Verfahren zur enzy atischen Racematspaltung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Racematspaltung. ^'

Ein ständig steigender Bedarf an Aminosäuren ist Anlaß, die vorhandenen Bezugsquellen auszubauen und zu optimieren und ferner neue Synthesewege zu erschließen. Bei den chemi¬ schen Synthesen entstehen im allgemeinen Racemate, die in weiteren Schritten in die Antipoden aufgetrennt werden müssen .

Erfinduπgsgemäß wird nun ein Verfahren zur Racematspaltung von Aminosäure-Derivaten vorgesehen, bei dem man von einem Aminosäurecarbamat-Racemat ausgeht und dieses Racemat enzyma- tisch spaltet.

Der Vorteil der Verwendung von Aminosäurecarbamaten zur Herstellung optisch aktiver Aminosäuren besteht darin, daß bei der Synthese der Ausgangsverbindungen nicht von den entsprechenden Aminosäuren ausgegangen werden muß, vielmehr Aminosäurevorstufen (beispielsweise alpha-Haloqen- carbonsäure) direkt zu den Carbamaten umgesetzt werden können .

ERSATZBLATT

*

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Racematspaltung läßt sich auch auf das Norephedrincarbamat-Racemat anwenden. Norephedrin wirkt als Sympathikomimetikum.

In das erfindungsgemäße Verfahren kann man beispielsweise Methylcarbamate mit der Methoxycarbonyl-Gruppe einsetzen.

Vorteilhafterweise verwendet man ein wasserlösliches Amino- säurecarbamat-Racemat und/oder das Racemat einer in der Natur vorkommenden Aminosäure.

Man kann das erfindungsgemäße Verfahren

(a) mit Hilfe eines Mikroorganismus, der über eine Enzym¬ aktivität verfügt, die eines der Enantiomeren eines Aminosäurecarbamat-Racemats oder Norephedrincarbamat- Racemats hydrolytisch spaltet, und der bei einem Test auf diese Enzymaktivität ermittelt worden ist, oder

(b) mit Hilfe der Enzymaktivität des Mikroorganismus gemäß (a)

durchführen.

Bei der Variante (b) kann man mit Hilfe der Enzymaktivität in Form des Kulturmediums des Mikroorganismus gemäß Variante (a), des vom Mikroorganismus abgetrennten Kulturmediums, eines Extraktes aus dem Kulturmedium oder eines Extraktes aus dem Mikroorganismus spalten.

Geeignete Mikroorganismen kann man aus Bodenproben isolie¬ ren. Zur Isolierung kann man beispielsweise Bodenproben verwenden, die mit Carbamaten behandelt worden sind. Man kann sich leicht vorstellen, daß beispielsweise auf Acker¬ flächen, die mit Carbamatpestiziden wie Betanal oder Unden behandelt worden sind, Carbamate abbauende Mikroorganismen

ERSATZBLATT

leben, die dort einen Selektionsvorteil genießen, so daß es zu einer Anreicherung von Stämmen mit den gesuchten Eigenschaften kommen kann.

Bei einer anderen Ausführungsform kann man das erfindungs¬ gemäße Verfahren auch mit Hilfe eines Enzyms durchführen, das eines der Enantiomeren eines Aminosäurecarbamat-Racema- tes oder Norephedrincarbamat-Racemates hydrolytisch spaltet, und das bei einem Test auf diese Enzymaktivität ermittelt worden ist.

Derartige Enzyme können ein breites Gebiet neuer Anwendun¬ gen eröffnen. Dabei ist an Einsatzmöglichkeiten bei der Peptidsynthese zu denken, wo eine milde Abspaltung einge¬ führter Schutzgruppen, beispielsweise der t-Butyloxycarbonyl- oder Benzoxycarbonyl-Gruppe von großem Interesse ist.

Schließlich kann man gemäß einer Ausführungsform des erfin¬ dungsgemäßen Verfahrens

- die bei der Racematspaltung anfallende optisch aktive Aminosäure, insbesondere L-Aminosäure, isolieren und/oder

- das bei der Racematspaltung ferner anfallende optisch aktive Carbamat der zur anfallenden Aminosäure enantiome¬ ren Aminosäure, insbesondere D-Aminosäure, in an sich bekannter Weise spalten und die enantiomere Aminosäure gewinnen.

In den folgenden Beispielen wird beispielsweise folgende enzymatische Racematspaltung beschrieben:

N-(Methoxycarbonyl)-DL-valin

N-(Methoxycarbonyl)-D-valin + L-Valin + CO _? + Methanol

Da das CO _? aus dem Gleichgewicht entfernt wird, wird dieses

ERSATZBLATT

Gleichgewicht ständig nach rechts bzw. unten verschoben, so daß sich beide Enantiomeren in hoher Reinheit gewinnen lassen.

Nachstehend wird die Erfindung durch experimentelle Methoden und Beispiele näher erläutert.

.Durchführung eines Screeninqs mit Bodenproben

Ein Gramm Bodenprobe wurde in 100 ml Minimalmedium (M2), welches ein Carba atderivat als einzige C- und N-Quelle enthielt, bei 27°C und 100 Up auf der Ruπdschüttelmaschine inkubiert. Nach 48h wurde mit

1% (v/v) eine weitere Kultur in dem gleichen Medium aπgeimpft. Zur

* - Gewinnung von Einzel olonien wurde mit steriler Saline eine Ver¬ dünnungsreihe hergestellt. Aliquots wurden auf Agarplatten mit dem Minimalmedium (M2) ausgestrichen . Die Petrischalen wurden bei 27 °C 3 - 7 Tage iπkubiert.

Organismen, die sin gutes Wachstum zeigten, wurden durch Verdüπnungs- ausstrich gereinigt. Die gereinigten Stämme wurden in 100 ml Flüssig¬ medium (Ml) in 500 ml Erlenmeyerkolbeπ mit 2 Schikanen überimpft und bei 27 C auf der Ruπdschüttelmaschine bei 100 UDm/angezogen. Nach 1-3 Tagen wurde der Kolbeniπhalt abzentrifugiert. Das Sediment wurde in 0.1 M Kal umsphophat-Puffer pH 8.0 suspendiert. Der Zellaufschluß erfolgte mit Ultraschall. Unlösliche Bestandteile wurden abzentrifu¬ giert (30 000 g, 4 °C ). Der überstand wurde direkt für den Enzymtest eingesetzt oder zunächst tiefgefroren (-20°C). -

Salinepuffer:

8,5 g Natriumchlorid

0,3 g H ₂ P0 ₄

0,5 g Na-HP0 ₄

10 ml 1% ige Gelatine (Merck)

990 ml H-0

', Medium für gescreente Stämme (Ml)

Kaliumdihydrogenphosphat 0,80 g

Dikaliumhydrogenphosphat 1,76 g

Hefeextrakt 0,50 g

NaCl 0,50 g Glucose 5,00 g

Aminosäurecarbamatderivat 5,00 g aufgefüllt mit dest. H-0 1,00 1 pH 7.0

Medium zur Anreicherung von Mi roorganismen aus Bodenproben (M2)

Kaliumdihydrogenphosphat 0,80 g Dikaliumhydrogenphosphat 1,76 g Spurensalzlösuπg 2,00 ml Vita iπlösung 2,00 ml

Aminosäurecarbamatder vat 10,00 g aufgefüllt mit dest. H-0 1,00 1 pH 7,0

Medium zur Fermentierung (M4)

Kaiiumdihydrogenphosphat 0,80 g

Dikaliumhydrogenphosphat 1,76 g

Methanol 0,50 % (v/v)

Hefeextrakt 5,00 g

Malzextrakt 5,00 g

NaCl 3,00 g aufgefüllt mit dest. H-0 1,00 1 pH 7,00

Kulturführuπg

Schütte!kulturen

Schütte!kul uren wurden bei 30°C in 500 ml Erlenmeyerkolben (zwei Schikanen) mit 100 ml Kulturmedium auf einer Rotationsschüttelmaschine (100 Upm) angezogen. Die Animpfung erfolgte von einer Schrägagarkultur mit einer ImpfÖse. Nach 48 h wurde von dieser ersten Vorkultur mi l%(v/v) auf eine weitere Vorkultur überimpft. Diese diente als Vorkultur für weitere Versuchsansätze, die wiederum nach 24h mit 3 % (v/v) aus letzterer angeimpft wurden.

Kulturführung im Fermenter (10 1 Arbeitsvolumen )

Der Fermenter wurde einen Tag vor dem Aπimpfen sterilisiert. Bis zum Animpfeπ konnte somit eine Sättigung des Kulturmediums mit Sauerstoff und eine Temperaturkonstaπz (30°C +1°C) gewährleistet werden. Die Steril sation des Fermentervolumens erfolgte in situ mit Heißdampf für die Dauer von 30 - 60 Min, 121 °C, 1,2 bar bei einer Rührgeschwindigkeit von 100 Upm. Die C-Quellen wurden ca. 1-2 h vor dem Animpfen dem Feππenteransat∑ aseptisch zugegeben. Zur Korrektur des pH-Wertes diente 1 M K0H bzw. I M H ₃ P0 ₄ . Wähnend des gesamten Fermeπtationsverlaufes wurde in der Regel gleichbl-eibeπd mit 1 vvm (Anfangswert) belüftet und m t 200 Upm gerührt.

Wenn nicht anders angegeben, wurden in den Fermentern folgende Parameter eingehalten:

Drehzahl : ^■ 200 Upm

Belüftung: 1 vvm

Temperatur: 30°C

Nährlösung: M4 pH : 7,0

Kulturdauer: 40 -80 Stunden

ERSATZBLATT

Während der Kulturführuπg wurden folgende Meßwerte permanent erfaßt:

- der Sauerstoffpartialdruck

- die Methanolkonzentration in der Abluft über einen FID

- Sauerstoff-Volumen-Konzentration der ausströmenden Reaktorluft

(Vo.S)

- Kohlendioxid-Volumen-Konzentrat on der ausströmenden Reaktorluft

(Vol%)

- pH-Wert

- Kulturtemperatur

- Belüftungsrate

Zur weiteren Charakterisierung des Kul urverlaufes wurden dis¬ kontinuierlich Proben über ein sterilisierbares Ventil entnommen und für Analysen verwendet.

Amiπosäureaπalysator

Die quantitative Bestimmung der Aminosäuren erfolgte auf einem Am nosäureanalysator oder im fluorimetrisehen Test

A inosäureanalysator: Biotroπik LC 6000

Säule: Biotronik DC-4A (Dioπex)

Vorsäule: Biotronik DC-3

Reaktionstemperatur T,: 49°C, T-: 63°C

Detektioπ: Biotronik Photometer Bt 6620 570 nm ; 440nm

Analysenzeit: 110 - 140 Min

Probeπmenge: 100 l

Eichlösung: Calbiochem - Behring Corp.

Amiπo Acid Calibration Standard Type H

Mit dem fest eingestellten Programm wurden folgende Retentionszei ten erhal ten :

Lysin 92,6 Min α-Benzoxycarboπyl-lysin 83,2 Min e -Benzoxycarbonyl-lysin 82,6 Min α-Acetyl-lysin 63,9 Min α-Methoxycarboπyl-lysin 50,7 Min e-Methoxycarbonyl-lysin 48,6 Min

Methioniπ 48,6 Min

--Ethoxycarbonyl-L-lysin 48,4 Min

Valin 43,3 Min

Alaniπ 0,4 Min e -Acetyl-lysin 36,3 Min

Verdünnungspuffer: 19,60 g Na-Ci trat x 2 H-.0 / pH 1,85 16 ,5 ml HC1 konz. 20,0 ml Thioethanol (dest. ) 0,1 ml Capryl säure aufgefül l auf 5 1 mit dest. H _^ O

Trennpuffer: Puffer A: 88,2 g Na-Citrat x 2 H-0 / pH 3,20 55 - 60m HC1 konz.

3,2 ml Thiodiethanol (redestiliiert) 12,0 ml 252 Brij

1,0 ml Phenol 75,0 ml Ethylglycolmonomethylether aufgefüllt auf 5 1 mit dest. H-0

Puffer B: 88,2 g Na-Citrat x 2H-0 /pH 3,93 29,0 g NaCl 43,0 ml HC1 konz. 12,0 ml 25% Brij l-,0 ml Phenol aufgefüllt auf 5 1 mit dest. H-O

ERSATZBLATT

Puffer C: 88,2 g Na-Citrat x 2H-0 /pH 5 ,00 29,0 g NaCl

5,0 ml HC1 konz. 12,0 ml 25% Brij

1,0 ml Phenol aufgefüllt auf 5 1 mit dest. H-0

Puffer D: 171,5 g Na-Citrat x 2 H-0 /pH 9 ,66 15,5 g H-B0-.

1,5 g NaOH

12,0 ml 25% Brij aufgefüllt auf 5 1 mit dest. H^O

Ninhydrinl sung: 3,0 1 Ethylenglycolmonomethylether M 859

80,0 g Ninhydriπ p. A.

1,0 1 4M Na-Acεtatpuffer pH 5,51

20,0 ml Titan-III-chloridlösung 15%ig

5.4.3. Fluorimetrischer Test

Reaqentien:

0.2 M Natriumboratpuffer pH 9,2 Fluram-Acetonlösung ( 20 mg / 100 ml )

Zu 2.25 ml Natriumboratpuffer wurden Aliquots der zu bestimmenden Aminosäurelösung (0,1 bis 100 nmol/ml) gegeben. Unter schnellem Schütteln auf einem Vortexm scher wurden 0,75 ml der Fluram-Acetonlösung zugegeben. Eine schnelle Zugabe und schnelles Mischen sind wichtig, uπir ein optimales Ergebnis zu erreichen. Die Fluorescenz wurde in einem Perkin-Elmer LS-5 Luminesceπs Gerät mit einer Aπregungs - Wellenlänge von 390 nm und einer Emissi-ons - Wellenlänge von 475 nm bis 490 nm gemessen. Von einer Eichkurve wurden die zugehörenden Werte ermittelt

ERSATZBLATT

Oberprüfung der Stereospezifit t

; Polarimeter

Die Messungen wurden am Perkin-Elmer-Polarimeter Typ 241 bei 436 nm, 25°C durchgeführt. Es wurden Eichreihen im Bereich von 0-300 mM auf¬ genommen, mit der quantitativ die Aminosäurekonzentratioπ bestimmt werden konnte.

Definitionen

a spezifische Drehung (α)= c x 1

a optische Reinheit P = ax

( c_ ) : spezifische Drehung : Drehung c: Konzentration g/1 1 : Länge (dm)

L-Aminosäureoxidasetest

L-Amiπosäureoxidase aus Crotalus durissus wurde zum Test auf L-Amino- säuren eingesetzt. Der Test wurde nach der Vorschrift von Boehringer Mannheim durchgeführt.

Lösungen:

a) Triethanolaminpuffer 0,2 M , pH 7,6 b) o-Dianisidin Lösung 23,2 mM c) Puffer - Aminosäurelösung + 0,5 ml Lösung (b)

ERSATZBLATT

d) Peroxidase (POD) 250 U/mg e) Enzy lösungen U/mg 1/100 oder 1/50 oder 1/20 mit destilliertem, e sgekühlten- Wasser verdünnt.

Reaktionsansatz:

Pufferlösung (c) 3,00 ml

POD Suspension (d) 0,01 ml Enzymlösung (e) 0,02 ml

Die Reaktion wurde bei 436 nm und 25 °C an einem DU-Beckmann- Spektralphotometer durchgeführt.

Eine Eichreihe mit L-Alaπiπ und L-Valin zeigte einen linearen Zusammen¬ hang im Bereich von 40 bis 4Q0 μM.

D-Aminosäureoxidasetest

D-Aminosäureoxidase aus Schweineniere wurde zum Test auf D-Aminosäuren eingesetzt. Der Test wurde nach der Vorschrift der Firma Boehringer Mannheim durchgeführt.

Lösungen:

a) Tris-Puffer, 200 mM pH 8,3 10 min mit Q~ begast. b) NADH Lösung, 12 mM ( 10 mg NADH , Na-Salz / ml H ₂ 0) c) Katalase - Lösung: ca. 260000 U/ml in destilliertem Wasser 1:100 verdünnt. d) Lactatdehydrogenase (LDH) ungefähr 450 U / mg e) Enzymlösungen, ungefähr 15 U/mg 1/50 , 1/20 , 1/10 verdünnt mit eiskaltem Wasser.

Eine Eichreihe mit D-Alaπin und D-Valiπ zeigte einen linearen Zusammenhang von 10 bis 350 /.M. Die Nachweisgrenze ^' lag bei 5 iM D-Aminosäure.

ERSATZBLATT

Reaktionsansatz:

Trispuffer (a) 2,50 ml Aminosäuretestlösuπg 0,50 ml NADH Lösung (b) . 0,05 ml Catalase Lösung(c) 0,01 ml LDH Suspension(d) 0,01 ml Enzymlösuπg(e) 0,01 ml

Die Änderung der Lichtabsorptioπ bei 340 nm wurde bei 25 °C spektral• photometrisch gemessen.

ERSATZBLATT

Beispiele 1 bis 42

Bei der Suche nach Mikroorganismen mit stereoselektiv Amino- säurecarbamate hydrolysiereπden Enzymen wurden Bodenproben von unterschiedlichen Standorten eingesetzt, um ein mög¬ lichst breites Spektrum an Mikroorganismen isolieren zu können.

Die Proben wurden auf einem Bauernhof und auf mit den Carb¬ amatpestiziden Betanal 32 und Unden 33 behandelten Acker¬ flächen entnommen .

Das Screeningergebnis zeigte keinen besonders zu bevorzugen¬ den Fundort. Die aus dem Boden ausgeschwemmten Mikroorganis¬ men wurden auf N-(Methoxycarbonyl)-DL-alanin , N-(Methoxy- carbonyl)-DL-valin oder N-alpha-epsilon-( Dimethoxycarbonyl )r DL-lysin als jeweils einziger C- und N-Ouelle angezogen. Auf N-(Methoxycarbonyl)-DL-valin wurden deutlich weniger Stämme gefunden, als auf den beiden anderen Aminosäurecarbamaten .

Von 42 gefundenen Stämmen zeigten 35 Stämme die höchste Enzymaktivität bei der Umsetzung des Substrates N-(Methoxy- carbonyl )-DL-alanin . Die enzymatische Hydrolyse von N-alpha- epsilon-( Dimethoxycarbonyl )-DL-lysin kann theoretisch zu vier Verbindungen führen, dem D- oder dem L-Enantiomer des N-epsilon-(Methoxycarbonyl )-lysins, dem N-alpha-(Meth¬ oxycarbonyl)-DL-lysin und dem Lysin.

Alle Stämme, die Aktivität bei όer Umsetzung von N-alpha- epsilon-( Dimethoxycarbonyl )-DL-lysin zeigten, bildeten das Produkt N-epsilon-(Methoxycarbonyl)-lysin , von dem in einigen Fällen das L-Enantiomer nachgewiesen werden konnte. Bei 5 von 42 Stämmen konnte auch die freie Amino¬ säure Lysin nachgewiesen werden. Die Verbindung N-alpha-

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(Methoxycarbonyl)-DL-lysin konnte in keinem Fall nachgewie¬ sen werden. Die Enzyme greifen somit bevorzugt die alpha- Stellung im Lysindicarbamat an.

Es fällt auf, daß alle näher untersuchten Wildtypisolate die erwartete Stereoselektivität in der Hydrolyse der race- mischen Aminosäurecarbamate zeigen.

Die Ergebnisse von Langzeitreaktionen mit 6 der 42 gefunde¬ nen Stämme sind Tabelle 1 und den Figuren 1 und 2 zu ent¬ nehmen .

Tabelle 1

Langzeitreaktion von zellfreiem Rohextrakt mit dem Substrat N-( Methoxycarbonyl )-DL-valin

Stamm Protein Substrat Ink.- Produkt Ausbeute mg/ml mmol/40ml zeit/h mmol/40ml mg/40ml %

A4 1,2 7,0 65,0 1,18 138,2 33,71

A3 0,2 7,0 65,5 0,74 86,6 21,14

L8 1,5 7,0 63,5 0,37 44,7 10,74

L10 0,5 7,0 67,0 1,84 215,8 52,65

L12 4,0 7,0 64,0 2,99 350,2 85,43

LI3 1,4 14,0 64,5 5,50 761,4 92,86

Die Stereospezif ität der Biotransformation mit den sechs Mikroorganismenstämmen wurde auch dadurch bewiesen, daß die Verbindung N-(Methoxycarbonyl )-D-valin nicht umgesetzt wurde. Auffallend ist der Aktivitätsverlauf von Stamm A3. Da es sich um Rohextrakte handelte, können eine Vielzahl

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von Faktoren, z.B. Inhibitoren, Einfluß auf den Reaktions¬ verlauf haben.

Beispiele 43 bis 50

Die hydrolytische Umsetzung der Aminosaurecarbamate zur Aminosäure, Kohlendioxid und Alkohol kann durch einen enzy- matischen Angriff auf die Amidbindung oder Esterbindung bewirkt werden. Diese Überlegungen führten zu der Frage, inwieweit käufliche Enzyme, die Ester- und Amidbindungen spalten, Aminosaurecarbamate als Substrate akzeptieren. Es wurden eine Esterase, drei Acetylcholinesterasen , eine Hydantoinase , eine Urease und zwei Acylasen untersucht.

Carboxylesterase (Beispiel 43) aus Schweineleber zeigte keine Reaktion. Während die Acetylchol-inesterase vom Aal (Beispiel 44) die Aminosaurecarbamate nicht umsetzt, konnte Enzymaktivität bei der Acetylcholinesterase aus Erythrozy- ten des Rindes (Beispiel 45) und des Menschen (Beispiel 46) gefunden werden. Es wurden nur die L-Aminosäurecarbamate umgesetzt. Die D-Antipode als Substrat eingesetzt, zeigte keine Reaktion.

Die Enzyme zeigten eine gute Stabilität. In Inkubationsan¬ sätzen über einen Zeitraum von 150 Stunden wurde ein linea¬ rer Substratumsatz erreicht. Die Hydantoinase aus Pseudomo- nas fluorescens (Beispiel 47) zeigte keine Aktivität. Keine Aktivität wurde ebenfalls bei der Urease (Beispiel 48) gefunden. Die gesuchte Aktivität konnte auch bei der Pilz- acylase (Beispiel 49) und der Acylase aus Schweinenieren (Beispiel 50) nachgewiesen werden.

Tabelle 2 zeigt einen Vergleich der prozentualen Umsatz¬ rate von Acetyl- und Carbamataminosäuren mit der Nieren- acylase . Die Reaktionen waren L-spezifisch .

ERSATZBLATT

Tabe lle 2

Substratspezifität von Aminoacylase aus Schweineniere (auf Alanin (100 %) bezogen).

Acylaminosäuren Aminosaurecarbamate

Aminosäure -C-R -C-OR relative ti II 0 0 Umsatzrate

Alanin Chloracetyl 100 Methoxycarbonyl 100 Acetyl 27 Ethoxycarbonyl 89

Valin Acetyl 14,5 Methoxycarbonyl 71 Ethoxycarbonyl 59

ERSATZBLATT