L'invention concerne des intercepteurs d'espèces activées du dioxygène, leur procédé de préparation et les compositions pharmaceutiques et cosmétiques les contenant.

Les espèces activées du dioxygène plus spécialement l'oxygène singulet ( ¹ 0 ₂ ) , l'ion radical superoxyde (02 ^; ) , le radical hydroxyle (OH-)/ les radicaux alkoperoxyles (AOO-) , et les radicaux alkoxyles (AO-) , dans lesquels A représente un groupement alcoyle (alkyle) sont des entités pathogènes vis-à-vis de la cellule.

Ces espèces activées jouent un rôle fondamental dans le développement ou 1'aggravation de nombreuses maladies comme le cancer, les infarctus, l'emphysème, l'artériosclérose et l'arthrite rhu atoïde.

De plus, ces espèces activées interviennent dans les processus de vieillissement des organes, en particulier de la peau, que ces processus soient naturels ou qu'ils résultent de radiations lumineuses.

Jusqu'à présent plusieurs types d'intercepteurs d'espèces activées du dioxygène ont été utilisés en pratique médicale ou en cosmétologie. Les plus couramment utilisés sont les vitamines ou leurs dérivés, en particulier l'acide ascorbique et la vitamine E, les oxydants dérivés du phénol (tert-butyl hydroxytoluène et tert-butyl hydroxyanisole) , les dérivés thiolés tels que la cystéine et ses dérivés, la superoxyde dismutase et les caroténoïdes.

Cependant ces substances ne sont pas totalement satisfaisantes en tant qu'intercepteurs contre les

espèces activées du dioxygène. En effet certaines d'entre elles ne réagissent qu'avec une seule espèce activée, ou sont instables ou encore s'avèrent inappropriées en raison de leur caractère hydrophile ou hydrophobe ou photosensibilisateur.

Les inventeurs ont recherché des produits, capables de réagir plus efficacement contre les espèces activées de l'oxygène intervenant dans les processus de vieillissement des organes et des cellules et dans diverses pathologies associées à l'intervention de ces espèces activées du dioxygène.

Ils ont ainsi constaté que la substitution de l'atome d'azote de dérivés de pyrrole par des groupes intervenant dans le métabolisme cellulaire leur conférait notamment des propriétés avantageuses comme intercepteurs vis-à-vis des espèces activées du dioxygène.

L'invention a pour but de nouveaux dérivés de pyrrole ayant des propriétés d'intercepteurs d'espèces activées du dioxygène. Elle a également pour but des compositions contenant ces dérivés de pyrrole. Elle vise également leur procédé de préparation, ainsi que des compositions pharmaceutiques les contenant.

L'invention concerne donc de nouveaux dérivés pyrroliques répondant aux caractéristiques suivantes :

- ils réagissent avec des espèces activées dérivées du dioxygène notamment avec l'oxygène singulet, les radicaux OH, les radicaux libres du type radicaux inorganiques. Envers ces radicaux, ils possèdent une activité marquée par une constante de vitesse de réaction bimoléculaire de l'ordre lo'M^s ^"1 . Certains réagissent aussi avec l'ion superoxyde formé au cours de réactions de photoxydations ou d'autooxydations cellulaires,

- ils sont stables à l'obscurité et à la lumière dans les conditions suivantes : en solution neutre

tamponnée et à l'obscurité, ils sont stables pratiquement indéfiniment à 4 ^β C (plus d'un mois), et à température ambiante, certains d'entre eux présentent une stabilité équivalente.

- ils ont un coefficient de partage entre la phase lipophile et la phase hydrophile qui varie entre 2 et 50 pour le mélange classique eau-octanol,

- ils sont stables dans les solvants organiques usuels comme le D.M.S.O., l'éthanol, notamment à la température ambiante,

- ils sont physiologiquement acceptables pour des fibroblastes humains,

- ils ne sont pas sensibles à l'action des hydrolases et estérases cellulaires.

Des dérivés particulièrement adaptés à la réalisation de l'invention sont des dérivés pyrroliques N-substitués répondant à la formule (I) suivante :

dans laquelle :

- R est un constituant physiologiquement acceptable, capable de pénétrer dans les cellules, insensible à l'action d'hydrolases et d'estérases cellulaires, ce groupement étant notamment un dérivé d'acides aminés, de peptides non protéiques à intérêt biologique, d'osamines possédant un groupement a iné primaire libre, de bases puriques le cas échéant substituées en position 9 par des groupements autres que phényle, par exemple par des groupements alkyle, ou de bases pyrimidiques possédant un groupement aminé primaire libre, les bases pyrimidiques étant substituées par au moins un groupe SH,

RI représente un ou plusieurs substituants identiques ou différents choisi(s) parmi un hydrogène ou un radical alcoyle comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, un radical a iné primaire, secondaire -NHB, ou tertiaire - N(B,B*), avec B et B', identiques ou différents et représentant un groupe alcoyle de 1 à 6 atomes de carbone, un radical SH ou SB, B étant tel que défini ci-dessus, un radical - CH ₂ OH, -CH(B)OH, - C(B,B')0H ou les éthers et esters correspondants, un radical cyclique de 3 à 6 atomes de carbone ou un hétérocycle oxygéné, azoté ou soufré tel que le furanne, le pyrrole ou le thiophène, et leurs sels notamment les sels de la fonction carboxyliques des radicaux R avec des ions métalliques ou des aminés physiologiquement acceptables, leurs esters de formule -COOR _2f R ₂ étant un radical alkyle notamment de 1 à 3 atomes de C, des amides COR ₃ avec R ₃ étant une aminé primaire, secondaire et/ou tertiaire, dans ces deux derniers cas susbtituée par un groupe alcoyle ou alcool de 1 à 4 atome de carbone et leurs complexes avec des métaux physiologiquement acceptables, ces dérivés pyrroliques t-substitués étant sous forme racé.m ique ou d'isomères optiquement

actifs, sous réserve que R, est différent de l'hydrogène lorsque R est un dérivé de glycine, leucine, phenylalanine, tyrosine, serine, acide glutamique.

On observera que les composés dont R dérive comportent un groupe NH ₂ libre servant à la formation du squelette du cycle pyrrolique.

De préférence le cycle pyrrole comporte deux substituants R, répondant aux définitions précédentes. Ces substituants occupent les positions 2,3 ; 2,4 ; 2,5 ; ou 3,4 sur le cycle pyrrole.

En variante, le cycle pyrrole des dérivés de 1'invention comporte trois substituants R ₁ , identiques ou différents, en position 2, 3, 4 ou 2, 3, 5.

Ce cycle peut également comporter selon encore une autre variante quatre substituants.

Des substituants R ₂ particulièrement intéressants sont : CH ₃ , C ₂ H ₅ , CH ₂ CH ₂ CH ₃ , CH(CH ₃ ) ₂

Des substituants R ₃ particulièrement intéressants sont : NH ₂ , NH(CH ₃ ), N(CH ₃ ) ₂ , N(C ₂ H ₅ ) ₂ , NHCH ₂ CH ₂ CH ₃ , NHCH(CH ₃ ) ₂ , NHCH ₂ CH ₂ OH, NHCH ₂ CH ₂ N(C ₂ H ₅ ) ₂ .

Les composés de l'invention présentent de façon tout à fait avantageuse pour la réalisation de l'invention, une réactivité accrue vis-à-vis des diverses espèces activées du dioxygène et vis-à-vis de radicaux inorganiques faiblement oxydants tels que Br ₂ ^: et SCN ₂ '.

Ces composés sont donc particulièrement utiles pour lutter contre les pathologies impliquant des réactions avec lesdites espèces activées du dioxygène. Dans le terme "pathologies" on englobe à la fois les maladies dans lesquelles interviennent les espèces activées du dioxygène, ainsi que les manifestations superficielles, par exemple au niveau de la peau en particulier l'érythème et l'oedème solaire engendrées

par des réactions cellulaires faisant intervenir les espèces activées du dioxygène. En d'autres termes, les composés de l'invention sont actifs vis-à-vis d'entités pathogènes à l'égard des cellules, constituées par les espèces activées du dioxygène.

Un premier groupe préféré de composés selon 1'invention est le groupe des dérivés pyrroliques ci- dessus caractérisés en ce que R est un dérivé d'acides aminés notamment de l'alanine, de l'histidine, du tryptophane, de la cystéine, de la lysine, de l'ornithine, ou de la tyrosine.

Un autre groupe préféré de composés selon 1•invention comprend des dérivés pyrroliques caractérisés en ce que R est un dérivé d'un peptide non protéique, par exemple du gluthation, de la carnosine, de l'homocarnosine, ou d'un peptide hormonal.

De façon avantageuse pour la réalisation de l'invention, les peptides non protéiques ont la capacité de franchir les barrières cellulaires enzymatiques.

Le cas du glutathion est particulièrement intéressant puisque sous la forme réduite, outre son rôle de bon intercepteur de radicaux, il intervient dans la cascade enzymatique conduisant aux prostaglandines PGE ₂ .

Un troisième groupe de composés avantageux pour réaliser l'invention comprend des dérivés caractérisés en ce que R provient d'une base purique ou pyrimidique choisie notamment parmi l'adénine, la guanine ou la cytosine.

Ces composés permettent l'amplification des propriétés anti-oxydantes.

Une autre propriété particulièrement intéressante de ces constituants résulte du fait qu'ils sont construits à partir de molécules d'intérêt biologique,

c'est-à-dire nécessaires pour le métabolisme cellulaire.

D'autres composés répondant aux caractéristiques précédentes peuvent être caractérisés en ce qu'ils sont chargés positivement et de préférence en ce qu'il s'agit de dérivés pyrroliques de polya ines ou d'acides aminés basiques, tels que l'arginine ou de la lysine.

D'autres dérivés pyrroliques préférés sont les dérivés chargés négativement et de préférence des dérivés pyrroliques de la glutamine ou de l'asparagine.

Avantageusement on peut utiliser des constituants tels que Lys-Cys-Pyr, Lys-Ala-Pyr, Lys-Trp-Pyr (dans lesquels Lys = Lysine, Cys = cystéine, Ala = Alanine, Trp = tryptophane, Pyr = Pyrrole) pour mettre en oeuvre l'invention.

Les dérivés renfermant un résidu cystéine sont particulièrement préférés.

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les dérivés répondant à la formule générale ci-dessus sont tels que les substituants R, sont au nombre de 2 et sont placés en position 2 et 5 respectivement du cycle pyrrole. Des composés particulièrement intéressants sont les dérivés pyrroliques pour lesquels R, sont des groupements alcoyle, plus spécialement méthyle.

Les dérivés pyrroliques de l'invention peuvent également former des complexes avec des ions métalliques. Des ions préférés sont Cu** ou Fe**. Selon un aspect préféré les dérivés de pyrrole obtenus à partir d'alanine ou d'histidine constituent de bons complexants d'ions cuivre.

Les sels des dérivés et complexes de l'invention entrent également dans le cadre de cette dernière.

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Parmi les dérivés pyrroliques N- substitués selon l'invention, certains présentent une activité optique. Ce sont par exemple les composés obtenus à partir d'acides aminés, de peptides, d'osamines. On obtient avantageusement ces dérivés pyrroliques à partir des acides aminés, peptides, osamines ayant la configuration naturelle ou à partir de leurs isomères optiques.

On choisira donc pour la mise en oeuvre de l'invention d'utiliser soit un mélange racémique, soit les isomères optiquements actifs, selon l'effet recherché.

Selon un autre aspect, l'invention vise également l'utilisation pour l'élaboration d'une composition présentant une activité en tant qu*intercepteur d'espèces activées du dioxygène, des dérivés de formule I dans laquelle

- R est un groupement chimique physiologiquement acceptable, capable de pénétrer dans les cellules, insensible à l'action d'hydrolases et d'estérases cellulaires, ce groupement étant notamment un dérivé d'acides aminés, de peptides non protéiques à intérêt biologique, d'osamines possédant un groupement a iné primaire libre, de bases puriques le cas échéant substituées en position 9 par des groupements autres que phényle, par exemple par des groupements alkyle, ou de bases pyrimidiques possédant un groupement aminé primaire libre, les bases pyrimidiques étant substituées par au moins un groupe SH,

R.| représente un ou plusieurs substituants identiques ou différents choisi(s) parmi un groupement alcoyle comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, un groupement aminé primaire, secondaire -NHB, ou tertiaire -N(B,B'), avec B et B', identiques ou différents et représentant un groupe alcoyle de 1 à 6 atomes de carbone, un groupe SH ou SB, B étant tel que

défini ci-dessus, ou un groupe -CH ₂ OH, -CH(B)OH, - C(B,B')OH ou les éthers et esters correspondants, un reste cyclique de 3 à 6 atomes de carbone ou un hétérocycle oxygéné, azoté ou soufré tel que le furanne, le pyrrole ou le thiophène, et leurs sels notamment les sels de la fonction carboxyliques des radicaux R avec des ions métalliques ou des aminés physiologiquement acceptables, leurs esters de formule -COOR _2j R ₂ étant un radical alkyle notamment de 1 à 3 atomes de C, des amides COR ₃ avec R ₃ étant une aminé primaire, secondaire et/ou tertiaire, dans ces deux derniers cas susbtituée par un groupe alcoyle ou alcool de 1 à 4 atomes de carbone et leurs complexes avec des métaux physiologiquement acceptables ,ces dérivés pyrroliques N-substitués étant sous forme racémique ou d'isomères optiquement actifs.

Ces dérivés sont utilisés pour la fabrication d'un médicament utile notamment dans le traitement du cancer, de l'infarctus, de l'emphysème, de l'artériosclérose, de l'arthrite rhu atoïde et autres pathologies évoquées ci-dessus. A titre d'exemple, les compositions pharmaceutiques de l'invention sont administrables par voie orale, intraveineuse selon des doses habituellement utilisées dans le traitement des pathologies ci-dessus.

Les propriétés anti-inflammatoires des produits peuvent être testées selon toutes méthodes permettant d'étudier les propriétés anti-inflammatoires des médicaments :

- inhibition de l'oedème et de l'érythème solaire,

- inhibition de l'oedème et de l'érythème au LTB ₄ ou à l'acide arachidonique ou aux autres dérivés du phorbol,

10 inhibition de l'oedème et de l'érythème à la carragériine,

- inhibition de la contraction de muscles lisses (intestins, bronches) sous l'action de différents agents pro-inflammatoires.

Les propriétés des dérivés pyrroliques de l'invention permettent également leur application à la formulation de compositions cosmétiques, caractérisées en ce que le ou les dérivés pyrroliques sont présents en quantité de l'ordre de 0,1% à 2% en volume, en association avec un véhicule cosmétique choisi par exemple parmi les liposomes, la cyclodextrine, les phytosomes ou d'autres véhicules entrant dans la composition de pommades, gels, lotions, crèmes ou autres formes d'administration classiques.

Ces produits peuvent alors être utilisés de façon topique et locale pour lutter contre les manifestations superficielles du vieillissement de la peau ou contre les manifestations cutanées dues à des réactions photo-induites.

La mise en "solution" de la substance active pour réaliser la formulation peut être effectuée de plusieurs manières :

- sous la forme d'acide libre,

- sous la forme d'un sel d'acide, par l'intermédiaire d'un groupement fonctionnel présent sur la chaîne aliphatique ou sur un noyau aromatique : sel d'acide, sel d'ammonium quaternaire, sels dérivés d'une fonction alcool ou thiol ou phénol...

Une autre application des dérivés pyrroliques selon l'invention est celle d'agents anti-oxydants dans les produits agro-alimentaires.

Les dérivés de l'invention sont également utilisables en tant que réactifs biologiques.

L'invention vise donc des compositions présentant notamment une activité d'intercepteurs d'espèces activées du dioxygène, comprenant au moins un dérivé pyrrolique répondant aux critères donnés dans les pages précédentes.

Avantageusement ces compositions présentent des propriétés multifonctionnelles, c'est-à-dire vis-à-vis de plusieurs formes activées du dioxygène.

De façon préférée la composition ainsi définie est bifonctionnelle et réagit par exemple avec ¹ 0 ₂ et 0 ₂ « ou 0 ₂ et OH- ou trifonctionnelle et réagit par exemple avec ¹ 0 ₂ , OH- et 0 ₂ '*.

Les propriétés in vitro des différents intercepteurs d'espèces activées du dioxygène peuvent être testées par les méthodes suivantes : - la première méthode permet de juger de l'efficacité des dérivés pyrroliques comme inhibiteurs d'effets photobiologiques impliquant ¹ 0 ₂ et les peroxydes lipidiques, la seconde permet d'éprouver leur valeur comme inhibiteurs de processus d'autooxydation cellulaire. 1/ Par microspectrofluorimétrie on détermine sur des fibroblastes humains en culture monocouche, la capacité des dérivés pyrroliques à inhiber la formation par photosensibilisation des pigments fluorescents de type lipofuschines. Ces pigments résultent de la formation de bases de Schiff entre des aldéhydes (en particulier le alonaldéhyde ou l'hydroxy-4-nonénal) résultant de la peroxydation des lipides par le ¹ 0 ₂ produit, par irradiation d'une cellule unique, après une pré-incubation avec un photosensibilisateur. Il convient alors, comme montré précédemment, par Morliere et al. (Photochem, Photobiol.46, 183-91 (1987) d'étudier la cinétique d'apparition de ces pigments fluorescents (leur maximum de fluorescence se situe vers 470nm) au sein

12 de la cellule, en présence et en absence des inhibiteurs.

2/ Pour étudier l'effet des dérivés pyrroliques sur les autoperoxydations cellulaires, on incube des fibroblastes humains à 37*C pendant une nuit avec des ions Fe ²⁺ ce qui induit la peroxydation des lipides cellulaires. Celle-ci sera mesurée par le test bien connu de l'acide thiobarbiturique (TBA) en utilisant la détection par fluorescence après extraction au 1- butanol des composés résultants du couplage TBA- aldéhydes. On mesure aussi l'effet de ces dérivés sur la capacité des cellules à synthétiser l'ADN après peroxydation en présence de Fe ² *.

Ces essais ont permis de révéler les propriétés des dérivés pyrroliques de l'invention, comme intercepteurs d'espèces activées du dioxygène. L'étude des compositions ci-dessus a montré qu'elles sont dépourvues de toxicité. Elles sont donc avantageusement utilisées pour le traitement des pathologies impliquant des réactions chimiques avec des espèces activées du dioxygène. Il s'agit notamment du traitement de porphyries, de la sphère O.R.L., des maladies asthmatiques, inflammatoires, athéromateuses ou allergiques, de la prévention anticancéreuse, de traitements immunomodulateurs ou de radioprotection.

Entrent donc dans le cadre de l'invention des compositions pharmaceutiques comprenant une quantité efficace d'au moins un dérivé pyrrolique répondant aux définitions ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable.

L'invention vise également un procédé de préparation des dérivés répondant à la formule I et définis ci-dessus dans le cadre de leur utilisation.

Selon ce procédé, on fait réagir un dérivé aminé de formule (II)RNH ₂ avec une dicétone de formule (III) R^O (CHR ₁ ) ₂ -CO-R ₁ , ce qui conduit à un dérivé de

pyrrole de formule I, R et R _1f étant tels que définis ci-dessus.

L'étape de condensation entre les dérivés de formules II et III est avantageusement réalisée en présence d'un excès de dicétone, de l'ordre de 5 à 10 % par rapport à la stoechiométrie de la réaction lorsque l'on emploie un solvant autre que la dicétone elle-même.

Pour accélérer la réaction de condensation, on a recours à une température supérieure à l'ambiante, avantageusement au-delà de 100"C, notamment entre 110°C et 150 ^β C.

La réaction de synthèse est avantageusement faite sous courant gazeux, notamment sous un courant d'azote.

Le produit ainsi obtenu est lavé, précipité et le précipité est alors à nouveau lavé et purifié notamment par HPLC.

Le milieu réactionnel utilisé est constitué par la dicétone et l'aminé, éventuellement en présence d'acide acétique, ou d'un solvant aprotique dipolaire (tel que le diméthylsulfoxide, diméthylformamide, hexaméthylphosphorotriamide) . Dans les exemples présentés ci-après, 1•hexanedione-2 ,5 a été employée comme dicétone-1,4, conduisant ainsi à des dérivés du diméthyl-2,5 pyrrole. Le rendement est généralement satisfaisant (supérieur à 50%) .

Les dispositions qui précèdent permettent de pallier l'insolubilité de certains des dérivés aminés dans les solvants organiques usuels.

L'étude de la réactivité des dérivés de pyrrole avec différentes espèces activées du dioxygène et avec des radicaux faiblement oxydants tels que Br ₂ ^" ., SCN ₂ ^" . a montré l'intérêt de ces dérivés pyrroles en tant qu'intercepteurs d'espèces activées du dioxygène. De

plus, les dérivés pyrroliques de l'invention sont stables.

Des propriétés particulières des dérivés pyrroliques adaptés à la réalisation de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent. EXEMPLE 1 - SYNTHESE ET CARACTERISATION DE DERIVES PYRROLIQUE (ces dérivés sont désignés ci-après par des codes pour faciliter la lecture) I - Glycine-Pyrrole (COONa) désigné par GlyPyr (COONa)

970mg de glycine (sel de sodium, 10 ^" mole) , 1,2g environ ( ^" )10 ^" mole) d'acétonylacétone et 10ml de diméthylsulfoxyde ont été chauffés environ 3mn à une température de 110-120°C, sous un courant d'azote. Après refroidissement à la température ambiante, le produit a été lavé 2 fois avec 20ml de pentane et le pyrrole a été précipité avec le minimum d'acétate d'éthyle froid. La poudre blanche a été essorée et lavée avec le minimum d'acétate d'éthyle froid. Le rendement obtenu était voisin de 85%. Le produit final a été caractérisé par ses propriétés physicochimiques et notamment par ses spectres d'absorption I.R, U.V, sa RMN ¹ H.

UV (eau) : 212 (e = 8000)

IR (KBr) : 1625 (TF) ; 1605 (TF) ; 1320 (F) ; 740 (F) ¹ H-RMN (D ₂ 0) (H ₂ 0:4,6 ref.int.) :ÇH-=- s:5,63 ; CH-=- s

: 1,82 ; ÇH, s : 4,21

II - Alanine-Pyrrole (COONa) : AlaPyr (COONa)

10

15

20

25

30

35

La synthèse a été réalisée selon le même procédé que celui décrit dans I par condensation de l'alanine avec 1'acétonylacétone. Après les lavages au pentane, le pyrrole a été précipité avec une quantité minimum d'éther sec. On a ensuite filtré et lavé avec une quantité minimum d'acétate d'éthyle froid. Le produit final est une poudre blanche obtenue avec un rendement d'environ 80%.

Le produit est caractérisé comme suit :

UV (tampon phosphate, 50 mmolaire; pH : 7) : 210nm

(e=7900)

IR (KBr) : 1594 (TF) ; 1407 (TF) ; 1300 (F) ; 757 (F) ¹ H-RMN (D ₂ 0) H ₂ 0 : 4,6 ref.int.) : ÇH-=-s:5,76 ;

CH,-=-S ; 2 , 15 ; CH-CH ₃ q:4,74 (J=7,35Hz) ; CH ₃ -CHd:l,48

(J=7,35Hz)

III - Phénylalanine-Pyrrole : PhePyr.

10

15

20

25

30

35

1,65g (10 ^"2 mole) de phenylalanine et 5ml d'acetonylacetone ont été chauffés, sous un courant d'azote, à une température d'environ 130 ^β C, jusqu'à obtention d'une solution limpide ("5-10mn) . Après refroidissement à la température ambiante, le pyrrole a été lavé 2 fois avec 50ml de pentane et essoré. Le prrduit obtenu a été lavé avec le minimum d'éther sec. On a récupéré une poudre presque blanche avec un rendement d'environ 80%.

Les caractéristiques du produit sont les suivantes:

Il se décompose à partir de 160°C, point de fusion

UV (H ₂ 0) : 207nm (e = 8000)

IR (KBr) : 1715 (TF) ; 1400 (TF) ; 1395 (TF) ; 760

(TF) ; 700 (TF)

¹ H-RMN (CDC1 ₃ ) : CH-=- s: 5, 75 ; O -≈-siΣ, 00; C ₆ H ₅ -m :

6,80-7,00 (2pr.), m:7,12-7,24 (3pr.) ; CH-CH _? système ABX masse 4,77-5,0 ; CH _? CH ABX 3,05-3,70 ABX calculé :<5HA = 3,55ppm ; 5HB ≈ 3,22ppm ; 5HX = 4,86 ; J (A-B)=14HZ : K (A-X)=4,80Hz ; J (B-X)=9,9Hz.

IV-Pyrimidine-Pyrrole : PyPyr

1,58g (10 ^"2 mole) de diamino-5,6-2-thiouracile dans le minimum d'hexamethylphosphorotriamide, à 50'C environ ont été dissous sous courant d'azote. 1,2g ("10 ^"2 mole) d'acetonylacetone ont été ajoutés et la température a été portée aux environs de 130"C ( ^" 10-15mn) . On a laissé revenir à la température ambiante et lavé 2 fois avec 30ml de pentane. Le pyrrole a été précipité par du chlorure de méthylène sec. Puis on a essoré et lavé au chlorure de méthylène. Le produit est obtenu avec un rendement d'environ 85%.

Ses caractéristiques sont les suivantes :

Point de fusion F>260 ^β C,

UV (tampon phosphate, 50 mmolaire à pH : 7 :284 (e =

3400) ; 260 (e = 2600) ; 210 (e ≈ 7600)

IR (KBr) : 3400 (F) ; 3275 (F) ; 1690 (TF) ; 1605 (TF)

; 1556 (TF) ; 1 5 (TF) ; 1195 (TF) ; 1161 (TF) ; 991

(TF) ; 971 (TF) ; 772 (TF) ; 748 (TF)

^-RM (DMSO d-6) : ÇH-=- s:5,74 ; CH^-≈- s:l,91 ; masse 236 ;179 ; 135 ; 92.

V-Adénine-Pyrrole : AdePyr

1,55g (10 ^"2 mole) d'adénine et 1,5ml d ^• acetonylacetone ont été chauffés, sous courant d'azote, à une température d'environ 140°C, jusqu'à ce que le mélange devienne limpide (" 5-10mn) . Après refroidissement, on a lavé 2 fois avec 50ml de pentane et précipité le pyrrole avec une quantité minimum d'éther sec. On a ensuite essoré et lavé avec le minimum d'éther sec. Le produit est obtenu avec un rendement voisin de 80%.

Ses caractéristiques sont les suivantes :

Point de fusion F _(dec 250 ^β C

UV (C ₂ H ₅ OH) : 280 (8600) ; 210 (9000)

IR (KBr) : 1615 (TF) ; 1590 (TF) ; 1410 (TF) ; 1315

(TF) ; 1215 (TF) ; 765 (TF) ; 645 (TF)

¹ H-RMN (CU3COCD3) : ÇH-=-s : 5 , 88 ; CH,-=-s : 2 , 15 ; N-CH-

NH s : 8 , 51 ; N=ÇH-N=ÇH-N s : 8 , 88

VI-Histidine-Pyrrole : HisPyr

1,55g (10 ^"2 mole) d'histidine, 1,2g ("10 ^"2 mole) d'acetonylacetone et 5ml de diméthylsuifoxyde ont été chauffés, sous courant d'azote, à une température d'environ 125 ^β C, jusqu'à ce que le mélange réactionnel devienne limpide ( ^" 10mn). Puis on a refroidi et lavé 2

fois avec 30ml de pentane. Le produit en début de cristallisation , a été précipité totalement par 20ml d'éther sec. On a ensuite essoré et lavé avec une quantité minimum d'éther sec. Le produit obtenu a un rendement voisin de 80%.

Il est caractérisé par les propriétés suivantes :

Point de Fusion F:173°C

UV (tampon phosphate, 50 mmolaire à pH:7:210 (e =

9800)

IR (KBr) : 3455 (F) ; 3130 (F) ; 1630épl595 (TF) ;

1404épl374 (TF) ; 1024 (F) ; 751 (F)

¹ H-RMN (DMSO d-6 ^* / N=ÇH-NH m : 7,62 ; HN-ÇH=C m :

6,41 ; ÇH=C-CH ₃ s : 5,51 ; ÇH3 s: 2,00 ; ÇH-CH ₂ ABX m :

4,98-4,93 ; CH-CH ABX m : 3,7-3,0

ABX : calculé : S HA = 3,37ppm : <5 HB = 3,04ppm :

S HX = 4,95 ;

J (A-B)=15Hz ; J (A-X)=5,3Hz ; J (B-X)≈lOHz masse : 233 ; 215 ; 189 ; 135 ; 120 ; 108 ; 94.

VII-Homocarnosine-Pyrrole : HcarPyr

1,2g (0,5.10 ^"2 mole) d'homocarnosine et 750mg ( ^" 0,5.10 ^' mole) d'acetonylacetone dans 15ml d'acide acétique ont été portés 3mn à ébullition, sous un courant d'azote. On a distillé l'acide acétique sous pression réduite, puis lavé 2 fois le mélange réactionnel avec 20ml de pentane et précipité le pyrrole par de 1'éther (" 30 ml) . On a obtenu une poudre rose, presque blanche avec un rendement proche de 85%.

Les caractéristiques du produit sont les suivantes:

Il se décompose à partir de 140°C

UV (tampon phosphate, 50 mmolaire à pH:7: 210 (e =

11000)

IR (KBr) : 3315 (F) ; 1651 (TF) ; 1411 (TF) ; 1300 (F)

; 845 (F) ; 750 (F) ; 633 (F)

¹ H-RMN (D ₂ 0) N=ÇH-NH d : 8,40 (J=l,4Hz) ; HN-ÇH-=C m :

7,07 ; CH,-C=Q m : 3,59-3,50 ; CH _? -N m : 2,13-2,04 ; CH _? -CH _? -CH _? m : 1,67-1,57 ; ÇH-CH ₃ s:4,6 ; ÇR3 s : 1,96

CH-CH? : Système ABX. Deux multiplets (6,61-5,89 et

6,02-5,31)

ABX calculé : δ HA = 3,08ppm ; δ HB = 2,88ppm ; δ HX ≈

6,25 : J (A-B)=15,25HZ ; J (A-X)=4,9Hz ; J (B-X)=9HZ masse : 318 ; 210 ; 181 ; 158 ; 135 ; 120 ; 108 ; 94

VlII-Carnosine-Pyrrole CarPyr

1,08g (0,5.10 ^"2 mole) de carnosine et 750mg ("0,5.10 ^'2 mole) d'acetonylacetone dans 15ml d'acide acétique ont été traités 3mn à l'ébullition. Comme précédemment, le pyrrole a été isolé sous la forme d'une poudre rose, presque blanche avec un rendement voisin de 85%.

Les caractéristiques du produit final sont :

Décomposition à partir de 150 ^β C.

UV (tampon phosphate, 50 mmolaire à pH:7: 210 (e =

11000)

IR (KBr) : 3280 (F) ; 1660 (TF) ; 1650épl620 (TF) ;

1580épl565 (TF) ; 1540 (F) ; 1407 (F) ; 1300 (F) ;

1245 (F) ; 845 (F) ; 755 (F) ; 630 (F) ; ¹ H-RMN (DMSO d-6) : HN-ÇH=N d : 7,62 (J=l,lHz) ;

HN-ÇH=C m : 6,77; 0=C-CH, t : 2,37 (J=7,6HZ) ; CH,-N t

: 3,85 (J=7,6Hz); JH-CH ₃ s : 5,56 ; ÇH ₃ S / 2,11 ;

CH _? CH ABX m : 2 , 77-2 , 97 ; ÇH-CH ₂

ABX m : 4 , 38-4 , 45 ABX calculé : δ HA = 2,94ppm ; <S HB = 2,81ppm ; δ HX =

4,41 ; J (A-B)=14,8Hz ; J (A-X)=5,8Hz ; J (B-X)=8,5Hz

EXEMPLE 2 : Etude de la réactivité de dérivés pyrroliques N-substitués avec l'oxygène singulet.

On a mesuré les constantes de vitesse de réactions bimoléculaires (k: (M ^"1 s ^"1 )) de l'oxygène singulet avec des pyrroles N-substitués obtenus à partir de précurseurs de macromolécules biologiques (acides aminés, bases puriques et pyrimidiques, osamines et leurs combinaisons) . La réactivité a été testée vis-à-vis de ¹ 0 ₂ à pH7 en solution aqueuse tamponnée (la mesure de la constante de vitesse a été faite selon la méthode de comparaison exposée par GIRAUD et al (J. Chem. Soc. Chem. Comm. , (1982), 1146-8) .

Les résultats du tableau 1 concernent les composés suivants

Pyr = diméthyl-2,5-pyrrole ; Ala = alanine : His = Histidine : Trp = Tryptophane ; Cys = Cystéine ; Lys ≈ Lysine ; Ade = Adénine ; Car = Carnosine ; Hcar = Homocarnosine.

Le chiffre 0 figurant dans tous les tableaux donnés ci-après, signifie qu'aucune réactivité n'a été détectée dans les conditions expérimentales choisies.

tableau 1

Le tableau 1 démontre sur quelques exemples que les molécules ainsi obtenues possèdent une réactivité considérablement augmentée vis-à-vis de ¹ 0 ₂ par rapport à l'acide aminé correspondant ou les bases puriques ou pyrimidiques correspondantes notamment pour Cys et surtour Ala qui ne réagit pas avec ¹ 0 ₂ . au pH physiologique.

EXEMPLE 3 : Etude de la réactivité des dérivés pyrroliques et de leurs complexes métalliques avec les radicaux 0 ₂ -, OH- et les radicaux faiblement oxydants (Br ₂ - et SCN ₂ ^_ ) .

Dans le tableau 2 suivant sont reportés, sur quelques exemples sélectionnés, les résultats des mesures effectuées par radiolyse puisée (selon la technique exposée dans US Department of Commerce NBS document 59, 1977) concernant la réactivité de ces dérivés avec des radicaux soit très oxydants (OH.) soit plus faiblement oxydants (Br ₂ ^" , SCN ₂ ^" ) . Ces derniers étant communément utilisés pour tester la réactivité vis-à-vis des radicaux oxydants, on constate que les produits synthétisés présentent une grande réactivité avec les radicaux OH-. En effet, les constantes de vitesse de réaction sont pratiquement celles de réactions contrôlées par la diffusion alors que ce n'est pas toujours le cas pour les composés de base (voir par exemple AlaPyr et LysPyr par rapport respectivement à Alanine et Lysine) . Le contraste est encore plus grand en ce qui concerne la réactivité avec les radicaux Br ₂ ^" et SCN ₂ ^" puisque tous les dérivés réagissent très facilement avec ces derniers alors que, et ceci est directement comparable avec les résultats obtenus pour 1•interception de 1'oxygène singulet, certains produits parents ne sont pas réactifs (Alanine, Lysine) .

Ces résultats démontrent donc l'importance du groupement diméthylpyrrole sur l'amplification des propriétés "antioxydantes". D'autre part, la comparaison des réactivités de LysPyr et de AlaPyr vis-à-vis des radicaux chargés négativement souligne, dans le cas de LysPyr, une augmentation de la réactivité liée à la charge positive du groupement Lysyle. On peut donc moduler la réactivité de ces

dérivés par l'utilisation de composés tels que Lys- Cys-Pyr, Lys-Ala-Pyr, Lys-Trp-Pyr.

TABLEAU 2

Radicaux OH- Br ^" . SCN ₂ ^" .

Dérivés

AlaPyr 5.10 ⁹ 7,5.10 ⁸ 8.10 ⁸

CysPyr 4.10 ⁹ 4.10 ⁸ 3,3.10 ⁸

LysPyr 8.10 ⁹ 1,3.10 ⁹ 1,3.10 ⁹

TrpPyr 8.10 ⁹ 7.10 ⁸ 7.10 ⁸

HisPyr 8,6.10 ⁹ 1,5.10 ⁹ 8,9.10 ⁸

CarPyr 9,2.10 ⁹ 1,1.10 ⁹ 1,1.10 ⁹

HcarPyr 1,2.10 ⁹ 1,4.10 ⁹ 1,3.10 ⁹

Ala 8.10 ⁷ 0 0

Cys 4.10 ¹⁰ 1,8.10 ⁸ 0,5.10 ⁸

Lys 3.10 ⁸ 0 0

Trp 1,3.10 ¹⁰ 7 , 7.10 ⁸ 2 , 7.10 ⁸

His 5.10 ⁹ 1,5.10 ⁷ <1.10 ⁶

Constantes de vitesse de réaction (en M ^"1 s ^*1 ) à pH 7 et t ^β =25 ^β C de certains intercepteurs et de leurs composés parents vis-à-vis de radicaux libres oxydants. EXEMPLE 4 - Test de réactivité des dérivés possédant la fonction thiol avec l'ion superoxyde (0".).

La réactivité des dérivés CysPyr et PyPyr avec l'ion superoxyde, généré par radiolyse puisée, a été déterminée par une méthode classique. Dans cette méthode, le cytochrome C est utilisé comme marqueur grâce à sa forte absorption des radiations lumineuses du spectre visible. La réduction du cytochrome C ferrique par 0 ₂ ^" . se traduit par l'apparition d'une bande d'absorption à 550nm caractéristique de la forme réduite. En présence d'un autre produit réagissant également avec 0 ^" . , le rendement en cytochrome C réduit est diminué. A partir de ces données, on déduit la constante de vitesse du produit étudié avec cette espèce radicalaire. A titre d'exemple, celle de CysPyr est de lO^^s ^"1 alors que celle de la Cystéine n'est que de l0 ⁴ M ^'1 s ^"1 .

Les composés synthétisés dans les exemples présentent des propriétés intéressantes :

Ils n'absorbent pas l'UV solaire, ils confèrent une bonne résistance à 1•autoxydation du cycle diméthyl-2,5 pyrrole. Des solutions aqueuses abandonnées à la température ordinaire sont parfaitement stables pendant des semaines comme l'indique le suivi par HPLC de ces solutions.

Les peptides, les acides aminés en particulier Ala et His, les bases puriques et pyrimidiques sont de bons complexants d'ions métalliques. Par exemple, de façon préférée, les ions Cu ⁺⁺ sont capables de former des complexes 1-1 avec Ala et His dans des solutions aqueuses tamponnées à pH neutre. La réactivité des complexes avec les radicaux 0 ₂ ^* ou même ¹ 0 ₂ peut se révéler intéressante puisque 1'on sait que certains

complexes métalliques comme l'auranofine (un antiarthritique) peuvent réagir avec ¹ 0 ₂ , dismuter efficacement 0 ^' et entrer dans des cycles redox pro ou antioxydants.