficacia y disminuir la toxicidad

• Mejorar la adherencia al tratamiento por parte del paciente

• Permitir el uso de vías de administración menos invasivas

• Reducción de los problemas de estabilidad de algunas formas farmacéuticas convencionales. EJEMPLOS DE APLICACIÓN

Ejemplo 1: Elaboración del microcarrier de nanopartículas.

El equipo utilizado para la elaboración del microcarrier de nanopartículas fue un Mini Spray Dryer B-290, acondicionado con una bomba peristáltica externa para incorporar una segunda solución de alimentación. Una particularidad de esta invención fue la utilización de una boquilla de triplefluido que permitió obtener partículas con un núcleo de nanopartículas y una corona de polímero que recubre al núcleo al utilizar una boquilla de tñplefuido como se muestra en la Figura Ib)

Las condiciones de proceso ensayadas se describen en la tabla 3:

Tabla 3: Condiciones y rangos de trabajo para el secado por atomización

Condiciones de secado Rangos de trabajo

Flujo bomba externa Flasta 2,5 mL/min Flujo bomba interna Flasta 4 mL/min

Aspiración 90 a 100%

Gas de atomización 40 a 50 mm

Temperatura 120 a 140° C

Temperatura de salida 79°C

Se estableció la utilización de quitosano como componente principal de matriz y se ensayaron diversas proporciones entre solución interna y externa mediante variaciones en los flujos de las bombas de alimentación, este factor fue determinante para lograr la morfología de corona-núcleo por lo cual se estableció la necesidad de realizar un diseño de experimento para optimizar la elaboración del microcarrier de nanopartículas obtenido por este método y así obtener las condiciones de secado óptimas.

El diseño de experimento realizado fue un diseño central compuesto con dos puntos estrella y se realizó en dos bloques, contando cada uno de ellos con 16 experimentos. Los parámetros de formulación (factores) que se modificaron se pueden ver en la tabla 4, los que se variaron en tres niveles con un valor máximo, medio y mínimo. Tabla 4: Factores modificados en el diseño de experimento para la obtención de un microcarrier de nanopartículas con boquilla de tres fluidos.

Factores Niveles

Cantidad de nanopartículas 50 mg - 100 mg - 200 mg*

Concentración de sólidos de quitosano 0,5 % p/v - 0,75 % p/v - 1% p/v

Temperatura de secado 130°C - 135 °C - 140 ⁰ C

* Para 20 mL de suspensión

El diseño se elaboró utilizando el software statgraphics Centurión XV, versión

15.1.02. 2007 se ingresaron los factores y los niveles a evaluar y el software arrojó una serie de 16 experimentos a realizar con su correspondiente duplicado para dar un total 32 ensayos, los cuales fueron realizados de acuerdo a las indicaciones que entregó la grilla de experimentos y posteriormente evaluados según las respuestas esperadas, indicadas en la tabla 5. Para cada experimento se prepararon un set de dos mezclas, una formadora de núcleo y otra formadora de corona. La mezcla formadora de núcleo contenía la cantidad correspondiente de nanopartículas, con rojo Nilo como marcador fluorescente suspendidas en 20 mL de agua. La mezcla formadora de corona correspondía a 20 mL de la solución de quitosano en la concentración indicada por el diseño, con un 10% del quitosano previamente marcado con isotiocianato de fluoresceína.

Tabla 5: Respuestas evaluadas en el diseño de experimento para la obtención de microcarrier de micropartículas con boquilla de triple fluido.

Respuestas Evaluación

Tamaño de Medición de diámetro medio (pm) mediante

partícula microscopía óptica

Evaluación de fotografías obtenidas con microscopía Morfología confocal y marcadores fluorescentes para polímeros de

corona y núcleo (score)

Recuperación % de polvo recuperado tras finalizado el secado Se consideraron como valores óptimos:

® Tamaño de partícula, con medias cercanas a 5 pm de diámetro

® Morfología, partículas esféricas, sin aglomerados ni restos de polímero suelto y con una conformación de corona-núcleo (equilibrio entre marcadores de corona y de núcleo).

® Maximizar el porcentaje de recuperación.

Se utilizó el mismo software Statgraphics Centurión para realizar el análisis de los resultados obtenidos, evaluando los efectos principales y sus significancias, además de obtener los valores ideales para cada uno de los factores que permitiese obtener partículas con las características óptimas mediante la función de optimización del programa.

Los experimentos se realizaron según lo indicado por el diseño de experimento y fueron un total de 16 pruebas cada una por duplicado. En la tabla 6 se pueden ver las condiciones con las cuales se trabajó.

Tabla 6: Grilla de combinaciones efectuadas según diseño de experimentos.

N° de Cantidad de Temperatura Concentración de sólidos de exp. nanopartículas (mg) (°C) quitosano (%p/v)

1 Ϊ00 135 075

2 50 130 0,5

3 200 130 0,5

4 50 140 0,5

5 200 140 0,5

6 50 130 1,0

7 200 130 1,0

8 50 140 1,0

9 200 140 1,0

10 50 135 0,75

11 200 135 0,75

12 100 130 0,75

13 100 140 0,75

14 100 135 0,5

15 100 135 1,0

16 100 135 0,75 Para cada una de las combinaciones efectuadas se obtuvo una masa de polvo a la cual se le midió su diámetro medio, porcentaje de rendimiento, de acuerdo a la cantidad de sólidos totales atomizados y la cantidad sólidos recuperados tras el proceso de secado y se observó mediante microscopía confocal para evaluar mediante una puntuación la distribución del polímero formador de corona y el polímero formador de núcleo.

La puntación asignado para las muestras observadas mediante microscopía confocal se conformó por valores de 1 a 4 donde 1 son los polímeros totalmente aparte uno de otro y 4 es la conformación corona-núcleo. Este parámetro buscó encontrar la relación ideal entre la solución formadora de núcleo y la solución formadora de corona; sin embargo, ninguna de las combinaciones realizadas en este diseño logró la conformación deseada, pero fue útil para determinar la proporción de componentes de matriz a utilizar para la formación de partículas a microescala. Como podemos ver en la Figura 4 donde 1) exceso de solución formadora de núcleo, 2) exceso de solución formadora de corona, 3) mezcla amorfa de soluciones, 4) conformación corona-núcleo.

Tabla 7: Resumen de resultados obtenidos para cada respuesta tras realizar el diseño de experimentos.

Respuestas evaluadas Intervalo de resultados obtenidos

Diámetros medios (pm) 2,68 a 14,7

% de recuperación 6,3 a 46,8

Score de distribución de polímeros 1 a 4

Tras realizar los experimentos requeridos se pudo observar que porcentaje de recuperación y la distribución de los polímeros en los microcarrier de nanopartículas fueron tan variables que no lograron los resultados esperados. La recuperación de sólidos una vez transcurrido el proceso de secado fue mucho menor a lo deseado, sin siquiera alcanzar la mitad de los sólidos totales lo cual impulsó a probar otras estrategias. Con respecto a la distribución de los polímeros observada con microscopía confocal, en ninguno de los casos se pudo apreciar la conformación corona-núcleo, por lo cual se buscó la manera de que ambas soluciones lograran incorporarse una dentro de la otra, lo cual derivó en el uso de tensioactivos para disminuir la tensión superficial de la solución formadora de corona, y permitir el ingreso de la solución formadora de núcleo. El diseño arrojó los siguientes resultados, de los diagramas de Pareto solo se obtuvo una respuesta que indicó que existían factores que influían de forma significativa. Este fue el caso de la recuperación, donde el factor concentración de solidos de quitosano, influye de forma directamente proporcional a la recuperación. También fue significativo el mismo factor al cuadrado, pero inversamente proporcional (Figura 5). Esto se correlacionó con la gráfica de efectos principales para la recuperación, donde se mostró un punto máximo en el valor medio de la concentración de solidos de quitosano (Figura 6), lo que explica que al aumentar la concentración de quitosano se aumenta la recuperación, pero solo hasta un punto limite (0,75%) pasado ese punto la recuperación comienza a caer llegando a tener una relación inversamente proporcional.

En cuanto a la optimización multirrespuesta (Figura 7) se obtuvo que la solución formadora de corona debía tener un 0,75% de sólidos de quitosano, ya que concentraciones menores y mayores disminuían de forma significativa la recuperación. Además de este diseño se extrajo que 50 mg de nanopartículas era la cantidad óptima para incorporar a la solución que conformaría el núcleo del microcarrier y que la temperatura de secado debía ser 140°C para mejores resultados, aunque estos dos últimos factores no influyeran de forma significativa.

Adoptando la información entregada por el diseño de experimentos en cuanto a temperatura, cantidad de nanopartículas y concentración de sólidos de quitosano, se ensayó agregar tensioactivos en la solución formadora de corona, como poloxámero 407 en diferentes concentraciones.

Al igual que en el diseño de experimentos se utilizó marcadores fluorescentes en las soluciones formadoras de corona y núcleo, con tal de observar la distribución obtenida en el microcarrier de nanopartículas. Gracias a la incorporación del surfactante en la solución formadora de núcleo fue posible obtener la conformación deseada y, por ende, se incorporó a la formulación definitiva (Figura 8).

Con el marcador fluorescente y la microscopía confocal fue posible observar las partículas en diferentes planos, haciendo cortes trasversales, así se pudo tener la certeza de que lo que se observaba era en tres dimensiones logrando obtener los perfiles de intensidad de marcadores a través de las partículas lo cual entrega información de su composición interna y externa (Figura 9). Además con esta técnica fue posible observar algunas características de la forma de estas partículas, tal como que eran esféricas de superficie ligeramente rugosa, ambas características deseables para un sistema de este tipo. Mediante microscopía óptica y el software Statgraphics centurión, fue posible obtener la distribución de tamaño del microcarrier la cual arrojó un diámetro medio de 3,77 pm con una desviación estándar de 1,5 pm (Figura 10).

La formulación definitiva del microcarrier de nanopartículas elaborado con boquilla de tres fluidos posee una conformación de núcleo y corona, cuya composición es 42,8% de quitosano como polímero de matriz el cual se encuentra en la corona, 28,6% de poloxámero 407 el cual solo está presente en el núcleo, y 28,6% de nanopartículas de PLGA cargadas con rhein que se encuentran en el núcleo del microcarrier. El proceso de secado tuvo una recuperación del 46,83%. En la Tabla 8 se pueden ver las condiciones de secado y parámetros de formulación para la elaboración de un lote de microcarrier de nanopartículas con corona y núcleo.

Tabla 8: Condiciones de secado y parámetros de formulación para elaboración del microcarrier de nanopartículas con boquilla de tres fluidos.

Condiciones y parámetros

Aspiración 90%

Temperatura secado 140° C

Flujo de bomba 2,5 mL/min ambas bombas

Gas atomización 473 L/hr

Pulsos de aire No hay pulsos

20 mL de agua con 100 mg de nanopartículas + 100

Solución formadora de núcleo

mg de poloxámero 407

Solución formadora de

20 mL de solución de quitosano 0,75% p/v

corona

Agitación de soluciones 100 rpm constante durante todo el secado.

Los perfiles de liberación obtenidos tras incubar al microcarrier de nanopartículas, las nanopartículas libres y al fármaco sin nanoencapsular, muestran que la cubierta del microcarrier retarda la liberación del fármaco. Específicamente, el fármaco libre a los 15 min se encontraba disuelto en un 80% aproximadamente y a los 30 min ya había alcanzado la disolución total. Cuando estaba nanoencapsulado a los 15 min se libera un 58 % y a los 30 min un 64 %, valor que se va incrementando alcanzando una liberación total a los 60 minutos. En el caso del microcarrier de nanopartículas cargadas con fármaco, la cesión del fármaco a los 15 min alcanzaba un 35% el cual fue incrementándose poco a poco durante la primera hora llegando a un

70% a los 60 min, lográndose la completa liberación del principio activo a las 18 horas de comenzado el estudio de liberación (Figura 11).