SECTOR TECNOLÓGICO

[001] La presente invención se enmarca en sector de la salud, principalmente en la salud humana. Especialmente en el desarrollo de vacunas vivas alternativas para contrarrestar la pandemia causada por el virus del SARS CoV-2.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[002] La presente invención hace referencia a una vacuna viva recombinante basada en una cepa de SE, Salmonella enterítidis 3934 XXII XrpoS waaL (3934VacR) atenuada y rugosa la cual ha sido modificada para la expresión de una proteína del virus Sars-Cov-2 causante de la pandemia COVID-19. Esta cepa de Salmonella entérica (3934VacR) es capaz de expresar el xenoantígeno proteico heterólogo RBD (receptor binding domain) externo de la proteína S del virus Sars-Cov-2 COV-19. La presente invención incluye además la utilización de esta cepa como vector vacunal frente al virus Sars-Cov-2, vía un proceso de inserción e integración de los genes que codifican el antígeno de la proteína de la superficie RBD del virus Sars-Cov-2 Covid-19. El vector de SE que se emplea, ha sido genéticamente modificado para funcionar como vehículo de expresión de los genes inmunodominantes del antígeno de la proteína RBD del virus Sars-Cov-2, con el fin último de estimular una respuesta inmune eficaz y duradera contra el virus Sars-Cov-2. La cepa generada es totalmente segura debido a que está exenta de los doce genes que codifican las proteínas de la ruta de señalización del mensajero secundario GMP-di-cíclico, el factor sigma RpoS y la proteína WaaL. Por lo anteriormente expuesto, esta cepa se propone como una nueva vacuna viva recombinante eficaz e inocua, contra el virus SArs-Cov-2, idónea para vacunar poblaciones de mamíferos, especialmente humanos, en donde todos los componentes de esta vacuna han sido específicamente diseñados y desarrollados con los tres factores prioritarios sucesivos de: eficacia, seguridad y costo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[003] La emergencia y reemergencia de patógenos es un nuevo desafío para la salud pública. (Gao, GF.). Los coronavirus son virus ARN con cubierta, distribuidos ampliamente en humanos, algunos mamíferos y aves causando enfermedades respiratorias, entéricas, hepáticas y neurológicas (Weiss SR, Leibowitz JL.) (Masters PS, Perlman S.). Ahora se conocen seis especies de coronavirus que causan enfermedades humanas y cuatro de ellas — 229E, OC43, NL63 y HKU1 — son los más prevalentes y causantes típicos de estas infecciones virales. (Su S, Wong G, Shi W, et al.). Las características clínicas más destacadas de los pacientes se muestran en el artículo titulado “Clinical Characteristics of Coronavirus Disease 2019 in China” (Guan, Wei-jie et.aL).

[004] Desde el punto de vista de patentes, se conoce el documento CN101838627 el cual se refiere a una estructura recombinante de salmonella choleraesuis, una vacuna de ingeniería genética bivalente y un método de preparación y aplicación de la recombinación de salmonella choleraesuis, donde la recombinación de salmonella choleraesuis no comprende un marcador de resistencia y expresa las principales proteínas Cap del antígeno del circovirus II porcino. El número de conservación de la recombinación Salmonella choleraesuis C501 (pYA-delta 410RF2) que no comprende el marcador de resistencia, expresa los principales sitios antigénicos del circovirus II porcino y se prepara mediante la invención de CCTCC M209314. La recombinación de salmonella choleraesuis elimina los genes asd que son necesarios para el crecimiento de la salmonella choleraesuis y comprende un plásmido que puede expresar los genes asd y los genes de los sitios antigénicos de las proteínas Cap del circovirus porcino II en la recombinación de salmonella choleraesuis.

[005] De otra parte, la patente WO205/035556se refiere a sistemas tales como plásmidos recombinantes, virus y procariotas que expresan las proteínas M, E y S asociadas a la membrana del SARS-CoV en células, tales como células humanas, tanto in vitro como in vivo en donde las proteínas SARS-CoV M, E y S forman espontáneamente partículas similares al virus del SARS-CoV (SARS-CoV-VLP). La expresión intracelular de las proteínas SARS-CoV M, E y S y su asociación para formar partículas tipo virus que presentan las proteínas virales en su contexto "natural", provoca la inducción de una respuesta del sistema inmunológico. También se refiere a métodos para producir una respuesta inmune en animales, tales como humanos y otros mamíferos, identificando a un sujeto en riesgo de desarrollar SARS y administrando al sujeto una o más construcciones genéticas capaces de expresar la SRAS- Polipéptidos CoV M, E y/o S. La invención enseña que las cepas procariotas vivas atenuadas deben mantener un equilibrio entre la atenuación y la inmunogenicidad y que no causan ninguna enfermedad ni alteren la fisiología normal del huésped.

[006] También se conoce el documento WO201 1/126976 el cual proporciona una proteína de reovirus S1 modificada que comprende un primer epítopo antigénico de un antígeno de no reovirus localizado en la región helicoidal de la proteína. El primer epítopo puede insertarse en la región alfa-helicoidal de la proteína, o puede reemplazar una o más repeticiones de heptada en la región alfa-helicoidal de la proteína. El primer epítopo puede ser un epítopo viral dentro de los cuales se encuentra el coronavirus asociado al SARS y un epítopo bacteriano de una bacteria dentro de las cuales se puede escoger la Salmonella spp.

[007] El documento US2018/296663 enseña una combinación de un primer componente y un segundo componente, en donde el primer componente es típicamente un componente inmunogénico y en donde el segundo componente es típicamente un componente adyuvante, en donde, el primer componente (inmunogénico) comprende al menos una molécula de ácido nucleico que codifica al menos un antígeno, o un fragmento o vahante del mismo. El segundo componente (adyuvante) de la combinación comprende al menos un compuesto adyuvante, en el que al menos un compuesto adyuvante es preferiblemente un compuesto inmunopotenciador. El segundo componente (adyuvante) de la combinación comprende al menos un compuesto potenciador inmunitaho, y/o al menos un compuesto del sistema de administración. Los antígenos patógenos son antígenos de péptidos o proteínas derivados preferiblemente de un patógeno asociado con una enfermedad infecciosa dentro de las cuales, se considera el coronavirus SARS.

[008] De otra parte, la patente WO2017/070626 enseña vacunas de ácido ribonucleico (ARN) que se basan en el conocimiento de que el ARN (por ejemplo, ARN mensajero (ARNm)) puede dirigir de manera segura la maquinaria celular del cuerpo para producir casi cualquier proteína de interés, desde proteínas nativas hasta anticuerpos y otras proteínas completamente nuevas. Los constructos pueden tener actividad terapéutica dentro y fuera de las células. Las vacunas de ARN (por ejemplo, ARNm) de acuerdo con dicha invención pueden usarse para inducir una respuesta inmune equilibrada contra hMPV, PrV, RSV, MeV y/o BetaCoV (por ejemplo, MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV- OC43, HCoV -229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HCoV- HKU1), o cualquier combinación de dos o más de los virus anteriores, que comprendan inmunidad celular y humoral, sin riesgo de mutagénesis insercional, por ejemplo, hMPV, PIV, RSV, MeV, BetaCoV (p. ej., MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKUl) y combinaciones de los mismos. También enseña que la f lagelina es una proteína monomérica de aproximadamente 500 aminoácidos que se polimeñza para formar los flagelos asociados con el movimiento bacteriano. La flagelina es expresada por una variedad de bacterias flageladas (Salmonella typhimurium por ejemplo) así como por bacterias no flageladas (tales como Escherichia coi!) para la detección de flagelina por células del sistema inmunológico innato.

[009] El documento US2016/339097 enseña la preparación y aislamiento de proteínas y antígenos de coronavirus, particularmente de coronavirus porcinos y proporciona además proteínas y antígenos virales obtenidos de células infectadas por coronavirus y composiciones que comprenden las proteínas y antígenos. Describe un método para preparar proteínas y/o antígenos de coronavirus, tales como proteínas y/o antígenos PEDV o PDCoV, a partir de células infectadas con un coronavirus, tales como PEDV o PDCoV. Las proteínas y/o antígenos se recolectan en un punto de tiempo temprano después de la infección cuando la mayoría, o la totalidad, de las proteínas y/o antígenos virales permanecen asociados con las células infectadas. La mayoría o la totalidad de las proteínas codificadas por coronavirus están dentro de las células infectadas o asociadas con la membrana celular de las células infectadas. En tales condiciones, relativamente pocas partículas de coronavirus, si las hay, están presentes en el entorno extracelular fuera de las células. La composición de vacuna puede comprender proteínas y/o antígenos de al menos un patógeno adicional que puede ser cualquier patógeno que cause una enfermedad y/o una infección en un sujeto porcino.

[010] En la parte de artículos científicos, se conoce la publicación “Ora! delivery of SARS-CoV-2 DNA vaccines using attenuated salmonella thyphimurium as a carrier in rat" Este artículo muestra una investigación y exploración del uso de Salmonella typhimurium como vehículos para administrar plásmidos de expresión por vía oral. Se administró por vía oral Salmonella phoP atenuada que albergaba plásmidos de expresión eucañotas que codificaban la proteína de espícula de SARS-CoV-2 a ratas Wistar. Las ratas se inmunizaron por vía oral con Salmonella que portaba un plásmido de expresión eucañota una vez a la semana durante tres semanas consecutivas. La eficacia del procedimiento de vacunación se debió a la transferencia del plásmido de expresión del portador bacteriano al hospedador mamífero. La evidencia de tal evento podría obtenerse ¡n vivo e in vitro. Los resultados mostraron que todos los animales inmunizados generaron inmunidad humoral contra la proteína de espícula del SARS- CoV-2, lo que indica que una vacuna basada en Salmonella que lleva el gen Spike puede provocar respuestas inmunes humorales específicas del SARS-CoV-2 en ratas, y puede ser útil para el desarrollo de una vacuna protectora contra la infección por SARS-CoV-2.

[011] De otra parte, el artículo titulado “Oral vaccination with attenuated salmonella enterica serovar typhimurium expressing cap protein of pcv2 and its immunogenicity in mouse and swine models" el cual menciona que se utilizó la cepa SL3261 de vacuna atenuada de Salmonella entérica serovar Typhimurium como un sistema de administración de antígeno para la inmunización oral de ratones contra dos antígenos de Cryptosporidium parvum, Cp23 y Cp40. Cada antígeno se subclonó en el sistema de vector pTECHI , lo que permite que se expresen como proteínas de fusión con el fragmento C altamente inmunogénico de la toxina del tétanos bajo el control del promotor n i r B anaeróbicamente inducible. El vector recombinante se introdujo en la cepa de vacuna de Salmonella Typhimurium SL3261 , y la expresión soluble estable de la proteína quimérica se evaluó y confirmó mediante transferencia Western con antisueros policlonales de C. parvum.

[012] Teniendo en cuenta el estado del arte, es evidente que si bien, actualmente existen diferentes métodos para detección del virus causante del Covid-19, a la fecha no existen vacunas comerciales contra el Sars-Cov-2, sin embargo, existen otras que están procesos muy avanzados y que próximamente podrían estar en el mercado. Estas vacunas varían en el tipo de adyuvante y naturaleza del antígeno. Por lo tanto, el problema que resuelve la presente invención es proporcionar una vacuna viva recombinante para el SARS-CoV-2 (Covid 19) que pueda generar una respuesta inmune efectiva y prolongada.

[013] En este sentido, la presente invención proporciona el desarrollo de una vacuna viva y recombinante contra el Sars-Cov-2 que tiene una elevadísima probabilidad de éxito sustentada en la estabilidad de la proteína recombinante, sencillez y facilidad en la aplicación que se ofrecería a la salud pública nacional e internacional utilizando como vector una cepa de SE atenuada. Estas ventajas se pueden resumir en: (1 ) atenuación severa gracias a varios procesos de mutagénesis dirigida mediante un mecanismo de intercambio alélico que evita la reversión y convierten a la cepa resultante en un vector vacunal totalmente seguro;

(2) la cantidad de expresión del antígeno RBD que puede ser regulada mediante manipulación genética;

(3) puede administrarse por rutas de inoculación intradermal, oral e intranasal;

(4) estimula fuertemente el sistema inmune innato y adaptativo; y,

(5) brindaría a su vez protección contra SE. El desarrollo de vacunas empleando vectores bacterianos ha sido y es actualmente objeto de numerosas investigaciones, pero a la fecha no existen vacunas comerciales con licencia basados en SE. Por todo ello, el desarrollo y registro de esta vacuna, marcaría un buen precedente en el ámbito de investigación y desarrollo en la industria de biológicos nacional y no tendría competencia en el mercado nacional e internacional.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[014] La figura 1 ¡lustra la electroforesis SDS-PAGE con tinción de coomassie realizada con anti-HIS de los extractos totales obtenidos.

[015] La figura 2 ¡lustra la electroforesis SDS-PAGE con tinción de coomassie einmunodetección con anti-SARS-CoV-2 de los extractos proteicos totales (Western Blot).

[016] La figura 3 muestra los resultados de la prueba de aglutinación que detecta los anticuerpos contra el antígeno particulado.

[017] La figura 4 enseña fotografías de cajas de Peth con muestras de heces de individuos inmunizados con la vacuna de acuerdo con la presente invención.

[018] La figura 5 muestra los resultados de la respuesta de los individuos inmunizados con el antígeno de Salmonella enterítidis que expresa RBD del SARs_CoV-2 (Covid- 19).

[019] La figura 6 muestra los resultados de células inmunológicas procedentes del bazo de ratones inmunizados con la vacuna oral, de acuerdo con la presente invención, donde muestra una gran actividad inmunológica de células T productoras de citocinas funcionales como IFN-y (interferon gamma) entre otras. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[020] La presente invención se refiere a una vacuna viva recombinante basada en una cepa de Salmonella enterítidis que expresa la proteína S del virus Sars-2019-Cov-2 en donde la mejor expresión se ha logrado cuando la inserción se encuentra en el plásmido en vez del cromosoma. Asimismo, se refiere a una vacuna que precisa de dicha cepa.

[021] También, la presente invención hace referencia al uso de una cepa de Salmonella enterítidis 3934 (depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT9332) para el tratamiento de SARS-Cov-2 y al método para controlar la infección del SARS-CoV-2 mediante la administración a mamíferos de una vacuna viva recombinante

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[022] La presente invención se refiere al desarrollo de una vacuna contra el SARS- Cov-2-2019 causante de la pandemia COVID-19, para lo cual se construyó el cassette <PR-LppOmpA-RBD-6XHis-TTterminator > mediante PCR sobrelapante de dos fragmentos de 670 y 671 de pares de bases. Se incluyó un linker (GGGSGGGS) entre el fragmento LppOmpA y el fragmento RBD. Finalmente, el fragmento obtenido de 1348 pb fue subclonado en un plásmido de expresión específicamente diseñado para la inserción de secuencias en el locus attTn7, el cual se usó para transformar la cepa rugosa de Salmonella enterítidis 3934 AXII ArpoS Awaal (3934VacR) mediante electroporación. Las colonias transformantes fueron seleccionadas en presencia de ampicilina.

[023] Para la expresión del antígeno de la proteína S del virus Sars-Cov-2-2019 Covid- 19 se ha diseñado y construido un “cassette" de expresión, el cual se caracteriza porque incluye:

• Región promotora (PR)

• Secuencia para la exportación a membrana del antígeno RBD (LppOmpA)

• Linker o enlazante (GGGSGGGS)

• Región de 6 residuos de histidina para la detección de la expresión (6XHis)

• Fragmento de proteína RBD de S1 de la Spike de Corona 223 aminoácidos y • Terminador (TT).

[024] Continuando con el proceso, con el fin de integrar en el cromosoma y plásmido, se realizó un abordaje por recombinación homologa de un cassette de expresión que permitiese la producción del antígeno heterólogo RBD de la proteína S del virus Sars- Cov-2-2019 en la cepa de SE. En la presente invención, el plásmido contiene, a parte de las regiones flanqueantes de recombinación, un cassette de expresión que queda integrado en el cromosoma.

[025] La cepa resultante a la que se refiere esta invención es una cepa mutante modificada de Salmonella enterítidis que porta una deleción del gen waaL, y presenta por tanto un fenotipo rugoso, y expresa un gen que codifica el dominio de la proteína RBD de la proteína S del Sars-Cov-2-2019, causante de la pandemia Covid-19.

[026] Para efectos de la presente invención Salmonella enterítidis es abreviatura de Salmonella entérica serovar Enterítidis y la cepa SE3934-Cap ha sido depositada con el nombre SALVAC CIRCO en el depositario internacional de acuerdo con los lineamientos del tratado de BUDAPEST. Por tanto, a lo largo del documento técnico, dichas denominaciones pueden ser intercambiables.

[027] Como se indicó anteriormente, una vacuna viva o vector vacunal debe ser seguro y eficaz, con un genotipo y fenotipo totalmente controlados, que eviten el riesgo de reversión a virulencia. Además, la cepa debe mantener un equilibrio entre el grado de atenuación e inmunogenicidad, permaneciendo en el organismo del hospedador el tiempo suficiente para dar lugar a una respuesta inmune protectora frente a antígenos homólogos y/o heterólogos.

[028] En la presente invención, la vacuna viva recombinante comprende la cepa de Salmonella enterítidis 3934 generada que presenta como características primordiales una drástica atenuación de la enfermedad, en donde es una cepa registrada y aceptada para la presente invención. Además, la cepa Salmonella enterítidis 3934 es incapaz de formar biopelículas y tiene una supervivencia muy reducida en el ambiente, evitando cualquier riesgo asociado al período en el que los mamíferos, tales como animales vacunados puedan excretar esta cepa. De manera que también se estima que puede tener un potencial uso en seres humanos. A diferencia de la mayoría de las vacunas comerciales, su genotipo y fenotipo están totalmente controlados y no posee genes de resistencia a antibióticos. La inocuidad de bacterias vivas y atenuadas ha sido verificada en otros modelos como la vacuna 9R, cuyos reportes descartan científicamente una potencial reversión a la forma virulenta original (Okamoto., et al 2010 Revista Brasilera de Ciencia Avícola).

[029] En este sentido, la presente invención involucra además el uso de una cepa de Salmonella enterítidis 3934 (depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT9332) a la cual, por técnicas de ingeniería genética, se le han delecionado los doce genes que codifican enzimas diguanilatociclasas, el gen rpoS y el gen waaL. Esta última mutación se realizó con el objetivo de obtener una cepa vacunal de fenotipo rugoso (Salmonella enterítidis 3934vac DwaaL) que confiera protección a animales mamíferos, incluyendo seres humanos.

[030] Asimismo, otro aspecto de la presente invención comprende una cepa vacunal de fenotipo rugoso que porta un cassette de expresión para el antígeno heterólogo RBD de la proteína S del virus Sars-Cov2-2019 causante de la pandemia del coronavirus 2019, la cual confiere inmunidad contra la infección viral causada por virus en ciertos animales. Es decir, la cepa CECT-9932 ha sido modificada para expresar una proteína del antígeno heterólogo RBD de la proteína S del virus SARS-Cov-2-2019.

[031] Con el objetivo de reducir la toxicidad y mantener la inmunogenicidad de las cepas basadas en el fondo genético 3934vac, se procedió a un doble proceso de atenuación, es decir se retiró 13 genes (AXIII) (cepa S. Enterítidis) llamado AXII, llevando a cabo mutaciones en los doce genes que codifican las proteínas del dominio GGDEF y el gen rpoS, Latasa 2016) y luego se hace rugosa a fin de hacerla más propensa al ataque inmune.

[032] La metodología empleada para la generación de los mutantes rugosos utiliza de manera general los siguientes pasos: a) Construcción del vector integrativo pKO:waaL b) Integración del vector suicida pKO:waaL (primera recombinación) c) Excusión del vector integrativo pKO:waaL (segunda recombinación) d) Verificación de los mutantes por PCR Transformación del cassette de expresión <PR-LppOmoA-RBD-6XHis-TT> en la cepa 3934:

[033] Para la construcción del casette de expresión <PR-SEM-6XHis-RBD-TT> Se utilizó la cepa rugosa de Salmonella enteritidis 3934 AXI I ArpoS Awaal (3934vacR) como vehículo para la expresión del antígeno de la proteína de la superficie RBD del virus del SARS-CoV-2.

Verificación de la expresión mediante Western Blot:

[034] Para corroborar la expresión de la fusión <PR-LppOmpA-RBD-6XHis-TT> de las cepas 3934Vac con el cassette att7n7;:PR-LppOmpA-RBD-6XHis-TT integrado, se prepararon extractos proteicos totales a partir de cultivos planctónicos crecidos en medio LB a 32 ^e C. Dichos extractos se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y SDS (SDS-PAGE). Una vez separadas, las proteínas se electro- transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (fig . 1 y 2) y se incubaron con anticuerpos anti-histidinas conjugados con Horseradish Peroxidase (HRP) (fig. 1 ). El experimento de inmunodetección demostró la presencia de una banda específica de aproximadamente 35-38 KDa (que se corresponde con el tamaño proteico esperado) tanto en las cepas en las que la expresión provenía desde plásmido (líneas 2, 3 y 4) como en las cepas con el cassette de expresión integrado en el cromosoma (líneas 5, 6, 7 y 8). Como control negativo se han utilizado extractos proteicos de la cepa 3934Vac salvaje (WT), en la cual, no se detecta expresión del antígeno (línea 9). También se incluyeron extractos procedentes de un clon de E. coi! conteniendo el vector de expresión (línea 1 ). La banda es reconocida tanto por el anticuerpo Anti-His, como por el Anti-SARS-CoV- 2. (fig. 2).

[035] Las composiciones de vacuna de acuerdo con la presente invención se pueden administrar por cualquier vía convencional, que incluye inyección, oral, aerosol intranasal por inhalación, por ejemplo, un aerosol o gotas nasales, o por infusión gradual en el tiempo. La administración puede ser, por ejemplo, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavitaha, subcutánea o transdérmica. En una modalidad preferida de la invención la vacuna viva recombinante se administra vía oral. [036] Las composiciones de vacuna de la presente invención pueden ser administradas en cantidades eficaces. Una "cantidad eficaz" es aquella cantidad de una composición de vacuna que, sola o junto con dosis adicionales, produce la respuesta inmune deseada.

[037] La presentación de las dosis y/o empaques para la vacuna viva recombinante para SARS-CoV 2 basada en salmonella enteritidis recombinante, puede ser cualquier forma conocida, por ejemplo, es decir, el empaque primario, esto es, el empaque que está directamente en contacto con la vacuna, puede ser, pero no se limita a ampolletas de vidrio o de plástico estériles, shachets (sobres), bien sea en frascos unidosis o multidosis. En otra modalidad de la invención, si se desea, la vacuna puede estar en un frasco y el adyuvante o diluyente en otro frasco separado, en donde el volumen de la vacuna y el diluyente en cada frasco se determina de acuerdo con la práctica normal del fabricante y pueden estar en empaques secundarios, es decir, una caja que contiene vahos envases primarios de la vacuna y/o del adyuvante o diluyente. Estos empaques pueden estar a temperatura entre -5°C y 10°C, preferiblemente entre 5°C y 8°C; por lo que es una ventaja adicional de la vacuna viva recombinante de la presente invención, ya que no requiere de dispositivos especiales de almacenamiento y/o de transporte para mantener temperaturas bajas extremas.

[038] En una modalidad preferida de la presente invención, las composiciones de vacuna comprenden un adyuvante y/o excipiente, en donde los adyuvantes farmacéuticamente aceptables se definen como sustancias que aumentan las respuestas inmunitahas específicas a los antígenos modulando la actividad de las células inmunitahas. Ejemplos de adyuvantes que pueden ser empleados en la presente invención para la vacuna viva recombinante incluyen, pero no se limitan a saponinas, anticuerpos agonistas para moléculas coestimuladoras, adyuvante de Freund, muramil dipéptido (MPD), DNA bacteriano (oligo CpG), lipo-polisacáridos (LPS), MPL (Mozilla Public license) y derivados sintéticos, I ipopéptidos y liposomas, entre otros. El adyuvante es un inmunomodulador. En una modalidad de la invención, otros adyuvantes preferidos pueden ser escualeno, Quillaja saponaria y surfactantes.

[039] La vacuna de acuerdo con la presente invención, comprende una cepa de Salmonella Enteritidis modificada de acuerdo con la presente invención la cual expresa proteínas de la región RBD del dominio S1 del SARS CoV-2, agua estéril y opcionalmente, adyuvantes tales como el escualeno, quillaja saponaria y surfactantes, [040] Las dosis de vacuna o concentraciones de la misma de acuerdo con la presente invención se formulan y administran en dosis entre un intervalo de 10 ⁵ UFC y 10 ¹⁵ UFC; de preferencia, en un intervalo entre 10 ⁸ UFC y 10 ¹² UFC de acuerdo con cualquier procedimiento estándar en la técnica. La administración puede realizarse en una, dos, tres o más tomas en periodos recomendados.

[041] Un experto en la técnica conocerá otros protocolos para la administración de las composiciones de vacuna, en los que la cantidad de dosis, el programa de inyecciones, los lugares de las inyecciones, el modo de administración y similares podrían variar de acuerdo con la práctica recomendada. La administración de las composiciones de vacuna a mamíferos distintos de los seres humanos (por ejemplo, con fines de prueba o con fines terapéuticos veterinarios) se lleva a cabo sustancialmente en las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Un sujeto, como se usa en este documento, es un mamífero, preferiblemente un ser humano, e incluye un primates, bovinos, equinos, porcinos, ovinos, felinos y roedores.

[042] Las composiciones de vacuna de acuerdo con la presente invención, también pueden contener, opcionalmente, conservantes adecuados, tales como: cloruro de benzalconio; clorobutanol, parabenos y tiomerosal, entre otros; inactivantes como los que se usan formaldehido, glutaraldehído, propiolactona y beta-propiolactona en una cantidad a nivel de trazas.

[043] Las composiciones de vacuna adecuadas para el caso de la administración parenteral comprenden convenientemente una preparación de vacuna acuosa o no acuosa estéril, que preferiblemente es ¡sotónica con la sangre del receptor. Estas vacunas se pueden formular de acuerdo con métodos conocidos usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1 ,3-butanodioL Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear se encuentran el agua, la solución de Ringer y la solución ¡sotónica de cloruro de sodio. Además, convencionalmente se emplean aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este propósito, se puede emplear cualquier aceite fijo suave incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos como el ácido oleico pueden usarse en la preparación de inyectables. Se puede encontrar una formulación de vehículo adecuada para administraciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares, orales. Para el caso de vacunas vivas recombinantes de acuerdo con la presente invención, se puede tener como adyuvantes, vehículos y/o diluyentes, agua estéril, levaduras, almidones, gelatina, albúmina, sacarosa, lactosa, glutamato sódico y glicina en cantidades farmacéuticamente aceptables.

EJEMPLO DE LA MEJOR FORMA DE LLEVAR A CABO LA INVENCÓN

Inmunización de ratones

[044] Los ratones Balb/c fueron divididos en 7 grupos de 6 ratones cada uno. Se colectó una muestra de sangre pre-inmune, mediante un corte en la vena caudal. Posteriormente, se administraron por cada grupo por vía oral, 60 mL de medio de cultivo con ampicilina, medio con Salmonella “wild type”, medio con Salmonella modificada con el inserto PL-1 , así como un tratamiento con la modificación de PL-1 1 , PL-12, PL-13 y un adicional con una combinación de todos los insertos. Todos los grupos recibieron una concentración de 10 ⁸ UFC/mL. Luego se administró 2 refuerzos adicionales cada 15 días, previa toma de muestra de sangre.

[045] Para saber y medir la respuesta inmune de los animales, así como título de anticuerpos, a los 28 días se realizó la prueba inmunológica ELISA indirecta. (Figura 5). [046] En la figura 5 se muestran resultados donde se observa la respuesta de los individuos inmunizados con el antígeno de Salmonella enterítidis que expresa RBD. Obsérvese que la respuesta incrementa con los días y sobresale la muestra antigénica cromosoma 30 a los 35 días, mientras que la respuesta del microorganismo cromosoma 23, es menor.

Ensayo de aglutinación

[047] La aglutinación en lámina o placa es una prueba serológica empleada para detectar anticuerpos contra un antígeno particulado. Es una prueba rápida y sencilla, donde se deposita sobre una lámina portabjetos el antígeno particulado, en este caso la Salmonella enterítidis modificada, en cuya superficie se expresa la molécula viral recombinante RBD. Sobre el antígeno se deposita una cantidad de suero inmune del individuo estimulado con el antígeno. Durante 2-3 minutos, la lámina es rotada y/o agitada para favorecer la unión entre el antígeno con el anticuerpo a fin de formar complejos antígeno-anticuerpo. En una muestra positiva, las moléculas de inmunoglobulina unidas con las partículas bacterianas serán visibles a simple vista pues tienen un aspecto grumoso como se muestra en la figura 3 (B). Si en la muestra no hubiese anticuerpos contra el antígeno, Salmonella enterítídís, no se observará la aglutinación tal como se observa en la misma figura 3 (A). Si hubiese dificultad o dudas en la observación, la aglutinación se comprueba con la ayuda del microscopio. En nuestro caso, los sueros de los individuos inmunizados resultaron positivos en la prueba de aglutinación en lámina, pues se observó aglutinación (Fig. 3), en donde A es una muestra control seronegativa donde se observa la ausencia de aglutinación. No hay aglutinación pues no tiene anticuerpos contra la bacteria y en B se observa la reacción positiva del suero de un individuo vacunado que contiene anticuerpos contra la Salmonella enterítídís. Por haber sido expuesto al antígeno microbiano que posee el antígeno RBD en la superficie, el anticuerpo reconocerá al antígeno y ocurrirá la reacción antígeno anticuerpo que será notoria como se nota en la reacción de aglutinación en B (figura 3).

Análisis de las heces de los individuos inmunizados con Salmonella enterítídís

[048] Como se puede apreciar en la figura 4, en las placas Petri conteniendo el medio de cultivo Agar SS estéril, se cultivaron muestras de heces obtenidas en diferentes días luego de la inmunización de los individuos (ratones). Obsérvese que la presencia de colonias de Salmonella enterítídís -positivos- (puntos oscuros) van disminuyendo a medida que transcurren los días post-inmunización. Del resultado se puede concluir que comparando el cuarto y quinto, al sexto día, el cultivo de la muestra de heces es negativo, lo cual significa que los individuos inmunizados de acuerdo con la vacuna de la presente invención excretan la totalidad de la bacteria luego del 6to día de la inmunización. Esta característica del comportamiento de la inmunización con la presente vacuna, permite de manera ventajosa que en ambientes insalubres o de muy baja salubridad, ocurra una inmunización indirecta de otros individuos.

Salmonella Respuesta inmune celular Interferon Gamma [049] Ratones hembra de 5 semanas recibieron la vacuna oral de acuerdo con la presente invención a los 0 y 15 días con 10 ⁸ UFC/ml. Luego de vacunarlos a los 15 y 30 DPV con Salmonella se les practicó la eutanasia y se les extrajo asépticamente el bazo. Los órganos fueron desagregados, la suspensión celular filtrada y colocada en un tubo de centrífuga que contenía 2 mL de Histopaque 1077 (Sigma), obteniéndose células mononucleares. Éstas fueron cultivadas en una placa ELISPOT de 96 pozos, precubiertas con el anticuerpo anti-ratón IFN-y (clon RMMG-1 , Merck) y bloqueadas con 1 % de albúmina sérica bovina (BSA, Sigma) y estimuladas con la rRBD del SARS-CoV- 2, durante 24 horas a 37°C y 5% de CO2. Como control positivo fue utilizada Concanavalina A (Sigma). Las células fueron eliminadas por lavado y los pozos incubados con el anti-ratón biotinilado IFN-y (policlonal, Abeam; o clon R4-6A2, Biolegend) durante 2 horas a temperatura ambiente. Previo lavado, los pozos fueron incubados con fosfatasa alcalina ligada a estreptavidina (SAV-ALP, Sigma) durante una hora a temperatura ambiente. Seguido de un lavado exhaustivo, fue utilizado el sustrato cromogénico, azul de nitro tetrazolio NBT / BCIP (Abeam). (Fig. 6)

[050] La presente invención no está limitada al ámbito de los microorganismos depositados en la patente dado que estos representan una ilustración puntual de un aspecto de la invención. Cualquier microorganismo o plásmido que sea funcionalmente equivalente a los descritos en la invención se incluyen dentro de la invención.