Verfahren zur selektiven Lokalisierung von Wirkstoffen an und in Mitochondrien und entsprechende Wirkstoffe

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verfahren zur selektiven Lokalisierung von Wirkstoffen sowohl an als auch in Mitochondrien innerhalb von lebenden Zellen sowie entsprechende Wirkstoffe, die ohne weitere Hilfsmittel durch die Zellmembran in Zellen eindringen und dort selektiv sowohl an als auch in Mitochondrien lokalisiert werden.

Lokalisierung von Wirkstoffen an bzw. in Mitochondrien bedeutet in der gesamten Anmeldung die Anreicherung von Wirkstoffen an bzw. in Mitochondrien. Der Begriff „lokalisiert" an bzw. in Mitochondrien bedeutet in der gesamten Anmeldung „angereichert" an bzw. in Mitochondrien.

Mitochondrien sind semiautonome Organellen der Zelle. Sie besitzen ein eigenes Genom (mtDNA) , das neben dem Kerngenom für einen Teil ihrer Proteine kodiert. Die mitochondrial kodierten Proteine werden auch mitochondrial transkribiert, translatiert und synthetisiert. Wichtige Stoffwechselwege in den Mitochondrien dienen der Energiegewinnung und sind somit essentiell für die Vitalität der Zelle.

Mitochondriale Krankheiten umfassen beispielsweise zahlreiche Erbkrankheiten, Krebs, Diabetes, Parkinson und Arteriosklerose.

Mitochondriale Stoffwechselstorungen werden unter anderem auch für Phänomene des Alterns, beispielsweise Schwerhörigkeit oder das Nachlassen der Sehkraft verantwortlich gemacht. Phänomene des Alterns werden beispielsweise auch auf Mutationen bzw. Deletionen der mitochondrialen DNA zurückgeführt.

(„Mitochondria as targets for detection and treatment of Cancer", Josephine S. Modica-Napolitano, Keshav K. Singh, expert reviews in molecular mediane, (02) 00445-3a . pdf (short code : txtOOlksb) ; 11 April 2002, ISSN 1462-3994 ©2002 Cambridge University Press. „Mitochondrial defects in Cancer", Jennifer S Carew, Peng Huang, Molecular Cancer, 2002, 1:9.

G. A. Cortopassi, Aliu Wong, Biochmica et Biophysica Acta (BBA)- Bioenergetics, 1999, 1410 (2), 183-193.).

Die den mitochondrialen Krankheiten zugrunde liegenden Gendefekte reichen von sporadisch auftretenden und auch rein maternal vererbten Punkt- und Langenmutationen der mtDNA bis hin zu autosomal dominant bzw. rezessiv vererbte Formen bei Veränderungen im Kerngenom. Außerdem wird diskutiert, dass Veränderungen in der mtDNA auch bei polygenen Erkrankungen mit komplizierten Erbgangen eine Rolle spielen.

Besonderheiten dieser Erkrankungen sind die Vielfältigkeit ihrer klinischen Bilder, die Komplexität der Diagnostik und die bisher nur beschrankt vorhandenen Therapieansatze .

Somit ist die Erforschung und Diagnose bestimmter Eigenschaften der Mitochondrien, wie zum Beispiel Mutationen der mitochondrialen DNA oder mitochondriale Stoffwechselstorungen, eine wichtige Voraussetzung in der Entwicklung entsprechender Wirkstoffe gegen mitochondriale Krankheiten.

Die selektive Lokalisierung von Wirkstoffen an Mitochondrien innerhalb von Zellen ist dabei ebenfalls ein wichtiger Aspekt, da dadurch eine hohe lokale Wirkstoff-Konzentration an den

Mitochondrien erzeugt wird, die schließlich zu einem Import der Wirkstoffe in die Mitochondrien führt.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem mitochondriale Wirkstoffe, wie zum Beispiel small molecules oder Antisense-Wirkstoffe, innerhalb von Zellen selektiv sowohl an als auch in Mitochondrien lokalisiert werden können.

Mitochondriale Wirkstoffe sind Substanzen, die eine Wirksamkeit sowohl an als auch in Mitochondrien erzielen, wie zum Beispiel Wirksamkeit in der Behandlung von mitochondrialen Krankheiten oder Wirksamkeit in Bezug auf diagnostische Verfahren sowohl an als auch in Mitochondrien.

Weiterhin ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Antisense- Wirkstoffe zur Verfügung zu stellen, die ohne weitere Hilfsmittel durch die Zellmembran in Zellen eindringen und dort selektiv sowohl an als auch in Mitochondrien lokalisiert werden, um in Mitochondrien einen Antisense- oder einen antigenomischen Effekt zu erzeugen.

Diese Aufgaben werden gelöst durch Verbindungen der allgemeinen Formel I :

worin

n eine ganze Zahl von 0 bis 35 ist, bevorzugt 1 bis 28, starker bevorzugt 9 bis 28, am stärksten bevorzugt 13 bis 20.

Die Reste K, L oder R ¹ sind unabhängig voneinander mit mindestens einem Monohydroxy-mononitro-phenyl-Rest, bevorzugt ein 4-Hydroxy- 3-nitro-phenyl-Rest , weiterhin bevorzugt ein 4-Hydroxy-2-nitro- phenyl-Rest, weiterhin bevorzugt ein 3-Hydroxy-6-nitro-phenyl- Rest, oder einem Monohydroxy-dinitro-phenyl-Rest, bevorzugt ein 3, 5-Dinitro-4-hydroxy-phenyl-Rest, weiterhin bevorzugt ein 2,5- Dinitro-4-hydroxy-phenyl-Rest, weiterhin bevorzugt ein 2,4- Dinitro-5-hydroxy-phenyl-Rest , substituiert, wobei die Verknüpfungsposition des Phenyl-Rests mit den Resten K, L oder R ¹ als Position 1 definiert ist und der Phenyl-Rest zusatzlich mit einem/einer oder mehreren Fluor-, Chlor-, Brom- oder Jodatomen oder -COOH, COOR ⁸ , -CSOH, CSOR ⁸ , -COSH, COSR ⁸ , -CONH ₂ , -CONHR ⁹ , - COR ¹⁰ R ¹¹ , -OH, -OR ⁸ , -SH, -SR ⁸ , -NH ₂ , -NHR ⁹ , -NR ¹⁰ R ¹¹ , -NR ¹² NOH, -NOR ¹³ , Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure-Funktionen oder Ci- C ₆ Alkyl-, C ₂ -C ₆ Alkenyl-, C ₂ -C ₆ Alkinyl-, Ci-C ₆ Heteroalkyl-, C ₃ -Ci ₀ Cycloalkyl-, C ₃ -Ci ₀ Heterocycloalkyl-, C ₆ -Ci ₀ Aryl-, C ₅ -C ₉ Heteroaryl-, C ₇ -Ci ₂ Aralkyl- oder C ₂ -Cn Heteroaralkyl-Gruppen substituiert sein kann, wobei R ⁸ , R ⁹ , R ¹⁰ , R ¹¹ , R ¹² und R ¹³ unabhängig voneinander Ci-C ₆ Alkylreste sind.

E ist unabhängig voneinander ein H-Atom, ein substituierter oder unsubstituierter Phenylrest, ein substituierter oder unsubstituierter Heterocyclus, eine gegebenenfalls mit Schutzgruppen substituierte Nukleobase, z.B. eine in der Natur vorkommende oder nicht in der Natur vorkommende Nukleobase, oder ein DNA-Intercalator.

Bevorzugt ist jedes E unabhängig voneinander ein Adeninyl-, Cytosinyl-, Pseudoisocytosinyl-, Guaninyl-, Thyminyl-, Uracilyl- oder Phenyl-Rest.

Jeder Rest R ¹ ist unabhängig voneinander ein H-Atom oder ein gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Alkenyl-, Alkylaryl-, Aryl- , heterocyclischer oder alicyclischer Rest mit bis zu 20 C- Atomen, wobei mindestens ein Rest R ¹ kein H-Atom und mit einer oder mehreren Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure-Funktionen substituiert ist.

Wenn der Rest R ¹ nicht mit einer oder mehreren Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure-Funktionen substituiert ist, kann er z.B. auch unabhängig voneinander eine oder mehrere Seitenketten einer naturlichen oder nichtnaturlichen Aminosäure aufweisen, bevorzugt einen gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkylaryl-, Aryl-, heterocyclischen oder alicyclischen Rest mit bis zu 20 C- Atomen.

Bevorzugt umfasst jeder Rest R ¹ unabhängig voneinander 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 C-Atome.

Jeder Rest R ¹ kann unabhängig voneinander verzweigt oder unverzweigt sein.

Der Ausdruck "gegebenenfalls substituiert" bezieht sich in der gesamten Anmeldung auf Gruppen, in denen ein oder mehrere Wasserstoffatome durch Fluor-, Chlor-, Brom- oder Jodatome oder - COOH, COOR ⁸ , -CSOH, CSOR ⁸ , -COSH, COSR ⁸ , -CONH ₂ , -CONHR ⁹ , -COR ¹⁰ R ¹¹ , -OH, -OR ⁸ , =0, -SH, -SR ⁸ , =S, -NH ₂ , =NH, -NHR ⁹ , -NR ¹⁰ R ¹¹ , -NR ¹² NOH, -NOR ¹³ oder NO ₂ -Gruppen, Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure- Funktionen ersetzt sind. Dieser Ausdruck bezieht sich weiterhin

auf Gruppen, die mit unsubstituierten Ci-C ₆ Alkyl-, C ₂ -C ₆ Alkenyl-, C ₂ -C ₆ Alkinyl-, Ci-C ₆ Heteroalkyl-, C ₃ -Ci ₀ Cycloalkyl-, C ₂ -C ₉ Heterocycloalkyl-, C ₆ -Ci ₀ Aryl-, C ₅ -C ₉ Heteroaryl-, C ₇ -Ci ₂ Aralkyl- oder C ₂ -Cu Heteroaralkyl-Gruppen substituiert sind, wobei R ⁸ , R ⁹ , R ¹⁰ , R ¹¹ , R ¹² und R ¹³ unabhängig voneinander Ci-C ₆ Alkylreste sind.

Phosphonsaureester-Funktionen können zum Beispiel die Formel -P(=O)(OV) ₂ oder -P (=0) (OV) (OH) aufweisen. Dabei kann jedes V unabhängig voneinander ein unsubstituierter Alkyl-, Alkenyl-, Alkylaryl-, Aryl-, oder alicyclischer Rest mit bis zu 20 C- Atomen, starker bevorzugt mit bis 7 Atomen und am stärksten bevorzugt ein Methyl-, Ethyl-, Cyclohexyl, oder Benzyl-Rest sein.

Bei den erfmdungsgemaßen Verbindungen können die Phosphonsaure- Funktionen zum Beispiel die Formel -P(=0) (OH) ₂ aufweisen.

Am stärksten bevorzugt wird jeder Rest R ¹ unabhängig voneinander aus einer Gruppe der Formeln - (Ci-Ci ₀ ) Alkyl- [P (=0) (0-V) ₂ ] ausgewählt, wobei jedes V unabhängig voneinander ein H-Atom, ein Methyl-, Ethyl-, Cyclohexyl-, oder ein Benzyl-Rest ist.

K ist eine Gruppe der Formel -NR ² R ³ , -N ⁰ R ² R ³ R ⁴ , -NR ² (CO) R ³ oder - NR ² (CS) R ³ , wobei R ² , R ³ und R ⁴ unabhängig voneinander ein H-Atom, ein Alkyl-, Alkaryl-, Alkenyl, oder Alkinyl- Rest, Ammo- Schutzgruppe, Reporterligand, Fluoreszenz-Marker, Intercalator, Chelator, Aminosäure, Peptid, Protein, Kohlenhydrat, Lipid, Steroid, Fettsaure, Oligonukleotid, Quantum-Dot, FRET-Quencher (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Quencher) oder ein in Wasser losliches oder unlösliches Polymer sind, wobei jeder der vorstehenden Reste gegebenenfalls substituiert sein kann.

Bevorzugt ist K eine NH ₂ -Funktion, ein -NH(CO)CH ₃ -ReSt, eine - NH (CO) -(Ci-Ci ₀ ) Alkyl-Funktion, eine -NH (CO) - (Ci-Ci ₀ ) Alkaryl- Funktion, eine -NH (CO) - (Ci-Ci ₀ ) Alkenyl-Funktion, eine -NH(CO)-(C ₁ - Ci ₀ ) Alkinyl-Funktion, eine Gruppe der Formel -NR ² R ³ oder -N ^φ R ² R ³ R ⁴ oder -NR ² (CO) R ³ , wobei R ² , R ³ und R ⁴ unabhängig voneinander ein H- Atom, eine natürliche oder nicht-naturliche Aminosäure, eine unsubstituierte oder mit Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure- Funktionen substituierte Aminosäure, Peptid oder Alkyl-, Alkaryl- , Alkenyl, oder Alkinyl- Rest sind, wobei jeder der vorstehenden Reste gegebenenfalls substituiert sein kann.

L ist eine Gruppe der Formel -NR ⁵ R ⁶ , -NR ⁵ (CO) R ⁶ , -NR ⁵ (CS) R ⁶ , -OR ⁷ oder -SR ⁷ wobei R ⁵ und R ⁶ unabhängig voneinander ein H-Atom, ein Alkyl-, Alkaryl-, Alkenyl, oder Alkinyl- Rest, Reporterligand, Fluoreszenz-Marker, Intercalator, Chelator, Aminosäure, Aminosaureamid, Peptid, Peptidamid, Protein, Kohlenhydrat, Lipid, Steroid, Fettsaure, Oligonukleotid , Quantum-Dot, FRET-Quencher (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Quencher) oder ein in Wasser lösliches oder ein unlösliches Polymer und R ⁷ ein H-Atom, ein Alkylrest, Reporterligand, Fluoreszenz-Marker, Intercalator, Chelator, Aminosäure, Aminosaureamid, Peptid, Peptidamid, Protein, Kohlenhydrat, Lipid, Steroid, Fettsaure, Oligonukleotid, Quantum-Dot, FRET-Quencher oder ein in Wasser losliches oder ein unlösliches Polymer ist, wobei jeder der vorstehenden Reste gegebenenfalls substituiert sein kann.

Bevorzugt ist L eine OH-Funktion, eine NH ₂ -Funktion, eine -NH-(Ci- Cio) Alkyl-Funktion, eine -NH- (Ci-Ci ₀ ) Alkaryl-Funktion, eine -NH- (Ci-Cio) Alkenyl-Funktion, eine -NH- (Ci-Ci ₀ ) Alkinyl-Funktion, eine naturliche oder nicht-naturliche Aminosäure, eine unsubstituierte oder mit Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure-Funktionen substituierte Aminosäure-, Aminosaureamid-, Peptid- oder

Peptidamid-Einheit , wobei jeder der vorstehenden Reste gegebenenfalls substituiert sein kann.

In der gesamten Anmeldung können Alkylreste vorzugsweise 1-6 C- Atome aufweisen, z. B. Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Butyl- Gruppen sein. Die Ausdrücke „Aralkyl", „Alkaryl" und „Arylalkyl" bedeuten in der gesamten Anmeldung eine Gruppe, die einen aliphatischen und einen aromatischen Teil aufweist.

Wenn R ¹ kein H-Atom ist, entsteht durch die Bindung vom Rest R ¹ an das Backbone der allgemeinen Verbindung I an der Verbindungsstelle ein asymmetrisches Zentrum (*). An jedem asymmetrischen Zentrum liegt demnach eine R-Konfiguration oder eine S-Konfiguration vor.

Dabei wird die Konfiguration vorzugsweise am asymmetrischen Zentrum analog den Cahn-Ingold-Prelog-Regeln definiert, mit der zusätzlichen Maßgabe, dass die Priorität der Liganden immer wie folgt definiert ist: Das Stickstoffatom am asymmetrischen Zentrum erhält immer die Priorität 1. Das Kohlenstoffatom der Carboxylgruppe am asymmetrischen Zentrum erhält immer die Priorität 2. Das Kohlenstoffatom des Rests R ¹ am asymmetrischen Zentrum erhält immer die Priorität 3. Das Wasserstoffatom am asymmetrischen Zentrum erhält immer die Priorität 4.

Erfindungsgemäß weisen die Verbindungen der allgemeinen Formel I mindestens 1 asymmetrisches Zentrum auf, wobei mindestens ein Rest R ¹ mit einer oder mehreren Phosphonsaureester- oder Phosphonsäure-Funktionen substituiert ist.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung entspricht jeder zweite Rest R ¹ unabhängig voneinander der

Seitenkette einer naturlichen oder nichtnaturlichen Aminosäure, bevorzugt einem gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkylaryl-, Aryl-, heterocyclischen oder alicyclischen Rest mit bis zu 20 C-Atomen und mindestens ein Rest R ¹ ist ein gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Alkenyl-, Alkylaryl-, Aryl- oder alicyclischer Rest mit bis zu 20 C-Atomen, der mit einer oder mehreren Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure-Funktionen substituiert ist, wobei die übrigen Reste R ¹ H-Atome sind.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung entspricht jeder dritte Rest R ¹ unabhängig voneinander der Seitenkette einer natürlichen oder nichtnaturlichen Aminosäure, bevorzugt einem gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkylaryl-, Aryl-, heterocyclischen oder alicyclischen Rest mit bis zu 20 C-Atomen und mindestens ein Rest R ¹ ist ein gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Alkenyl-, Alkylaryl-, Aryl- oder alicyclischer Rest mit bis zu 20 C-Atomen und mit einer oder mehreren Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure-Funktionen substituiert, wobei die übrigen Reste R ¹ H-Atome sind.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung entsprechen zwei, drei oder mehr benachbarte Reste R ¹ unabhängig voneinander der Seitenkette einer naturlichen oder nichtnaturlichen Aminosäure, bevorzugt einem gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkylaryl-, Aryl-, heterocyclischen oder alicyclischen Rest mit bis zu 20 C-Atomen und mindestens ein Rest R ¹ ist ein gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Alkenyl-, Alkylaryl-, Aryl- oder alicyclischer Rest mit bis zu 20 C-Atomen und mit einer oder mehreren Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure-Funktionen substituiert, wobei die übrigen Reste R ¹ H-Atome sind.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung entspricht jedes R ¹ unabhängig voneinander der Seitenkette einer naturlichen oder nichtnaturlichen Aminosäure, bevorzugt einem gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkylaryl-, Aryl- , heterocyclischen oder alicyclischen Rest mit bis zu 20 C-Atomen und mindestens ein Rest R ¹ ist ein gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Alkenyl-, Alkylaryl-, Aryl- oder alicyclischer Rest mit bis zu 20 C-Atomen und mit einer oder mehreren Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure-Funktionen substituiert.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung weisen einer oder mehrere der Reste R ¹ unabhängig voneinander mindestens eine Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure-Funktion auf.

Gemäß weiterer bevorzugter Ausfuhrungsformen der vorliegenden Erfindung gilt folgendes:

Sind in der Verbindung der allgemeinen Formel I mehr als ein asymmetrisches Zentrum und mehr als ein gegebenenfalls substitutierter Rest R ¹ mit einer oder mehreren Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure-Funktionen vorhanden, haben mindestens 50% der Anzahl der asymmetrischen Zentren, die Reste mit einer oder mehreren Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure-Funktionen aufweisen, die R-Konfiguration, bevorzugt 66%, starker bevorzugt 70%, starker bevorzugt 75%, starker bevorzugt 80%, starker bevorzugt 85%, starker bevorzugt 90%, starker bevorzugt 95%, am stärksten bevorzugt 100%.

Gemäß alternativer bevorzugter Ausfuhrungsformen der vorliegenden Erfindung gilt folgendes:

Sind in der Verbindung der allgemeinen Formel I mehr als ein asymmetrisches Zentrum und mehr als ein gegebenenfalls substitutierter Rest R ¹ mit einer oder mehreren Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure-Funktionen vorhanden, haben mindestens 50% der Anzahl der asymmetrischen Zentren, die Reste mit einer oder mehreren Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure-Funktionen aufweisen, die S-Konfiguration, bevorzugt 66%, starker bevorzugt 70%, starker bevorzugt 75%, starker bevorzugt 80%, starker bevorzugt 85%, starker bevorzugt 90%, starker bevorzugt 95%, am stärksten bevorzugt 100%.

In einer weiteren Ausfuhrungsform sind maximal 80% der Anzahl der

Reste R ¹ mit Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure-Funktionen substituiert und die übrigen Reste R ¹ sind H-Atome.

In einer weiteren Ausfuhrungsform sind maximal 60% der Anzahl der

Reste R ¹ mit Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure-Funktionen substituiert und die übrigen Reste R ¹ sind H-Atome.

In einer weiteren Ausfuhrungsform sind maximal 50% der Anzahl der

Reste R ¹ mit Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure-Funktionen substituiert und die übrigen Reste R ¹ sind H-Atome.

In einer weiteren Ausfuhrungsform sind maximal 40% der Anzahl der

Reste R ¹ mit Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure-Funktionen substituiert und die übrigen Reste R ¹ sind H-Atome.

In einer weiteren Ausfuhrungsform sind maximal 30% der Anzahl der

Reste R ¹ mit Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure-Funktionen substituiert und die übrigen Reste R ¹ sind H-Atome.

In einer weiteren Ausfuhrungsform sind maximal 20% der Anzahl der

Reste R ¹ mit Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure-Funktionen substituiert und die übrigen Reste R ¹ sind H-Atome.

In einer weiteren Ausfuhrungsform sind maximal 10% der Anzahl der

Reste R ¹ mit Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure-Funktionen substituiert und die übrigen Reste R ¹ sind H-Atome.

In einer weiteren Ausführungsform sind maximal 4% der Anzahl der Reste R ¹ mit Phosphonsäureester- oder Phosphonsäure-Funktionen substituiert und die übrigen Reste R ¹ sind H-Atome .

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen alle asymmetrischen Zentren (*) der allgemeinen Verbindung I die gleiche Konfiguration auf.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen alle asymmetrischen Zentren (*) der allgemeinen Verbindung I die S-Konfiguration auf.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen alle asymmetrischen Zentren (*) der allgemeinen Verbindung I die R-Konfiguration auf.

Ferner werden erfindungsgemäß Zusammensetzungen offenbart, die eine oder mehrere erfindungsgemäße Verbindungen gegebenenfalls in Kombination mit üblichen Adjuvantien enthalten.

Die Synthese der Verbindungen der allgemeinen Formel I erfolgt vorzugsweise aus enantiomerenreinen Monomeren. Während der Synthese der Verbindungen der allgemeinen Formel I können einzelne asymmetrische Zentren aufgrund der chemischen Synthesebedingungen zu einem geringen Prozentsatz ihre vorher definierte Konfiguration ändern. Der größte Prozentsatz, der während der Synthese gebildeten Verbindungen der allgemeinen Formel I, ist aber stereoisomerenrein. Auch diese Zusammensetzungen sind in der Lage, die erfindungsgemäße Aufgabe zu erfüllen.

Eine Verbindung der allgemeinen Formel I kann über die Reste K und L als Linker mit einer zweiten Verbindung der allgemeinen Formel I verbunden sein wobei die Reste wie oben definert sind. Die Konfiguration an den asymmetrischen Zentren der einen Verbindung der allgemeinen Formel I ist dabei unabhängig von der Konfiguration an den asymmetrischen Zentren der über den Linker verbundenen zweiten Verbindung der allgemeinen Formel I. So können beispielweise alle asymmetrischen Zentren der einen Verbindung der allgemeinen Formel I die R-Konfiguration aufweisen und alle asymmetrischen Zentren der zweiten, verbundenen Verbindung der allgemeinen Formel I die S-Konfiguration aufweisen. Es können auch beispielweise alle asymmetrischen Zentren der einen Verbindung der allgemeinen Formel I die R- Konfiguration aufweisen und alle asymmetrischen Zentren der zweiten, verbundenen Verbindung der allgemeinen Formel I die R- Konfiguration aufweisen.

Der Linker dient inbesondere dazu, den Abstand zwischen zwei Verbindungen der allgemeinen Formel I so einzustellen, dass zwischen den beiden Verbindungen der allgemeinen Formel I mit Linker und einzelstrangiger RNA oder DNA bzw. doppelstrangiger DNA eine gegenseitige Interaktion über die jeweiligen Nukleobasen erfolgen kann.

Als Linker eignen sich alle bekannten und alle für diesen Zweck eingesetzten bzw. einsetzbaren Linkermolekule. Beispielsweise kann ein solcher Linker eine gegebenenfalls substituierte Alkylkette, ein Peptid, ein Oligonukleotid, oder ein Oligomer, das aus mindestens drei 8-Amino-3, 6-dioxaoctansaure-Einheiten (egl-Einheiten) aufgebaut ist, sein.

Dxe Anzahl und die Reihenfolge der Reste R ¹ , die mit einer Phosphonsaureester- bzw. Phosphonsaure-Funktion substituiert sind, kann erfindungsgemaß frei gewählt werden. So kann beispielsweise jeder, jeder zweite, jeder dritte, jeder vierte, jeder fünfte, jeder sechste, jeder siebte, jeder achte, jeder neunte oder jeder zehnte Rest R ¹ mit einer Phosphonsaureester- bzw. Phosphonsaure-Funktion substituiert sein. Die Substitutionen mit den Phosphonsaureester- bzw. Phosphonsaure-Funktionen können regelmäßig sein oder an beliebigen Positionen vorliegen.

Ferner können auch mehrere Reste R ¹ aufeinander folgend mit einer Phosphonsaureester- bzw. Phosphonsaure-Funktion substituiert sein (benachbarte Anordnung) . Dabei können in der Verbindung der allgemeinen Formel I auch mehrere dieser benachbarten Anordnungen enthalten sein.

Es können aber auch beispielsweise nur einzelne Reste R ¹ an beliebigen Positionen mit einer Phosphonsaureester- bzw. die Phosphonsaure-Funktion substituiert sein.

Die Positionen mit den einzelnen, aufeinander folgenden Reste R ¹ , die mit einer Phosphonsaureester- bzw. die Phosphonsaure-Funktion substituiert sind, können beliebig sein.

In EP 1157031 werden Verbindungen beschrieben, die mit Phosphonsaureester- oder Phosphonsaure-Funktionen substituiert sind und dadurch eine gute Zellgangigkeit aufweisen.

Im Gegensatz zu den in EP 1157031 beschriebenen Verbindungen sind die hier beschriebenen, erfindungsgemaßen Verbindungen zusatzlich mit mindestens einem Monohydroxy-mononitro-phenyl-Rest oder Monohydroxy-dimtro-phenyl-Rest substituiert .

Bei diesen erfindungsgemaßen Verbindungen haben die Erfinder eine überraschende, selektive Lokalisierung sowohl an als auch in Mitochondrien innerhalb von lebenden Zellen festgestellt. Die erfindungsgemaßen Verbindungen können nach ihrer selektiven Lokalisierung sowohl an als auch in Mitochondrien ihre Wirksamkeit durch einen überraschend starken Antisense- oder antigenomischen Effekt innerhalb der Mitochondrien entfalten.

Zur Feststellung der Lokalisierung sowohl an als auch in Mitochondrien wurden erfindungsgemaße Verbindungen mit dem Fluoreszenz-Farbstoff Biotin gelabelt, um diese in Zellgangigkeitsexperimenten mit einem konfokalen Mikroskop anhand der grünen Fluoreszenz innerhalb der Zellen detektieren zu können. Zur Anfarbung der Mitochondrien wurde kommerziell erhältlicher „MitoTracker" verwendet, mit dessen Hilfe die Mitochondrien mit dem konfokalen Mikroskop anhand der roten Fluoreszenz zu erkennen sind. Gleichzeitig wurde der Zellkern durch „DAPI"-Anfarbung anhand seiner blauen Fluoreszenz identifiziert. Die Zellen wurden mit einer lOμM Losung der erfindungsgemaßen und Biotm-gelabelten Verbindungen 24 Stunden inkubiert und danach mit dem konfokalen Mikroskop analysiert. Dabei wurden verschiedene Linescans durch die Zellen gemessen.

Die Linescan-Analysen in den Abbildungen 1-4 durch die Heia- Zellen bzw. 143B parentalen Zellen zeigen die Signalintensitaten der Verbindungen der allgemeinen Formel I, der Mitochondrien und des Zellkerns.

An den parallelen Signalintensitaten der erfindungsgemaßen Verbindungen der allgemeinen Formel I mit einem Monohydroxy- mononitro-phenyl-Rest (Abb. 1-2) bzw. Monohydroxy-dinitro-phenyl- Rest (Abb. 3-4) und der Mitochondrien ist die selektive

Lokalisierung der Verbindungen der allgemeinen Formel I sowohl an als auch in den Mitochondrien deutlich zu erkennen. Im Zellkern dagegen sind keine erfindungsgemaßen Verbindungen zu erkennen. Die erfindungsgemaßen Verbindungen zeigen hierbei eine vergleichbare Selektivität in Bezug auf die Lokalisierung sowohl an als auch in Mitochondrien wie das kommerziell erhältliche Mitochondrien-Anfarbe-Reagenz „MitoTracker" .

Die erfindungsgemaßen Verbindungen zeigen einen ebenfalls überraschend starken Antisense- und antigenomischen Effekt innerhalb der Mitochondrien. Eine gegen die Expression des mitochondrialen Proteins COXl gerichtete erfindungsgemaße Verbindung reduziert in HeLa-Zellen bei einer Konzentration von lOμM den Protein-Level von COXl nach 3 Tagen auf 71% und nach 9 Tagen auf 20% im Vergleich zu unbehandelten HeLa-Zellen. Neben einem zeitabhängigen Effekt ist auch ein konzentrationsabhangiger Effekt beobachtbar. So wird beispielsweise nach 9 Tagen der Protein-Level von Coxl bei einer Konzentration von 2,5μM auf 55% und bei 50OnM noch auf 80% gesenkt.

Auch die Anzahl der Kopien an mitochondrialer DNA in den HeLa- Zellen wird durch die Behandlung mit den erfindungsgemaßen Verbindungen (mit Anti-COXl-Sequenz) ebenfalls zeit- und konzentrationsabhangig reduziert .

Wahrend bei einer Konzentration von lOμM nach 3 Tagen noch kein Effekt festgestellt werden kann, ist nach 6 Tagen eine Reduktion der mtDNA auf 81% und nach 9 Tagen auf 62% beobachtbar. Diese Werte stehen im Vergleich zu unbehandelten HeLa-Zellen bzw. im Vergleich zu HeLa-Zellen, die mit einer erfindungsgemaßen Verbindung behandelt wurden, die keine komplementäre Sequenz zur mtDNA besitzt (Negativ Kontrolle) .

Bei den HeLa-Zellen, die mit den erfindungsgemäßen Verbindungen (mit Anti-COXl-Sequenz) mit verschiedenen Konzentrationen behandelt wurden, sind beispielsweise die mtDNA-Kopien nach 9 Tagen bei lOμM auf 62%, bei 2,5μM auf 82% und bei 50OnM auf 83% reduziert .

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind damit den bekannten (A. Muratovska, R. N. Lightowlers, R. W. Taylor, D. M. Turnbull, R. A. J. Smith, J. A. Wilce, S. W. Martin, M. P. Murphy, Nucleic Acid Research, 2001, Vol. 29, No. 9, 1852-1863), mit einem Triphenyl-phosphonium-Rest gekoppelten, Peptidnukleinsäuren deutlich überlegen. Die dort beschriebenen Moleküle zeigen nur in zellfreien Systemen eine Bindung an mitochondriale DNA. Darüber hinaus sind diese Moleküle zwar in der Lage, die äußere Zellmembran einer Zelle zu durchdringen und sich an Mitochondrien anzulagern, zeigen aber dann in den Mitochondrien innerhalb von Zellen keine Wirksamkeit, wie zum Beispiel einen Antisense- oder antigenomischen Effekt.

Verbindungen der allgemeinen Formel I, die keinen Monohydroxy- mononitro-phenyl-Rest oder Monohydroxy-dinitro-phenyl-Rest an den Substituenten K, L oder R ¹ tragen, verteilen sich entweder gleichmäßig innerhalb von Zellen oder lagern sich in anderen Zellkompartimenten als den Mitochondrien an. überraschenderweise führt allein die Substitution der Verbindungen der allgemeinen Formel I mit einem Monohydroxy-mononitro-phenyl-Rest oder Monohydroxy-dinitro-phenyl-Rest zu einer selektiven Lokalisierung dieser mitochondrialen Wirkstoffe sowohl an als auch in Mitochondrien .

Dadurch stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren bereit, bei dem Verbindungen, beispielsweise Verbindungen, die

mit oder ohne Hilfe von Transfektionsreagentien bei einer extrazellulären Konzentration von unter 50 μM durch die äußere Zellmembran in das Zellinnere gelangen können, durch die kovalente Kopplung mit einem Monohydroxy-mononitro-phenyl-Rest oder Monohydroxy-dinitro-phenyl-Rest selektiv sowohl an als auch in Mitochondrien innerhalb von Zellen lokalisiert werden, um anschließend ihre Wirksamkeit an oder in Mitochondrien entfalten zu können.

Das Verfahren umfasst beispielsweise auch die kovalente Kopplung eines Monohydroxy-mononitro-phenyl-Rests oder Monohydroxy- dinitro-phenyl-Rests (gegebenenfalls über einen Linker M) an einen zur Oxidation oder Reduktion fähigen Wirkstoff wie beispielsweise ein Antioxidans, um dadurch einen selektiv gegen mitochondriale Krankheiten gerichteten Wirkstoff zu erhalten.

Auf Basis dieses Verfahrens stellt die Erfindung weitere Verbindungen der allgemeinen Formel V bereit:

Z-M-P V worin

Z eine zur Oxidation oder Reduktion fähige funktionelle Gruppe,

M eine Linkergruppe,

und P ein Monohydroxy-mononitro-phenyl-Rest oder Monohydroxy- dinitro-phenyl-Rest ist.

Bevorzugt ist Z eine Gruppe der allgemeinen Formel VI, VII, VIII oder IX

worin,

m und m' eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist.

Jedes Y und Y' ist unabhängig voneinander eine Alkoxy-, Thioalkyl-, Haloalkyl-, Halogen-, Mino-, Nitro- oder ein gegebenenfalls substituierter Alkyl- oder Aryl-Rest, oder, wenn m gleich 2 oder 3 ist, können zwei Reste Y zusammen ein oder zwei oder drei zu dem Aryl-Ring annelierten aliphatische, heterozyklische (Heteroatom ist O, S oder N) oder aromatische Ringe bilden.

Bevorzugt ist jedes Y und Y' unabhängig voneinander eine Methyloder eine Methoxy-Gruppe .

Bevorzugt ist M eine verzweigte oder unverzweigte, gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl- oder Alkylaryl-Kette, die gegebenenfalls auch eine Carbonsäureester-, Ether-, Amin- oder eine Carbonsäureamid-Funktion als Bestandteil dieser Kette aufweist, wobei M insgesamt bis zu 30 C-Atome aufweist, stärker bevorzugt ist M - (CH ₂ ) _p -, wobei p eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist, am stärksten bevorzugt ist M ein Ethyl- Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl- oder Decyl-Kette.

Am stärksten bevorzugt ist Z eine Gruppe der Formel

oder eine Gruppe der Formel

oder eine Gruppe der Formel

oder eine Gruppe der Formel

Die erfindungsgemaßen Verbindungen und das erfindungsgemaße Verfahren sind dadurch zur Behandlung von mitochondrialen Krankheiten sowie zu diagnostischen Zwecken im Zusammenhang mit Mitochondrien geeignet. Dies sind beispielsweise Erbkrankheiten, Krebs, Parkinson oder Diabetes. Erfindungsgemaße Verbindungen können auch als anti-aging-Wirkstoffe eingesetzt werden.

Auch die Verwendung der erfindungsgemaßen Verbindungen zur Herstellung von Arzneimitteln zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Erkrankungen ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Im Allgemeinen werden erfindungsgemaße Verbindungen unter Anwendung der bekannten und akzeptablen Modi, entweder einzeln oder in Kombination mit einem beliebigen anderen therapeutischen Mittel verabreicht. Die Verabreichung kann z.B. auf einem der folgenden Wege erfolgen: oral, z.B. als Dragees, überzogene Tabletten,

Pillen, Halbfeststoffe, weiche oder harte Kapseln, Losungen, Emulsionen oder Suspensionen; parenteral, z.B. als injizierbare Losung; rektal als Suppositorien; durch Inhalation, z.B. als Pulverformulierung oder Spray, transdermal oder intranasal. Zur Herstellung solcher Tabletten, Pillen, Halbfeststoffe, überzogenen Tabletten, Dragees und harten Gelatinekapseln kann das therapeutisch verwendbare Produkt mit pharmakologisch inerten, anorganischen oder organischen Arznei- mitteltragersubstanzen vermischt werden, z.B. mit Lactose, Sucrose, Glucose, Gelatine, Malz, Silicagel, Starke oder Derivaten derselben, Talkum, Stearinsaure oder ihren Salzen, Trockenmagermilch und dgl . Zur Herstellung von weichen Kapseln kann man Arzneimitteltragerstoffe wie z.B. pflanzliche Ole, Petroleum, tierische oder synthetische Ole, Wachse, Fette, Polyole einsetzen. Zur Herstellung von flussigen Losungen und Sirups kann man Arzneimitteltragerstoffe wie z.B. Wasser, Alkohole, wassrige Salzlosung, wassrige Dextrose, Polyole, Glycerin, pflanzliche Ole, Petroleum, tierische oder synthetische Ole verwenden. Für Suppositorien kann man Arzneimitteltragerstoffe wie z.B. pflanzliche Ole, Petroleum, tierische oder synthetische Ole, Wachse, Fette und Polyole verwenden. Für Aerosol- Formulierungen kann man komprimierte Gase, die für diesen Zweck geeignet sind, wie z.B. Sauerstoff, Stickstoff, Fluorchlorkohlenwasserstoffe, FluorkohlenwasserStoffe,

Chlorkohlenwasserstoffe und Kohlendioxid einsetzen. Die pharmazeutisch verwendbaren Mittel können auch Zusatzstoffe zur Konservierung, Stabilisierung, Emulgatoren, Süßstoffe, Aromastoffe, Salze zur Veränderung des osmotischen Drucks, Puffer, Umhullungszusatzstoffe und Antioxidantien enthalten.

Die erfindungsgemaßen Verbindungen der allgemeinen Formel I lassen sich beispielsweise mittels in der Literatur beschriebenen

Verfahren durch Umsetzung von Verbindungen der allgemeinen Formel II in an sich bekannter Weise (z.B. L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P.E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J.Pept.Sci. 3, 1995, 175-183. T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J.Pept.Res. 49, 1997, 80-88. F. Bergmann, W. Bannwarth, S. Tarn, Tetrahedron Lett. 36, 1995, 6823-6826) herstellen.

Die Einfuhrung von Monohydroxy-mononitro-phenyl-Resten oder Monohydroxy-dinitro-phenyl-Resten als Substituent in den erfindungsgemaßen Verbindungen kann beispielsweise über die Kopplung der Verbindungen der allgemeinen Formel III oder IV an eine Aminfunktion in den Resten K, L oder R ¹ erfolgen.

III IV

Im Folgenden wird die Verbindung der allgemeinen Formel III als MNPA („MonoNitro-hydroxy-Phenyl-Acetat") die Verbindung der allgemeinen Formel IV als DNPA („DiNitro-hydroxy-Phenyl-Acetat") abgekürzt .

In den Verbindungen der allgemeinen Formel II

II

ist der Rest R ^ 14 z.B. ein H-Atom oder ein Allyl-, Benzyl-, Ethyl-, Methyl-Rest oder ein lösliches oder unlösliches Polymer.

Pr ist ein H-Atom oder eine abspaltbare Aminschutzgruppe . Die Aminschutzgruppe muß in Gegenwart der Nukleobasen-Schutzgruppen selektiv abspaltbar sein. Vorzugsweise ist Pr ein H-Atom, eine Oxocarbamat- oder eine Thiocarbamat-Schutzgruppe, am stärksten bevorzugt ist Pr ein H-Atom oder eine Fmoc-, Boc-, Cbz-, Mmt- oder eine Bhoc-Schutzgruppe.

E und der Rest R ¹ sind wie oben definiert.

Das asymmetrische Zentrum (*), an das der Rest R ¹ bindet, kann die R- oder S-Konfiguration aufweisen.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel II können zum Beispiel nach folgendem Verfahren hergestellt werden.

Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel II mit R- Konfiguration am asymmetrischen Zentrum:

Reaktionsschritt 1:

Ausgehend von der S-Konfiguration des Pyrazin-Edukts kann die Durchfuhrung beispielsweise wie in der Literatur beschrieben (U. Schόllkopf, U. Busse, R. Lonsky, R. Hinrichs, Liebigs Ann. Chem. 1986, 2150 -2163; A. Schick, T. Kolter, A. Giannis, K. Sandhoff, Tetrahedron _5JL, 1995, 11207-11218) erfolgen.

Reaktionsschritt 2:

Die Durchfuhrung kann beispielsweise wie in der Literatur beschrieben (U. Schollkopf, U. Busse, R. Lonsky, R. Hinrichs, Liebigs Ann. Chem. 1986, 2150 -2163) erfolgen.

Reaktionsschritt 3:

Das Produktgemisch aus Reaktionsschritt 2 kann, nach Freisetzung der Amine aus ihren Hydrochloriden durch eine Base (z.B. NaHCθ ₃ , NH ₃ ) , in die Fσlgereaktion eingesetzt werden. Diese, eine reduktive Aminierung, kann wie in der Literatur beschrieben (G. Haaima, A. Lohse, O. Buchardt, P.E. Nielsen, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 1996, No 17, 1939-1942) durchgeführt werden. Statt Natriumcyanoborhydπd können auch andere Reduktionsmittel wie z. B. Wasserstoff und ein Katalysator (z. B. Pd/C) verwendet werden. Die Reaktionsprodukte werden chromatographisch aufgetrennt .

Reaktionsschritt 4 :

Die Durchfuhrung kann beispielsweise wie in der Literatur beschrieben (G. Haaima, A. Lohse, 0. Buchardt, P.E. Nielsen,

Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 1996, No 17, 1939-1942) erfolgen. Dabei können auch andere Kupplungsreagentien an Stelle von DCC /DHBT eingesetzt werden.

Die Herstellung der Verbindung E-CH ₂ -COOH (zum Beispiel C(PG)-CH ₂ - COOH, A(PG)-CH ₂ -COOH, G(PG)-CH ₂ -COOH oder T-CH ₂ -COOH, J(PG)-CH ₂ - COOH wobei A = Adeninyl, C = Cytosinyl, G = Guaninyl, T = Thyminyl, J = Pseudoisocytosinyl PG = Schutzgruppe wie beispielsweise Benzyloxycarbonyl (Z), Benzyl (BzI), Acetyl (Ac) oder Anisoyl (An) ) kann beispielsweise wie in der Literatur beschrieben (S.A. Thomson, J.A. Josey, R.Cadilla, M. D. Gaul, F. C. Hassmann, M. J. Lazzio, A. J. Pipe, K. L. Reed, D. J. Ricca, R.W. Wiether, S.A. Noble, Tetrahedron 51, 1995, 6179-6194) erfolgen. Weitere mögliche Schutzgruppen sind ebenfalls in der Literatur beschrieben (G. Breitpohl, D.W. Will, A. Peymann, E. Uhlmann, Tetrahedron 53, 1997, 14671-14686; T. Kofoed, H. F. Hansen, H. Orum, T. Koch, J. Peptide Sei., 7, 2001, 402-412)

Reaktionsschritt 5:

Die Durchführung kann beispielsweise wie in der Literatur beschrieben (G. Haaima, A. Lohse, 0. Buchardt, P.E. Nielsen, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 1996, No 17, 1939-1942) erfolgen.

Zur einfacheren Beschreibung der Verbindungen der allgemeinen Formel II, die als Produkte in dem Reaktionsschritt 5 entstehen, werden folgende Abkürzungen verwendet:

Wird beispielsweise A(PG)-CH ₂ -COOH im Reaktionsschritt 5 eingesetzt, so erhält man die entsprechende Verbindung der allgemeinen Formel II, die ein asymmetrisches Zentrum aufweist. Diese Verbindung wird hier im Allgemeinen als A ^R (PG) abgekürzt. Dabei steht A für die Nukleobase in der Verbindung der allgemeinen Formel II mit einem asymmetrischen Zentrum, das hochgestellte R steht für die R-Konfiguration der Verbindung und das PG steht für die Schutzgruppe an der Nukleobase. Wird beispielsweise Phenylessigsäure im Reaktionsschritt 5 eingesetzt, so erhält man eine Verbindung der allgemeinen Formel II mit einem asymmetrischen Zentrum, die als P ^R abgekürzt wird.

Die entsprechenden Verbindungen der allgemeinen Formel II ohne asymmetrisches Zentrum (R ¹ = H) werden analog zu den Verbindungen der allgemeinen Formel II mit einem asymmetrischen Zentrum abgekürzt, mit dem Unterschied, dass anstatt des Großbuchstabens für die Nukleobase und des hochgestellten Buchstabens für die Konfiguration (z.B. A ^R ) der entsprechende Kleinbuchstabe a

verwendet wird. Beispielsweise wird eine Verbindung der allgemeinen Formel II ohne asymmetrisches Zentrum mit PG- geschutztem C als Nukleobase als c(PG) abgekürzt.

Für die Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel II mit S-Konfiguration am asymmetrischen Zentrum wird im Reaktionsschritt 1 das Pyrazin-Edukt mit der R-Konfiguration eingesetzt und die Reaktionsschritte 1 bis 5 analog durchgeführt. Man erhalt dann beispielsweise eine Verbindung der allgemeinen Formel II mit der Abkürzung A ^S (PG) .

Die erfindungsgemaßen Verbindungen lassen sich beispielsweise mittels Festphasensynthese durch Umsetzung von Verbindungen der allgemeinen Formel II in an sich bekannter Weise herstellen. Nach der Festphasensynthese werden die Schutzgruppen an den Nukleobasen abgespalten, so dass man Verbindungen der allgemeinen Formel I erhalt, die wie folgt abgekürzt werden:

Beispielsweise wird eine erfindungsgemaße Verbindung, die nur aus Verbindungen der allgemeinen Formel II mit einem asymmetrischen Zentrum mit R-Konfiguration hergestellt und welche im letzten Schritt mit MNPA-OH gekuppelt und danach als primäres Amid vom Harz abgespalten wurde, abgekürzt als MNPA- A ^R C ^R G ^R G ^R T ^R C ^R G ^R G ^R C ^R G ^R A ^R A ^R C ^R A ^R T ^R -NH ₂ .

Beispielsweise wird eine erfindungsgemaße Verbindung, die aus Verbindungen der allgemeinen Formel II mit einem asymmetrischen Zentrum mit R-Konfiguration und Verbindungen der allgemeinen Formel II ohne asymmetrisches Zentrum hergestellt und welche im letzten Schritt mit MNPA-OH gekuppelt und danach als primäres Amid vom Harz abgespalten wurde, abgekürzt als MNPA- A ^R cG ^R gT ^R cG ^R gC ^R gA ^R aC ^R aT ^R -NH ₂ .

Beispielsweise wird eine erfindungsgemaße Verbindung, die nur aus Verbindungen der allgemeinen Formel II mit einem asymmetrischen Zentrum mit S-Konfiguration hergestellt und welche im letzten

Schritt mit DNPA-OH gekuppelt und danach als primäres Amid vom Harz abgespalten wurde, abgekürzt als DNPA- A ^S C ^S G ^S G ^S T ^S C ^S G ^S G ^S C ^S G ^S A ^S A ^S C ^S A ^S T ^S -NH ₂ .

Beispielsweise wird eine erfindungsgemäße Verbindung, die nur aus Verbindungen der allgemeinen Formel II mit einem asymmetrischen Zentrum mit S-Konfiguration und Verbindungen der allgemeinen Formel II ohne asymmetrisches Zentrum hergestellt und welche im letzten Schritt mit DNPA gekuppelt und danach als primäres Amid vom Harz abgespalten wurde, abgekürzt als DNPA- A ^s cG ^s gT ^s cG ^s gC ^s gA ^s aC ^s aT ^s -NH ₂ .

Beispielsweise wird eine erfindungsgemäße Verbindung, die an einem Boc-Gly-PAM-MBHA-Harz nur aus Verbindungen der allgemeinen Formel II mit einem asymmetrischen Zentrum mit R-Konfiguration und Verbindungen der allgemeinen Formel II ohne asymmetrisches Zentrum hergestellt und welche im letzten Schritt mit DNPA gekuppelt und danach als primäres Amid vom Harz abgespalten wurde, abgekürzt als DNPA- tG ^R cC ^R tA ^R ggactc ^R cA ^R gC ^R -Gly-NH ₂ . Beispielsweise wird eine erfindungsgemaße Verbindung, die an einem Boc-Gly-PAM-MBHA-Harz nur aus Verbindungen der allgemeinen Formel II mit einem asymmetrischen Zentrum mit R-Konfiguration und Verbindungen der allgemeinen Formel II ohne asymmetrisches Zentrum, Glycin sowie zwei Aminosäuren wie 4-(Diethoxy- phosphoryl) -2- (tert .butoxycarbonylamino) -buttersäure (Boc-DEPABS) hergestellt und welche im letzten Schritt mit DNPA gekuppelt und danach als primäres Amid vom Harz abgespalten wurde, abgekürzt als DNPA- ( DEPABS) ₂ -Gly- tG ^R cC ^R tA ^R ggactc ^R cA ^R gC ^R -Gly-NH ₂ . Beispielsweise wird eine erfindungsgemäße Verbindung, die an einem Boc-Gly-PAM-MBHA-Harz aus Verbindungen der allgemeinen Formel II mit einem asymmetrischen Zentrum mit R-Konfiguration und Verbindungen der allgemeinen Formel II ohne asymmetrisches Zentrum, dem Chelator 1, 4, 7, lO-Tetraazacyclododecane-l, 4, 7, 10- tetraessigsäure-tri-tert .butylester (DOTA) hergestellt und welche

im letzten Schritt mit DNPA gekuppelt und danach als primäres Amid vom Harz abgespalten wurde, abgekürzt als DNPA-DOTA- gG ^R cT ^R cG ^R aA ^R tA ^R aG ^R gA ^R gG ^R -Gly-NH ₂ .

Beispiele

Beispiel 1: Herstellung von (2R, 5S) -2- (2- (Diethoxy- phosphoryl) ethyl) -2 , 5-dihydro-3 , 6-dimethoxy-5-isopropyl-pyrazin

0,52 mol (S) -2, 5-Dihydro-3, 6-dimethoxy-2-isopropylpyrazin werden in 400 ml absolutem THF unter Argon gelost und auf -78°C gekühlt. Unter Ruhren werden 200 ml einer 2,7 M Butyllithium-Losung (in Heptan) (0,54 mol) langsam zugetropft. Anschließend tropft man eine Losung von 0,52 mol Diethyl- (2-bromethyl) -phosphonat in 300 ml absolutiertem THF langsam unter Ruhren zu und rührt weitere 3 h bei -78°C. Dann werden 11,7 ml (ca. 0,2 mol) wasserfreie Essigsaure langsam zugegeben. Man lasst die Reaktionsmischung dann langsam auf Raumtemperatur erwarmen. Das Losemittel wird entfernt, der Ruckstand in 600 ml Diethylether aufgenommen und mit 200 ml Wasser gewaschen. Die wassrige Phase wird noch 3-mal mit je 100 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten Etherphasen werden über MgSO ₄ getrocknet, filtriert und das Losemittel wird im Vakuum entfernt. Der Ruckstand wird in

Et ₂ O/Hexan (1/10) aufgenommen und über ein Kieselgelbett filtriert. Danach wird nicht umgesetztes Edukt mit Et ₂ O /Hexan (1/5) eluiert. Abschließend wird dann das Produkt mit Essigester eluiert .

Ausbeute: ca. 70 %, Gelbe Flüssigkeit

¹ H-NMR(CDCl ₃ ): 0.71, 1.04 (d, 6H, CH(CH ₃ ) ₂ ), 1.33 (t, 6H, P(O) (OCH ₂ CH ₃ ) _z ) , 1.68-2.25 (m, 4H, CHCH ₂ CH ₂ P), 3.65, 3.67 (s, 6H, OCH ₃ ), 4.02 (m, IH), 4.10-4.20 (m, 4H, P (O) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) .

Beispiel 2: Herstellung von (2R, 5S) -2- (8- (Dibenzyloxy- phosphoryl) octyl) -2 , 5-dihydro-3 , 6-dimethoxy-5-isopropyl-pyrazin

Analog dem Herstellungsverfahren in Beispiel 1 wird ausgehend von (S) -2, 5-Dihydro-3, 6-dimethoxy-2-isopropylpyrazin und Dibenzyl- (8- bromoctyl) -phosphonat (2R, 5S) -2- (8- (Dibenzyloxy- phosphoryl) octyl) -2, 5-dihydro-3, 6-dimethoxy-5-isopropyl-pyrazin hergestellt .

Beispiel 3: Herstellung von (2S , 5R) -2- (4- (Dicyclohexyloxy- phosphoryl)but-2-enyl) -2 , 5-dihydro-3 , 6-dimethoxy-5-isopropyl- pyrazin

Analog dem Herstellungsverfahren in Beispiel 1 wird ausgehend von (R) -2, 5-Dihydro-3, 6-dimethoxy-2-isopropylpyrazin und

Dicyclohexyl- (4-brom-but-2-enyl) -phosphonat (2S, 5R) -2- (4- (Dicyclohexyloxy-phosphoryl) but-2-enyl) -2, 5-dihydro-3, 6- dimethoxy-5-isopropyl-pyrazin hergestellt .

Beispiel 4: Herstellung von (2R) -2- [2-

(tert.Butoxycarbonylamino) ethyl] -amino-4- (diethoxy-phosphoryl) - buttersäuremethyIester

0,38 mol (2R, 5S) -2- (2- (Diethoxy-phosphoryl) ethyl) -2, 5-dihydro- 3, 6-dimethoxy-5-isopropyl-pyrazin werden in 400 ml Diethylether gelost. Zu dieser Losung werden 1150 ml einer IN wassrigen HCl- Losung zugefugt. Nach 60 min ist die Reaktion beendet, und der Ether wird entfernt. Soll das Produkt gelagert werden, wird auch das Wasser komplett im Vakuum entfernt.

Soll das Produkt gleich weiter umgesetzt werden, wird das Wasser etwa zur Hälfte abrotiert, dann wird der pH-Wert des Reaktionsgemisches mit Ammoniaklosung auf 8-9 eingestellt. Die basische Losung wird 6x mit Dichlormethan extrahiert, wobei jedes Mal der pH-Wert kontrolliert und nötigenfalls korrigiert wird. Die Dichlormethan-Phasen werden vereinigt, mit MgSO ₄ getrocknet, und das Losungsmittel im Vakuum entfernt. Das resultierende gelbe

Ol wird sofort in der Folgereaktion , der reduktiven Aminierung eingeset zt .

Das gelbe Ol (angenommen wird ein vollständiger Umsatz) wird in 600 ml Methanol aufgenommen und auf 0 ⁰ C gekühlt. Anschließend werden 0,76 mol N-Boc-Aminoacetaldehyd zugegeben. Nachdem 30 min. bei 0 ⁰ C gerührt wurde, werden erst 0,90 mol wasserfreie Essigsaure, dann 0,40 mol Natriumcyanoborhydrid zugefugt. Die Reaktionsmischung wird bei 0 ⁰ C gerührt, bis die Gasentwicklung beendet ist, dann wird das Losemittel am Rotationsverdampfer entfernt. Der Ruckstand wird in Essigsaureethylester aufgenommen (ca. 600 ml) und einmal mit gesättigter NaHCθ ₃ ~Lsg. (ca. 200 ml) und einmal mit gesättigter NaCl-Lsg. (ca. 100 ml) gewaschen. Die organische Phase wird mit MgSO4 getrocknet und filtriert. Anschließend wird das Losungsmittel im Vakuum entfernt. Die weitere Aufreinigung erfolgt durch SPE über eine mit Kieselgel gefüllte Glasfritte. Verunreinigungen und unerwünschte Produkte werden zuerst mit Hexan/Essigester 1:1, dann mit reinem Essigester eluiert. Das gewünschte Produkt wird schließlich durch Extraktion mit 10% Methanol in Dichlormethan erhalten.

Nach Entfernen des Losemittels werden ca. 75% Produkt als gelbes viskoses Ol erhalten.

¹ H-NMR(CDCl ₃ ): 1.35 (t, 6H, P(O)(OCH ₂ CHj) ₂ ), 1.47 (s, 9H, C(CH ₃ J ₃ ); 1.8-2.0 (m, 4H, CHCH ₂ CH ₂ P,), 2.5-2.6, 2.75-2.85, 3.0-3.4 (m, 4H, NCH ₂ CH ₂ N), 3.75 (s, 3H, OCH ₃ ), 4.0-4.2 (m, 4H, P (O) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) .

Beispiel 5: Herstellung von (2R) -2- [2-

(tert . Butoxycarbonylamino) ethyl] -amino-10- (dibenzyloxy- phosphoryl) -decansäuremethylester

Analog dem Herstellungsverfahren in Beispiel 4 wird ausgehend von (2R, 5S) -2- (8- (Dibenzyloxy-phosphoryl) octyl) -2, 5-dihydro-3, 6- dimethoxy-5-isopropyl-pyrazin (2R) -2- [2- (tert . Butoxycarbonylamino) ethyl] -amino-10- (dibenzyloxy- phosphoryl) -decansäuremethylester hergestellt .

Beispiel 6: Herstellung von (2S) -2- [2-

(tert.Butoxycarbonylamino) ethyl] -amino-6- (dicyclohexyloxy- phosphoryl) -hex-4-ensäuremethylester

Analog dem Herstellungsverfahren in Beispiel 4 wird ausgehend von (2S, 5R) -2- (4- (Dicyclohexyloxy-phosphoryl) but-2-enyl) -2, 5-dihydro- 3, 6-dimethoxy-5-isopropyl-pyrazin (2S) -2- [2-

(tert . Butoxycarbonylamino) ethyl] -amino-6- (dicyclohexyloxy- phosphoryl) -hex-4-ensauremethylester hergestellt.

Beispiel 7: Herstellung von (R)-2- ( [2-{N4- Benzyloxycarbonylcytosin-lyl } -acetyl] - [2-

tert .butoxycarbonylamino-ethyl] -amino) -4- (diethoxy-phosphoryl) - buttersäure-methylester

Zu einer gerührten Losung aus 30,96 mmol 4-N- (Benzyloxycarbonyl) - cytosin-1-yl-essigsaure, und 30,96 mmol 3, 4-Dihydro-3-hydroxy-4- oxo-1,2, 3-benzotnazm (DHBT-OH) in 100 ml absolutem DMF werden 32,51 mmol DCC gegeben, und diese Losung wird für 1 h bei 4O ⁰ C gerührt. Anschließend werden 23,84 mmol (2R) -2- [2- (tert . Butoxycarbonylamino) ethyl] -amino-4- (diethoxy-phosphoryl) - buttersauremethylester gegeben und bei 40° gerührt. Die Reaktion wird mit HPLC verfolgt und ist nach 3 Tagen beendet. Vom Unlöslichen wird abfiltriert, das Losemittel wird im Vakuum entfernt. Der Ruckstand wird in Dichlormethan aufgenommen und über Nacht in den Kühlschrank gestellt. Dabei fallt weiterer Dicyclohexylharnstoff aus, der abfiltriert wird. Das Filtrat wird 2-3x mit verdünnter NaHC0 ₃ -Losung (1/3 ges. NaHC0 ₃ -Lsg., 2/3 Wasser) , l-2x mit verdünnter KHSCg-Losung (1/3 gesättigter KHSO4- Lsg., 2/3 Wasser) gewaschen, mit MgSO ₄ getrocknet und einrotiert. Die weitere Aufreinigung erfolgt durch Losen in Essigester und Lagerung über Nacht im Kühlschrank, wonach eventuell weiterer ausgefallener Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Losemittel wieder entfernt wird. Das Rohprodukt wird dann in Dichlormethan gelost (5 mL je 3 g Rohprodukt) und mit Diethylether (25 mL je 3 g Rohprodukt) und Hexan (5 mL je 3 g

Rohprodukt) wieder ausgefallt. Das Losemittel mit Verunreinigungen wird entfernt und das Produkt in Vakuum getrocknet .

Ausbeute: ca. 65% hellgelber Feststoff

¹ H-NMR(CDCl ₃ ): 1.32 (t, 6H, P (0) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) ; 1.44 (s, 9H, C(CH ₃ J ₃ ); 1.75-2.45 (m, 4H, CHCH ₂ CH ₂ P); 3.2-3.85 (m, 4H, NCH ₂ CH ₂ N); 3.73 (s, 3H, OCH ₃ ); 4.07 (m, 4H, P (0) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) ; 4.28 (m, IH, NCHC(O)); 4.42/4.99 (2d, 2H, NCH ₂ C(O)); 5.22 (s, 2H, OCH ₂ Ph); 5.56 (t, br, IH, C(O)NHCH ₂ ); 7.25 (d, IH, CCH=CHN); 7.38 (s, 5H, Ph); 1.55 (d, IH, CCH=CHN) .

Beispiel 8: Herstellung von (R) -2- ( [2-{N4-Benzyloxycarbonylamino- cytosin-lyl}-acetyl] - [2-tert.butoxycarbonylamino-ethyl] -amino) -4- (diethoxy-phosphoryl) -buttersäure

19,1 mmol (R) -2- ( [2- {N4-Benzyloxycarbonylcytosin-l-yl } -acetyl] - [2-tert . butoxycarbonylammo-ethyl] -amino) -4- (diethoxy- phosphoryl) -buttersaure-methylester wird in 80 ml THF / Wasser (2/3) gelost und auf 0°C gekühlt. Dazu werden 48 ml einer IM Lithiumhydroxid-Losung getropft (pH ~ 9) . Der Fortschritt der

Reaktion wird mit DC (10% Methanol in Dichlormethan) verfolgt. Nach Abschluss der Reaktion wird die Reaktionslosung mit 130 ml Wasser / NaCl-Losung verdünnt und einmal mit Dichlormethan (200 ml) extrahiert. Die wassrige Phase wird mit 2M KHS0 ₄ -Losung auf pH 2-3 eingestellt und mehrfach mit Dichlormethan extrahiert. Dabei wird immer wieder der pH-Wert kontrolliert und nötigenfalls nachkorrigiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über MgSO ₄ getrocknet, und das Losungsmittel im Vakuum entfernt. Wenn notwendig, kann das Rohprodukt aus Dichlormethan mit Diethylether umgefallt werden. Schließlich wird das Produkt am Lyophylisator getrocknet .

Ausbeute: ca. 80 % weißgelber Feststoff

¹ H-NMR(DMSO-d ₆ ) : 1.21 (t, 6H, P (0) (OCH ₂ CW ₃ ) 2) ; 1.39 (s, 9H, C (CH ₃ ) ₃ ); 1.70-2.30 (m, 4H, CHCH ₂ CF ₂ P); 2.90-3.60 (m, 4H, NCH ₂ CH ₂ N); 3.93-4.02 (m, 4H, P (O) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) ; 4.25 (m, IH, NCHC(O)); 4.50-4.83 (m, 2H, NCH ₂ C(O)); 5.19 (s, 2H, OCH ₂ Ph); 6.88 (m, br, IH, C(O)NHCH ₂ ); 7.02 (d, IH, CCH=CHN); 7.31-7.41 (m, 5H, Ph); 7.97 (d, IH, CCH=CHN).

Beispiel 9 : Herstellung von weiteren Verbindungen der allgemeinen Formel II

Durch analoge Synthesen wie in den Beispielen 7 und 8 beschrieben, bei denen neben C(Z)-CH ₂ -COOH weitere Z-geschutzte, Benzyl-geschutzte (BzI) , Anisoyl-geschutzte (An) bzw. Acetyl- geschutzte (Ac) und ungeschützte Nukleobasen-Essigsaure- Komponenten A(Z)-CH ₂ -COOH, A(An)-CH ₂ -COOH, A(BzI)-CH ₂ -COOH, G(Z)- CH ₂ -COOH, G(Ac)-CH ₂ -COOH, C(An)-CH ₂ -COOH, C(BzI)-CH ₂ -COOH, J(Z)- CH ₂ -COOH, J(BzI)-CH ₂ -COOH, J(An)-CH ₂ -COOH bzw. T-CH ₂ -COOH (A = Adeninyl, C = Cytosinyl, G = Guaninyl, T = Thyminyl; J =

Pseudoisocytosinyl) sowie Phenylessigsäure eingesetzt werden, werden weitere erfindungsgemäße Verbindungen der allgemeinen Formel II hergestellt.

A ^R (Z) :

¹ H-NMR ( CH ₃ OH-d ₄ ) : 1.20 (t, 6H, P (O) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) ; 1-34 (S, 9H, C (CH ₃ ) ₃ ) ; 1.70-2.30 (m, 4H, CHCH ₂ CH ₂ P) ; 3.00-3.80 (in, 4H, NCH ₂ CH ₂ N) ; 3.93-4.02 (m, 4H, P(O) (OCH ₂ CH ₃ J ₂ ) ; 4.10 (m, IH, NCHC(O) ) ; 5.18 (s, 2H, OCH ₂ Ph) ; 5.20-5.40 (m, 2H, NCH ₂ C(O) ) ; 7.15- 7.40 (m, 5H, Ph) ; 8.14 (s, IH, N=CHN) ; 8.46 (s, IH, N=CHN) .

A ^R (BzI) :

¹ H-NMR ( DMSO-d ₆ ) : 1.21 (t, 6H, P (0) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) , 1.40 (s, 9H,

C(CH ₃ J ₃ ) ; 1.70-2.20 (m, 4H, CHCH ₂ CH ₂ P, ) , 2.90-3.75 (m, 4H,

NCH ₂ CH ₂ N) ; 3.90-4.10 (m, 4H, P (O) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) ; 4.22 (m, IH,

NCHC(O) ) ; 5.25-5.45 (m, 2H, NCH ₂ C(O) ) ; 6.96 (m, br, IH,

C(O)NHCH ₂ ) ; 7.50-8.10 (m, 5H, Ph) ; 8.42 (s, IH, N=CHN) ; 8.69 (s, IH, N=CHN) .

A ^R (An) :

¹ H-NMR ( DMSO-d ₆ ) : 1.21 (t, 6H, P (0) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) ; 1.41 (s, 9H,

C(CH ₃ J ₃ ) ; 1.70-2.20 (m, 4H, CHCH ₂ CH ₂ P) ; 2.90-3.750 (m, 4H, NCH ₂ CH ₂ N) ; 3.86 (s, 3H, OCH ₃ ) ; 3.90-4.10 (m, 4H, P (O) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) ;

4.22 (m, IH, NCHC(O) ) ; 5.25-5.45 (m, 2H, NCH ₂ C(O) ) ; 6.96 (m, br,

IH, C(O)NHCH ₂ ) ; 7.08 (d, 2H, Ph) ; 8.05 (d, 2H, Ph) ; 8.42 (s, IH, N=CHN) ; 8.69 (s, IH, N=CHN) .

J^(Z) :

¹ H-NMR (DMSO-d ₆ ) : 1.32 (t, 6H, P (0) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) , 1.42 (s, 9H,

C(CH ₃ J ₃ ) ; 1.60-2.50 (m, 4H, CHCH ₂ CH ₂ P,) , 3.10-3.55 (m, 4H, NCH ₂ CH ₂ N) ; 3.65-3.90 (m, 2H, NCH ₂ C(O) ) ; 4.00-4.15 (m, 4H, P(O) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) ; 4.20 (m, IH, NCHC(O) ) ; 5.24 (s, 2H, OCH ₂ Ph) ; 6.80

(m, br, IH, C(O)NHCH ₂ ) ; 7.27 (d, IH, C=CHN) ; 7.30-7.50 (m, 5H, Ph) .

J^(An) :

¹ H-NMR ( DMSO-de ) : 1.22 (t, 6H, P(O) (OCH ₂ CH ₃ J ₂ ) ; 1.38 (s, 9H,

C (CH ₃ ) ₃ ) ; 1.65-2.25 (m, 4H, CHCH ₂ CH ₂ P) ; 2.80-3.70 (m, 4H, NCH ₂ CH ₂ N) ; 2.80-3.70 (m, 2H, CCH ₂ C(O) ) ; 3.84 (s, 3H, OCH ₃ ) ; 3.90-

4.05 (m, 4H, P (O) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) ; 4.17 (m, IH, NCHC(O) ) ; 6.81 (m, br,

IH, C(O)NHCH ₂ ) ; 7.05 (d, 2H, Ph) ; 7.70 (s, IH, NCH=C) ; 8.07 (d, 2H, Ph) .

G ^R (Z) :

¹ H-NMR ( DMSO-d ₆ ) : 1.18 (t, 6H, P (O) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) , 1.37 (s, 9H, C(CH ₃ ) ₃ ) ; 1.70-2.30 (m, 4H, CHCH ₂ CH ₂ P, ) , 2.95-3.70 (m, 4H, NCH ₂ CH ₂ N) ; 3.90-4.10 (m, 4H, P (O) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) ; 4.20 (m, IH, NCHC(O) ) ; 4.85-5.20 (m, 2H, NCH ₂ C(O) ) ; 5.269 (s, 2H, OCH ₂ Ph) ; 6.95 (m, br, IH, C(O)NHCH ₂ ) ; 7.30-7.50 (m, 5H, Ph) ; 7.85 (s, IH, N=CHN) .

G ^R (Ac) :

¹ H-NMR ( DMSO-de) : 1.20 (t, 6H, P (O) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) ; 1.41 (s, 9H, C(CH ₃ J ₃ ) ; 1.70-2.18 (m, 4H, CHCH ₂ CH ₂ P) ; 2.20 (s, 3H, CH ₃ C(O) ) ; 2.90-3.60 (m, 4H, NCH ₂ CH ₂ N) ; 3.90-4.10 (m, 4H, P (O) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) ; 4.22 (m, IH, NCHC(O) ) ; 4.91-5.22 (m, 2H, NCH ₂ C(O) ) ; 7.00 (m, br, IH, C(O)NHCH ₂ ) ; 7.88 (s, IH, N=CH-N) ; .

C ^R (BzI) :

¹ H-NMR (DMSO-d ₆ ) : 1.21 (t, 6H, P (0) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) ; 1.40 (s, 9H,

C (CH ₃ ) ₃ ) ; 1.70-2.30 (m, 4H, CHCH ₂ CH ₂ P) ; 3.20-3.60 (m, 4H,

NCH ₂ CH ₂ N) ; 3.93-4.02 (m, 4H, P(O) (OCH ₂ CH ₃ J ₂ ) ; 4.28 (m, IH,

NCHC(O) ) ; 4.50-4.83 (m, 2H, NCH ₂ C(O) ) ; 6.90 (m, IH,

C(O)NHCH ₂ ) ; 7.33 (d, IH, CCH=CHN) ; 7.50-7.55 (m, 2H, Ph) ; 7.62 (d, IH, CCH=CHN) ; 8.00-8.10 (m, 3H, Ph) .

C ^R (An) :

¹ H-NMR ( DMSO-d ₆ ) : 1.22 (t, 6H, P (O) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) ; 1.39 (s, 9H,

C (CH ₃ ) ₃ ) ; 1.65-2.10 (m, 4H, CHCH ₂ CH ₂ P) ; 3.20-3.60 (m, 4H, NCH ₂ CH ₂ N) ; 3.84 (s, 3H, OCH ₃ ) ; 3.85-4.05 (m, 4H, P (O) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) ;

4.25 (m, IH, NCHC(O) ) ; 4.50-4.95 (m, 2H, NCH ₂ C(O) ) ; 6.90 (m, br,

IH, C(O)NHCH ₂ ) ; 7.04 (d, 2H, Ph) ; 7.30 (d, IH, CCH=CHN) ; 8.00 (d, IH, CCH=CHN) ; 8.03 (d, 2H, Ph) .

T ^R :

¹ H-NMR ( DMSO-d ₆ ) : 1.22 (t, 6H, P (O) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) ; 1.39 (s, 9H, C (CH ₃ ) ₃ ) ; 1.65-2.20 (m, 4H, CHCH ₂ CH ₂ P) ; 1.75 (s, 3H, C=CCH ₃ ) ; 2.90- 3.50 (m, 4H, NCH ₂ CH ₂ N) ; 3.90-4.10 (m, 4H, P (O) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) ; 4.18 (m, IH, NCHC(O) ) ; 4.45-4.65 (m, 2H, NCH ₂ C(O) ) ; 6.86 (m, br, IH, C(O)NHCH ₂ ) ; 7.37 (s, IH, NCH=C) .

P ^R :

¹ H-NMR ( DMSO-d ₆ ): 1.20 (t, 6H, P(O)(OCH ₂ CH ₃ J ₂ ); 1.38 (s, 9H,

C (CH ₃ ) ₃ ); 1.46-2.30 (m, 4H, CHCH ₂ CH ₂ P); 3.00-3.45 (m, 4H,

NCH ₂ CH ₂ N); 3.50-3.75 (m, 2H, CCH ₂ C(O)); 3.80-4.00 (m, 4H,

P(O) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) ; 4.22 (m, IH, NCHC(O)); 7.10-7.30 (m, 5H, Ph).

Beispiel 10 : Herstellung von weiteren Verbindungen der allgemeinen Formel II mit S-Konfiguration am asymmetrischen Zentrum:

Das Herstellungsverfahren für die Verbindungen der allgemeinen Formel II mit der R-Konfiguration wird analog für die Herstellung der entsprechenden Verbindungen der allgemeinen Formel II mit S- Konfiguration angewendet. Hierbei wird bei der in Beispiel 1

beschriebenen Synthese das (R) -2, 5-Dihydro-3, 6-dimethoxy-2- isopropylpyrazin als Edukt eingesetzt und die folgenden Synthesen analog wie beschrieben durchgeführt.

Beispielsweise wurde hergestellt: J ^S (Z):

¹ H-NMR ( DMSO-d ₆ ) : 1.32 (t, 6H, P (O) (OCH ₂ CH ₃ ) ₂ ) , 1.42 (s, 9H, C(CH ₃ ) ₃ ) ; 1.60-2.50 (m, 4H, CHCH ₂ CH ₂ P,) , 3.10-3.55 (m, 4H, NCH ₂ CH ₂ N) ; 3.65-3.90 (m, 2H, NCH ₂ C(O) ) ; 4.00-4.15 (m, 4H, P(O) (OCH ₂ CH ₃ ) _z ) ; 4.20 (m, IH, NCHC(O) ) ; 5.24 (s, 2H, OCH ₂ Ph) ; 6.80 (m, br, IH, C(O)NHCH ₂ ) ; 7.27 (d, IH, C=CHN) ; 7.30-7.50 (m, 5H, Ph) .

Beispiel 11 : Allgemeine Synthesevorschrift für erfindungsgemäße Verbindungen mit MNPA-Substituent am Rest K:

Durch sequenzielle Verknüpfung von entsprechenden Verbindungen der allgemeinen Formel II mit asymmetrischem Zentrum und/oder entsprechender Verbindungen der allgemeinen Formel II ohne asymmetrisches Zentrum und/oder Aminosäuren und/oder Aminosäurederivaten und/oder Fluoreszenzmarkern mittels Festphasenpeptidsynthese werden die erfindungsgemäßen Verbindungen hergestellt. Dabei wird folgendes Syntheseprotokoll verwendet:

Schritt 1: 3 h Vorquellen von 10 mg Harz (Boc-Gly-PAM-MBHA, 0,54 mmol/g) in Dichlormethan.

Schritt 2: Beginn des Synthesezyklus: 4x Waschen mit

Dichlormethan .

Schritt 3: Boc-Abspaltung durch Reaktion mit TFA/m-Kresol (95:5).

Reaktionsdauer: 2x je 3 min

Schritt 4: 5x Waschen mit Dichlormethan.

Schritt 5: 5x Waschen mit NMP.

Schritt 6: 1 min Voraktivierung von 4 äquivalenten der entsprechenden geschützten Verbindung der allgemeinen Formel II bzw. einer entsprechend geschützten Aminosäure mit 3,8

äquivalenten HATU und 9 äquivalenten NMM in NMP/Pyridin (2:1).

Schritt 7: Reaktion der aktivierten geschützten Verbindung der allgemeinen Formel II bzw. einer entsprechend geschützten

Aminosäure mit der festen Phase (1. Kupplung; Dauer: 30 min).

Schritt 8: 4x Waschen mit NMP.

Schritt 9: Ix Waschen mit Dichlormethan.

Schritt 10: Wiederholung der Schritte 6 bis 8 (2. Kupplung) .

Schritt 11: überprüfung der Kupplungseffizienz mit Ninhydrin

(Kaiser-Test; Wenn der Kaiser-Test positiv ist, müssen die

Schritte 6 bis 8 mit der entsprechenden geschützten Verbindung der allgemeinen Formel II wiederholt werden) .

Schritt 12: Nach negativem Kaiser-Test, 2x Capping mit einer

Losung aus Ac ₂ O/NMP/Pyridin (1:25:25) für je A min.

Schritt 13: 5x Waschen mit NMP.

Schritt 14: Wiederholen des Synthesezyklus (Schritte 2 bis 13) bis zur Kupplung mit der letzten entsprechenden geschützten

Verbindung der allgemeinen Formel II. Anschließend gegebenenfalls

Wiederholen des Synthesezyklus (Schritte 2 bis 13) bis zur

Kupplung mit der letzten entsprechend geschützten Aminosäure.

Schritt 15: 4x Waschen mit Dichlormethan.

Schritt 16: Boc-Abspaltung durch Reaktion mit TFA/m-Kresol

(95:5). Reaktionsdauer: 2x je 3 min

Schritt 17: 5x Waschen mit Dichlormethan.

Schritt 18: 5x Waschen mit NMP.

Schritt 19: 1 min Voraktivierung von 6 äquivalenten MNPA-OH mit

5,7 äquivalenten HATU und 13 äquivalenten NMM in NMP/Pyridin

(2:1) .

Schritt 20: Reaktion von aktivierten MNPA-OH mit der festen Phase

(Dauer: 30 min) .

Schritt 21: 4x Waschen mit NMP.

Schritt 22: Wiederholung der Schritte 19 bis 21 (2. Kupplung) .

Schritt 23: 5x Waschen mit Dichlormethan.

Schritt 24: zur Trocknung: 5x Waschen mit Diethylether .

Man erhalt eine Verbindung der allgemeinen Formel I, die am C- terminalen Ende an das Harz gebunden ist.

Abspaltung der erfindungsgemaßen Verbindung vom Harz:

Das Harz mit der erfindungsgemaßen Verbindung wird in wassriger

Ammoniaklosung (28-30 Gewichtsprozente NH ₃ in H ₂ O) bei 60 ⁰ C 20 h gerührt. Das abgespaltene Harz wird anschließend abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt und getrocknet. Das Rohprodukt wird durch praparative HPLC über eine RP-C18-Saule mit Methanol /

Wasser gereinigt. Man erhalt die erfmdungsgemaße Verbindung als farblosen Feststoff in ca. 50%-iger Ausbeute. Die Masse der erfindungsgemaßen Verbindung wird mit MALDI-TOF charakterisiert.

Beispiel 12 : Allgemeine Synthesevorschrift für erfindungsgemäße Verbindungen mit DNPA-Substituent am Rest K:

Durch sequenzielle Verknüpfung von entsprechenden Verbindungen der allgemeinen Formel II mit asymmetrischem Zentrum und/oder entsprechender Verbindungen der allgemeinen Formel II ohne asymmetrisches Zentrum und/oder Aminosäuren und/oder Aminosaurederivaten und/oder Fluoreszenzmarkern mittels Festphasenpeptidsynthese werden die erfindungsgemaßen Verbindungen hergestellt.

Dabei wird folgendes Syntheseprotokoll verwendet:

Schritt 1: 3 h Vorquellen von 10 mg Harz (Boc-Gly-PAM-MBHA, 0,54 mmol/g) in Dichlormethan.

Schritt 2: Beginn des Synthesezyklus: 4x Waschen mit

Dichlormethan .

Schritt 3: Boc-Abspaltung durch Reaktion mit TFA/m-Kresol (95:5).

Reaktionsdauer: 2x ]e 3 mm

Schritt 4: 5x Waschen mit Dichlormethan.

Schritt 5: 5x Waschen mit NMP.

Schritt 6: 1 min Voraktivierung von 4 äquivalenten der entsprechenden geschützten Verbindung der allgemeinen Formel II bzw. einer entsprechend geschützten Aminosäure mit 3,8

äquivalenten HATU und 9 äquivalenten NMM in NMP/Pyridm (2:1).

Schritt 7: Reaktion der aktivierten geschützten Verbindung der allgemeinen Formel II bzw. einer entsprechend geschützten

Aminosäure mit der festen Phase (1. Kupplung; Dauer: 30 min).

Schritt 8: 4x Waschen mit NMP.

Schritt 9: Ix Waschen mit Dichlormethan.

Schritt 10: Wiederholung der Schritte 6 bis 8 (2. Kupplung) .

Schritt 11: überprüfung der Kupplungseffizienz mit Ninhydrin

(Kaiser-Test; Wenn der Kaiser-Test positiv ist, müssen die

Schritte 6 bis 8 mit der entsprechenden geschützten Verbindung der allgemeinen Formel II wiederholt werden) .

Schritt 12: Nach negativem Kaiser-Test, 2x Capping mit einer

Losung aus Ac ₂ O/NMP/Pyridin (1:25:25) für je 4 min.

Schritt 13: 5x Waschen mit NMP.

Schritt 14: Wiederholen des Synthesezyklus (Schritte 2 bis 13) bis zur Kupplung mit der letzten entsprechenden geschützten

Verbindung der allgemeinen Formel II. Anschließend gegebenenfalls

Wiederholen des Synthesezyklus (Schritte 2 bis 13) bis zur

Kupplung mit der letzten entsprechend geschützten Aminosäure.

Schritt 15: 4x Waschen mit Dichlormethan.

Schritt 16: Boc-Abspaltung durch Reaktion mit TFA/m-Kresol

(95:5). Reaktionsdauer: 2x je 3 min

Schritt 17: 5x Waschen mit Dichlormethan.

Schritt 18: 5x Waschen mit NMP.

Schritt 19: 1 min Voraktivierung von 6 äquivalenten DNPA-OH mit

5,7 äquivalenten HATU und 13 äquivalenten NMM in NMP/Pyridin

(2:1) .

Schritt 20: Reaktion von aktivierten DNPA-OH mit der festen Phase

(Dauer : 30 min) .

Schritt 21: 4x Waschen mit NMP.

Schritt 22: Wiederholung der Schritte 19 bis 21 (2. Kupplung) .

Schritt 23: 5x Waschen mit Dichlormethan.

Schritt 24: zur Trocknung: 5x Waschen mit Diethylether .

Man erhält eine Verbindung der allgemeinen Formel I _r die am C- terminalen Ende an das Harz gebunden ist.

Abspaltung der erfindungsgemäßen Verbindung vom Harz: Das Harz mit der erfindungsgemäßen Verbindung wird in wässriger Ammoniaklösung (28-30 Gewichtsprozente NH ₃ in H ₂ O) bei 60 ⁰ C 20 h gerührt. Das abgespaltene Harz wird anschließend abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt und getrocknet. Das Rohprodukt wird durch präparative HPLC über eine RP-C18-Säule mit Methanol / Wasser gereinigt. Man erhält die erfindungsgemäße Verbindung als farblosen Feststoff in ca. 50%-iger Ausbeute. Die Masse der erfindungsgemäßen Verbindung wird mit MALDI-TOF charakterisiert.

Beispiel 13 : Allgemeine Synthesevorschrift für die erfindungsgemäßen Verbindungen mit Linker und MNPA-Substituent bzw. DNPA-Substituent am Rest K:

Durch sequenzielle Verknüpfung von entsprechenden Verbindungen der allgemeinen Formel II mit asymmetrischem Zentrum und/oder entsprechender Verbindungen der allgemeinen Formel II ohne asymmetrisches Zentrum und/oder Aminosäuren und/oder Aminosaurederivaten und/oder Fluoreszenzmarkern sowie geeigneten Linker-Monomeren mittels Festphasenpeptidsynthese werden die erfindungsgemaßen Verbindungen hergestellt. Dabei wird folgendes Syntheseprotokoll verwendet:

Syntheseprotokoll :

Schritt 1: 3 h Vorquellen von 10 mg Harz (Boc-Gly-PAM-MBHA, 0,54 mmol/g) in Dichlormethan.

Schritt 2: Beginn des Synthesezyklus: 4x Waschen mit

Dichlormethan .

Schritt 3: Boc-Abspaltung durch Reaktion mit TFA/m-Kresol (95:5).

Reaktionsdauer: 2x ]e 3 min

Schritt 4: 5x Waschen mit Dichlormethan.

Schritt 5: 5x Waschen mit NMP.

Schritt 6: 1 min Voraktivierung von 4 äquivalenten der entsprechenden geschützten Verbindung der allgemeinen Formel II bzw. einer entsprechend geschützten Aminosäure mit 3,8

äquivalenten HATU und 9 äquivalenten NMM in NMP/Pyridin (2:1).

Schritt 7: Reaktion der entsprechenden geschützten Verbindung der allgemeinen Formel II bzw. einer entsprechend geschützten

Aminosäure mit der festen Phase (1. Kupplung; Dauer: 30 min).

Schritt 8: 4x Waschen mit NMP.

Schritt 9: Ix Waschen mit Dichlormethan.

Schritt 10: Wiederholung der Schritte 6 bis 8 (2. Kupplung) .

Schritt 11: überprüfung der Kupplungseffizienz mit Ninhydπn

(Kaiser-Test; Wenn der Kaiser-Test positiv ist, müssen die

Schritte 6 bis 8 mit der entsprechenden geschützten Verbindung der allgemeinen Formel II wiederholt werden) .

Schritt 12: Nach negativem Kaiser-Test, 2x Capping mit einer

Losung aus Ac ₂ θ/NMP/Pyridin (1:25:25) für je 4 min.

Schritt 13: 5x Waschen mit NMP.

Schritt 14: Wiederholen des Synthesezyklus (Schritte 2 bis 13) bis zur Kupplung der Linker egl (8-Amino-2, 6-dioxaoktansaure) .

Schritt 15: Kupplung der Linker: 4x Waschen mit Dichlormethan.

Schritt 16: Boc-Abspaltung durch Reaktion mit TFA/m-Kresol

(95:5). Reaktionsdauer: 2x je 3 min

Schritt 17: 5x Waschen mit Dichlormethan.

Schritt 18: 5x Waschen mit NMP.

Schritt 19: 1 min Voraktivierung von 4 äquivalenten egl mit 3,8

äquivalenten HATU und 9 äquivalenten NMM in NMP/Pyridin (2:1).

Schritt 20: Reaktion des aktivierten Linkers mit der festen Phase

(1. Kupplung; Dauer: 30 min) .

Schritt 21: 4x Waschen mit NMP.

Schritt 22: Ix Waschen mit Dichlormethan.

Schritt 23: Wiederholung der Schritte 19 bis 21 (2. Kupplung) .

Schritt 24: überprüfung der Kupplungseffizienz mit Ninhydrin

(Kaiser-Test; Wenn der Kaiser-Test positiv ist, müssen die

Schritte 19 bis 21 wiederholt werden) .

Schritt 25: 2x Capping mit einer Losung aus Ac ₂ O/NMP/Pyridin

(1:25:25) für je 4 mm nach negativem Kaiser-Test.

Schritt 26: 5x Waschen mit NMP.

Schritt 27: 2x Wiederholen des Syntheseabschnitts (Schritte 15 bis 26) für (egl) ₃ .

Schritt 28: Wiederholen des Synthesezyklus (Schritte 2 bis 13) bis zur Kupplung mit der letzten entsprechenden geschützten

Verbindung der allgemeinen Formel II. Anschließend gegebenenfalls Wiederholen des Synthesezyklus (Schritte 2 bis 13) bis zur Kupplung mit der letzten entsprechend geschützten Aminosäure. Anschließend die Durchfuhrung der Schritte 15-24 aus Beispiel 11 im Falle der Kupplung MNPA-OH bzw. die Durchfuhrung der Schritte 15-24 aus Beispiel 12 im Falle der Kupplung DNPA-OH.

Man erhalt eine erfindungsgemaße Verbindung mit Linker, die am C- terminalen Ende an das Harz gebunden ist.

Abspaltung der erfindungsgemaßen Verbindung mit Linker vom Harz: Das Harz mit der erfindungsgemaßen Verbindung mit Linker wird in wassriger Ammoniaklosung (28-30 Gewichtsprozente NH ₃ in H ₂ O) bei 60 ⁰ C 20 h gerührt. Das abgespaltene Harz wird anschließend abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt und getrocknet. Das Rohprodukt wird durch praparative HPLC über eine RP-C18-Saule mit Methanol / Wasser gereinigt. Man erhalt die erfindungsgemaße Verbindung mit Linker als farblosen Feststoff in 50%-iger Ausbeute. Die Masse der erfindungsgemaßen Verbindung mit Linker wird mit MALDI-TOF charakterisiert.

Beispiel 14 : Weitere Beispiele von Sequenzen

Durch Durchfuhrung der allgemeinen Synthesevorschriften aus den Beispielen 11 oder 12 wurden weitere erfindungsgemaße Verbindungen hergestellt:

MNPA-A ^R cG ^R gT ^R cG ^R gC ^R gA ^R aC ^R aT ^R -Gly-NH ₂

MNPA-Bio-A ^R cG ^R gT ^R cG ^R gC ^R gA ^R aC ^R aT ^R -Gly-NH ₂ (Bio = Lysin, funktionalisiert mit Biotin über die Aminfunktion der Lysin- Seitenkette)

DNPA-A ^R cG ^R gT ^R cG ^R gC ^R gA ^R aC ^R aT ^R -Gly-NH ₂ DNPA-Bio-A ^R cG ^R gT ^R cG ^R gC ^R gA ^R aC ^R aT ^R -Gly-NH ₂

DNPA-tG ^κ cC ^κ tA ^κ gG ^κ aC ^κ tC ^κ cA ^κ gC -GIy-NH ₂ DNPA-Bio-tG ^R cC ^R tA ^R gG ^R aC ^R tC ^R cA ^R gC ^R -Gly-NH ₂ DNPA-tG ^R cC ^R tA ^R ggactC ^R cA ^R gC ^R -Gly-NH ₂ DNPA-Bio-tG ^R cC ^R tA ^R ggactC ^R cA ^R gC ^R -Gly-NH ₂

DNPA-cG ^R aA ^R tA ^R aG ^R gA ^R gG ^R cT ^R tA ^R -Gly-NH ₂ DNPA-Bio-cG ^R aA ^R tA ^R aG ^R gA ^R gG ^R cT ^R tA ^R -Gly-NH ₂ DNPA-cG ^R aA ^R tA ^R aggagG ^R cT ^R tA ^R -Gly-NH ₂ DNPA-Bio-cG ^R aA ^R tA ^R aggagG ^R cT ^R tA ^R -Gly-NH ₂

DNPA-gG ^R cT ^R cG ^R aA ^R tA ^R aG ^R gA ^R gG ^R -Gly-NH ₂ DNPA-Bio-gG ^R cT ^R cG ^R aA ^R tA ^R aG ^R gA ^R gG ^R -Gly-NH ₂ DNPA-gG ^R cT ^R cG ^R aataaG ^R gA ^R gG ^R -Gly-NH ₂ DNPA-Bio-gG ^R cT ^R cG ^R aataaG ^R gA ^R gG ^R -Gly-NH ₂

DNPA-aC ^R aA ^R aT ^R gC ^R aT ^R gG ^R gC ^R tG ^R -Gly-NH ₂ DNPA-Bio-aC ^R aA ^R aT ^R gC ^R aT ^R gG ^R gC ^R tG ^R -Gly-NH ₂ DNPA-aC ^R aA ^R aT ^R gcatgG ^R gC ^R tG ^R -Gly-NH ₂ DNPA-Bio-aC ^R aA ^R aT ^R gcatgG ^R gC ^R tG ^R -Gly-NH ₂

DNPA-cG ^R cC ^R tT ^R aT ^R cC ^R gT ^R aG ^R cC ^R -Gly-NH ₂ DNPA-Bio-cG ^R cC ^R tT ^R aT ^R cC ^R gT ^R aG ^R cC ^R -Gly-NH ₂ DNPA-cG ^R cC ^R tT ^R atccgT ^R aG ^R cC ^R -Gly-NH ₂ DNPA-Bio-cG ^R cC ^R tT ^R atccgT ^R aG ^R cC ^R -Gly-NH ₂

DNPA-tgccT ^κ aG ^κ gactcC ^κ aG ^κ c-Gly-NH ₂

DNPA-Dota-gG ^R cT ^R cG ^R aA ^R tA ^R aG ^R gA ^R gG ^R -Gly-NH ₂ (DOTA= Lysin, funktionalisiert mit DOTA über die Aminfunktion der Lysin- Seitenkette)

Beispiel 15 : Synthesevorschrift für eine erfindungsgemäße Verbindungen der allgemeinen Formel V:

In einem Schraubdeckelglas werden 2ml DMF und 2 ml Pyridin vorgelegt. Unter Rühren werden 382 mg (2.95 mmol) DIPEA und anschließend 291 mg (1.48 mmol) 4-Hydroxy-3-nitro- phenylessigsaure zugefugt. Anschließend werden 562 mg (1.48 mmol) HATU, gelost in 2 ml DMF, zugefugt. Man lässt 5 min voraktivieren. Die voraktivierte Losung wird zu einer Losung aus 500 mg (1.48 mmol) 2- (10-Hydroxydecyl) -5, 6-dimethoxy-3- methylcyclohexa-2, 5-diene-l, 4-dione (Idebenone) , gelost in 10 ml DMF, zugetropft und anschließend auf 40 ⁰ C erhitzt. Nach 24 Stunden Reaktionszeit wird das Losungsmittel entfernt und der Ruckstand in Essigester aufgenommen. Die organische Phase wird zweimal mit 2 N Kaliumhydrogensulfatlosung und einmal mit gesättigter Kochsalzlosung gewaschen und anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Rohprodukt wird durch Chromatographie (Kieseigel, Hexan/Essigester, 1/1, v/v) gereinigt .

HATU, DMF, DIPEA, Pyridm, 40 ⁰ C

Beispiel 16: Selektive Lokalisierung von Verbindungen der allgemeinen Formel I, die einen Monohydroxy-mononitro-phenyl-Rest bzw. Monohydroxy-dinitro-phenyl-Rest tragen.

Heia-Zellen bzw. 143B parentale Zellen werden mit einer lOμM Losung von Biotin-gelabelten Verbindungen der allgemeinen Formel I inkubiert. Nach 24 Stunden wird eine 2μM MitoTracker-Losung dazugegeben, und nach weiteren 45 Minuten werden die Zellen mit Ethanol fixiert. Anschließend lasst man auf die Zellen 30 Minuten lang eine Fluorescein-Avidin-Losung (5μg/ml) bei Raumtemperatur einwirken. Nach dem Waschen der Zellen lasst man 30 Minuten lang eine biotmylierte Anti-Avidm Losung (5μg/ml) auf die Zellen bei Raumtemperatur einwirken. Nach erneutem Waschen der Zellen lasst man auf die Zellen wiederum 30 Minuten lang eine Fluorescein- Avidin-Losung (5μg/ml) bei Raumtemperatur einwirken. Nach weiteren Waschschritten wird der Zellkern durch DAPI-Gegenfarbung markiert. Anschließend wird die raumliche Verteilung bzw.

Ausbreitung der Verbindungen der allgemeinen Formel I, der Mitochondrien sowie des Zellkerns innerhalb der Zellen mit einem konfokalen Mikroskop untersucht.

Beispiel 17 : Reduktion von COXl und Menge an mtDNA in HeLa-Zellen durch Behandlung mit der erfindungsgemäßen Verbindung DNPA- tG ^R cC ^R tA ^R ggactC ^R cA ^R gC ^R -GIy-NH ₂ .

HeLa-Zellen werden mit einer Lösung von DNPA-tG ^R cC ^R tA ^R ggactC ^R cA ^R gC ^R -Gly-NH∑ („Effektiv"), das gegen eine Position auf der mtDNA /mtRNA gerichtet ist, welche für das mitochondriale Protein COXl codiert, in verschiedenen Konzentrationen (10OnM, 25OnM, 50OnM, lμM, 2,5μM, 5μM and lOμM) und für unterschiedliche Zeiträume inkubiert (3, 6, 9, 11 und 17 Tagen) . Bei Experimenten, die länger als 3 Tage dauern, wird der überstand alle drei Tage durch frisches Medium mit jeweils gleicher Konzentration an der erfindungsgemäßen Verbindung DNPA-tG ^R cC ^R tA ^R ggactC ^R cA ^R gC ^R -Gly-NH ₂ ersetzt .

Die Bestimmung der COXl-Level erfolgt durch Western-Blotting gegen Porin, ein mitochondriales Transmembran-Protein, dessen Gehalt nicht durch die Behandlung mit der erfindungsgemäßen Verbindung beeinflusst wird, als internem Standard. Die Reduktion von COXl wird im Vergleich zu den unbehandelten HeLa-Zellen dargestellt. Dabei wird das COXl-Level der unbehandelten HeLa- Zellen als 100% definiert.

Bei einer Konzentration von lOμM an erfindungsgemäßer Verbindung ist das COXl-Level in den HeLa-Zellen nach 3 Tagen auf 67% und nach 9 Tagen auf 20% reduziert.

Die folgende Tabelle zeigt die Konzentrationsabhangigkeit der COXl-Reduktion nach einer Behandlungsdauer von 9 Tagen:

Die Bestimmung der mtDNA-Menge erfolgt durch Real-Time-PCR gegen Zellkern-DNA, die nicht durch die Behandlung mit der erfindungsgemaßen Verbindung DNPA-tG ^R cC ^R tA ^R ggactC ^R cA ^R gC ^R -Gly-NH ₂ beeinflusst wird, als internem Standard. Die Reduktion von mtDNA wird im Vergleich zu den unbehandelten HeLa-Zellen dargestellt. Dabei wird die Menge an mtDNA der unbehandelten HeLa-Zellen als 100% definiert.

Als weiterer Vergleich wurde eine erfmdungsgemaße Verbindung ohne komplementäre Sequenz zu mtDNA / mtRNA verwendet („negative Kontrolle")

Bei einer Konzentration an erfmdungsgemaßer Verbindung DNPA- tG ^R cC ^R tA ^R ggactC ^R cA ^R gC ^R -Gly-NH ₂ von lOμM kann nach 3 Tagen noch kein Effekt festgestellt werden. Nach 6 Tagen ist, im Vergleich zu unbehandelten Heia-Zellen bzw. im Vergleich zu HeLa-Zellen, die mit der negativen Kontrolle behandelt wurden, eine Reduktion der mtDNA auf 81% und nach 9 Tagen auf 62% beobachtbar. Danach bleibt der Wert der reduzierten mtDNA-Menge auch nach 11 Tagen (64%) und 17 Tagen (61%) konstant.

Die folgende Tabelle zeigt die Konzentrationsabhangigkeit der mtDNA-Reduktion nach einer Behandlung mit der effektiven

erfindungsgemäßen Verbindung von 9 Tagen im Vergleich zu der negativen Kontrolle: