HE QIMING (CN)
| RU2434877C1 | 2011-11-27 |
MARCO, A.T.Z. ET AL.: "Brassinosteroid phytohormones-structure, bioactivity and applications", BRAZILIAN JOURNAL OF PLANT PHYSIOLOGY, vol. 14, no. 3, 31 December 2002 (2002-12-31), pages 143 - 181, XP001183868
| 权 利 要 求 书 1、 天然芸苔素内酯类似物的提取方法， 其包括， ( 1 )用 80~100% (V/V)乙醇水溶液提取破碎的油菜花粉， 固液分离后保留滤液（任 选其中滤液进一步浓缩）， 获得醇溶性提取液； (2) 将醇溶性提取液与 0~60% (V/V) 乙醇水溶液混合， 然后加入乙酸乙酯萃取， 保留乙酸乙酯层并加入酯酶和糖化酶进行不完全反应， 然后干燥， 获得酯溶性提取 物； (3)酯溶性提取物上样于硅胶色谱柱， 用甲醇和乙酸乙酯的混和液洗脱， 收集含有 天然芸苔素内酯类似物的洗脱液， 干燥并溶解于甲醇中， 获得硅胶柱纯化液； 和 (4)将硅胶柱纯化液上样于 C18反相色谱柱， 用乙腈和水的混和液洗脱， 分别收集 含有如式 BR6、 BRK BR2、 BR3、 BR4和 /或 BR5所示的天然芸苔素内酯类似物的 洗脱液： BR4 BR5o 2、 权利要求 1所述的提取方法， 其特征在于， 在步骤 （1 ) 中， 乙醇水溶液的浓度为 85~98% (V V),优选为 90~97% (V V), 更优选为 93~96% (V/V)， 最优选为 95% (V/V); 油菜花粉： 乙醇水溶液的重量体积比为 50~200克： 200~500mL， 优选为 80~150 克： 250~450mL， 更优选为 90~120克： 280~350mL， 最优选为 100克： 300mL; 步骤 （1 ) 进一步包括， 固液分离后得到的滤渣用 80~100% (V/V) 乙醇水溶液 提取， 然后进行固液分离， 保留滤液并与步骤 （1 ) 中获得的滤液合并； 浓缩是减压干燥浓缩， 优选为以 65~80°C和 0.08~0.09Mpa的真空度干燥浓缩， 最优选为以 75°C和 0.085Mpa的真空度干燥浓缩； 和 /或 醇溶性提取液：步骤（2)中的乙醇水溶液的体积比为 0.5~2： 1-3 ,优选为 0.8~1.5： 1.5-2.5, 最优选为 1： 2 o 3、 权利要求 1所述的提取方法， 其特征在于， 在步骤 （2) 中， 乙醇水溶液的浓度为 30~55% (V/V),优选为 40〜53% (V/V)， 更优选为 45~52% (V/V), 最优选为 50% (V/V); 乙醇水溶液: 乙酸乙酯的体积比为 1-3： 3-8, 优选为 1.5-2.5： 4-6, 最优选为 2: 步骤 （2) 进一步包括， 萃取后得到的非乙酸乙酯层加入乙酸乙酯萃取， 保留乙 酸乙酯层并与步骤 （2) 中获得的乙酸乙酯层合并； 酯酶是提取自细菌的酯酶， 而且糖化酶是提取自真菌的糖化酶； 不完全反应是在 35~42°C反应 0. 5-2小时， 优选是在 37〜41 °C反应 0. 75-1. 5小 时， 最优选在 40°C反应 1小时； 和 /或 干燥是减压干燥， 优选为以 65~80°C和 0.08~0.09Mpa的真空度干燥， 最优选为 以 75。C和 0.085Mpa的真空度干燥。 4、 权利要求 1所述的提取方法， 其特征在于， 在步骤 （3 ) 中， 硅胶色谱柱中的填料是 200~300目硅胶， 最优选是 300目硅胶； 混和液中甲醇： 乙酸乙酯的体积比为 3~8： 0.5-1.5, 优选为 4~7： 0.8-1.3, 最优 选为 5:1 ; 和 /或 干燥是减压干燥， 优选为以 65~80°C和 0.08~0.09Mpa的真空度干燥， 最优选为 以 75°C和 0.085Mpa的真空度干燥。 5、 权利要求 1所述的提取方法， 其特征在于， 在步骤 （4) 中， 混和液中乙腈： 水的体积比为 60~90： 10-40, 优选为 70〜80: 20-30, 最优选为 75:25； 和 /或 如式 BR6、 BR BR2、 BR3、 BR4和 /或 BR5所示的天然芸苔素内酯类似物的 纯度大于 90%， 优选大于 95%， 更优选大于 98%， 最优选大于 99%。 6、 农用组合物， 其是用分离的如式 BR6、 BRK BR2、 BR3、 BR4和 /或 BR5所示的 天然芸苔素内酯类似物同农学上可接受的辅料混合而成的， 优选农用组合物是成分 配比稳定的农用组合物。 7、 权利要求 6所述的农用组合物， 其中天然芸苔素内酯类似物是由权利要求 1~5之 任一所述的提取方法提取的， 更优选天然芸苔素内酯类似物的纯度大于 90%， 优选 大于 95%， 更优选大于 98%, 最优选大于 99%。 8、 分离的如式 BR6、 BRK BR2、 BR3、 BR4和 /或 BR5所示的天然芸苔素内酯类似 物在促进植物生长和 /或增强植物抗逆性中的应用， 和 /或， 在制备促进植物生长和 / 或增强植物抗逆性的农用组合物中的应用。 9、 权利要求 8所述的应用， 其中， 植物生长选自^ [物发育和植物发芽； 植物抗逆性选自植物抗低温性和植物抗高盐性； 和 /或 植物选自双子叶植物和单子叶植物， 优选选自水稻、 小麦、 玉米、 大豆和棉花， 更优选选自水稻、 玉米和大豆。 10、 权利要求 8或 9所述的农用组合物， 其中分离的如式 BR6、 BRK BR2, BR3、 BR4和 /或 BR5所示的天然芸苔素内酯类似物是分离的如式 BR6所示的天然芸苔素 内酯类似物。 |
本发明属于农用化学技术领域， 具体而言， 本发明涉及提取自植物的芸苔素内 酯类似物及其应用， 包括促进植物生长、 抗低温和耐高盐等方面的应用。 背景技术
芸苔素内酯是国际上公认为活性最高的高效、 广谱、 无毒的植物生长调节剂， 生理效益比已经发现的另外五大类植物激素高 ， 而被称为世界第六大类植物激素。 芸苔素内酯广泛存在于被子植物、 裸子植物和某些低等植物中， 从在植物体内的分 布来看， 存在于根、 茎、 叶、 花粉、 雌蕊、 果实和种子中， 如油菜花粉中含有较丰 富的芸苔素内酯。
化学合成的芸苔素内酯，如中国专利申请 CN1217337A、CN1217338A等所述的， 虽然产品较为均一， 但是活性成分单一， 长期施用效果通常不如天然芸苔素内酯好， 这在中国国内已经广泛使用的 28-表高芸苔素内酯上表现得尤为突出。
从植物 （如， 花粉） 或其他天然来源 （如， 蜂蜡） 中提取的芸苔素内酯， 其中 通常含有多种芸苔素内酯结构类似物， 其作为一种绿色的生产资料， 其推广使用更 容易为国内外用户所推崇， 但是由于提取中工艺的限制， 容易产生产品质量不稳定 的情况； 如果进一步提纯， 则制备成本上升较大， 不利于产业化实施， 因而阻碍了 人们进一步大量纯化， 并阻碍了人们去研究其中各芸苔素内酯类似物 是否具有芸苔 素内酯的活性。 例如， Zhu, W. M.等 （Synthetic Communications, 32(9)， 1385-1391 ) 和 Suksamaram, A.等 （Tetrahedron, 58， 6033-6037)合成了一些化合物， 但仅仅被 当成昆虫的蜕皮激素类似物而只启示其的昆虫 激素应用。
本发明人通过长期而艰苦的努力， 摸索出了从植物中提取（纯化）芸苔素内酯 类似物的稳定流程， 精心研究了其中的各种提取溶剂， 尽管其中需要一定的提纯过 程， 但是只需要一次提取过程， 最终可以收集到多种分离的高纯度的天然芸苔 素内 酯类似物， 因而摊薄了提纯的成本， 有利于产业化推广实施； 这些分离的天然芸苔 素内酯类似物可以单独施用， 也可以配比混和施用， 因而产品质量稳定而容易控制。 在获得了大量分离的高纯度的天然芸苔素内酯 类似物的基础上， 本发明人进一步研 究， 令人意外地发现了， 这些天然芸苔素内酯类似物在植物生物活性增 加、 抗低温 和耐高盐等方面均有效用， 甚至在一定条件下效果、 活性可以高于现有化学合成的 芸苔素内酯类产品。 发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供了新的天然 芸苔素内酯类似物的提取方法和 应用， 包括促进植物发育、 提高植物发芽率、 增加植物抗低温性和 /或增加植物耐髙 盐性的应用。 另外， 本发明还提供了配比稳定的农用组合物， 其中包含天然芸苔素 内酯类似物。
具体而言， 在第一方面， 本发明提供了天然芸苔素内酯类似物的提取方 法， 其包 括，
( 1 )用 80~100% (V/V)乙醇水溶液提取破碎的油菜花粉， 固液分离后保留滤液（任 选其中滤液进一步浓缩）， 获得醇溶性提取液；
(2) 将醇溶性提取液与 0~60% (V/V) 乙醇水溶液混合， 然后加入乙酸乙酯萃取， 保留乙酸乙酯层并加入酯酶进行不完全反应， 然后干燥， 获得酯溶性提取物；
(3 )酯溶性提取物上样于硅胶色谱柱， 用甲醇和乙酸乙酯的混和液洗脱， 收集含有 天然芸苔素内酯类似物的洗脱液， 干燥并溶解于甲醇中， 获得硅胶柱纯化液； 和
(4)将硅胶柱纯化液上样于 C18反相色谱柱， 用乙腈和水的混和液洗脱， 分别收集 含有如式 BR6、 BR1、 BR2、 BR3、 BR4和 /或 BR5所示的天然芸苔素内酯类似物的 洗脱液。
在本文中， "天然"指的是从所限定的物质是从天然来源 （如花粉、 蜂蜡等） 中 提取的。 在本发明的具体实施方式中， 所提供的芸苔素内酯类似物是从油菜花粉中。 当然， 由于已经解析了这些天然芸苔素内酯类似物， 因此它们不限于从天然来源（如 花粉、 蜂蜡等） 中提取， 也可以是化学合成的。
在本文中， 如式 BR6、 BR1、 BR2、 BR3、 BR4和 BR5所示的天然芸苔素内酯类 似物的结构式如下：
BR4 BR5。
以上天然芸苔素内酯类似物可以通过本发明的 具体实施方式所述的提取方法依 次洗脱， 其鉴定图谱分别如图 2八~图2？所示。 在本发明的具体实施方式中， BR1、 BR5和 /或 BR6是更优选的， 尤其是 BR6是最优选的。
在本发明第一方面的提取方法中， 在步骤 （1 ) 中， 可以使用 100% (V/V) 乙醇 水溶液（即， 纯乙醇）， 但优选乙醇水溶液的浓度为 85~98% (V/V)， 优选为 90~97% (V/V), 更优选为 93~96% (V/V), 最优选为 95% (V/V)。
在本发明第一方面的提取方法中， 在步骤 （1 ) 中， 破碎油菜花粉的方式一般是 用物理破碎方式， 包括超声破碎、 碾磨破碎等。
在本发明第一方面的提取方法中， 在步骤 （1 ) 中， 油菜花粉和乙醇水溶液的比 例可以优化， 比例过低， 将使用过量乙醇， 需要更高成本的浓缩； 比例过高， 则提 取不充分。 经本发明人研究， 优选在步骤 （1 ) 中， 油菜花粉： 乙醇水溶液的重量体 积比为 50~200克： 200~500mL， 优选为 80~150克： 250~450mL, 更优选为 90~120 克： 280~350mL， 最优选为 1Q0克： 300mL。 在步骤 （1 ) 中， 为了提取完全， 可以对提取后的滤渣进一步提取， 并如此反复 提取滤渣， 合并滤液。 因此优选在本发明第一方面的提取方法中， 步骤 （1 )进一步 包括， 固液分离后得到的滤渣用 80~100% (V/V)乙醇水溶液提取， 然后进行固液分 离， 保留滤液并与步骤 （1 ) 中获得的滤液合并。 该步骤可以步骤 （1 ) 的其他提取 步骤采用相同的条件， 而且该步骤固液分离后得到的滤渣可以进一步 采用与该步骤 相同的步骤提取 0~5次， 只要最后将所有滤液合并即可。
在步骤 （1 ) 中， 滤液或者合并的滤液， 体积过大， 则不利于以后步骤的萃取效 率。 因此优选在本发明第一方面的提取方法中， 在步骤 （1 ) 中， 滤液进一步浓缩。 浓缩是减压干燥浓缩， 优选为以 65~80'C和 0.08~0.09Mpa的真空度干燥浓缩， 最优 选为以 75°C和 0.085Mpa的真空度干燥浓缩。浓缩后， 优选醇溶性提取液： 步骤（2) 中的乙醇水溶液的体积比为 0.5~2： 1〜3， 优选为 0.8~1.5： 1.5-2.5, 最优选为 1 : 2。
在本发明第一方面的提取方法中， 在步骤（2) 中， 可以使用 0% (V/V) 乙醇水 溶液（即，纯水），但优选乙醇水溶液的浓度 为 30~55%(V/V)，优选为 40~53%(V/V)， 更优选为 45~52% (V/V)， 最优选为 50% (V/V)o
在本发明第一方面的提取方法中， 在步骤 （2) 中， 加入的乙酸乙酯的量可以优 化。 经本发明人研究， 优选在步骤（2) 中， 乙醇水溶液： 乙酸乙酯的体积比为 1~3： 3〜8， 优选为 1.5~2.5： 4-6, 最优选为 2: 5。
在步骤 （1 ) 中， 为了萃取完全， 可以对萃取后的非乙酸乙酯层 （即， 分离了乙 酸乙酯层后剩余的层） 进一步提取， 并如此反复萃取非乙酸乙酯层， 合并乙酸乙酯 层。 因此优选在本发明第一方面的提取方法中， 步骤 （2)进一步包括， 萃取后得到 的非乙酸乙酯层加入乙酸乙酯萃取， 保留乙酸乙酯层并与步骤（2) 中获得的乙酸乙 酯层合并。 萃取可以进行 1~8次， 优选为 2~5次。
优选在本发明第一方面的提取方法中， 在步骤 （2) 中， 酯酶， 也称脂肪酶， 能 水解甘油三酯或脂肪酸脂产生单或双甘油酯和 游离脂肪酸。 这样的酶本身己经在食 品领域广泛应用。 脂肪酶优选是提取自细菌的酯酶， 如可以是能够从市场购买获取 的脂肪酶， 也可以是直接从细菌（如， 荧光假单胞菌， 优选是 CGMCC No.1.867 (即 AS 1.867) 菌株） 中提取的酯酶 （如参见中国专利申请 200810046182.0)。
优选在本发明第一方面的提取方法中， 在步骤 （2) 中， 糖化酶， 也称葡萄糖淀 粉酶， 能将淀粉链转化为葡萄糖。 这样的酶本身已经在酿造领域广泛应用。 糖化酶 优选是提取自真菌的糖化酶， 如可以是能够从市场购买获取的糖化酶， 也可以是直 接从真菌 （如黑曲霉） 中提取的糖化酶。
在本文中， "不完全反应"指的是使酶反应的底物在全部转 前终止反应， 由此 保持天然芸苔素内酯类以物的多样性。 通常完全反应要进行 3 小时以上， 因此优选 在本发明第一方面的提取方法中，在步骤 (2)中，不完全反应是在 35~42°C反应 0. 5-2 小时， 优选是在 37~41 °C反应 0. 75-1. 5小时， 最优选在 40°C反应 1小时。
优选在本发明第一方面的提取方法中， 在步骤 （2) 中， 干燥是减压干燥， 优选 为以 65~80°C和 0.08~0.09Mpa的真空度干燥， 最优选为以 75°C和 0.085Mpa的真空 度干燥。
本发明人发现，初步的提纯以硅胶色谱柱为宜 ，只需要根据洗脱速度来设置收集 的起始和终止时间即可全面收集多种天然芸苔 素内酯类似物， 简便易行。 优选在本 发明第一方面的提取方法中， 在步骤（3 ) 中， 硅胶色谱柱中的填料是 200~300目硅 胶， 最优选是 300目硅胶。
在步骤 （3 ) 中， 潜在可以选择的洗脱液种类繁多， 经本发明人研究， 发现用甲 醇和乙酸乙酯的混和液洗脱， 产物较稳定。 优选在本发明第一方面的提取方法中， 在步骤 （3 ) 中， 混和液中甲醇： 乙酸乙酯的体积比为 3~8： 0.5-1.5, 优选为 4~7： 0.8-1.3 , 最优选为 5:1。
优选在本发明第一方面的提取方法中， 在步骤 （3 ) 中， 干燥是减压干燥， 优选 为以 65~80'C和 0.08~0.09Mpa的真空度干燥， 最优选为以 75'C和 0.085Mpa的真空 度干燥。
在步骤 （4) 中， 潜在可以选择的洗脱液种类繁多， 经本发明人研究， 发现用乙 腈和水的混和液洗脱， 可以有效分离各种天然芸苔素内酯类似物。 优选在本发明第 一方面的提取方法中， 在步骤（4)中， 混和液中乙腈： 水的体积比为 60~90： 10-40, 优选为 70~80： 20-30, 最优选为 75:25。
用本发明第一方面的提取方法提取的天然芸苔 素内酯类似物是高纯度的。优选在 本发明第一方面的提取方法中， 在步骤（4) 中， 如式 BR6、 BR1、 BR2、 BR3、 B 4 和 /或 BR5所示的天然芸苔素内酯类似物的纯度大于 90%，优选大于 95%，更优选大 于 98%， 最优选大于 99%。
在第二方面， 本发明提供了农用组合物，其是用分离的如式 BR6、 BR1、 BR2、 BR3、 BR4和 /或 BR5所示的天然芸苔素内酯类似物同农学上可接 受的辅料混合而成的。 在本文中， "农学上可接受的辅料"指的是不千扰、 甚至能增强天然芸苔素内酯 类似物起效的农用辅料， 包括赋形剂、 稀释剂、 乳化剂、 P H调节剂等。 在本发明的 具体实施方式中， 农学上可接受的辅料是水。
优选在本发明第二方面的农用组合物宁，天然 芸苔素内酯类似物是由本发明第一 方面的提取方法提取的， 更优选天然芸苔素内酯类似物的纯度大于 90%， 优选大于 95%, 更优选大于 98%， 最优选大于 99%。 在本文中， "分离的"指的是天然芸苔素内酯类似物脱离了 者曾经脱离了天然 存在的环境而以高于 50%的纯度存在或者存在过。尽管天然芸苔素内 酯类似物可以重 新混合入混合物中从而降低了它本身的纯度， 但是曾经的高纯度， 便于使得各批次 产品稳定。 优选本发明第二方面的农用组合物是成分配比 稳定的农用组合物。 在本 文中， "配比稳定"指的是不同批次产品中天然芸苔素 酯类似物的组成和含量是 相同的。 由于本发明第一方面的提取方法能够将天然芸 苔素内酯类似物分离， 因此 可以单独使用或者重新配比使用， 完全能够做到配比稳定。 在本发明的具体实施方 式中，天然芸苔素内酯类似物的含量介于 0. 0001-0. lppm,优选介于 0. 0005-0. 05ppm, 如为 0. 005ppm。 如式 BR6、 BR1、 BR2、 BR3、 BR4和 BR5所示的天然芸苔素内酯类似物 可以单独使用， 也可以混合使用， 混合使用时， BR1 : BR2: BR3: BR4: BR5和 BR6的 重量比可以为 0.01~100： 0.01-100： 0.01-100： 0.01-100： 0.01-100： 0.01-100, 在本 发明的具体实施方式中， BR1 : BR2: BR3: BR4: BR5和 BR6的重量比为 0. 4: 0. 4： 0. 4： 0. 4： 0. 4： 98。
在第三方面， 本发明提供了分离的如式 BR6、 BR1、 BR2、 BR3、 BR4和 /或 BR5 所示的天然芸苔素内酯类似物在促进植物生长 和 /或增强植物抗逆性中的应用；另外, 本发明也提供了分离的如式 BR6、 BR1、 BR2、 BR3、 BR4和 /或 BR5所示的天然芸 苔素内酯类似物在制备促进植物生长和 /或增强植物抗逆性的农用组合物中的应用。
优选在本发明第三方面的应用中， 植物生长选自植物发育和植物发芽； 和 /或， 植物抗逆性选自植物抗低温性和植物抗高盐性 。 根据本发明的具体实施方式， 这些 优异性质在双子叶植物和 /或单子叶植物上得到了体现。
优选在本发明第三方面的应用中，植物选自双 子叶植物和单子叶植物，优选选自 水稻、 小麦、 玉米、 大豆和棉花， 更优选选自水稻、 玉米和大豆。 本发明取得的优异效果在于， 提取（纯化）流程稳定； 一次提取， 最终可以收集 到多种分离的高纯度的天然芸苔素内酯类似物 ， 因而摊薄了成本； 多种分离的天然 芸苔素内酯类似物可以单独施用， 也可以配比混和施用， 产品质量稳定而容易控制； 多种芸苔素内酯类似物在植物生物活性增加、 抗低温和耐高盐等方面均有效用， 甚 至在一定条件下效果、 活性高于现有化学合成的芸苔素内酯类产品。 为了便于理解， 以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行 详细地描述。 需 要特别指出的是， 具体实例和附图仅是为了说明， 并不构成对本发明范围的限制。 显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明 ， 在本发明的范围内对本发明做出各 种各样的修正和改变， 这些修正和改变也纳入本发明的范围内。 另外， 本发明引用 了公开文献， 这些文献也是为了更清楚地描述本发明， 它们的全文内容均纳入本发 明进行参考， 就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复 叙述过一样。 附图说明
图 1显示了天然芸苔素内酯类似物的纯化图谱。
图 2显示了各天然芸苔素内酯类似物的质谱鉴定 谱。 具体实施方式
实施例 1 天然芸苔素内酯类似物的提取和鉴定 取油菜花粉 100克， 加入 95% (V/V)乙醇 300mL， 超声破碎， 过滤， 保留滤液； 滤渣加入 95% (V/V) 乙醇 300mL， 超声破碎， 过滤， 保留滤液。 合并滤液， 于 75 °C、 0.085Mpa的真空度干燥浓缩至体积为 lOOmL, 得花粉醇提液。
将 50% (V/V) 乙醇 200mL加到花粉醇提液中， 混合均匀， 然后加入 500mL乙 酸乙酯萃取， 保留上层 （乙酸乙酯层）； 下层继续加入 500mL 乙酸乙酯萃取， 保留 上层 （乙酸乙酯层）。 合并乙酸乙酯层， 加入 3Q0mL酶液 （即， 脂肪酶与糖化酶的 混合酶液， 其中脂肪酶（购自济宁和美生物工程有限公司 ） 2500U/L, 糖化酶（购自 济宁和美生物工程有限公司） 2000U/L) 于 40°C搅拌 （45rpm) 处理 1小时， 然后于 75°C、 0.085Mpa的真空度干燥， 得酯溶性提取物。
取酯溶性提取物上样于硅胶色谱柱（2.6cmX40cm 300目硅胶），加流动相（即， 甲醇和乙酸乙酯的混和液， 甲醇： 乙酸乙酯的体积比为 5:1 )洗脱， 控制流速为 4ml/ 分钟， 收集第 40分钟至第 150分钟流出的洗脱液， 合并后于 75°C、 0.085Mpa的真 空度干燥完全， 溶解于 10mL甲醇中， 得硅胶柱纯化液。
然后，将硅胶柱纯化液上样于 C18反相色谱柱 (柱参数为 50mmX25cm， 5 μ m)， 加流动相 （即， 乙腈和水的混和液， 乙腈： 水的体积比为 75:25 ) 洗脱， 控制流速为 lOml/min, 洗脱图谱如图 1 所示， 其中标明了各天然芸苔素内酯类似物的峰及其 洗 脱时间，可以在各洗脱时间分别收集相应的天 然芸苔素内酯类似物 (BR6、BR1、BR2、
BR3、 BR4、 BR5) o 上述提取流程的稳定性好， 综合效率高， 能够一次获得上述 6 种天然芸苔素内酯类似物。
收集天然芸苔素内酯类似物 BR1、 BR2、 BR3、 BR4、 BR5和 BR6, 用高分辨率 质谱验证 （BR1的质谱图谱如图 2A所示， BR2的如图 2B所示， BR3的如图 2C所 示， BR4的如图 2D所示， BR5的如图 2E所示， BR6的如图 2F所示） 正确， 各类 似物纯度均高于 99%， 然后委托四川大学分析测试中心根据标准方法 （质谱分析 (GB/T 6041-2002)、 红外光谱分析 （GB/T6040-2002)、 超导脉冲傅里叶变换核磁共 振谱（JY/T 007-1996) 和分子吸收分光光度分析 （GB/T 9721-2006))进行测试， 解 析出各天然芸苔素内酯类似物的如下化学结构 ：
BR1 : BR2:
BR3: BR4:
BR5: BR6:
实施例 2 天然芸苔素内酯类似物的增强植物发育的测定 我们通过水稻叶片弯曲试验， 测量水稻叶片倾斜角来测定天然芸苔素内酯类 似物 对植物发育的增强作用。 水稻叶片倾斜角越大， 发育的作用越强。 具体试验过程如 下：
分别取实施例 1制备的天然芸苔素内酯类似物 BR1、 BR2、 BR3、 BR4、 BR5和 BR6， 另外将 BR1、 BR2、 BR3、 BR4、 BR5和 BR6混和成混和芸苔素类似物（简称 为 " BR混"； 其中 BR1 : BR2: BR3: BR4: BR5和 BR6的重量比为 0.4: 0.4： 0.4： 0.4： 0.4： 98),分别溶于 95% (V/V)乙醇中，然后用大量的纯水梯度稀释至 1 mg/L 、 0.1mg/L、 0.01mg/L 0.001 mg/L和 0.0001 mg/L; 同时用纯水作为对照。
用 5%次氯酸钠溶液将水稻种子消毒处理后， 用蒸馏水漂洗至碱性， 置于培养皿 中， 放在 30°C ±2°C 的恒温箱中黑暗环境下水培 9天。 然后， 取出该 9天龄的水稻 黄化苗， 以第二片叶片基部为中心， 切取含叶片及叶鞘长各 lcm的切断叶片， 漂浮 于蒸馏水中， 置于黑暗环境中， 在 30°C ±2°C的恒温培养箱中培养 24小时， 取出用 滤纸吸于水分。 吸干水分的叶片段分别浸入上述含不同浓度的 天然芸苔素内酯类似 物的溶液或纯水中， 每种溶液或纯水中放入采自 20株水稻的切断叶片， 在黑暗环境 中以 30°C ±2°C的恒温箱中培育 48小时。 然后， 用量角器对水稻幼苗的切断叶片进 行测量， 测量第二叶与叶鞘之间的倾斜角度。结果如表 2-1所示， 各天然芸苔素内酯 类似物及其混和物均相对于对照， 具有明显的增强水稻叶片倾斜效应的作用， 均具 有植物生长调节活性； 而且该效应的增强与天然芸苔素内酯类似物及 其混和物的浓 度基本成正相关关系，其中在高浓度下， BR1、 BR5、 BR6和 BR混的活性强于 BR2、 BR3和 BR4的。
表 2-1 天然芸苔素内酯类似物对水稻叶片倾斜的倾斜 效应 ~~ #1 浓度 （mg/1) 总角度数 (度) S 平均角度数 (度）
BR! 0.0001 ϊθόϋ 20 5J4 0.001 225.4 20 11.27
0.01 421 20 21.05
0.1 725 20 36.25
1 2215 20 110.75
0.0001 80.5 20 4.025
0.001 145.6 20 7.28
BR2 0.01 265 20 13.25
0.1 423 20 21.15
1 1425 20 71.25
0.0001 76.8 20 3.84
0.001 136 20 6.8
BR3 0.01 243 20 12.15
0.1 420 20 21
1 1306 20 65.3
0.0001 76 20 3.8
0.001 130 20 6.5
BR4 0.01 245 20 12.25
0.1 428 20 21.4
1 1280 20 64
0.0001 78 20 3.9
0.001 186 20 9.3
BR5 0.01 401 20 20.05
0.1 700 20 35
1 2200 20 110
0.0001 85 20 4.25
0.001 142 20 7.1
BR6 0.01 460 20 23
0.1 710 20 35.5
1 2180 20 109
0.0001 70 20 3.5
0.001 125 20 6.25
BR混 0.01 430 20 21.5
0.1 690 20 34.5
1 2090 20 104.5
对照 20.5 20 1.025 实施例 3天然芸苔素内酯类似物赋予植物抗低温胁迫 性的测定 我们通过低温胁迫实验，测量水稻苗低温胁迫 后的株高、叶数、叶面积、分蘖数、 根数等参数， 来全面反映天然芸苔素内酯类似物对植物抗低 温活性的作用。
分别取实施例 1制备的天然芸苔素内酯类似物 BR1、 BR2、 BR3、 BR4、 BR5和 BR6，分别溶于 95%(V/V)乙醇中，然后用大量的纯水梯度稀释至 1 mg/L 、 0.1mg/L、 0.01mg/L 0.001 mg/L和 0.0001 mg/L; 同时用纯水作为对照。
用 5%次氯酸钠溶液将水稻种子消毒处理后， 用蒸馏水漂洗至碱性， 置于培养皿 中， 放在 30'C ±2°C 的恒温箱中黑暗水培 9天。然后， 取出该 9天龄的水稻黄化苗， 分别在 TC、 2°C、 3°C、 4°C和 5'C温度下， 用上述含不同浓度的天然芸苔素内酯类 似物的溶液或纯水浸泡培养 24h， 测量第 3天、 6天、 9天和 12天的株高、 叶面积、 根重以及第 12天的叶数、 分蘖数等参数。 结果如表 3-0~3-6所示， 各天然芸苔素内 酯类似物均相对于对照， 能够在低温情况下， 具有明显的增加水稻株高、 叶面积和 根重的作用， 均具有赋予植物抗低温胁迫的活性； 而且该作用的增加与天然芸苔素 内酯类似物的浓度基本成正相关关系， 其中 BR1、 BR5和 BR6的活性略强于 BR2、 BR3和 BR4。
表 3-0 纯水对照的试验结果
样品 浓 度 温 度 株高 (cm) 叶数 叶面积 （cm2) 分 根重 （g)
(mg 1) (。c ) 蘖
数
1 6.6/6.7/6.8/7 3 9.8/11/11.2/12 3 2.8/3.1/3.3/3.8
2 6.6/6.8/6.9/7.1 3 10/11.1/12/12.3 3 2.8/3.0/3.2/3.9 对照 3 6.8/6.9/6.9/7.2 3 10.4/12/12.6/13.2 2 2.5/2.6/2.9/2.9
4 6.8/6.9/7.1/7.3 3 9.6/10.7/11.9/12.4 2 2.4/2.4/2.5/2.6
5 7.0/7.3/7.4/7.7 3 10.1/11.6/12.4/13 2 2.4/2.5/2.5/2.7 注： 表格中斜线划分的数据依次为第 3天、 6夭、 9天和 12天测量的数据。
表 3-1 BR1增强水稻抗低温胁迫性的试验结果
样品 浓 度 温 度 株高 (cm) 叶数 叶面积 （cm2 ) 分 根重 (g)
(mg 1) ( Ό ) 蘖
数
BR 1 1 7.1/7.2/7.3/7.4 3 10/11.2/12.4/13 3 2.8/3.1/3.4/3.9
2 7.1/7.2/7.3/7.5 3 10.2/11.7/12.6/13 3 2.8/3.0/3.2/3.9
0.000
3 7.1/7.2/7.5/7.6 3 10.4/12/12.6/13.2 2 2.5/2.6/2.9/2.9
1
4 7.1/7.3/7.5/7.7 3 10.6/12.2/13/13.4 2 2.5/2.6/2.9/2.9
5 7.2/7.4/7.5/7.8 3 10.6/12.4/13.6/14 2 2.6/2.8/2.9/3.0
0.001 1 6.9/7.1/7.3/7.3 3 10.1/11.3/12.6/13 3 2.8/3.1/3.4/3.9 2 6.9/7.1/7.2/7.3 3 10.3/11.8/12.6/13.1 3 2.8/3.0/3.2/3.9
3 7/7.1/7.4/7.3 3 10.4/12/12.6/13.2 2 2.5/2.6/2.9/2.9
4 7.1/7.3/7.5/7.7 3 10.6/12.4/13.1/13.5 2 2.5/2.6/2.9/2.9
5 7.5/7.7/7.9/8.2 3 10.7/14.6/16.4/17 3 2.8/2.9/3.0/3.7
1 6.9/7.2/7.3/7.4 3 10.1/11.9/12.9/13.6 3 2.8/3.0/3.4/3.9
2 6.9/7.2/7.3/7.5 3 10.3/11.8/12.8/13.4 3 2.8/3.0/3.1/3.2
0.01 3 7/7.2/7.4/7.6 3 10.4/12/12.6/13.2 2 2.5/2.6/2.9/2.9
4 · 7.1/7.3/7.5/7.8 3 10.8/12.4/13.4/13.7 2 2.5/2.6/2.9/3.0
5 7.7/7.8/8.2/8.5 4 10.9/13.9/17.4/18 3 2.8/3.0/3.4/3.9
1 7.0/7.2/7.3/7.5 3 10.1/11.9/12.9/13.4 3 2.8/3.0/3.4/3.6
2 7.1/7.2/7.3/7.4 3 10.4/11.8/12.8/13.6 3 2.9/3.0/3.1/3.2
0.1 3 7.2/7.3/7.4/7.6 3 10.5/12/12.8/13.4 2 2.5/2.6/2.9/2.9
4 7.1/7.4/7.5/7.7 3 10.8/12.5/13.5/13.8 2 2.5/2.7/2.9/3.1
5 7.7/7.9/8.4/8.7 3 11.1/13.9/17.8/19 2 2.9/3.2/3.5/4.1
1 7.1/7.2/7.3/7.4 3 10/11.2/12.4/13 3 2.8/3.1/3.4/3.9
2 7.1/7.2/7.3/7.5 3 10.2/11.7/12.6/13 3 2.8/3.0/3.2/3.9
1 3 7.1/7.2/7.5/7.6 3 10.4/12/12.6/13.2 2 2.5/2.6/2.9/2.9
4 7.1/7.5/7.6/7.7 3 10.9/12.6/13.7/14 2 2.5/2.7/3.0/3.2
5 7.7/8.0/8.6/8.9 3 11.1/13.6/18.4/20 2 2.9/3.5/3.7/4.5 注： 表格中斜线划分的数据依次为第 3天、 6天、 9天和 12天测量的数据。
表 3-2 BR2增强水稻抗低温胁迫性的试验结果
样品 浓 度 温 度 株髙 (cm) 叶数 叶面积 （cm2) 分 根重 （g)
(mg 1) (。C )
数
BR 2 1 6.8/6.9/7 /7.2 3 9.8/11.2/12.4/13.1 3 2.8/3.1/3.4/3.9
2 6.8/7/7.1/7.4 3 10/11.7/12.4/13 3 2.8/3.0/3.2/3.9
0.000
3 6.9/7.2/7.4/7.5 3 10/11.8/12.3/13.2 2 2.5/2.6/2.9/2.9
1
4 6.9/7.3/7.5/7.6 3 10/11.7/13/13.4 2 2.5/2.6/2.9/2.9
5 7.0/7.4/7.5/7.7 3 10.2/12/13.6/14 2 2.5/2.7/2.9/3.0
1 6.9/7.1/7.1/7.3 3 10.1/11.3/12.6/13 3 2.8/3.1/3.4/3.9
2 6.9/7.1/7.1/7.3 3 9.8/11.6/12.1/13.1 3 2.8/3.0/3.2/3.9
0.001 3 7/7.1/7.3/7.4 3 10/12/12.4/13 2 2.5/2.6/2.9/2.9
4 7.1/7.3/7.5/7.5 3 10/12.1/13/13.5 2 2.5/2.6/2.9/2.9
5 7.2/7.5/7.8/8 3 10.2/14/15.4/16 3 2.8/2.9/3.0/3.7
0.01 1 7.0/7.2/7.4/7.5 3 10.1/11.6/12.4/13,6 3 2.8/3.0/3.4/3.9
2 7.1/7.2/7.5/7.5 3 10.1/11.1/12.5/13.4 3 2.8/3.1/3.1/3.2
3 7.1/7.2/7.7/7.9 3 10.2/12/12.6/13.2 2 2.5/2.6/2.9/2.9
4 7.1/7.5/7.7/7.8 3 10.8/12.4/13.2/13.5 2 2.5/2.6/2.9/3.0 5 7.4/7.6/8/8.2 4 10.3/13.1/16.4/17 3 2.8/3.0/3.4/3.9
1 7.0/7.2/7.3/7.4 3 10.1/11 /12.1/13.4 3 2.8/3.0/3.4/3.6
2 7.1/7.3/7.3/7.4 3 10.4/11.2/12.6/13.6 3 2.8/3.0/3.1/3.2
0.1 3 7.4/7.4/7.8/7.9 3 10.5/12/12.6/13.4 2 2.5/2.7/2.9/2.9
4 7.5/7.5/8/8.1 3 10.8/12.1/13.4/13.8 2 2.5/2.7/2.9/3.1
5 7.5/7.6/8.1/8.3 3 11/12.9/16.8/19 2 2.9/3.2/3.5/4.1
1 7.2/7.3/7.3/7.9 3 10/11.2/12.4/13 3 2.6/3.1/3.2/3.7
2 7.2/7.2/7.3/8 3 10.2/11.7/12.6/13 3 2.6/3.0/3.2/3.7
1 3 7.4/7.5/7.9/8.1 3 10.4/12/12.1/13.2 2 2.5/2.6/2.9/2.9
4 7.4/7.5/8.0/8.2 3 10.9/12.6/13.2/14 2 2.5/2.7/3.0/3.2
5 7.4/7.7/8.2/8.4 3 11.1/13.1/18/20 2 2.9/3.5/3.7/4.5 注： 表格中斜线划分的数据依次为第 3天、 6天、 9天和 12天测量的数据。
表 3-3 BR3增强水稻抗低温胁迫性的试验结果
样品 浓 度 温 度 株高 (cm) 叶数 叶面积 （cm2) 分 根重 （g) (mg/1) ( Ό )
数
BR 3 1 6.8/6.9/7.1 /7.2 3 9.8/11 /12.2/13.1 3 2.8/3/3.4/3.9
2 6.8/7/7.1/7.4 3 10/11.7/12.1/13 3 2.8/3.0/3.2/3.9
0.000
3 6.9/7.1/7.4/7.5 3 10/11.8/12.1/13.2 2 2.5/2.6/2.9/2.9 1
4 6.9/7.3/7.5/7.5 3 10/11.5/13/13.4 2 2.5/2.6/2.9/2.9
5 7.0/7.4/7.5/7.7 3 10.2/12/13.4/14 2 2.5/2.5/2.9/3.0
1 6.9/7.1/7.1/7.3 3 10/11.3/12.6/13 3 2.8/3.1/3.2/3.9
2 6.9/7.1/7.1/7.3 3 9.8/11.6/12/13.1 3 2.8/3.0/3.1/3.9
0.001 3 7/7.2/7.3/7.4 3 10/12/12.2/13 2 2.5/2.7/2.9/2.9
4 7.1/7.3/7.4/7.5 3 10/12 /13/13.1 2 2.5/2.6/2.9/2.9
5 7.2/7.5/7.8/7.9 3 10.2/14/15.4/16 3 2.8/2.9/3.0/3.7
1 7.0/7.1/7.4/7.5 3 10/11.6/12.4/13.6 3 2.8/3.0/3.1/3.9
2 7.1/7.2/7.4/7.5 3 10.1/11/12.5/13.4 3 2.8/3.1/3/3.2
0.01 3 7.1/7.3/7.5/7.8 3 10.2/12/12.1/13.2 2 2.5/2.7/2.9/2.9
4 7.1/7.4/7.7/7.8 3 10.8/12.4/13/13.5 2 2.5/2.6/2.9/3.0
5 7.4/7.6/7.8/8.2 4 10.3/13.1/16.4/17 3 2.8/3.0/3.4/3.9
1 7.1/7.2/7.3/7.4 3 10.1/11 /12.1/13.1 3 2.8/2.9/3.4/3.6
2 7.1/7.3/7.3/7.4 3 10.4/11.2/12.6/13.2 3 2.8/3.0/3/3.2
0.1 3 7.3/7.4/7.8/7.9 3 10.5/12/12.1/13.4 2 2.5/2.7/2.7/2.9
4 7.4/7.4/7.8/8.1 3 10.8/12/13.4/13.4 2 2.5/2.7/2.9/3.1
5 7.5/7.5/8/8.1 3 11/12.1/16.2/17.9 2 2.9/3.2/3.5/4.1
1 1 7.2/7.2/7.3/7.9 3 10/11/12.4/13 3 2.6/3.1/3.1/3.7
2 7.2/7.2/7.4/8 3 10.2/11.7/12/13 3 2.6/3.0/3.2/3.7 3 7.4/7.5/7.7/8.1 3 10.4/12/12/13.2 2 2.5/2.6/2.7/2.9
4 7.4/7.5/7.8/8.2 3 10.9/12/13.2/14 2 2.5/2.7/3.0/3.2
5 7.4/7.5/8.2/8.3 3 11.1/13.1/18/20 2 2.9/3.5/3.7/4.5 注： 表格中斜线划分的数据依次为第 3天、 6天、 9天和 12天测量的数据。
表 3-4 BR4增强水稻抗低温胁迫性的试验结果
样品 浓 度 温 度 株髙 (cm) 叶数 叶面积 （cm2) 分 根重 （g)
(mg/1) (。C )
数
1 6.8/6.9/7 /7.2 3 9.8/11 12.2/13 3 2.8/3/3.1/3.5
2 6.8/7/7.1/7.2 3 10/11.7/12/13 3 2.8/3.0/3.2/3.7
0.000
3 6.9/7.1/7.4/7.4 3 10/11.8/12.1/13 2 2.5/2.6/2.9/2.9 1
4 6.9/7.1/7.5/7.5 3 10/11.5/13/13.4 2 2.5/2.6/2.9/2.9
5 7.0/7.3/7.5/7.6 3 10.2/12/13/13.4 2 2.5/2.5/2.9/2.9
1 6.9/7/7.1/7.4 3 10/11.3/12.6/13.6 3 2.8/3.1/3.2/3.7
2 6.9/7/7.1/7.3 3 9.8/11.6/12/13.1 3 2.8/3.0/3/3.9
0.001 3 7/7.2/7.4/7.5 3 10/12/12.2/13 2 2.5/2.6/2.9/2.9
4 7.1/7.3/7.4/7.5 3 10/12 /13/13.1 2 2.5/2.6/2.9/2.9
5 7.2/7.4/7.4/7.9 3 10.2/14/15.4/16 3 2.8/2.9/3.0/3.7
1 6.7/7.1/7.4/7.5 3 9.2/11.6/12.4/13.6 3 2.8/3.0/3.1/3.9
2 7/7.2/7.4/7.5 3 10/11/12.5/13.4 3 2.8/3/3/3.2
BR 4
0.01 3 7/7.3/7.5/7.8 3 10.2/12/12.1/13.2 2 2.5/2.6/2.9/2.9
4 7/7.4/7.7/7.8 3 10.8/12.4/13/13.5 2 2.5/2.7/2.9/3.0
5 7.2/7.4/7.8/8.2 4 10.3/13.1/16.4/17 3 2.8/3.0/3.4/3.9
1 7.1/7.2/7.3/7.3 3 10/11 /12.1/13.1 3 2.8/2.9/3.3/3.6
2 7.1/7.1/7.3/7.4 3 10.2/11.2/12.6/13.2 3 2.8/3.1/3.1/3.2
0.1 3 7.3/7.4/7.8/7.9 3 10.5/12/12.1/13.4 2 2.5/2.7/2.7/2.9
4 7.3/7.4/7.8/8 3 10.6/12/13.2/13.4 2 2.5/2.6/2.9/3.1
5 7.4/7.5/8/8.1 3 11/12.1/16.2/17.8 2 2.9/3.1/3.5/4.1
1 6.8/7/7.1/7.7 3 10/11/12.4/13 3 2.6/3.1/3.2/3.7
2 7/7.2/7.4/8 3 10.1/11.7/12/13 3 2.55/3.0/3.2/3.7
1 3 7/7.5/7.7/8.1 3 10.4/12/12/13.2 2 2.5/2.6/2.6/2.9
4 7.3/7.5/7.8/8.2 3 10.7/12/13.2/14 2 2.5/2.7/3.0/3.2
5 7.4/7.4/8.1/8.3 3 11.1/13/18/20 2 2.9/3.5/3.7/4.5 注- 表格中斜线划分的数据依次为第 3天、 6天、 9天和 12天测量的数据。
表 3-5 BR5增强水稻抗低温胁迫性的试验结果
样品 浓 度 温 度 株高 （cm) 叶数 叶面积 （cm2) 分 根重 （g)
(mg/1) ( °C ) 数
1 6.8/6.9/7 /7.2 3 9.8/11.2/12/13.1 3 2.8/3.1/3.4/3.6
2 6.8/7/7.1/7.4 3 10/11.7/12.4/13 3 2.8/3.0/3.2/3.4
0.000
3 6.9/7.2/7.4/7.5 3 10/11.8/12.3/13.2 2 2.5/2.6/2.9/2.9 1
4 6.9/7.3/7.5/7.6 3 10/11.7/13/13.4 2 2.5/2.6/2.7/2.9
5 7.0/7.2/7.5/7.7 3 10.2/12/13.2/14 2 2.5/2.7/2.9/3.0
1 6.9/7.1/7.2/7.3 3 10.1/11.3/12.8/13 3 2.8/3.1/3.3/3.9
2 6.9/7.1/7.3/7.3 3 9.8/11.6/12.2/13.1 3 2.8/3.0/3.2/3.9
0.001 3 7/7/7.3/7.4 3 10/12/12.4/13 2 2.5/2.6/2.9/2.9
4 7.1/7.3/7.5/7.5 3 10/12.1/13/13.5 2 2.5/2.6/2.9/2.9
5 7.2/7.5/7.6/8 3 10.2/14/15.4/16 3 2.8/2.9/3.0/3.4
1 7.0/7.2/7.3/7.5 3 10.1/11.6/12/13.6 3 2.8/3.0/3.1/3.9
2 7.1/7.2/7.5/7.5 3 10.1/11.1/12.1/13.4 3 2.8/3/3/3.2
BR 5
0.01 3 7.1/7.2/7.5/7.9 3 10.2/12/12.2/13.2 2 2.5/2.6/2.7/2.9
4 7.1/7.5/7.6/7.8 3 10.8/12.4/13.1/13.5 2 2.5/2.6/2.9/3.0
5 7.4/7.4/8/8.2 4 10.3/13.1/16.4/17 3 2.8/3.0/3.4/3.6
1 7.0/7.2/7.2/7.4 3 10.1/11 /12/13.4 3 2.8/3.0/3.4/3.4
2 7.1/7.3/7.3/7.4 3 10.4/11.2/12.4/13.6 3 2.8/3.0/3.1/3.2
0.1 3 7.4/7.4/7.9/7.9 3 10.5/12/12.6/13.4 2 2.5/2.7/2.7/2.9
4 7.5/7.5/8/8 3 10.8/12.1/13.2/13.8 2 2.5/2.7/2.9/3
5 7.5/7.6/8 /8.3 3 11/12.9/16.8/19 2 2.9/3.2/3.5/4.1
1 7.0/7.3/7.3/7.9 3 10/11.2/12.4/13 3 2.6/3.1/3.1/3.7
2 7.1/7.2/7.2/7.8 3 10.2/11.7/12.6/12.8 3 2.6/3.0/3.2/3.7
1 3 7.2/7.5/7.6/8.1 3 10.4/12/12.1/13 2 2.5/2.6/2.8/2.9
4 7.2/7.5/7.8/8.2 3 10.9/12.6/13.2/13.4 2 2.5/2.7/3.1/3.2
5 7.3/7.7/8/8.4 3 11.1/13.1/18/20 2 2.9/3.5/3.6/4.5 注： 表格中斜线划分的数据依次为第 3天、 6天、 9天和 12天测量的数据。
表 3-6 BR6增强水稻抗低温胁迫性的试验结果
样品 浓 度 温 度 株高 （cm) 叶数 叶面积（cm2) 分 根重（g)
(mg 1) (。C )
数
BR 6 1 7.1/7.2/7.4/7.4 3 10/11.2/12.4/13 3 2.8/3.1/3.5/3.9
2 7.1/7.2/7.3/7.5 3 10.2/11.7/12.6/13 3 2.8/3.0/3.2/3.9
0.000
3 7.1/7.2/7.5/7.6 3 10.4/12/12.6/13.2 2 2.5/2.6/2.9/2.9 1
4 7.1/7.3/7.5/7.7 3 10.6/12.2/13/13.4 2 2.5/2.6/2.8/2.9
5 7.2/7.5/7.5/7.8 3 10.6/12.8/13.6/14 2 2.6/2.7/2.9/3.0
0.001 1 6.9/7.1/7.3/7.3 3 10/11.3/12.6/13 3 2.8/3.1/3.4/3.9
2 6.9/7.1/7.2/7.3 3 10.3/11.8/12.7/13.1 3 2.8/3.0/3.2/3.9 3 7/7.1/7.4/7.4 3 10.4/12/12.6/13.2 2 2.5/2.6/2.9/2.9
4 7.1/7.3/7.5/7.7 3 10.6/12.4/13.1/13.5 2 2.5/2.6/2.9/2.9
5 7.5/7.8/7.9/8.2 3 10.7/14.6/16/17 3 2.8/2.7/3.0/3.7
1 7.0/7.2/7.3/7.4 3 10/11.9/12.9/13.6 3 2.8/3.0/3.4/3.9
2 7.0/7.2/7.3/7.5 3 10.6/11.8/12.8/13.4 3 2.8/3.0/3.1/3.2
3 7/7.2/7.4/7.6 3 10.4/12/12.6/13.2 2 2.5/2.6/2.9/2.9
4 7.1/7.3/7.6/7.8 3 10.8/12.4/13.7/13.7 2 2.5/2.6/2.9/3.0
5 7.7/7.8/8.1/8.5 4 10.9/13.9/17.1/18 3 2.8/3.0/3.4/3.9
1 7.0/7.3/7.3/7.5 3 10.1/12/12.9/13.4 3 2.8/3.0/3.4/3.7
2 7.1/7.2/7.3/7.4 3 10.4/11.8/12.8/13 3 2.9/3.0/3.1/3.2
3 7.2/7.3/7.4/7.5 3 10.5/12/12.8/13.2 2 2.5/2.6/2.8/2.9
4 7.1/7.4/7.5/7.7 3 10.8/12.5/13.5/13.8 2 2.5/2.7/2.9/3.1
5 7.7/7.8/8.4/8.6 3 11.1/13.9/17.8/18.9 2 2.9/3.2/3.5/4
1 7.1/7.2/7.3/7.3 3 10/11.2/12.4/12.8 3 2.8/3.1/3.4/3.9
2 7.1/7.2/7.3/7.6 3 10.2/11.7/12.6/13.1 3 2.8/3.0/3.2/3.9
3 7.1/7.3/7.5/7.6 3 10.4/12.2/12.6/13.2 2 2.5/2.6/2.9/2.9
4 7.1/7.5/7.5/7.7 3 10.9/12/13.4/14 2 2.5/2.6/3.0/3.2
5 7.7/8.0/8.8/8.9 3 11.1/13.6/18.9/20 2 2.9/3.6/3.7/4.5 注： 表格中斜线划分的数据依次为第 3天、 6天、 9天和 12天测量的数据。 实施例 4天然芸苔素内酯类似物赋予植物抗高盐的活 测定 我们通过抗高盐胁迫实验，测量水稻种子在高 盐环境下的发芽率，来反映天然芸 苔素内酯类似物对植物抗高盐活性的作用。
分别取实施例 1制备的天然芸苔素内酯类似物 BR1、 BR2、 BR3、 BR4、 BR5和 BR6, 另外将 BR1、 BR2、 BR3、 BR4、 BR5和 BR6混和成混和芸苔素类似物（简称 为 " BR混"； 其中 BR1 : BR2: BR3: BR4: BR5和 BR6的重量比为 0.4: 0.4： 0.4： 0.4： 0.4： 98)，分别溶于 95% (V/V)乙醇中，然后用大量的纯水梯度稀释至 1 mg/L 、 0.1mg/L、 0.01 mg/L ^ 0.001 mg/L和 0.0001 mg/L; 同时用纯水作为对照。 向上述含不 同浓度的天然芸苔素内酯类似物的溶液或纯水 分别添加 NaCl， 使盐浓度分别达到 300、 400、 500和 600 mg/L。
用 5%次氯酸钠溶液将水稻种子消毒处理后， 用蒸馏水漂洗至碱性， 置于培养皿 中， 放在 30°C ±2°C 的恒温箱中以上述含有高浓度盐的不同浓度的 天然芸苔素内酯 类似物的溶液或纯水培养， 观察发芽情况， 计算发芽率。 结果如表 4-0~4-4所示， 各 天然芸苔素内酯类似物及其混和物相对于对照 ， 基本都能够在高盐环境下， 增加水 稻株的发芽率， 具有赋予植物抗高盐的活性； 而且发芽率的增加与天然芸苔素内酯 类似物及其混和物的浓度基本成正相关关系。
表 4-0 纯水对照的试验结果
样品 盐浓度 （mg/1) 发芽率 （％)
300 45
400 42
对照
500 37
600 31
表 4-1 BRK BR2增强水稻耐高盐性的试验结果
样品浓度 盐 浓 度 样品浓度 盐 浓 度 发 芽 率 样品 发芽率(％) 样品
(mg/1) (mg/1) (mg/1) (mg/1) (%)
300 51 300 45
400 48 400 41
0.0001 0.0001
500 42 500 39
600 36 600 36
300 53 300 50
400 49 400 42
0.001 0.001
500 45 500 40
600 37 600 36
300 55 300 50
BR 1 400 52 BR 2 400 51
0.01 0.01
500 47 500 47
600 39 600 39
300 58 300 50
400 52 400 50
0.1 0.1
500 49 500 46
600 40 600 38
300 62 300 58
400 55 400 51
1 1
500 50 500 46
600 42 600 38 表 4-2 BR3、 BR4增强水稻耐高盐性的试验结果
样品浓度 盐 浓 度 样品浓度 盐 浓 度 发 芽 样品 发芽率 (％) 样品
(mg/1) (mg/D (mg/1) (mg/1 ) (%)
BR 3 0.0001 300 50 BR 4 0.0001 300 50
400 45 400 47 500 39 500 42
600 32 600 36
300 50 300 51
400 43 400 49
0.001 0.001
500 40 500 43
600 33 600 37
300 51 300 55
400 50 400 52
0.01 0.01
500 47 500 47
600 39 600 39
300 50 300 58
400 50 400 50
0.1 0.1
500 41 500 49
600 38 600 40
300 52 300 60
400 46 400 55
1 1
500 40 500 50
600 38 600 41 表 4-3 BR5、 BR6增强水稻耐高盐性的试验结果
样品浓度 盐 浓 度 样品浓度 盐 浓 度 发 芽 率 样品 发芽率(％) 样品
(mg/1) (mg/1) (mg/1) (mg/1) (%)
BR5 300 50 BR 6 300 52
400 48 400 48
0.0001 0.0001
500 42 500 42
600 36 600 36
300 52 300 53
400 49 400 50
0.001 0.001
500 45 500 44
600 38 600 37
300 56 300 55
400 51 400 51
0.01 0.01
500 47 500 46
600 39 600 39
0.1 300 58 0.1 300 58
400 52 400 53
500 43 500 47 600 40 42
300 62 68
400 55 55
500 50 52
600 42 44
表 4-4 BR混增强水稻耐高盐性的试验结果
样品浓度 盐 浓 度
样品 发芽率 （°/。）
(mg/1) (rag/1)
300 51
400 46
0.0001
500 43
600 36
300 54
400 50
0.001
500 44
600 37
300 55
BR混 400 52
0.01
500 47
600 39
300 58
400 54
0.1
500 49
600 42
300 64
400 57
1
500 50
600 44 实施例 5 天然芸苔素内酯类似物的混合物与化学合成的 芸苔素内酯的田间活性测定 将 BR1、 BR2、 BR3、 BR4、 BR5和 BR6混和成混和芸苔素类似物（简称为 "BR 混"； 其中 BR1 : BR2: BR3: BR4: BR5和 BR6的重量比为 0.4: 0.4： 0.4： 0.4： 0.4： 98)； 同时用纯水作为阴性对照， 用化学合成的表高芸苔素内酯（购自云大科技 股份 有限公司）作为阳性对照。 将 BR混和阳性对照分别稀释至至以下浓度： l ppm、 0.5 ppm、 0.1ppm、 0.05ppm O.Olppm, 0.005ppm、 O.OOlppm. 0.0005ppm O.OOOlppm, 在实验田中对大豆种子进行活性测定。 本次试验于 7月月 9日播种， 7月 22日、 23 日、 24日调査出苗情况， 9月 5日对株高进行调査。
结果如表 5-1所示， 相对于阴性对照， 无论是化学合成的表高芸苔素内酯还是从 本发明的天然来源中提取的芸苔素类似物的混 合物， 对大豆的出苗、 株高及鲜重、 干重都有促进作用的， 但是生物活性有所差异。在低浓度下， 本发明的 BR混的各方 面促进生长的效果大都均优于现有化学合成的 产品， 例如表 5-1所示， 本发明的 BR 混以 0.005ppm 施用的活性甚至基本上高于现有化学合成的表 高芸苔素内酯以 O.Olppm施用的活性。
表 5-1 芸苔素内酯生物活性数据 (大豆） 样品 浓度, ppm 出苗数 (株） 出苗率(％) 株高 (cm) 鲜重 (g/株） 干重 (g株）
BR混 0.1 114 57 17.20 3.79 0.42
0.05 118 62. 1 17.95 4.08 0.45
0.01 129 64. 5 17.82 4.07 0.44
0.005 125 62. 5 17.65 4.05 0.40
0.001 119 59. 5 17.44 4.02 0.38
0.0005 112 58. 6 17.23 3.99 0.38
0.0001 100 54. 3 17.14 3.97 0.35 阳性对照 0.1 106 53 17.14 3.89 0.41
0.05 115 57. 5 17.32 4.05 0.39
0.01 121 60. 5 17.19 4.01 0.40
0.005 118 59 17.08 3.98 0.39
0.001 113 56.5 17.09 3.95 0.35
0.0005 98 52.4 17.02 3.94 0.33
0.0001 95 47.5 16.98 3.94 0.34 阴性对照 97 48.5 16.98 3.94 0.33