Die chemotherapeutische Behandlung maligner Erkrankungen mit Doxorubi- cin ist aufgrund einer geringen therapeutischen Breite dieses Wirkstoffes mit Nebenwirkungen verbunden (Dorr RT, Von Hoff DD,"Cancer Chemotherapy Handbook", 2nd ed. Appleton and Lange, Norwalk, 1994).

Es ist deshalb für eine effektivere Behandlung wünschenswert, die syste- mische Toxizität dieses Zytostatikums zu reduzieren und gleichzeitig des- sen pharmakologisches Potenzial zu steigern. Es ist bekannt, dass mit bestimmten Prodrugs einerseits ein gezielter Transport von gebundenen Wirkstoffen ins befallene Gewebe und andererseits ein effizientes und möglichst spezifisches Freisetzen des Wirkstoffs am Zielort infolge bioche- mischer oder physiologischer Besonderheiten des malignen Gewebes er- reicht werden konnte. Ein Ansatz zur Verbesserung des Nebenwirkungs- profils und der Wirksamkeit von Zytostatika liegt in der Entwicklung Pro- tein-bindender Formulierungen, welche in vivo an endogene Serumproteine, insbesondere Albumin, koppeln und auf diese Weise makromolekulare Transportformen der Wirksstoffe darstellen (Kratz, F. et al., J. Med. Chez.

2000, 43, 1253-1256).

Weiterhin sind Ifflatrix-Metalloproteinasen (MMIP), insbesondere l@MP-2 und MMP-9, als wichtige Proteasen bei der Progression von bösartigen Tumo- ren identifiziert worden (Stetler-Stevenson, W. G. et al., anne. Rev. Cell Biol. 1993, 9, 541-573).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde zur Vergrößerung der therapeuti- schen Breite von Doxorubicin, Derivate dieses Wirkstoffes zu schaffen, die nach intravenöser Applikation kovalent an zirkulierendes Albumin binden und durch MMP-2 bzw. MMP-9 im Tumorgewebe gespalten werden. Diese Aufgabe wird erfindungsgemä# gelöst durch niedermolekulare Doxorubicin- Peptid-Derivate der allgemeinen Formel 1 Y 0))'1/\ c C-P5-P'5--NH m P in der Doxorubicin (Formel nachstehend) puY = O oder S n = 0 bis 5 m = 0 bis 6 P5-P'5 eine Peptidsequenz bestehend aus bis zu zehn der 20 essenziellen Aminosäuren bedeuten und PM eine Protein-bindende Gruppe ist. 0 OH 0 < °OH OCH3 HO OH - C HO DOXO- NH

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind aus Doxorubicin, einem Peptid- spacer und einem heterobifunktionellen Crosslinker, enthaltend eine Pro- tein-bindende Gruppe PM aufgebaut. Im Folgenden wird dieser Aufbau näher erläutert : Der heterobifunktionelle Crosslinker ist ein Carbonsäure-Derivat mit einer Protein-bindenden Gruppe der allgemeinen Formel II in der Y = O oder S n = 0 bis 5 m = 0 bis 6 PM = Protein-bindende Gruppe bedeuten.

Bevorzugt eingesetzt werden heterobifunktionelle Crosslinker mit m < 2 und n = 2 bis 5. Die Oxyethylen-Einheiten gewährleisten eine erhöhte Wasserlöslichkeit, insbesondere bei den größeren Werten von n.

Die Protein-bindende Gruppe (PM) ist bevorzugt ausgewählt unter einer 2- Dithiopyridylgruppe, einer Halogenacetamidgruppe, einer Halogenacetat- gruppe, einer Disulfidgruppe, einer Acytsäureestergruppe, einer Monoalkyl- maleinsäureestergruppe, einer Slonoalkylmaleaminsäureamidgruppe, einer N-Hydroxysuccinimidylestergruppe, einer Isothiocyanatgruppe, einer Aziri-

dingruppe oder einer Maleinimidgruppe. Eine besonders bevorzugte Protein- bindende Gruppe ist die Maleinimidgruppe.

Der Peptidspacer ist eine Peptidsequenz P5-P'S, bestehend aus bis zu zehn der 20 messenden Aminosäuren, die durch MMP-2 bzw. Mump-9 spaltbar ist. Bevorzugte Peptidspacer bestehen aus acht Aminosäuren. Besonders bevorzugte Sequenzen sind : Peptid ! l 2 4 Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Trp-Gly-Gln Diese Peptide werden durch MMP-2 bzw. MMP-9 an der P1-P'1-Bindung enzymatisch gespalten.

Am meisten bevorzugt ist die Sequenz Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Doxorubicin-Peptid-Derivate erfolgt zweckmäßig durch Umsetzung von Doxorubicin mit einem Peptid-Derivat der allgemeinen Formel 111

in der Y = O oder S n = Obis5 m = 0 bis 6 P5-P'5 eine Peptidsequenz, bestehend aus bis zu zehn der 20 essenziellen Aminosäuren und PM eine Protein-bindende Gruppe bedeuten, durch Kon- densation der aktivierten Carboxylgruppe des Peptid-Derivats mit der Ami- nogruppe des Daunosaminrings von Doxorubicin.

Als Reagenzien zur Aktivierung des C-terminalen Endes des Peptid-Derivats werden vorzugsweise N, N'-Dicyclohexylcarbodiimid, N, N'-Diisopropylcarbo- diimid, (Benzotriazol-1-yloxy) tris (dimethylamino) phosphonium-hexafluoro- phosphat oder 2-Chlor- 1-methyl-pyrdiniumiodid unter Zusatz gängiger Katalysatoren bzw. Hilfs- basen wie z. B. Trialkylamine, Pyridin, 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) oder Hydroxybenzotriazol (HOBt) eingesetzt. Die Umsetzungen werden zweck- mäßig in polaren Lösemitteln, etwa DMF, DMA bzw. DMSO, bei Tempera- turen zwischen-20 °C und 40 °C, bevorzugt bei 0 bis 5 °C, durchgeführt, wobei die Reaktionszeit normalerweise zwischen 1 und 120 h, bevorzugt zwischen 24 und 96 h, liegt. Die Produktisolierung kann durch übliche Methoden, wie Kristallisation, Chromatographie an Kiese) get oder Chroma- tographie, erfolgen.

Die Herstellung des Peptid-Derivats erfolgt vorzugsweise durch Umsetzung der aktivierten Carboxylgruppe des heterobifunktionellen Crosslinkers der allgemeinen Formel II mit dem N-terminalen Ende der Peptidsequenz P5-P'5.

Dabei werden als Reagenzien zur Aktivierung der Carboxylgruppe des <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Crosslinkers vorzugsweise N, N'-Dicyclohexylcarbodiimid, N, N'-Diisopropyl- carbodiimid, (Benzotriazol-1-yloxy)-tris (dimethylamino) phosphonium-hexa- fluorophosphat oder 2-Chlor-1-methylpyridiniumiodid unter Zusatz gängiger Katalysatoren bzw. Hilfsbasen wie z. B. Trialkylamine, Pyridin, 4-Dimethyl- aminopyridin (DMAP) oder Hydroxybenzotriazol (HOBt) eingesetzt. Die Umsetzung erfolgt zweckmäßig an der Festphase, und die Produktisolie- rung erfolgt in der Regel durch Reversed-Phase-Chromatographie (präpara- tive HPLC), wie dem Fachmann geläufig ist.

Die erfindungsgemäßen Protein-bindenden Doxorubicin-Peptid-Derivate werden parenteral, bevorzugt intravenös appliziert. Dazu werden die erfin- dungsgemäßen Doxorubicin-Peptid-Derivate als Lösungen, Feststoffe oder Lyophilisate, gegebenenfalls unter Verwendung üblicher Hilfsstoffe bereit- gestellt. Solche Hilfsstoffe sind beispielsweise Polysorbate, Glucose, Lacto- se, Mannitol, Saccharose, Dextrane, Zitronensäure, Tromethamol, Trietha- nolamin, Aminoessigsäure und/oder synthetische Polymere. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Doxorubicin-Peptid-Derivate in einem isotonischen Puffer in einem pH-Bereich von 2, 0-8, 0, bevorzugt pH 5,0 bis 7,0, gelöst und appliziert. In der Regel besitzen die erfindungsgemäßen Doxorubicin-Peptid-Derivate eine ausreichende Wasserlöslichkeit aufgrund der Oxyethylen-Einheiten im Crosslinker und/oder der Integration von polaren Aminosäuren in die Peptidsequenz, wie z. B. Arginin, Prolin, Gluta- min und/oderGlutaminsäure. Die Löslichkeitdes Doxorubicin-Peptid-Deriva- tes kann gegebenenfalls durch pharmazeutische Lösungsmittel wie etwa 1, 2-Propandiol, Ethanol, Isopropanol, Glycerol und/oder Poly (ethylenglykol) mit einem Molekulargewicht von 200 bis 600 g/mol, bevorzugt Poly (ethy- lenglykol) mit einem Molekulargewicht von 600 g/mol und/oder Löslich-

keitsvermittler wie z. B. Tween 80, Cremophor oder Polyvinylpyrrolidon verbessert werden.

Ein wesentliches Merkmal der erfindungsgemäßen Doxorubicin-Peptid- Derivate liegt in einer raschen kovalenten Bindung an Serumproteine über die Protein-bindende Gruppe, wodurch eine makromolekulare Transportform des Wirkstoffs generiert wird. Von Serumproteinen wie Transferrin oder Albumin, ist eine erhöhte Aufnahme in Tumorgewebe bekannt (Kratz F. ; Beyer U. Drug Delivery 1998, 5, 281-299), sodass diese im Rahmen der Erfindung als endogene Träger für Zytostatika herangezogen werden kön- nen. Ein besonders bevorzugtes Serumprotein ist zirkulierendes Humanse- rumalbumin (HSA), das mit einer durchschnittlichen Konzentration von 30 bis 50 g/1 die Hauptprotein-Komponente des menschlichen Blutes bildet (Peters T. Adv. Protein Chem. 1985,37, 161-245) und eine freie Cystein- gruppe (Cystein-34-Gruppe) an der Oberfläche des Proteins aufweist, welche zur Anbindung von Thiol-bildenden Gruppen wie Maleinimiden oder Disulfiden geeignet ist (WO 00/76551). Die Reaktion der Doxorubicin- Peptid-Derivate mit Serumproteinen kann auch extrakorporal durchgeführt werden, z. B. mit einer zur Infusion vorgesehenen Albumin-, Blut-oder Serummenge.

Protein-gebundene Doxorubicin-Peptid-Derivate weisen gegenüber Doxoru- bicin eine veränderte Bioverteilung auf und reichern sich aufgrund ihres makromolekularen Charakters in Tumorgewebe an. Durch eine dort statt- findende Spaltung durch MMP-2 bzw. MMP-9 werden niedermolekulare Doxorubicinpeptide abgespalten, welche im Tumorgewebe Doxorubicin als aktive Komponente freisetzen. In Tierversuchsstudien zeigten Protein- bindende Doxorubicin-Peptid-Derivate überraschend auch eine höhere Wirksamkeit als der klinische Standard Doxorubicin (siehe Beispiel 1).

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung in Verbindung mit der Zeich- nung näher. In der Zeichnung stellen dar :

Figur 1 die Strukturformel des Produkts von Beispiel 1 ; Figur 2 ein Chromatogramm eines Produkts der Inkubation der Ver- bindung von Figur 1 mit Humanplasma ; Figur 3 ein Chromatogramm eines Spaltungsansatzes der Albumin- gebundenen Form der Verbindung von Figur 1 durch MiviP-2 ; Figur 4 ein Chromatogramm eines Inkubationsansatzes von gespalte- nem Doxorubicintetrapeptid mit A375-Melanoma-Gewebehomogenat ; Figur 5 eine graphische Darstellung des Tumorwachstums von A375 Melanom mit Doxorubicin einerseits und der Verbindung von Figur 1 ande- rerseits.

Beispiel 1 Synthese von 1 (siehe Figur 1) : 175,0 mg (0,3 mmol) Doxorubicin-Hydro- chlorid, 298,5 mg (0,3 mmol) Mal-Gly-Pro-Leu-Gly-lle-Ala-Gly-Gln (Mal = Maleinimidotriethylenglykolsäure), 40,5 mg (0,3 mmol) 1-Hydroxyben- zotriazol-Hydrat und 98, 95 ul (91,0 mg, 0,9 mmol) 4-Methylmorpholin wurden in 50 ml wasserfreiem N, N-Dimethylformamid (DMF) bei + 5 °C 15 Minuten lang gerührt. 139, 36 ul (113, 6 mg, 0,9 mmol) N, N'-Diisopro- pylcarbodiimid wurden zugegeben und der Ansatz bei + 5 °C 72 Stunden lang gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel im Hochvakuum entfernt, der Rückstand in einer Minimalmenge Chloroform/Methanol 4 : 1 gelöst und das Produkt durch zweimalige Säulenchromatographie an Kiesel- gel 60 (Merck, Darmstadt) mit Chloroform/Methanol 4 : 1 aufgereinigt. Aus den erhaltenen Fraktionen wurde 1 durch Zugabe eines Überschusses an Diethylether gefällt und abzentrifugiert, mit 2 x 20 ml Diethylether gewa- schen und erneut zentrifugiert. Nach Trocknen im Hochvakuum wurden 250 mg 1 als rotes Pulver erhalten. Masse (MALDI-TOF, Mr 1520. 7) : rn/z 1543 [M+Na] +, HPLC (495 nm) : > 98 %.

1 enthält Maleinimidotriethylenglykolsäure als wasserlösliche und Albumin- bindende Komponente. 1 bindet innerhalb weniger Minuten selektiv an die Cystein-34-Position von endogenem Albumin im Blutplasma (siehe Figur 2).

Figur 2 zeigt Chromatogramme einer Inkubationsstudie von 1 mit Human- plasma bei 37 °C nach 2 und 5 min. Konzentration von 1 = 59 µM. HPLC : BioLogic Duo-Flow System von Biorad, München ; Lambda 1000 Monitor von Bischoff (A = 495 nm) und Merck F-1050 Fluoreszenz-Spektrophoto- meter (EX. 490 nm, EM. 540 nm) ; UV-Detektion bei 280 nm ; Säule : Wa- ters, 300 Ä, Symmetry C18 [4,6 x 250 mm] mit Vorsäule ; Fluss : 1, 2 ml/min, mobile Phase A : 27,5 % CH3CN, 72,5 % 20 mM Kaliumphosphat (pH 7,0), mobile Phase B : CH3CN, Gradient : 0-25 min 100 % mobile Phase A ; in 25 bis 40 min auf 70 % CH3CN, 30 % 20 mM Kaliumphosphat ; 40 bis 50 min 70 % CH3CN, 30 % 20 mM Kaliumphosphat ; 50-60 min 100 % mobile Phase A ; Injektionsvolumen : 50 lit.

Die Chromatogramme zeigen, dass nach 2 min Inkubation bereits ein erheblicher Teil von 1 an Albumin gebunden vorliegt ; nach 5 min ist die gesamte Menge 1 an Albumin gebunden.

Beispiel 2 Die Albumin-gebundene Form von 1 wurde 1,5 Stunden mit 2 mU aktiver- ter MMP-2 bei 37 °C in Abwesenheit und Anwesenheit eines zweifachen Überschusses an TIMP-2 (tissue inhibitor of MMP-2) inkubiert. Der Spal- tungsansatz wurde dann einer HPLC unter den Bedingungen wie zu Figur 2 unterzogen. Die Konzentration an Anthracyklin war 100, um. Das Chroma- togramm wird in Figur 3 dargestellt. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Ver- wendung von MMP-9 anstelle von MMP-2 erzielt (MMP-2 und MMP-9 von Calbiochem FRG). Das Chromatogramm des Ansatzes mit MMP-2 und ohne Tip-2 zeigt, dass nach 1, 5 Stunden aus dem Albuminkonjugat von 1 vollständig der Rest lle-Ala-Gly-Gln-DOXO abgespalten war. Bei Hemmung

von MMP-2 durch TIMP-2 war nur eine sehr geringe Spaltung erfolgt und das Albuminkonjugat von 1 fast vollständig erhalten geblieben.

Beispiel 3 Mit dem wie in Beispiel 2 beschrieben, erhaltenen gespaltenten Doxorubi- cintetrapeptid (lle-Ala-Gly-Gln-DONO) wurde eine Inkubationsstudie mit <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> A375-Melanome-Gewebehomogenat durchgeführt. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C. Die Konzentration an Anthracyklin war 1 00, um. Nach 2 min, 30 min und 3 Stunden wurde jeweils eine HPLC-Chromatographie unter den Bedingungen von Figur 2 durchgeführt. Das für diese Versuche verwendete Melanoma-Gewebehomogenat wurde mit A375 Xenograft-Tumoren in 50 mM Tris-HCL-Puffer pH 7,4, enthaltend 1 mM Monothioglycerol hergestellt.

Figur 4 zeigt die dabei erhaltenen Ergebnisse.

Beispiel 4 Der Verlauf des Tumorwachstums von subkutan wachsenden A375 Mela- noma-Xenografts, die mit Doxorubicin und 1 [Dosis (i. v.) ; Doxorubicin (= doxo) : 2 x 13, 3, umol/kg = 2 x 8 mg/kg Doxorubicin) an den Tagen 8 und 15 ; 1 : 2 x 13, 3, umol/kg (= 2 x 8 mg/kg Doxorubicin-Äquivalente) an den Tagen 8 und 15,3 x 39, 9, umol/kg (= 3 x 24 mg/kg Doxorubicinäquivalen- te) an den Tagen 8,15 und 22 behandelt wurden, wird in Figur 5 gezeigt.

Dargestellt ist das relative Tumorvolumen zu den angegebenen Zeiten.

Tiere : Nacktmäuse ; Stammlösung von Doxorubicin (2 mg/ml) ; Stamm- lösung von 1 : 6 mg/ml in 10 mM Natriumphosphat, 5 % D-Glucose (pH 6,4), Kontrolle (Puffer) : Glucose-Phosphat-Puffer (10 mM Natriumphosphat, 5 % D-Glucose-pH 6,4) an den Tagen 8 und 15.

Die Kurven in Figur 5 zeigen ganz klar die große Überlegenheit des erfin- dungsgemäßen Doxorubicinderivates im Vergleich zu Doxorubicin. Doxoru- bicin ergibt dabei ein etwa dreimal so großes Tumorvolumen verglichen mit der Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Derivat. Dies zeigt die über- raschend bessere Wirksamkeit, die mit dem erfindungsgemäßen Derivat erzielt wird.