技术领域

本发明涉及一种纳米羟基磷灰石 /壳聚糖的制备方法， 属于无机纳米材料技 术领域。

背景技术

纳米羟基磷灰石 （n-HA) 具有良好的生物相容性和生物活性， 被广泛应用 于骨骼组织的修复与替代技术， 但该材料脆性太大， 因而限制了其在承载部位 骨替换与骨修补中的应用。 壳聚说糖（CS ) 是甲壳素脱乙酰化后带有阳离子的多 糖， 具有天然可降解性， 对人体及组织无毒、 无害、 无刺激、 生物相容性良好、 对多种组织细胞的黏附和增殖具有促进作用等 多种优良特性。 如将 n-HA与 CS 制成复合材料， 新材料除具备优良的生物相容性之外还可有望 改善其力学性能， 因而在骨替代材料领域有较大的发展空间。 针对 n-HA/CS复合材料所开展的研 究是目前生物医学材料领域的研究热点之一， 如书 Thein-Han等采用冻干法制得了 孔隙大小为 50〜120 μ πι的多孔支架， n-HA可在 CS基质中均匀分布，在 n-HA 与 CS之间存在着化学相互作用， 复合后材料的机械性能有了较大幅度的提升， 与前成骨细胞（MC 3T3-E1 )共培养的实验结果表明， 与纯 CS相比， 复合材料 具有更好的细胞亲合性， 同时也能更好地促进细胞的增殖 [Thein-Han W. W.; Misra R. D. K.， Biomimetic chitosan-nanohydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering, ACTA BIOMATERIALIA, 2009， 5(4): 1182—1197.]。

目前所制备的 HA/CS复合材料多为微米级材料， 或为纳米 HA分散分布在 微米级的 CS中的材料， 目前能够简便地制备颗粒宽度及长径均在纳米 尺度的纳 米羟基磷灰石 /壳聚糖复合材料的方法并不多见。 在制备纳米材料的技术中， 反 相微乳液法因其具有热力学稳定性高、 粒径细小、 均匀、 操作简单等特点而备 受瞩目。如 Zhu等利用反相微乳液法制备了 CS包覆的磁性纳米粒子并成功地将 其用作抗癌药物 5-氟尿嘧啶的药物载体 [Zhu Longzhang; Ma Jingwei; Jia Nengqin; Zhao Yu; Shen Hebai, COLLOIDS AND SURFACES B: BIOINTERFACES, 2009, 68(1): 1 - 6.] c

但目前尚缺少采用反相微乳液法成功制备颗粒 宽度及长径均在纳米尺度的 纳米羟基磷灰石 /壳聚糖复合材料的简便制备方法， 如能成功制备， 则将有望在 很大程度上拓展纳米羟基磷灰石 /壳聚糖复合材料在生物医学领域的应用前景� � 发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的不足， 提供一种纳米羟基磷灰石 /壳 聚糖的制备方法， 能够采用反相微乳液法简便地制备得到颗粒宽 度与长径均在 纳米尺度的纳米羟基磷灰石 /壳聚糖。

按照本发明提供的技术方案， 所述纳米羟基磷灰石 /壳聚糖的制备方法， 特 征是， 包括以下工艺步骤：

( 1 )将 0.05〜1.5g壳聚糖粉末溶于 5~500mL质量百分浓度为 1~5%的乙酸 水溶液中， 得到壳聚糖溶液；

(2)称取 0.05〜1.5g纳米羟基磷灰石粉末， 与步骤 （1 )得到的壳聚糖溶 液混合， 得到混合物； 将混合物与 100~500mL液体石蜡混合均匀， 再加入 1〜 15mL山梨糖醇酐油酸酯， 进行乳化， 乳化时间为 0.2~50小时； 再加入 l〜15mL 质量百分浓度为 10~50%的戊二醛溶液， 在 30〜95°C的水浴中反应 5〜24小时， 得到悬浮液； 将悬浮液经离心机离心得到固体沉积物， 得到的固体沉积物用氯 仿和无水乙醇交替洗涤 2~20次，再在 30〜80°C真空干燥，得到所述的纳米羟基 磷灰石 /壳聚糖。

所述纳米羟基磷灰石的宽度为 5〜100nm， 长度为 15〜800nm _; 所述纳米羟 基磷灰石 /壳聚糖的宽度为 10〜300nm， 长度为 20〜990nm。

所述纳米羟基磷灰石采用以下方法合成得到： 将磷酸盐溶液、 钙盐溶液和 十六垸基三甲基溴化铵溶液 （CTAB) 混合， 得到反应体系， 在该反应体系中 Ca ²⁺ 离子的浓度为 0.08~500 ηιιηο1·ΐ 磷酸根离子的浓度为 0.048~300 mmoH ¹ , CTAB 的浓度为 mol-L ¹ , 且钙离子与磷酸根离子的摩尔比为 5:3； 反应 12〜96小时， 并调节 pH值保持在 8〜14 _; 将得到的产物经离心机离 心后由微孔滤膜过滤,将过滤得到的固体用水� �无水乙醇进行交替洗涤 2〜20次， 再在 30〜80°C真空干燥得到纳米羟基磷灰石粉末。

在一个具体实施方式中， 所述磷酸盐为分子式中含有磷酸根、 磷酸氢根或 磷酸二氢根的易溶于水的无机化合物。

在一个具体实施方式中， 所述磷酸盐为磷酸钠、 磷酸氢钠、 磷酸二氢钠、 磷酸三钠、 磷酸钾、 磷酸氢钾、 磷酸二氢钾、 磷酸铵、 磷酸氢铵或磷酸二氢铵。

在一个具体实施方式中， 所述钙盐为含有钙离子的易溶于水的无机化合 物。 在一个具体实施方式中， 所述钙盐为氯化钙。

本发明所述的纳米羟基磷灰石 /壳聚糖复合材料的制备方法将纳米羟基磷灰 石与壳聚糖的乙酸溶液进行均匀混合后， 将混合物与液体石蜡混合， 再加入乳 化剂 span80 (山梨糖醇酐油酸酯）， 待体系充分乳化后， 再加入戊二醛进行交联 反应， 所得悬浮液经离心分离、 洗涤真空干燥后收集， 即得到纳米羟基磷灰石 / 壳聚糖复合材料。 本发明所提供的纳米羟基磷灰石 /壳聚糖复合材料的反相微乳 液制备方法， 所得产品颗粒宽度及长径均在纳米尺度范围内 ， 产品形貌规则、 结晶性好。 该方法制备工艺简单， 成本低廉， 适于批量生产， 在生物医学领域 有着重要的应用价值。

说明书附图

图 1为纳米羟基磷灰石的透射电镜相片。

图 2为纳米羟基磷灰石 /壳聚糖颗粒的透射电镜相片。

图 3为纳米羟基磷灰石、 壳聚糖和纳米羟基磷灰石 /壳聚糖的红外光谱图， 其中， 横坐标为波数， 单位为 cm^

图 4为纳米羟基磷灰石、 壳聚糖和纳米羟基磷灰石 /壳聚糖的 X射线衍射谱 图， 其中， 横坐标为 2Θ角， 即衍射谱仪扫描的角度， 单位为 °；

具体实施方式 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例一： 一种纳米羟基磷灰石 /壳聚糖的制备方法， 包括以下工艺步骤：

( 1 )合成纳米羟基磷灰石： 将磷酸钠溶液、 氯化钙溶液和十六烷基三甲基 溴化铵溶液（CTAB)混合， 得到反应体系， 在该反应体系中 Ca ²⁺ 离子的浓度为 Ο.ΟδπιπιοΙ-υ ¹ , 磷酸根离子的浓度为 0.048ηιιηο1·ΐ CTAB的浓度为 8><1θ ηο1· L- ¹ , 且钙离子与磷酸根离子的摩尔比为 5:3; 反应 12〜96小时， 并调节 ρΗ值保 持在 8;将得到的产物经离心机离心后由 0.22 μ ιη的微孔滤膜过滤，将过滤得到 的固体用水和无水乙醇进行交替洗涤 2次， 再在 30°C真空干燥过夜得到纳米羟 基磷灰石粉末；

(2)将 0.05g壳聚糖粉末溶于 5mL质量百分浓度为 1%的乙酸水溶液中， 得到壳聚糖溶液；

(3 )称取 0.05g步骤（1 )得到的纳米羟基磷灰石粉末或市售产品， 与步骤 (2)得到的壳聚糖溶液混合， 得到混合物； 将混合物与 100 mL液体石蜡混合 均勾， 再加入 lmL山梨糖醇酐油酸酯， 进行乳化， 乳化时间为 0.2小时； 再加 入 lmL质量百分浓度为 10%的戊二醛溶液， 在 30°C的水浴中反应 24小时， 得 到悬浮液； 将悬浮液经离心机离心得到固体沉积物， 得到的固体沉积物用氯仿 和无水乙醇交替洗涤 2次， 再在 30°C真空干燥过夜， 得到所述的纳米羟基磷灰 石 /壳聚糖；

将纳米羟基磷灰石和纳米羟基磷灰石 /壳聚糖分别用透射电电镜 (JEM-2100, 日本 JEOL公司）进行形貌分析， 如图 1、 图 2所示， 所述纳米羟 基磷灰石的宽度为 5〜100 nm， 长度为 15〜800 nm; 所述纳米羟基磷灰石 /壳聚 糖的宽度为 10〜300 nm, 长度为 20〜990 nm。

再将纳米羟基磷灰石、 壳聚糖和纳米羟基磷灰石 /壳聚糖分别用傅立叶转换 红外光谱仪（FTLA2000-104, 加拿大 ABB Bbomem公司）进行红外光谱分析， 所得图谱如图 3所示， 图中 472， 566, 597, 632, 962 cm' ¹ 处的吸收峰为 Ρ0 ₄ ³ · 的变形振动引起， 1039-1097 cm' ¹ 处的吸收峰为 Ρ0 ₄ ³ —的反对称伸缩振动引起，这 些都是纳米羟基磷灰石的特征吸收峰。 1653cm' ¹ 处为壳聚糖中酰胺的 C=0的伸 缩振动吸收峰（酰胺 I谱带）， 1599cm' ¹ 处的肩峰为胺基的弯曲振动吸收峰（酰 胺 II谱带） ， 而在 3428cm' ¹ 附近出现的吸收峰为 O-H及 -NH ₂ 的 N-H伸縮振动 吸收峰。 红外衍射图谱分析证实， 得到的产品确为纳米羟基磷灰石 /壳聚糖。

将纳米羟基磷灰石、 壳聚糖和纳米羟基磷灰石 /壳聚糖分别用 X射线衍射分 析仪进行物相分析， 所得图谱如图 4所示， 图中 2Θ= 25. 9° 、 31. 8° 、 32. 8° 、 34° 、 39. 8° 、 49. 4° 、 53. 1 ° 处的衍射峰分别对应于纳米羟基磷灰石的（ 002)、 ( 211) 、 ( 300) 、 ( 202) 、 ( 310) 、 ( 321) 以及（004)晶面。 图中 2Θ= 12·2° 、 20.1 ° 处的两个峰是壳聚糖的特征衍射峰， 当形成复合材料后， 由于相对含量发 生了变化， 所以与纯的纳米羟基磷灰石及壳聚糖材料相比 ， 复合材料相应的衍 射峰强度有所下降， 但各衍射峰的出峰位置及各峰之间的相对强度 仍保持不变。 X射线衍射图谱的分析结果同样证实了得到的� �品确为纳米羟基磷灰石 /壳聚 实施例二： 一种纳米羟基磷灰石 /壳聚糖的制备方法， 包括以下工艺步骤：

( 1 )合成纳米羟基磷灰石： 将磷酸氢钠溶液、 氯化钙溶液和十六垸基三甲 基溴化铵溶液（CTAB)混合， 得到反应体系， 在该反应体系中 Ca ²⁺ 离子的浓度 为 500mmol*L ，磷酸根离子的浓度为 300mmol，L , CTAB的浓度为 10.5 1θ ηο1 •Ι 且钙离子与磷酸根离子的摩尔比为 5:3; 反应 96小时， 并调节 ρΗ值保持 在 14; 将得到的产物经离心机离心后由 0.22 μ πι的微孔滤膜过滤， 将过滤得到 的固体用水和无水乙醇进行交替洗涤 20次，再在 80°C真空干燥过夜得到纳米羟 基磷灰石粉末；

(2)将 1.5g壳聚糖粉末溶于 500mL质量百分浓度为 5%的乙酸水溶液中， 得到壳聚糖溶液；

(3 )称取 1.5g步骤 （1 ) 得到的纳米羟基磷灰石粉末或市售产品， 与步骤 (2)得到的壳聚糖溶液混合，得到混合物；将混 合物与 500mL液体石蜡混合均 匀， 再加入 15mL山梨糖醇酐油酸酯， 进行乳化， 乳化时间为 50小时； 再加入 15mL质量百分浓度为 50%的戊二醛溶液， 在 95°C的水浴中反应 5小时， 得到 悬浮液； 将悬浮液经离心机离心得到固体沉积物， 得到的固体沉积物用氯仿和 无水乙醇交替洗涤 20次， 再在 80°C真空干燥过夜，得到所述的纳米羟基磷灰� �� /壳聚糖； 所述纳米羟基磷灰石的宽度为 5〜100nm， 长度为 15〜800nm; 所述纳 米羟基磷灰石 /壳聚糖的宽度为 10〜300nm， 长度为 20〜990nm。

实施例三： 一种纳米羟基磷灰石 /壳聚糖的制备方法， 包括以下工艺步骤：

( 1 )合成纳米羟基磷灰石： 将磷酸二氢钠溶液、 氯化钙溶液和十六垸基三 甲基溴化铵溶液（CTAB)混合， 得到反应体系， 在该反应体系中 Ca ²⁺ 离子的浓 度为 10 mmol-L ¹ , 磷酸根离子的浓度为 6 mmol-L" ¹ , CTAB的浓度为 9X10" ⁴ mol •Ι 且钙离子与磷酸根离子的摩尔比为 5:3; 反应 36小时， 并调节 ρΗ值保持 在 10; 将得到的产物经离心机离心后由 0.22 μ πι的微孔滤膜过滤， 将过滤得到 的固体用水和无水乙醇进行交替洗涤 10次，再在 50°C真空干燥过夜得到纳米羟 基磷灰石粉末；

(2)将 lg壳聚糖粉末溶于 250mL质量百分浓度为 2%的乙酸水溶液中， 得到壳聚糖溶液；

(3 )称取 lg步骤（1 )得到的纳米羟基磷灰石粉末或巿售产品，与� �骤（2) 得到的壳聚糖溶液混合， 得到混合物； 将混合物与 200mL液体石蜡混合均匀， 再加入 10mL山梨糖醇酐油酸酯，进行乳化，乳化时间� � 20小时；再加入 10mL 质量百分浓度为 20%的戊二醛溶液，在 50°C的水浴中反应 12小时，得到悬浮液; 将悬浮液经离心机离心得到固体沉积物， 得到的固体沉积物用氯仿和无水乙醇 交替洗涤 10次， 再在 50Ό真空干燥过夜， 得到所述的纳米羟基磷灰石 /壳聚糖; 所述纳米羟基磷灰石的宽度为 5〜100nm， 长度为 15〜800nm _; 所述纳米羟基磷 灰石 /壳聚糖的宽度为 10〜300nm， 长度为 20〜990nm。