Rekombinante Herstellung eines Kollagenpeptidpräparates und dessen Verwendung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung rekombinante Kollagenpeptide aufweisender Kollagenpeptidpräparate, die mittels dieser Verfahren hergestellten Kollagenpeptidpräparate, die Kollagenpeptidpräparate enthaltende Produkte und Verwendungen der vorgenannten Präparate und Produkte.

Kollagen ist ein extrazelluläres Strukturprotein, das in Tieren vorkommt, zum Beispiel in Säugetieren, Vögeln und Fischen. Es findet sich dort in der Regel im Bindegewebe, insbesondere als Bestandteil der extrazellulären Matrix. Besonders reich an Kollagen sind Sehnen, Bänder, Knorpel und Knochen. In Pflanzen und einzelligen Organismen sind Kollagene hingegen nicht anzutreffen.

Kollagene treten in verschiedenen, strukturell und funktionell unterschiedlichen Typen auf und unterscheiden sich unter anderem in Hinblick auf ihre Struktur, Funktion und Herkunft. Die das Kollagen aufbauenden Polypeptidketten werden in der Zelle einzeln an den Ribosomen des endoplasmatischen Retikulums in Form größerer Vorläufermoleküle synthetisiert und weisen umfangreiche repetitive (Gly-X-Y) _n -Sequenzen auf, wobei X und Y jede Aminosäure sein können, meist allerdings Prolin und 4-Hydroxyprolin sind.

Diese Vorläufer-Polypeptidketten werden im endoplasmatischen Retikulum unter Bildung von Hydroxyprolin- und Hydroxylysinresten posttranslational an Prolin- und Fysinresten der Polypeptidkette hydroxyliert. Die Hydroxylierung dient der Stabilisierung benachbarter Kollagen-Polypeptidketten der sich in der Zelle bildenden rechtsgängigen Tripel-Helix aus jeweils drei der Vorläufer-Polypeptidketten (Prokollagen).

Das so gebildete Prokollagen wird intrazellulär glykosyliert, in der glykosylierten tripelhelikalen Form (Tropokollagen) von der Zelle sezemiert und anschließend durch Peptidase-vermittelte Abspaltung der terminalen Reste Kollagen gebildet. Dieses lagert sich im Rahmen eines Fibrillogenese-Prozesses zu Kollagenfibrillen zusammen, die anschließend kovalent quervemetzt werden und Kollagenfasern bilden. Kollagen wird häufig auch in denaturierter und dann als Gelatine bezeichneter Form oder in Form von Hydrolysaten genutzt.

Unterzieht man Gelatine und Kollagen hydrolytischen Prozessen, insbesondere einer enzymatischen Hydrolyse, können je nach eingesetztem Kollagentyp und Herkunft sowie enzymatischen Bedingungen Kollagenhydrolysate mit unterschiedlichster Zusammensetzung und Anwendungsprofil hergestellt werden. Diese Kollagenhydrolysate stellen ein Gemisch von Peptiden dar, deren Molekulargewichte über bestimmte Größenbereiche verteilt sind. Die Verwendung solcher Kollagenhydrolysate zum Beispiel als Nahrungsergänzungsmittel oder als kosmetisches Hilfsmittel ist seit längerem bekannt, unter anderem zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Beschwerden, die im Zusammenhang mit den Knochen, den Gelenken oder dem Bindegewebe stehen.

So beschreibt die WO 2012/065782 aus Schweinschwartengelatine gewonnene Kollagenhydrolysate, die zur Stimulation der Biosynthese extrazellulärer Matrixproteine durch Hautzellen dienen und insbesondere für kosmetische Zwecke geeignet sind.

Die WO 2012/117012 offenbart enzymatisch hydrolysiertes Kollagen aus Rinderspalt mit einem mittleren Molekulargewicht von 1500 bis 8000 Da, das gemeinsam mit einem Präbiotikum zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Osteoporose eingesetzt werden kann.

Obgleich für viele Anwendungen und Konsumentengruppen die Verwendung von aus tierischen Materialien gewonnen Kollagenhydroly säten Vorteile mit sich bringt, kann mit Blick auf bestimmte Konsumentengruppen und Anwendungsprofile die Verwendung solchermaßen gewonnener Kollagenhydrolysate auch weniger wünschenswert sein. So stehen bestimmte Konsumentengruppen aus tierischen Materialien gewonnenen Rohstoffen grundsätzlich kritisch oder ablehnend gegenüber, sei es, dass Kontaminationen mit gesundheitsgefährdenden Mikroorganismen oder Agenden, zum Beispiel Verfahrenshilfs stoffen, oder unerwünschte Immunreaktionen befürchtet werden oder aus religiösen oder ethischen Motiven. Darüber hinaus umfassen die für die Gewinnung von aus tierischen Materialien gewonnenen Kollagenhydrolysaten eingesetzten Herstellverfahren häufig aufwändige und teure Aufschluss-, Reinigungs- und Weiterverarbeitungsschritte. Schließlich kann es für bestimmte Anwendungen sinnvoll sein, ein hinsichtlich seiner Herkunft und Zusammensetzung standardisiertes, exakt und verlässlich definiertes Kollagenhydrolysat bereitzustellen, das vorteilhafterweise kostengünstig auch in industriellem Maßstab hergestellt werden kann. Vor diesem Hintergrund ist es nicht verwunderlich, dass Verfahren entwickelt wurden, Gelatine und Kollagen sowie Hydrolysate davon unter Einsatz rekombinanter Gentechnologie herzustellen.

So offenbart die WO 2006/052451 A2 die Herstellung von rekombinantem Kollagen Typ III in Pichia pastoris- Stämmen, die auch humane Prolylhydroxylasen exprimieren.

Die WO 2005/012356 A2 offenbart die Herstellung von Gelatine aus humanem Kollagen Typ I sowie einzelner 50 kDa, 65 kDa und 100 kDa großer Kollagenpeptidspezies, jeweils in vollständig hydroxylierter, partiell und nicht-hydroxylierter Form.

Die WO 01/34646 A2 offenbart ebenfalls die Herstellung einzelner rekombinanter Gelatinespezies mit sich jeweils aus dem rekombinanten Herstellweg ergebendem definiertem Molekulargewicht, die in nicht-hydroxylierter, partiell oder vollständig hydroxylierter Form vorliegen können.

Die Herstellung von rekombinantem Kollagen oder Hydrolysaten davon, welche sich durch strukturelle und funktionelle Eigenschaften auszeichnen, die denen aus natürlichen Quellen gewonnenen Kollagens oder Kollagenhydroly säten davon gleichen oder zumindest ähneln, stellt sich jedoch als problematisch dar. Dies unter anderem deshalb, weil die natürliche Bildung von Kollagen ein vergleichsweise komplexer physiologischer, durch eine Reihe von intra- und extrazellulären Einflussfaktoren geprägter Vorgang ist, der auch posttranslationale Syntheseschritte, wie Glykosylierungen und Hydroxylierungen, umfasst. Diese posttranslationalen Syntheseschritte, insbesondere die konkrete Positionierung und das Ausmaß der Hydroxylierungen von Prolin und Lysin, gewährleisten die Bereitstellung stabilen Tropokollagens, welches sich letztendlich zu Fibrillen und Fasern assoziiert. So ist aus Wang et al. (Engineering Biology, 2017 (1), 18 - 23) bekannt, dass die gegenwärtige rekombinante Herstellung von Kollagen durch geringe Ausbeuten, hohe Kosten und insbesondere durch fehlende oder abweichende posttranslationale Syntheseschritte wie sie bei der Bildung von nativem Kollagen auftreten, gekennzeichnet ist. Bekannt ist es auch, dass genau diese posttranslationalen Modifikationen wesentlich für sowohl die natürliche Struktur und Funktion von Kollagen als auch für Kollagen oder Kollagenhydroly säte nutzende Anwendungen sind.

Dementsprechend sind bis dato keine rekombinant hergestellten Kollagene oder Kollagenhydrolysate bekannt, die eine Struktur, insbesondere Qualität und Quantität posttranslationaler Modifikationen, insbesondere der Hydroxylierungs- und Glykosylierungsgrade sowie der Hydroxylierungs- und Glykosylierungspositionen, aufweisen, die identisch zu natürlichem Kollagen oder daraus gewonnenen Kollagenhydroly säten ist.

Die Bereitstellung von rekombinant hergestelltem Kollagen und Kollagenhydrolysaten mit einem gezielt aus konventionell hergestelltem Kollagen oder Kollagenhydrolysaten abgeleiteten Eigenschaftspotential ist unter anderem aufgrund der vorstehend geschilderten Umstände, insbesondere der Unterschiedlichkeit der Ausgangsmaterialen und Herstellverfahren, nicht ohne weiteres möglich. Insbesondere in prokaryotischen Organismen, die sich per se für eine industrielle Herstellung von rekombinanten Proteinen eignen, stellt sich die Herstellung von rekombinantem Kollagen unter anderem insofern als problematisch dar, als dass in der Regel auch die posttranslationalen Syntheseschritte durch rekombinante Technologien in die Zelle eingeführt werden müssen und sich dadurch eine zusätzliche metabolische Last ergibt, die die Expression und Gewinnung der gewünschten Kollagenpeptide erschweren oder unmöglich macht. Darüber hinaus kann die Expression von Fremdproteinen für die Wirtszelle toxisch sein, die Gewinnung von rekombinant hergestellten Proteinen in oder aus Wirtszellen kann sich als technisch oder wirtschaftlich nicht realisierbar darstellen, die Stabilität des gewonnenen Expressionsproduktes kann zu gering sein oder es können andere Effekte wie Wachstums- und Vermehrungs Störungen der Wirtszelle auftreten.

Es besteht daher nach wie vor ein großer Bedarf an der Bereitstellung von rekombinant hergestellten Kollagenhydrolysaten für Anwendungen in verschiedensten Bereichen, insbesondere auch für therapeutische Zwecke, insbesondere zur Prophylaxe oder Behandlung von Zuständen oder Krankheiten, die Muskeln, Gelenke, Knochen und Haut von Mensch und Tier betreffen.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher das technische Problem zugrunde, Verfahren zur Herstellung von Kollagenpeptidpräparaten sowie die so erhaltenen rekombinanten Kollagenpeptidpräparate bereitzustellen, die die vorgenannten Nachteile überwinden, insbesondere die sich in standardisierter, verlässlicher und genau definierter Form rekombinant, auch im größerem industriellen und kostengünstigen Maßstab, herstellen lassen und die zu entsprechenden aus tierischen Materialien gewonnenen Kollagenhydrolysaten vergleichbare, insbesondere verbesserte Eigenschaften, insbesondere Wirksamkeit aufweisen, insbesondere biologische Wirksamkeit entfalten in Bezug auf den Erhalt der Gesundheit von Muskeln, Gelenken, Knochen und Haut sowie auf die Prophylaxe oder Behandlung von Krankheiten, die Muskeln, Gelenke, Knochen und Haut von Mensch und Tier betreffen.

Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem durch die Bereitstellung der Lehren der unabhängigen Ansprüche, insbesondere auch der Lehren der bevorzugten Ausführungsformen in der Beschreibung und der anhängigen Patentansprüche.

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinante Kollagenpeptide aufweisenden Kollagenpeptidpräparats, umfassend die V erfahrens schritte a) Bereitstellen eines Expressions Systems, das mindestens eine Expressionskassette aufweist, wobei die Expressionskassette mindestens eine Nukleotidsequenz aufweist, die ein Kollagenpeptid mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 8 bis 100 kDa codiert, b) Inkubieren des Expressions Systems unter Bedingungen, die die Expression des Kollagenpeptids ermöglichen, c) Gewinnen des Kollagenpeptids, d) Hydrolysieren des Kollagenpeptids unter Bedingungen, die zur Herstellung eines Kollagenpeptidpräparats führen, das Kollagenpeptide eines mittleren Molekulargewichts von 1 bis 7 kDa und mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 0,1 bis 13,5 kDa aufweist und e) Gewinnen des Kollagenpeptidpräparates.

Das erfindungsgemäß bereitgestellte Verfahren zur Herstellung von Kollagenpeptidpräparaten zeichnet sich insbesondere dadurch aus, dass aus mindestens einem, vorzugsweise genau definierten, rekombinant hergestellten Kollagenpeptid einer spezifische Größe von 8 bis 100 kDa durch Hydrolyse ein rekombinant hergestelltes Kollagenpeptidpräparat bereitgestellt wird, das eine Molekulargewichtsverteilung und Struktur aufweist, die sich vorteilhafterweise aus der für die Hydrolyse eingesetzten rekombinanten spezifischen Kollagenpeptidspezies und den anschließenden Verfahrens schritten, insbesondere Hydrolyseschritt, insbesondere

Hydroxylierungsprofil, ergeben und welches sich trotz seiner rekombinanten Herstellung unmittelbar und ohne weitere Aufbereitungs schritte durch eine vorteilhafte biologische Aktivität auszeichnet.

Die erfindungsgemäß bereitgestellten Kollagenpeptidpräparate weisen aufgrund ihrer rekombinanten Herstellweise deutliche Unterschiede in ihrer Struktur, insbesondere in Bezug auf die durch posttranslationale Syntheseschritte eingeführten Modifikationen, wie Hydroxylierungen und Glykosylierungen, zu aus natürlichen Quellen gewonnenen Kollagenhydrolysaten auf. Überraschenderweise lassen sie sich in den verschiedensten Expressionssystemen auch im industriellen Maßstab ohne unerwünschte Kontaminationen bereitstellen, wobei sie gleichzeitig vorteilhafte biologische Wirksamkeit, insbesondere in Hinblick auf Anwendungen zum Erhalt und zur Verbesserung der Gesundheit von Knochen, Knorpel, Haut, Haare und Nägeln aufweisen.

Die erfindungs gemäß gefundene biologische Wirksamkeit der vorliegend bereitgestellten rekombinanten Kollagenpeptidpräparate kommt bereits den unmittelbar aus der Hydrolyse gewonnenen Präparaten zu, ohne dass es weiterer Verarbeitungs schritte bedarf.

Die erfindungsgemäß gefundene und den rekombinant hergestellten Kollagenpeptidpräparaten der vorliegenden Erfindung zukommende biologische Wirksamkeit lässt sich insbesondere anhand von in vitro-Tests zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten feststellen, bevorzugt anhand von in vitro-Tests zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen oder diese Proteine codierende mRNA in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, insbesondere anhand der in den Beispielen 3 bis 7, insbesondere Beispielen 3 bis 5, dargestellten in vitro-Tests zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten.

In bevorzugter Ausführungsform weisen die erfindungsgemäß hergestellten rekombinante Kollagenpeptide aufweisenden Kollagenpeptidpräparate der vorliegenden Erfindung in mindestens einem in vitro-Test zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, insbesondere in mindestens einem, bevorzugt mindestens zwei, bevorzugt in allen, der in den Beispielen 3 bis 7, insbesondere Beispielen 3 bis 5, dargestellten in vitro-Tests zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, eine biologische Wirksamkeit auf. Bevorzugt weisen die erfindungs gemäß hergestellten rekombinante Kollagenpeptide aufweisenden Kollagenpeptidpräparate der vorliegenden Erfindung in mindestens einem in vitro- Test zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, insbesondere in mindestens einem, bevorzugt in mindestens zwei, bevorzugt in allen, der in den Beispielen 3 bis 7, insbesondere Beispielen 3 bis 5, dargestellten in vitro-Tests zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, die gleiche biologische Wirksamkeit auf wie aus natürlichen Quellen isolierte Kollagenpeptidpräparate, insbesondere nicht rekombinant hergestellte Kollagenpeptidpräparate.

Besonders bevorzugt weisen die erfindungsgemäß hergestellten rekombinante Kollagenpeptide aufweisenden Kollagenpeptidpräparate der vorliegenden Erfindung in mindestens einem in vitro- Test zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, insbesondere in mindestens einem, bevorzugt in mindestens zwei, bevorzugt in allen, der in den Beispielen 3 bis 7, insbesondere Beispielen 3 bis 5, dargestellten in vitro-Tests zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, eine bessere biologische Wirksamkeit auf als aus natürlichen Quellen isolierte Kollagenpeptidpräparate, insbesondere nicht rekombinant hergestellte Kollagenpeptidpräparate.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressions System ein zellbasiertes oder zellfreies Expressions System.

Bevorzugt ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem, insbesondere das zellbasierte Expressionssystem, eine Wirtszelle, insbesondere eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle.

Bevorzugt ist das Expressions System, insbesondere das zellbasierte Expressions System, eine Wirtszelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bakterienzelle, Hefezelle, Pilzzelle, Säugetierzelle, Insektenzelle und Pflanzenzelle.

Bevorzugt ist das Expressions System, insbesondere das zellbasierte Expressions System, eine Bakterienzelle, insbesondere der Arten Escherichia coli oder Bacillus subtilis. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Expressions System, insbesondere das zellbasierte Expressionssystem, eine Hefezelle, insbesondere der Arten Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris oder Ogataea angusta (Hansenula polymorpha).

Bevorzugt ist das Expressions System, insbesondere das zellbasierte Expressions System, eine Pilzzelle, insbesondere der Art Aspergillus niger.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Expressionssystem, insbesondere das zellbasierte Expressionssystem, eine Säugetierzelle, insbesondere eine CHO-Zelle, eine HeLa-Zelle oder eine HEK293-Zelle.

Bevorzugt ist das Expressions System, insbesondere das zellbasierte Expressions System, eine Insektenzelle, insbesondere eine Sf-9, Sf-2l oder Tn-5 Zelle.

Bevorzugt ist das Expressions System, insbesondere das zellbasierte Expressions System, eine Pflanzenzelle, insbesondere eine Mais- oder Tabakzelle.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem ein Expressionssystem, insbesondere ein zellbasiertes Expressionssystem, das zur Hydroxylierung von Prolin-, Lysin- oder Prolin- und Lysinresten des exprimierten Kollagenpeptids befähigt ist. Bevorzugt ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem eine Wirtszelle, die zur Hydroxylierung von Prolin-, Lysin- oder Prolin- und Lysinresten des exprimierten Kollagenpeptids befähigt ist.

Bevorzugt ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem ein Expressions System, insbesondere ein zellbasiertes Expressions System, das Prolylhydroxylase- und/oder Lysylhydroxylase-Aktivität aufweist. Bevorzugt ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem eine Wirtszelle, die Prolylhydroxylase- und/oder Lysylhydroxylase-Aktivität aufweist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem ein zellbasiertes Expressionssystem, das mindestens eine Expressionskassette aufweist, die eine Prolyl-4-hydroxylase-codierende Polynukleotidsequenz umfasst. Besonders bevorzugt ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressions System ein zellbasiertes Expressionssystem, das mindestens eine Expressionskassette aufweist, die eine Prolyl-4-hydroxylase-codierende Polynukleotidsequenz umfasst, so dass in Verfahrens schritt e) ein in vivo hydroxyliertes Kollagenpeptidpräparat gewonnen wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem ein zellbasiertes Expressionssystem, das mindestens eine Expressionskassette aufweist, die eine Lysylhydroxylase-codierende Polynukleotidsequenz umfasst. Besonders bevorzugt ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressions System ein zellbasiertes Expressionssystem, das mindestens eine Expressionskassette aufweist, die eine Lysylhydroxylase-codierende Polynukleotidsequenz umfasst, so dass in Verfahrens schritt e) ein in vivo hydroxyliertes Kollagenpeptidpräparat gewonnen wird.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem ein zellbasiertes Expressionssystem, das mindestens eine Expressionskassette aufweist, die eine Prolyl-4-hydroxylase-codierende Polynukleotidsequenz umfasst und mindestens eine Expressionskassette, die eine Lysylhydroxylase-codierende Polynukleotidsequenz umfasst. Besonders bevorzugt ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem ein zellbasiertes Expressions System, das mindestens eine Expressionskassette aufweist, die eine Prolyl-4-hydroxylase-codierende Polynukleotidsequenz umfasst und mindestens eine Expressionskassette, die eine Lysylhydroxylase-codierende Polynukleotidsequenz umfasst, so dass in Verfahrens schritt e) ein in vivo hydroxyliertes Kollagenpeptidpräparat gewonnen wird.

Demnach umfasst die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinante Kollagenpeptide aufweisenden Kollagenpeptidpräparats, insbesondere eines in vivo hydroxylierten Kollagenpeptidpräparats, umfassend die Verfahrensschritte a) Bereitstellen eines zellbasierten Expressions Systems, das mindestens eine Expressionskassette aufweist, wobei die Expressionskassette mindestens eine Nukleotidsequenz aufweist, die ein Kollagenpeptid mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 8 bis 100 kDa codiert und wobei das zellbasierte Expressions System zur Hydroxylierung von Prolin-, Lysin- oder Prolin- und Lysinresten des exprimierten Kollagenpeptids befähigt ist, b) Inkubieren des Expressionssystems, insbesondere Kultivieren des zellbasierten

Expressionssystems, unter Bedingungen, die die Expression und Hydroxylierung des Kollagenpeptids ermöglichen, c) Gewinnen des Kollagenpeptids, insbesondere des in vivo hydroxylierten Kollagenpeptids, d) Hydrolysieren des Kollagenpeptids, insbesondere des in vivo hydroxylierten

Kollagenpeptids, unter Bedingungen, die zur Herstellung eines Kollagenpeptidpräparats führen, das Kollagenpeptide, insbesondere in vitro hydroxylierte Kollagenpeptide, eines mittleren Molekulargewichts von 1 bis 7 kDa und mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 0,1 bis 13,5 kDa aufweist und e) Gewinnen des Kollagenpeptidpräparates, insbesondere des in vivo hydroxylierten

Kollagenpeptidpräparates, im Folgenden auch Kollagenpeptidpräparat A genannt.

Mit Hilfe des vorgenannten Verfahrens ist es somit vorteilhafterweise möglich, ein

Kollagenpräparat mit in vivo hydroxylierten rekombinant hergestellten Kollagenpeptiden mit einem spezifischen Molekulargewicht und einem spezifischen mittleren Molekulargewicht zu erhalten, die sich je nach verwendetem zellbasierten Expressions System durch ein spezifisches Muster an posttranslationalen Modifikationen, insbesondere Hydroxylierungen und Glykosylierungen auszeichnen. Auf diese Weise ist es vorteilhafterweise insbesondere möglich, direkt, das heißt ohne die Notwendigkeit einer nachträglichen Modifizierung der Kollagenpeptide des Kollagenpeptidpräparats, ein Kollagenpeptidpräparat mit biologischer Wirksamkeit zu erhalten.

In bevorzugter Ausführungsform weist das erfindungs gemäß hergestellte rekombinante Kollagenpeptide aufweisende in vivo hydroxylierte Kollagenpeptidpräparat, das heißt Kollagenpeptidpräparat A, in mindestens einem in vitro-Test zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, insbesondere in mindestens einem, bevorzugt in mindestens zwei, bevorzugt in allen, der in den Beispielen 3 bis 7, insbesondere Beispielen 3 bis 5, dargestellten in vitro-Tests zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, eine biologische Wirksamkeit auf. Bevorzugt weist das erfindungs gemäß hergestellte rekombinante Kollagenpeptide aufweisende in vivo hydroxylierte Kollagenpeptidpräparat, das heißt Kollagenpeptidpräparat A, in mindestens einem in vitro-Test zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, insbesondere in mindestens einem, bevorzugt in mindestens zwei, bevorzugt in allen, der in den Beispielen 3 bis 7, insbesondere Beispielen 3 bis 5, dargestellten in vitro-Tests zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, die gleiche biologische Wirksamkeit auf wie aus natürlichen Quellen isolierte Kollagenpeptidpräparate, insbesondere nicht rekombinant hergestellte Kollagenpeptidpräparate.

Besonders bevorzugt weist das erfindungs gemäß hergestellte rekombinante Kollagenpeptide aufweisende in vivo hydroxylierte Kollagenpeptidpräparat, das heißt Kollagenpeptidpräparat A, in mindestens einem in vitro-Test zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, insbesondere in mindestens einem, bevorzugt in mindestens zwei, bevorzugt in allen, der in den Beispielen 3 bis 7, insbesondere Beispielen 3 bis 5, dargestellten in vitro-Tests zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, eine bessere biologische Wirksamkeit auf als aus natürlichen Quellen isolierte Kollagenpeptidpräparate, insbesondere nicht rekombinant hergestellte Kollagenpeptidpräparate.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem ein Expressionssystem, das nicht dazu befähig ist, eine Hydroxylierung von Prolin-, Lysin- oder Prolin- und Lysinresten des exprimierten Kollagenpeptids zu bewirken, insbesondere weist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem keine Prolylhydroxylase- und Lysylhydroxylase- Aktivität auf.

Somit umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinante Kollagenpeptide aufweisenden Kollagenpeptidpräparats, insbesondere eines nicht-hydroxylierten Kollagenpeptidpräparats, umfassend die Verfahrens schritte a) Bereitstellen eines Expressions Systems, das mindestens eine Expressionskassette aufweist, wobei die Expressionskassette mindestens eine Nukleotidsequenz aufweist, die ein Kollagenpeptid mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 8 bis 100 kDa codiert und wobei das Expressionssystem nicht zur Hydroxylierung von Prolin-, Lysin- oder Prolin- und Lysinresten des exprimierten Kollagenpeptids befähigt ist, b) Inkubieren des Expressions Systems unter Bedingungen, die die Expression des

Kollagenpeptids ermöglichen, c) Gewinnen des Kollagenpeptids, insbesondere des nicht-hydroxylierten Kollagenpeptids, d) Hydrolysieren des Kollagenpeptids, insbesondere des nicht-hydroxylierten

Kollagenpeptids, unter Bedingungen, die zur Herstellung eines Kollagenpeptidpräparats führen, das Kollagenpeptide eines mittleren Molekulargewichts von 1 bis 7 kDa und mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 0,1 bis 13,5 kDa aufweist und e) Gewinnen des Kollagenpeptidpräparates, insbesondere des nicht-hydroxylierten

Kollagenpeptids, im Folgenden auch Kollagenpeptidpräparat B genannt.

In bevorzugter Ausführungsform weist das erfindungs gemäß hergestellte rekombinante Kollagenpeptide aufweisende nicht-hydroxylierte Kollagenpeptidpräparat, das heißt Kollagenpeptidpräparat B, in mindestens einem in vitro-Test zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, insbesondere in mindestens einem, bevorzugt in mindestens zwei, bevorzugt in allen, der in den Beispielen 3 bis 7, insbesondere Beispielen 3 bis 5, dargestellten in vitro-Tests zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, eine biologische Wirksamkeit auf.

Bevorzugt weist das erfindungs gemäß hergestellte rekombinante Kollagenpeptide aufweisende nicht-hydroxylierte Kollagenpeptidpräparat, das heißt Kollagenpeptidpräparat B, in mindestens einem in vitro-Test zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, insbesondere in mindestens einem, bevorzugt in mindestens zwei, bevorzugt in allen, der in den Beispielen 3 bis 7, insbesondere Beispielen 3 bis 5, dargestellten in vitro-Tests zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, die gleiche biologische Wirksamkeit auf wie aus natürlichen Quellen isolierte Kollagenpeptidpräparate, insbesondere nicht rekombinant hergestellte Kollagenpeptidpräparate.

Besonders bevorzugt weist das erfindungs gemäß hergestellte rekombinante Kollagenpeptide aufweisende nicht-hydroxylierte Kollagenpeptidpräparat, das heißt Kollagenpeptidpräparat B, in mindestens einem in vitro-Test zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, insbesondere in mindestens einem, bevorzugt in mindestens zwei, bevorzugt in allen, der in den Beispielen 3 bis 7, insbesondere Beispielen 3 bis 5, dargestellten in vitro-Tests zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, eine bessere biologische Wirksamkeit auf als aus natürlichen Quellen isolierte Kollagenpeptidpräparate, insbesondere nicht rekombinant hergestellte Kollagenpeptidpräparate.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das in Verfahrens schritt c) gewonnene Kollagenpeptid vor Durchführung von Verfahrens schritt d) in einem Verfahrens schritt xl) hydroxyliert und in Verfahrensschritt e) ein prälysal, das heißt vor der Hydrolyse, ex vivo hydroxyliertes Kollagenpeptidpräparat gewonnen.

Demgemäß umfasst die vorliegende Erfindung ferner ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinante Kollagenpeptide aufweisenden Kollagenpeptidpräparats, insbesondere eines prälysal ex vivo hydroxylierten Kollagenpeptidpräparats, umfassend die Verfahrens schritte a) Bereitstellen eines Expressions Systems, das mindestens eine Expressionskassette aufweist, wobei die Expressionskassette mindestens eine Nukleotidsequenz aufweist, die ein Kollagenpeptid mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 8 bis 100 kDa codiert und wobei das Expressionssystem nicht zur Hydroxylierung von Prolin-, Lysin- oder Prolin- und Lysinresten des exprimierten Kollagenpeptids befähigt ist, b) Inkubieren des Expressions Systems unter Bedingungen, die die Expression des Kollagenpeptids ermöglichen, c) Gewinnen des Kollagenpeptids, xl) ex vivo Hydroxylieren des in Schritt c) gewonnenen Kollagenpeptids, d) Hydrolysieren des Kollagenpeptids, insbesondere des ex vivo hydroxylierten Kollagenpeptids, unter Bedingungen, die zur Herstellung eines Kollagenpeptidpräparats führen, das Kollagenpeptide, insbesondere ex vivo hydroxylierte Kollagenpeptide, eines mittleren Molekulargewichts von 1 bis 7 kDa und mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 0,1 bis 13,5 kDa aufweist und e) Gewinnen des Kollagenpeptidpräparates, insbesondere des prälysal ex vivo hydroxylierten Kollagenpeptidpräparates, im Folgenden auch Kollagenpeptidpräparat C genannt.

In bevorzugter Ausführungsform weist das erfindungs gemäß hergestellte rekombinante Kollagenpeptide aufweisende prälysal ex vivo hydroxylierte Kollagenpeptidpräparat, das heißt Kollagenpeptidpräparat C, in mindestens einem in vitro-Test zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, insbesondere in mindestens einem, bevorzugt in mindestens zwei, bevorzugt in allen, der in den Beispielen 3 bis 7, insbesondere Beispielen 3 bis 5, dargestellten in vitro-Tests zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, eine biologische Wirksamkeit auf.

Bevorzugt weist das erfindungs gemäß hergestellte rekombinante Kollagenpeptide aufweisende prälysal ex vivo hydroxylierte Kollagenpeptidpräparat, das heißt Kollagenpeptidpräparat C, in mindestens einem in vitro-Test zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, insbesondere in mindestens einem, bevorzugt in mindestens zwei, bevorzugt in allen, der in den Beispielen 3 bis 7, insbesondere Beispielen 3 bis 5, dargestellten in vitro-Tests zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, die gleiche biologische Wirksamkeit auf wie aus natürlichen Quellen isolierte Kollagenpeptidpräparate, insbesondere nicht rekombinant hergestellte Kollagenpeptidpräparate.

Besonders bevorzugt weist das erfindungs gemäß hergestellte rekombinante Kollagenpeptide aufweisende prälysal ex vivo hydroxylierte Kollagenpeptidpräparat, das heißt Kollagenpeptidpräparat C, in mindestens einem in vitro-Test zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, insbesondere in mindestens einem, bevorzugt in mindestens zwei, bevorzugt in allen, der in den Beispielen 3 bis 7, insbesondere Beispielen 3 bis 5, dargestellten in vitro-Tests zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, eine bessere biologische Wirksamkeit auf als aus natürlichen Quellen isolierte Kollagenpeptidpräparate, insbesondere nicht rekombinant hergestellte Kollagenpeptidpräparate.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das in Verfahrens schritt c) gewonnene Kollagenpeptid nach Durchführung von Verfahrens schritt d) in einem Verfahrens schritt x2) hydroxyliert und in Verfahrens schritt e) ein postlysal, das heißt nach Hydrolyse, ex vivo hydroxyliertes Kollagenpeptidpräparat gewonnen.

Demgemäß umfasst die vorliegende Erfindung ferner ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinante Kollagenpeptide aufweisenden Kollagenpeptidpräparats, insbesondere eines postlysal ex vivo hydroxylierten Kollagenpeptidpräparats, umfassend die Verfahrensschritte a) Bereitstellen eines Expressions Systems, das mindestens eine Expressionskassette aufweist, wobei die Expressionskassette mindestens eine Nukleotidsequenz aufweist, die ein Kollagenpeptid mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 8 bis 100 kDa codiert und wobei das Expressionssystem nicht zur Hydroxylierung von Prolin-, Lysin- oder Prolin- und Lysinresten des exprimierten Kollagenpeptids befähigt ist, b) Inkubieren des Expressions Systems unter Bedingungen, die die Expression des

Kollagenpeptids ermöglichen, c) Gewinnen des Kollagenpeptids, d) Hydrolysieren des Kollagenpeptids unter Bedingungen, die zur Herstellung eines

Kollagenpeptidpräparats führen, das Kollagenpeptide eines mittleren Molekulargewichts von 1 bis 7 kDa und mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 0,1 bis 13,5 kDa aufweist und x2) ex vivo Hydroxylieren der in Schritt d) erhaltenen Kollagenpeptide des

Kollagenpeptidpräparats, e) Gewinnen des Kollagenpeptidpräparates, insbesondere des postlysal ex vivo hydroxylierten Kollagenpeptidpräparates, im Folgenden auch Kollagenpeptidpräparat D genannt.

In bevorzugter Ausführungsform weist das erfindungsgemäß hergestellte rekombinante Kollagenpeptide aufweisende postlysal ex vivo hydroxylierte Kollagenpeptidpräparat, das heißt Kollagenpeptidpräparat D, in mindestens einem in vitro-Test zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, insbesondere in mindestens einem, bevorzugt in mindestens zwei, bevorzugt in allen, der in den Beispielen 3 bis 7, insbesondere Beispielen 3 bis 5, dargestellten in vitro-Tests zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, eine biologische Wirksamkeit auf.

Bevorzugt weist das erfindungs gemäß hergestellte rekombinante Kollagenpeptide aufweisende postlysal ex vivo hydroxylierte Kollagenpeptidpräparat, das heißt Kollagenpeptidpräparat D, in mindestens einem in vitro-Test zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, insbesondere in mindestens einem, bevorzugt in mindestens zwei, bevorzugt in allen, der in den Beispielen 3 bis 7, insbesondere Beispielen 3 bis 5, dargestellten in vitro-Tests zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, die gleiche biologische Wirksamkeit auf wie aus natürlichen Quellen isolierte Kollagenpeptidpräparate, insbesondere nicht rekombinant hergestellte Kollagenpeptidpräparate.

Besonders bevorzugt weist das erfindungs gemäß hergestellte rekombinante Kollagenpeptide aufweisende postlysal ex vivo hydroxylierte Kollagenpeptidpräparat, das heißt Kollagenpeptidpräparat D, in mindestens einem in vitro-Test zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, insbesondere in mindestens einem, bevorzugt in mindestens zwei, bevorzugt in allen, der in den Beispielen 3 bis 7, insbesondere Beispielen 3 bis 5, dargestellten in vitro-Tests zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, eine bessere biologische Wirksamkeit auf als aus natürlichen Quellen isolierte Kollagenpeptidpräparate, insbesondere nicht rekombinant hergestellte Kollagenpeptidpräparate.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die mindestens eine Nukleotidsequenz der mindestens einen Expressionskassette codon-optimiert, das heißt, dass diejenigen Codons in der Nukleotidsequenz, die vom Translations System des bereitgestellten Expressionssystems, insbesondere des bereitgestellten zellbasierten Expressions Systems, insbesondere der bereitgestellten Wirtszelle, nicht oder nicht bevorzugt genutzt werden, durch solche ersetzt werden, die vom Translations System des bereitgestellten Expressionssystems, insbesondere des bereitgestellten zellbasierten Expressionssystems, insbesondere der bereitgestellten Wirtszelle, bevorzugt verwendet werden ohne dadurch die Aminosäuresequenz des codierten Peptids oder Proteins zu verändern.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das durch die Nukleotidsequenz codierte Kollagenpeptid ein Kollagenpeptid eines Wirbeltiers, insbesondere eines Säugetiers, zum Beispiel des Menschen oder eines nicht-menschlichen Säugetiers, zum Beispiel Pferd, Esel, Känguru, Schaf, Nagetier, Schwein oder Rind, eines Vogels, zum Beispiel Huhn, eines Fisches, einer Amphibie, eines Reptils oder eines wirbellosen Tieres, zum Beispiel Qualle.

Bevorzugt weist das durch die Nukleotidsequenz codierte Kollagenpeptid eine in Kollagen der Typen I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX, XX, XXI, XXII, XXIII, XXIV, XXV, XXVI, XXVII, bevorzugt Typ I, II oder III, bevorzugt Typ I, bevorzugt Typ II, bevorzugt Typ III, vorkommende Aminosäuresequenz auf.

Bevorzugt ist das durch die Nukleotidsequenz codierte Kollagenpeptid vom Typ I, II oder III, bevorzugt vom Typ I oder II, besonders bevorzugt vom Typ I.

Bevorzugt weist das durch die Nukleotidsequenz codierte Kollagenpeptid eine in Kollagen aus Wirbeltieren, insbesondere Fischen, Amphibien, Reptilien, Vögeln und Säugetieren, insbesondere in humanem, bovinem, porcinem, equinem oder avianem Kollagen der Typen I, II oder III, bevorzugt Typ I, bevorzugt Typ II, bevorzugt Typ III, vorkommende Aminosäuresequenz auf.

Besonders bevorzugt weist das durch die Nukleotidsequenz codierte Kollagenpeptid eine in humanem Kollagen, insbesondere in humanen Typ I Kollagen, bevorzugt in der al-Kette des humanen Typ I Kollagen, vorkommende Aminosäuresequenz auf.

Besonders bevorzugt weist das durch die Nukleotidsequenz codierte Kollagenpeptid eine in nicht-humanem Kollagen, insbesondere in nicht-humanem Typ I Kollagen, bevorzugt in der al- Kette des nicht-humanen Typ I Kollagens vorkommende Aminosäuresequenz auf, insbesondere eine in bovinem, porcinem, equinem oder avianem Kollagen vorkommende Aminosäuresequenz.

Bevorzugt ist das durch die Nukleotidsequenz codierte Kollagenpeptid ein natürlich vorkommendes Kollagenpeptid. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das durch die Nukleotidsequenz codierte Kollagenpeptid kein natürlich vorkommendes Kollagenpeptid. Bevorzugt ist das durch die Nukleotidsequenz codierte Kollagenpeptid ein gentechnisch verändertes Kollagenpeptid. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das durch die Nukleotidsequenz codierte Kollagenpeptid ein gentechnisch verändertes Kollagenpeptid, bei dem mindestens eine Aminosäure der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Kollagenpeptids, bevorzugt mindestens eine nicht-essentielle Aminosäure, insbesondere Ala, Asn, Asp, Glu, Ser, der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Kollagenpeptids, durch mindestens eine ganz bestimmte Aminosäure, insbesondere durch mindestens eine essentielle Aminosäure, insbesondere Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Val, His, Cys, Tyr, besonders bevorzugt Trp, ersetzt wurde.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist das durch die Nukleotidsequenz codierte Kollagenpeptid ein gentechnisch verändertes Kollagenpeptid, bei dem der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Kollagenpeptids mindestens eine Aminosäure, bevorzugt mindestens eine essentielle Aminosäure, insbesondere Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Val, His, Cys, Tyr, besonders bevorzugt Trp, hinzugefügt wurde. Dabei kann erfindungs gemäß vorgesehen sein, dass die mindestens eine Aminosäure, bevorzugt die mindestens eine essentielle Aminosäure, insbesondere Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Val, His, Cys, Tyr, besonders bevorzugt Trp, N- terminal, C-terminal und/oder innerhalb der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Kollagenpeptids hinzuzufügt wurde.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung codiert die mindestens eine Nukleotidsequenz ein Kollagenpeptid mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von bevorzugt 8 bis 95 kDa, bevorzugt 8 bis 90 kDa, bevorzugt 8 bis 85 kDa, bevorzugt 8 bis 80 kDa, bevorzugt 9 bis 95 kDa, bevorzugt 9 bis 90 kDa, bevorzugt 9 bis 85 kDa, bevorzugt 9 bis 80 kDa, bevorzugt 10 bis 95 kDa, bevorzugt 10 bis 90 kDa, bevorzugt 10 bis 85 kDa, bevorzugt 10 bis 80 kDa.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Hydrolyse eine enzymatische oder säurekatalysierte Hydrolyse, bevorzugt eine enzymatische Hydrolyse, bevorzugt eine säurekatalysierte Hydrolyse. Besonders bevorzugt erfolgt die Hydrolyse des in Schritt c) gewonnen Kollagenpeptids durch Zugabe von mindestens einer bakteriellen oder mikrobiellen Protease, insbesondere von mindestens einer bakteriellen und/oder mikrobiellen Serin-, Cystein-, Aspartat- und/oder Metalloprotease, bevorzugt von mindestens einer bakteriellen und/oder mikrobiellen Endoprotease, bevorzugt von mindestens einer bakteriellen und/oder mikrobiellen Exoprotease.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt das Hydrolysieren des Kollagenpeptids in Schritt d) unter Bedingungen, die zur Herstellung eines Kollagenpeptidpräparats führen, das Kollagenpeptide eines mittleren Molekulargewichts von 1 bis 3 kDa und mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 0,1 bis 10 kDa, bevorzugt 0,18 bis 10 kDa, bevorzugt 0,2 bis 10 kDa, aufweist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt das Hydrolysieren des Kollagenpeptids in Schritt d) unter Bedingungen, die zur Herstellung eines Kollagenpeptidpräparats führen, das Kollagenpeptide eines mittleren Molekulargewichts von 1 bis 5 kDa und mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 0,1 bis 12 kDa, bevorzugt 0,18 bis 12 kDa, bevorzugt 0,2 bis 12 kDa, aufweist.

Die vorliegende Erfindung betrifft zudem ein mit einem der vorgenannten erfindungsgemäßen Verfahren hergestelltes Kollagenpeptidpräparat, insbesondere ein Kollagenpeptidpräparat, das Kollagenpeptide eines mittleren Molekulargewichts von 1 bis 7 kDa und mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 0,1 bis 13,5 kDa, bevorzugt 0,18 bis 13,5, bevorzugt 0,2 bis 13,5, aufweist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das mit einem der vorgenannten erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Kollagenpeptidpräparat, insbesondere das Kollagenpeptidpräparat, das Kollagenpeptide eines mittleren Molekulargewichts von 1 bis 7 kDa und mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 0,1 bis 13,5 kDa aufweist, ein nicht- hydroxyliertes, partial hydroxyliertes oder vollständig hydroxyliertes Kollagenpeptidpräparat, bevorzugt ein nicht-hydroxyliertes Kollagenpeptidpräparat, bevorzugt ein partial hydroxyliertes Kollagenpeptidpräparat, bevorzugt ein vollständig hydroxyliertes Kollagenpeptidpräparat.

Bevorzugt ist das mit einem der vorgenannten erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Kollagenpeptidpräparat, insbesondere das Kollagenpeptidpräparat, das Kollagenpeptide eines mittleren Molekulargewichts von 1 bis 7 kDa und mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 0,1 bis 13,5 kDa aufweist, ein Kollagenpeptidpräparat, wobei mindestens 1%, bevorzugt mindestens 2%, bevorzugt mindestens 3%, bevorzugt mindestens 4%, bevorzugt mindestens 5%, bevorzugt mindestens 10%, bevorzugt mindestens 15%, bevorzugt mindestens 20%, bevorzugt mindestens 25%, bevorzugt mindestens 30%, bevorzugt mindestens 35%, bevorzugt mindestens 40%, bevorzugt mindestens 45%, bevorzugt mindestens 50% der Prolylreste, bevorzugt der Lysylreste, besonders bevorzugt der Prolyl- und Lysylreste, der Kollagenpeptide hydroxyliert sind, bevorzugt in vivo hydroxyliert sind, bevorzugt ex vivo hydroxyliert sind, insbesondere prälysal ex vivo hydroxyliert sind oder postlysal ex vivo hydroxyliert sind. Besonders bevorzugt ist das mit einem der vorgenannten erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Kollagenpeptidpräparat, insbesondere das Kollagenpeptidpräparat, das Kollagenpeptide eines mittleren Molekulargewichts von 1 bis 7 kDa und mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 0,1 bis 13,5 kDa aufweist, ein Kollagenpeptidpräparat, wobei höchstens 95%, bevorzugt höchstens 90%, bevorzugt höchstens 85%, bevorzugt höchstens 80%, bevorzugt höchstens 75%, bevorzugt höchstens 70%, bevorzugt höchstens 65%, bevorzugt höchstens 60%, bevorzugt höchstens 55%, bevorzugt höchstens 50%, bevorzugt höchstens 45%, bevorzugt höchstens 40%, bevorzugt höchstens 35%, bevorzugt höchstens 30%, bevorzugt höchstens 25%, bevorzugt höchstens 20%, bevorzugt höchstens 15%, bevorzugt höchstens 10%, bevorzugt höchstens 5% der Prolylreste, bevorzugt der Lysylreste, besonders bevorzugt der Prolyl- und Lysylreste, der Kollagenpeptide hydroxyliert sind, bevorzugt in vivo hydroxyliert sind, bevorzugt ex vivo hydroxyliert sind, insbesondere prälysal ex vivo hydroxyliert sind oder postlysal ex vivo hydroxyliert sind.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das mit einem der vorgenannten erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Kollagenpeptidpräparat, insbesondere das Kollagenpeptidpräparat, das Kollagenpeptide eines mittleren Molekulargewichts von 1 bis 7 kDa und mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 0,1 bis 13,5 kDa aufweist, ein Kollagenpeptidpräparat, wobei 0,5 bis 80%, bevorzugt 1 bis 75%, bevorzugt 5 bis 70%, bevorzugt 5 bis 65%, bevorzugt 10 bis 60%, bevorzugt 15 bis 55%, bevorzugt 20 bis 50%, bevorzugt 25 bis 50%, bevorzugt 30 bis 50%, bevorzugt 35 bis 50%, bevorzugt 40 bis 50% der Prolylreste, bevorzugt der Lysylreste, besonders bevorzugt der Prolyl- und Lysylreste, der Kollagenpeptide hydroxyliert sind, bevorzugt in vivo hydroxyliert sind, bevorzugt ex vivo hydroxyliert sind, insbesondere prälysal ex vivo hydroxyliert sind oder postlysal ex vivo hydroxyliert sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das mit einem der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Kollagenpeptidpräparat, insbesondere das Kollagenpeptidpräparat, das Kollagenpeptide eines mittleren Molekulargewichts von 1 bis 7 kDa und mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 0,1 bis 13,5 kDa aufweist, ein Kollagenpeptidpräparat, dessen Kollagenpeptide, glykosyliert sind. Bevorzugt sind die Kollagenpeptide in vivo glykosyliert, bevorzugt ex vivo glykosyliert. Bevorzugt sind mindestens 1%, bevorzugt mindestens 2%, bevorzugt mindestens 3%, bevorzugt mindestens 4%, bevorzugt mindestens 5%, bevorzugt mindestens 6%, bevorzugt mindestens 7%, bevorzugt mindestens 8%, bevorzugt mindestens 9%, bevorzugt mindestens 10%, bevorzugt mindestens 15%, bevorzugt mindestens 20%, der Hydroxylreste glykosyliert, bevorzugt in vivo glykosyliert, bevorzugt ex vivo glykosyliert.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das mit einem der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Kollagenpeptidpräparat, ein Kollagenpeptidpräparat, dessen Kollagenpeptide nicht glykosyliert sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das

Kollagenpeptidpräparat, insbesondere das Kollagenpeptidpräparat, das Kollagenpeptide eines mittleren Molekulargewichts von 1 bis 7 kDa und mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 0,1 bis 13,5 kDa aufweist, ein in vivo hydroxyliertes Kollagenpeptidpräparat, das heißt Kollagenpeptidpräparat A.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das

Kollagenpeptidpräparat, insbesondere das Kollagenpeptidpräparat, das Kollagenpeptide eines mittleren Molekulargewichts von 1 bis 7 kDa und mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 0,1 bis 13,5 kDa aufweist, ein nicht-hydroxyliertes Kollagenpeptidpräparat, das heißt Kollagenpeptidpräparat B.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Kollagenpeptidpräparat, insbesondere das Kollagenpeptidpräparat, das Kollagenpeptide eines mittleren Molekulargewichts von 1 bis 7 kDa und mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 0,1 bis 13,5 kDa aufweist, ein ex vivo hydroxyliertes Kollagenpeptidpräparat, das heißt Kollagenpeptidpräparat C oder D.

Bevorzugt ist das Kollagenpeptidpräparat, insbesondere das Kollagenpeptidpräparat, das Kollagenpeptide eines mittleren Molekulargewichts von 1 bis 7 kDa und mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 0,1 bis 13,5 kDa aufweist, ein prälysal, das heißt vor der Hydrolyse, ex vivo hydroxyliertes Kollagenpeptidpräparat, das heißt Kollagenpeptidpräparat C.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Kollagenpeptidpräparat, insbesondere das Kollagenpeptidpräparat, das Kollagenpeptide eines mittleren Molekulargewichts von 1 bis 7 kDa und mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 0,1 bis 13,5 kDa aufweist, ein postlysal, das heißt nach der Hydrolyse, ex vivo hydroxyliertes Kollagenpeptidpräparat, das heißt Kollagenpeptidpräparat D.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Kollagenpeptidpräparat, insbesondere ein hydroxyliertes oder nicht-hydroxyliertes Kollagenpräparat, welches durch Hydrolyse von rekombinant in einer Wirtszelle hergestelltem Kollagenpeptid mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 8 bis 100 kDa hergestellt ist, wobei das Kollagenpeptidpräparat Kollagenpeptide mit einem mittleren Molekulargewicht von 1 bis 7 kDa und einem Molekulargewicht in einem Bereich von 0,1 bis 13,5 kDa aufweist.

Das Vorhandensein der charakteristischen Peptide des Kollagenpeptidpräparats, die zu dessen Wirksamkeit beitragen, kann insbesondere mittels Massenspektroskopie, vorzugsweise mittels ESI (Elektronenspray-Ionisation) oder MALDI-Massenspektroskopie, bestimmt werden, wobei die charakteristischen Peptide im Massenspektrum als Peaks auftreten. Die charakteristischen Peptide weisen in einer mittels MALDI-Massenspektroskopie bestimmten Molekulargewichtsverteilung eine mindestens doppelte Intensität, weiter bevorzugt eine mindestens vierfache Intensität, im Vergleich zu ihrer Umgebung auf.

Die erfindungs gemäßen Kollagenpeptidpräparate, insbesondere das Kollagenpeptidpräparat A, das Kollagenpeptidpräparat B, das Kollagenpeptidpräparat C und das Kollagenpeptidpräparat D, können zusätzlich auch charakteristische Peptide einer Größe von 1.500 bis 3.500 Da aufweisen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen die erfindungs gemäßen Kollagenpeptidpräparate, insbesondere das Kollagenpeptidpräparat A, das Kollagenpeptidpräparat B, das Kollagenpeptidpräparat C und das Kollagenpeptidpräparat D, höchstens 5,5%, bevorzugt höchstens 5%, bevorzugt höchstens 4,5%, bevorzugt höchstens 4%, bevorzugt höchstens 3,5%, Kollagenpeptide mit einer Größe von < 500 Da auf.

Gemäß dieser Ausführungsform kommt es durch den besonders geringen Anteil an Peptiden mit einer Größe von weniger als 500 Da vorteilhafterweise zu einer Geschmacksverbesserung der Kollagenpeptidpräparate gegenüber den im Stand der Technik bekannten Präparaten, insbesondere zu einer verringerten Bitterkeit der Kollagenpeptidpräparate.

Bevorzugt weisen 35 bis 60%, bevorzugt 35 bis 55%, bevorzugt 35 bis 50%, bevorzugt 36 bis 48%, bevorzugt 36 bis 46%, bevorzugt 37 bis 45%, bevorzugt 38 bis 44%, der Kollagenpeptide der erfindungsgemäßen Kollagenpeptidpräparate, insbesondere des Kollagenpeptidpräparats A, des Kollagenpeptidpräparats B, des Kollagenpeptidpräparats C und des Kollagenpeptidpräparats D, eine Größe im Bereich von 1500 Da bis 3500 Da auf.

Bevorzugt weisen die erfindungsgemäßen Kollagenpeptidpräparate, insbesondere das Kollagenpeptidpräparat A, das Kollagenpeptidpräparat B, das Kollagenpeptidpräparat C und das Kollagenpeptidpräparat D, höchstens 2,8%, bevorzugt höchstens 2,75%, bevorzugt höchstens 2,7%, bevorzugt höchstens 2,65%, bevorzugt höchstens 2,6%, bevorzugt höchstens 2,55%, bevorzugt höchstens 2,5%, bevorzugt höchstens 2,45%, bevorzugt höchstens 2,4%, bevorzugt höchstens 2,35%, bevorzugt höchstens 2,3%, Kollagenpeptide mit einer Größe im Bereich von 7500 Da bis 13500 Da auf.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weisen mindestens 93%, bevorzugt mindestens 93,5%, bevorzugt mindestens 94%, bevorzugt mindestens 94,5%, bevorzugt mindestens 95%, der Kollagenpeptide der erfindungsgemäßen Kollagenpeptidpräparate, insbesondere des Kollagenpeptidpräparats A, des Kollagenpeptidpräparats B, des Kollagenpeptidpräparats C und des Kollagenpeptidpräparats D, eine Größe im Bereich von 500 Da bis 7500 Da auf.

Bevorzugt weisen mindestens 94,5%, bevorzugt mindestens 95%, bevorzugt mindestens 95,5%, bevorzugt mindestens 95,6%, bevorzugt mindestens 95,7%, bevorzugt mindestens 95,6%, bevorzugt mindestens 95,7%, bevorzugt mindestens 95,8%, bevorzugt mindestens 95,9%, bevorzugt mindestens 96%, bevorzugt mindestens 96,1%, bevorzugt mindestens 96,2%, bevorzugt mindestens 96,3%, bevorzugt mindestens 96,4%, bevorzugt mindestens 96,5%, der Kollagenpeptide der erfindungs gemäßen Kollagenpeptidpräparate, insbesondere des Kollagenpeptidpräparats A, des Kollagenpeptidpräparats B, des Kollagenpeptidpräparats C und des Kollagenpeptidpräparats D, eine Größe im Bereich von 500 Da bis 13500 Da auf.

In bevorzugter Ausführungsform wird gemäß der vorliegenden Erfindung das Kollagenpeptidpräparat lokal, insbesondere topisch, oder systemisch, insbesondere enteral, bevorzugt oral, verabreicht.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Kollagenpeptidpräparat in Form eines Nahrungsergänzungsmittels verabreicht. Besonders vorteilhaft liegt das erfindungsgemäße Nahrungsergänzungsmittel als Lösung, Suspension oder Gel, zum Beispiel in einer Ampulle, als Granulat oder Pulver vor. Auf Grund seiner guten Löslichkeit kann das Kollagenpeptidpräparat auch verschiedenen Getränken zugesetzt werden, ohne eine Trübung zu verursachen.

Das erfindungsgemäß bereitgestellte Nahrungsergänzungsmittel enthält gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung neben dem Kollagenpeptidpräparat keine weiteren Proteine oder Proteinhydrolysate.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung enthält das erfindungsgemäße Nahrungsergänzungsmittel neben dem Kollagenpeptidpräparat keine weiteren physiologisch aktiven Bestandteile, insbesondere keine Proteine oder Proteinhydrolysate.

Die Erfindung betrifft zudem ein Produkt, umfassend ein erfindungsgemäßes Kollagenpeptidpräparat und mindestens einen Zusatzstoff.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Nahrungsergänzungsmittel, umfassend ein erfindungsgemäßes Kollagenpräparat und mindestens einen weiteren Bestandteil, insbesondere mindestens einen Nahrungsmittel- akzeptablen Zusatzstoff.

In einer Ausführungsform kann das Kollagenpeptidpräparat einem Lebensmittel oder Genussmittel zugesetzt werden, zum Beispiel einem Schokoriegel, Proteinriegel, Cerealienriegel, Milch, Milchprodukten, zum Beispiel Joghurt, Molke oder Quark und Milchersatz, zum Beispiel Sojamilch, Reismilch, Mandelmilch und Kokosmilch (sog. Functional Food).

Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Lebensmittel oder Genussmittel, umfassend ein erfindungsgemäßes Kollagenpräparat.

Es kann erfindungsgemäß ferner vorgesehen sein, das Kollagenpeptidpräparat in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung zu verabreichen. Besonders vorteilhaft wird die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung beispielsweise im Formen von Tabletten, Lutschtabletten, Kautabletten, Kapseln, Beißkapseln, Dragees, Pastillen, Säften, Gels oder Salben verabreicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein erfindungsgemäßes Kollagenpeptidpräparat und mindestens einen pharmazeutisch-akzeptablen Zusatzstoff. In einer weiteren Ausführungsform kann vorgesehen sein, das Kollagenpeptidpräparat in Form einer kosmetischen Zusammensetzung zu verabreichen. Besonders vorteilhaft wird die erfindungsgemäße kosmetische Zusammensetzung beispielsweise im Formen von Lotionen, Salben, Cremes, Gelen, Puder, Spritzen oder Sprays verabreicht.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine kosmetische Zusammensetzung, umfassend ein erfindungsgemäßes Kollagenpeptidpräparat und mindestens einen hautverträglichen Zusatzstoff.

Sofern das Kollagenpeptidpräparat gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung nicht als einziger physiologisch aktiver Bestandteil eines Produktes, insbesondere eines Nahrungsergänzungsmittels, eines Lebensmittels oder Genussmittels, einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder einer kosmetischen Zusammensetzung, eingesetzt wird, kann es mit einer oder mehreren weiteren Komponenten kombiniert werden, die einen positiven Effekt auf die allgemeine Gesundheit aufweisen, insbesondere auf die Ausdauerleistungsfähigkeit. Solche Komponenten sind bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Vitamin C, Vitaminen der B-, D-, E- und K-Reihe, Omega-3-Fettsäuren, Omega-6-Fettsäuren, konjugierten Linolensäuren, Coffein und dessen Derivaten, Guaranäextrakt, Grünteeextrakt, Epigallocatechingallat, Kreatin, L-Carnitin, a-Liponsäure, N- Acetylcystein, NADH, D-Ribose, Magnesiumaspartat, Antioxidantien wie Anthocyane, Carotinoide, Flavonoide, Resveratrol, Glutathion und Superoxiddismutase (SOD), Cannabinoide wie Cannabidiol (CBD), Adaptogene wie Rhodiola rosea, Panax ginseng, Withania somnifera, Shiitake, Ganoderma lucidum Lepidium meyenii, Mineralstoffen wie Eisen, Magnesium, Calcium, Zink, Selen und Phosphor, sowie weiteren Proteinen, Hydrolysaten und Peptiden wie Soja-, Weizen- und Molkenprotein.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Kollagenpeptidpräparat in einer Menge von 1 bis 40 g pro Tag verabreicht, bevorzugt von 1 bis 30 g pro Tag, bevorzugt von 1 bis 20 g pro Tag, bevorzugt von 1 bis 15 g pro Tag, bevorzugt von 2,5 bis 30 g pro Tag, bevorzugt 2,5 bis 20 g pro Tag, bevorzugt 2,5 bis 15 g pro Tag, bevorzugt 2,5 bis 10 g pro Tag, bevorzugt 4 bis 15 g pro Tag, bevorzugt 4 bis 12 g pro Tag, weiter bevorzugt von 5 bis 25 g pro Tag, bevorzugt 5 bis 15 g pro Tag, weiter bevorzugt von 10 bis 25 g pro Tag, bevorzugt 12 bis 22 g pro Tag, und insbesondere von 12,5 bis 20 g pro Tag, besonders bevorzugt 6 bis 15 g pro Tag, insbesondere von 2,5 bis 7,5 g pro Tag, bevorzugt 2,5 bis 5 g pro Tag..

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein erfindungsgemäßes Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem therapeutisches Verfahren zum Erhalt und der Verbesserung der Knochengesundheit, zur Prävention und/oder Behandlung von Osteoporose, zur Prävention und/oder Behandlung von Sarkopenie, zur Prävention und/oder Behandlung von degenerativem Verlust von Muskelmasse, zur Verbesserung der Muskelkraft, zur Stimulation des Fettabbaus, zur Reduzierung des Körpergewichts.

Die vorliegende Erfindung betrifft in einer bevorzugten Ausführungsform zudem das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem Verfahren zur Prävention und/oder Behandlung von Knochenerkrankungen, insbesondere Osteoporose.

In bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem Verfahren zur Prävention und/oder

Behandlung von Sarkopenie.

In bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem Verfahren zur Prävention und/oder

Behandlung von degenerativem Verlust von Muskelmasse.

In bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem Verfahren zur Prävention und/oder

Behandlung von Knorpelerkrankungen, insbesondere Arthrose oder Arthritis.

In bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem Verfahren zur Verbesserung der Muskelkraft.

In bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem Verfahren zur Prävention und/oder

Behandlung eines pathologischen Zustandes charakterisiert durch eine verminderte mitochondriale Aktivität, insbesondere zur Prävention und/oder Behandlung eines pathologischen Zustandes charakterisiert durch eine verminderte Ausdauerleistungsfähigkeit.

In bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem Verfahren zur Stimulation des Fettabbaus.

In bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem Verfahren zur Reduktion des Körpergewichtes. In bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem Verfahren zur Prävention und/oder Behandlung von degenerativen Gelenkerkrankungen, insbesondere Arthrose, rheumatoider Arthritis, rheumatischen Erkrankungen, Spondylitis und/oder Fibromyalgie.

In bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem Verfahren zur Prävention und/oder Behandlung von Erkrankungen der Sehnen oder Bänder.

In bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem Verfahren zur Prävention und/oder Behandlung von Hauterkrankungen, insbesondere Psoriasis vulgaris, Akne, atopische Dermatitis, chronische Pruritus und/oder Rosazea.

In bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Wunden, insbesondere von chronischen Wunden, akuten Wunden und/oder Brandwunden.

In bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem Verfahren zur Prävention und/oder

Behandlung von degenerativen Nervenerkrankungen.

In bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem Verfahren zur Prävention und/oder

Behandlung von Demenz.

In bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem Verfahren zur Prävention und/oder

Behandlung der Alzheimer-Erkrankung.

In bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem Verfahren zur Prävention und/oder

Behandlung eines pathologischen Zustandes charakterisiert durch eine Verminderung der mentalen Leistungsfähigkeit. In bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem Verfahren zur Prävention und/oder

Behandlung von mit Fehlfunktionen der Blut-Hirn-Schranke, insbesondere der Struktur und/oder Funktion der Hirnhaut zusammenhängenden Krankheiten.

In bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem Verfahren zur Prävention und/oder

Behandlung von Darmerkrankungen, insbesondere chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen.

In bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem Verfahren zur Prävention und/oder

Behandlung von Erkrankungen des Herz-Kreislauf-Systems, insbesondere der Struktur und/oder Funktion der Blutgefäße, insbesondere der Gefäßwand, insbesondere zur Prävention und/oder Behandlung von Bluthochdruck und/oder Durchblutungsstörungen.

In bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem Verfahren zur Prävention und/oder

Behandlung von Erkrankungen des Zahnhalteapparats.

Die vorliegende Erfindung betrifft zudem ein erfindungsgemäßes Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem nicht therapeutischen Verfahren zum Erhalt und der Verbesserung der Knochengesundheit, zur Prävention von Osteoporose, zur Prävention und/oder Behandlung von Sarkopenie, zur Prävention von degenerativem Verlust von Muskelmasse, zur Verbesserung der Muskelkraft, zur Stimulation des Fettabbaus, zur Reduzierung des Körpergewichts und/oder zur Prävention von degenerativen Gelenkerkrankungen.

Die vorliegende Erfindung betrifft in einer bevorzugten Ausführungsform ferner die nicht therapeutische Verwendung des erfindungs gemäßen Kollagenpeptidpräparats zur optischen und strukturellen Verbesserung der Haut, insbesondere zur Reduktion der Faltenbildung, Verbesserung der Hautelastizität, Erhöhung der Spannkraft der Haut, Erhöhung des Feuchtigkeitsgehalts der Haut, Reduktion von Cellulite und/oder Reduktion von Dehnungs steifen, insbesondere Schwangerschaftsstreifen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die nicht therapeutische Verwendung des erfindungsgemäßen Kollagenpeptidpräparats zur Beschleunigung des Wachstums der Nägel und/oder Reduktion der Brüchigkeit von Nägeln.

In bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung zudem die nicht therapeutische Verwendung des erfindungs gemäßen Kollagenpeptidpräparats zur optischen und strukturellen Verbesserung der Haare, insbesondere zur Verbesserung der Haarqualität, Verminderung von Spliss und/oder Reduktion/Verzögerung von Haarausfall.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die nicht therapeutische Verwendung des erfindungs gemäßen Kollagenpeptidpräparats zur Steigerung der Mitochondrienzahl und/oder Mitochondrienaktivität.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die nicht therapeutische Verwendung des erfindungsgemäßen Kollagenpeptidpräparats zur Verbesserung der Ausdauerleistungsfähigkeit.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die nicht therapeutische Verwendung des erfindungsgemäßen Kollagenpeptidpräparats zur Verbesserung der mentalen Leistungsfähigkeit.

In bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das erfindungs gemäße Kollagenpeptidpräparat allein, das heißt ohne weitere Stoffe, zur Anwendung in einer der erfindungsgemäß vorgesehenen Anwendungen eingesetzt.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat als das einzige biologische Wirksamkeit aufweisende Agens in einer erfindungsgemäß vorgesehenen Anwendung eingesetzt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat gemeinsam mit mindestens einem weiteren Agens, insbesondere einem weiteren biologisch wirkenden Agens in einer erfindungsgemäß vorgesehenen Anwendung eingesetzt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Prävention und/oder Behandlung der vorgenannten Indikationen, insbesondere der vorgenannten therapeutischen Indikationen, gemäß denen dem menschlichen oder tierischen Körper eine für den therapeutischen Zweck ausreichende Menge des erfindungsgemäßen Kollagenpeptidpräparats, gegebenenfalls mit einem Zusatzstoff, verabreicht wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein nicht- therapeutisches Verfahren zur Verbesserung der Muskelkraft, zur Vermehrung der Muskelmasse, zur Stimulation des Fettabbaus, zur Reduktion des Körpergewichtes, zum Erhalt und/oder zur Verbesserung der Knochengesundheit, zum Erhalt und/oder zur Verbesserung der Hautgesundheit, zum Erhalt und/oder zur Verbesserung der Darmgesundheit, zum Erhalt und/oder Verbesserung der Blutgefäßstruktur, zum Erhalt und oder Verbesserung der Gesundheit des Herzkreislaufsystems, zum Erhalt und/oder Verbesserung des Zahnhalteapparates, zum Erhalt und/oder zur Verbesserung der Gesundheit der Nägel und Haare eines menschlichen oder tierischen Körpers, zum Erhalt und/oder zur Steigerung der Mitochondrienzahl und/oder Mitochondrienaktivität, zum Erhalt und/oder Verbesserung der Ausdauerleistungsfähigkeit oder zum Erhalt und/oder zur Verbesserung der mentalen Leistungsfähigkeit, wobei dem menschlichen oder tierischen Körper mindestens ein erfindungsgemäßes Kollagenpeptidpräparat verabreicht wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein erfindungsgemäßes Kollagenpeptidpräparat zur Anwendung in einem Verfahren zur Herstellung von Filmen, Folien und Beschichtungen. Bei den Beschichtungen kann es sich beispielsweise um Farben und Lacke, insbesondere Farben und Lacke mit speziellen optischen Effekten, oder um Beschichtungen zur Erzeugung von selbstreinigenden Oberflächen, handeln.

In bevorzugter Ausführungsform wird der Begriff „Kollagen“ im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung in fachüblicher Weise verstanden, insbesondere so wie beispielsweise in der WO 01/34646 definiert. In bevorzugter Ausführungsform betrifft der Begriff„Kollagen“ die Kollagen-Typen I bis XXVII. In weiterer bevorzugter Ausführungsform wird unter dem Begriff „Kollagen“ ein die Sequenz Glycin-Prolin, Glycin-4-Hydroxyprolin oder Glycin-X-4- Hydroxyprolin, bevorzugt das repetitive Motiv (Gly-X-Y) _n , aufweisendes Peptid verstanden, wobei X und Y jede Aminosäure sein können, vorzugsweise Prolin und 4-Hydroxyprolin sind. Besonders bevorzugt wird unter dem Begriff„Kollagen“ ein das repetitive Motiv (Gly-Pro-Y) _n und/oder (Gly-X-Hyp) _m aufweisendes Peptid verstanden, wobei X und Y jede Aminosäure sein können. Der Begriff „Gelatine“ wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bevorzugt in fachüblicher Weise verstanden, insbesondere so wie beispielsweise in der WO 01/34646 definiert.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „Kollagenpeptid“ bevorzugt ein Peptid verstanden, das eine in Kollagen gemäß vorstehender Definition vorkommende Aminosäuresequenz aufweist. Unter einem„Kollagenpeptid“ wird bevorzugt auch ein gentechnisch verändertes Kollagenpeptid verstanden, das durch Abwandlung der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Kollagenpeptids erhalten wurde, wobei das in Schritt e) der erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene aus dem„Kollagenpeptid“ gewonnene Kollagenpeptidpräparat bevorzugt in mindestens einem in vitro-Test zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, insbesondere in mindestens einem, bevorzugt in mindestens zwei, bevorzugt in allen, der in den Beispielen 3 bis 7, insbesondere Beispielen 3 bis 5, dargestellten in vitro-Tests zur Stimulation der Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrocyten, eine biologische Wirksamkeit, bevorzugt die gleiche biologische Wirksamkeit wie aus natürlichen Quellen isolierte Kollagenpeptidpräparate, insbesondere nicht rekombinant hergestellte Kollagenpeptidpräparate, besonders bevorzugt eine bessere biologische Wirksamkeit wie aus natürlichen Quellen isolierte Kollagenpeptidpräparate, insbesondere nicht rekombinant hergestellte Kollagenpeptidpräparate, aufweist.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „rekombinante DNA“ ein artifiziell hergestelltes oder manipuliertes DNA-Molekül bezeichnet, das in vitro mittels gentechnischer Methoden hergestellt wurde. In bevorzugter Ausführungsform setzt sich die rekombinante DNA aus Bestandteilen unterschiedlicher Herkunftsorganismen zusammen.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem„rekombinanten oder rekombinant hergestellten Kollagenpeptid“ ein durch rekombinante DNA codiertes Kollagenpeptid verstanden.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „Expressionskassette“ ein DNA-Segment verstanden, das für die Transkription der in diesem Segment codierten Information in eine RNA, insbesondere in eine mRNA, verantwortlich ist und zumindest einen Promotor und eine proteincodierende Nukleotidsequenz, in der Regel mindestens einen Promotor, mindestens eine proteincodierende Nukleotidsequenz und gegebenenfalls einen Terminator aufweist.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer„Nukleotidsequenz“ die Abfolge der Nukleotide einer Nukleinsäure, insbesondere eines Nukleinsäurestrangs, insbesondere eines DNA- oder RNA-Strangs verstanden. Eine„Nukleotidsequenz“ ist daher sowohl als informatorische Einheit als auch als der diese Information physisch manifestierende DNA- oder RNA-Strang zu verstehen.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem„Expressionssystem“ ein System verstanden, in dem eine gezielte und kontrollierte Proteinbiosynthese erfolgen kann. Dabei umfasst der Begriff „Expressions System“ erfindungs gemäß sowohl zellfreie Expressionssysteme, bei denen die zur Proteinbiosynthese notwendigen Komponenten nicht innerhalb einer Zelle vorliegen, das heißt die Proteinbiosynthese außerhalb einer Zelle erfolgt, als auch zellbasierte Expressions Systeme, bei denen die Proteinbiosynthese innerhalb einer lebenden Zelle erfolgt. Bei einem zellfreien Expressions System handelt es sich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bevorzugt um ein Lysat oder ein Extrakt aus E. coli, Insektenzellen, Weizenkeimen, Tabakzellen oder Säugetierzellen, insbesondere CHO- Zellen oder Retikulocyten aus Kaninchen, welches die zur Proteinbiosynthese notwendigen Komponenten, insbesondere ein Translations- und ein Transkriptions System, aufweist.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer„Wirtszelle“ eine lebende Zelle verstanden, die zur Expression von in Fremd-DNA, insbesondere in rekombinanter DNA, codierten Peptiden oder Proteinen, befähigt ist.

Mit den Begriffen„prälysal“ und„postlysal“ wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein Zeitpunkt vor beziehungsweise nach der Hydrolyse, insbesondere vor beziehungsweise nach enzymatischer oder säurekatalysierter Hydrolyse, bezeichnet.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff„Inkubieren“ sowohl das Kultivieren eines zellbasierten Expressionssystems, insbesondere einer Wirtszelle, als auch das Einwirken bestimmter Bedingungen auf ein zellfreies Expressionssystem verstanden.

Unter den Begriffen „Gewinnen des Kollagenpeptids“ gemäß Verfahrens schritt c) und „Gewinnen des Kollagenpeptidpräparats“ gemäß Verfahrens schritt e) wird erfindungsgemäß ein dem Fachmann bekanntes Verfahren zur Isolierung des Kollagenpeptids beziehungsweise des Kollagenpeptidpräparats aus einer mehrere Komponenten enthaltenden Zusammensetzung mittels bekannter Isolierungsverfahren, wie beispielsweise Zentrifugationsverfahren, insbesondere differenzielle Zentrifugation und/oder Dichtegradientenzentrifugation, chromatografischer Verfahren, insbesondere Gelfiltrations-, Ionenaustausch-, Affinitäts und/oder Hochleistungsflüssigkeitschromatografie, Elektrophoreseverfahren,

Filtrationsverfahren und/oder Extraktionsverfahren, verstanden, wobei eine Anreicherung und Reinigung der betreffenden Komponente aus der mehrere Komponenten enthaltenden Zusammensetzung bevorzugt durch sequenzielle Anwendung mehrerer Isolationsverfahren erzielt werden kann.

Unter „Bedingungen, die die Expression des Kollagenpeptids ermöglichen“ werden erfindungsgemäß Bedingungen, wie insbesondere Temperatur, Druck, Zeit, Licht sowie An oder Abwesenheit von Induktoren und/oder Repressoren, verstanden, die eine Expression des Kollagenpeptids aktivieren oder verstärken. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Expression des Kollagenpeptids in Rahmen einer Hochzelldichtefermentation, insbesondere unter Hochdruck, bevorzugt Luft-Hochdruck. Die konkreten Bedingungen, die eine Expression des Kollagenpeptids ermöglichen, sind dem Fachmann bekannt und hängen von dem verwendeten Expressions System und der verwendeten Expressionskassette, insbesondere des darin enthaltenen Promotors, ab. Bei der Expression des Kollagenpeptids kann es sich je nach Aufbau der Expressionskassette um eine konstitutive oder induzierbare Expression handeln.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter dem Begriff „Hydrolysieren des Kollagenpeptids unter Bedingungen, die zur Herstellung eines Kollagenpeptidpräparats führen“ diejenigen Bedingungen, insbesondere Art der Hydrolyse, gegebenenfalls Art und Menge des mindestens einen zur Hydrolyse verwendeten Enzyms, pH-Wert, Hydrolysedauer, Hydrolysetemperatur, verstanden, die zum Erhalt von Kollagenpeptiden eines mittleren Molekulargewichts von 1 bis 7 kDa und mit einem Molekulargewicht im Bereich von 0,1 bis 13,5 kDa aus einem rekombinat hergestellten Kollagenpeptid mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 8 bis 100 kDa führen. Zum Erhalt von Kollagenpeptiden eines mittleren Molekulargewichts von 1 bis 7 kDa und mit einem Molekulargewicht im Bereich von 0,1 bis 13,5 kDa aus einem rekombinant hergestellten Kollagenpeptid mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 8 bis 100 kDa geeignete Bedingungen sind beispielsweise in Beispiel 1 angegeben. Die im Zusammenhang mit der Molekulargewichtsverteilung der Kollagenpeptide in den erfindungsgemäßen Kollagenpeptidpräparaten angeführten %-Angaben beziehen sich jeweils auf Gew.-% in Bezug auf alle im betreffenden Kollagenpeptidpräparat enthaltenen Kollagenpeptide.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter den Begriffen„umfassend“ und „aufweisend“ verstanden, dass zusätzlich zu den von diesen Begriffen explizit erfassten Elementen noch weitere, nicht explizit genannte Elemente hinzutreten können. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter diesen Begriffen auch verstanden, dass allein die explizit genannten Elemente erfasst werden und keine weiteren Elemente vorliegen. In dieser besonderen Ausführungsform ist die Bedeutung der Begriffe„umfassend“ und„aufweisend“ gleichbedeutend mit dem Begriff „bestehend aus“. Darüber hinaus erfassen die Begriffe„umfassend“ und„aufweisend“ auch Zusammensetzungen, die neben den explizit genannten Elementen auch weitere nicht genannte Elemente enthalten, die sich jedoch von funktionell und qualitativ untergeordneter Natur sind. In dieser Ausführungsform sind die Begriffe„umfassend“ und„aufweisend“ gleichbedeutend mit dem Begriff „im Wesentlichen bestehend aus“.

Unter dem Begriff „und/oder“ wird in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verstanden, dass alle Mitglieder einer Gruppe, welche durch den Begriff„und/oder“ verbunden sind, sowohl alternativ zueinander als auch jeweils untereinander kumulativ in einer beliebigen Kombination offenbart sind. Dies bedeutet für den Ausdruck„A, B und/oder C“, dass folgender Offenbarungsgehalt darunter zu verstehen ist: a) A oder B oder C oder b) (A und B) oder c) (A und C) oder d) (B und C) oder e) (A und B und C).

Weitere bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Die Erfindung wird nachstehend ohne Beschränkung des allgemeinen Erfindungsgedankens anhand von Figuren, Tabellen und den dazugehörigen Ausführungsbeispielen beschrieben.

Dabei zeigt

Figur 1 die prozentualen Anteile einzelner Kollagenpeptide der Vergleichsprodukte 1 und 2 sowie der Kollagenpeptidpräparate gemäß den Beispielen 1.3, 1.4 und 1.5 in definierten Molekulargewichtsbereichen. Figur 2A ein Chromatogramm einer 1 %-igen Lösung des Vergleichsprodukts 1. Das Molekulargewicht ist auf der Abszisse mit einer logarithmischen Skala aufgetragen.

Figur 2B ein Chromatogramm einer 1 %-igen Lösung des Vergleichsprodukts 2. Das Molekulargewicht ist auf der Abszisse mit einer logarithmischen Skala aufgetragen.

Figur 3A ein Chromatogramm einer 1 %-igen Lösung des Kollagenpeptidpräparats gemäß Beispiel 1.3. Das Molekulargewicht ist auf der Abszisse mit einer logarithmischen Skala aufgetragen.

Figur 3B ein Chromatogramm einer 1 %-igen Lösung des Kollagenpeptidpräparats gemäß Beispiel 1.4. Das Molekulargewicht ist auf der Abszisse mit einer logarithmischen Skala aufgetragen.

Figur 4 ein Chromatogramm einer 1 %-igen Lösung des Kollagenpeptidpräparats gemäß Beispiel 1.5. Das Molekulargewicht ist auf der Abszisse mit einer logarithmischen Skala aufgetragen.

Figur 5 einen Vergleich der Stimulation der Kollagensynthese primärer humaner Fibroblasten in Abwesenheit eines Kollagenpeptids (Kontrolle 1), in Anwesenheit von 0,5 mg/ml eines 100 kDa Kollagenpeptids (Kontrolle 2), eines erfindungsgemäßen nicht-hydroxylierten

Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren Molekulargewicht von 1,8 kDa (Probe 1), eines erfindungsgemäßen nicht-hydroxylierten Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren

Molekulargewicht von 2,4 kDa (Probe 2) oder eines erfindungsgemäßen nicht-hydroxylierten Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren Molekulargewicht von 3,4 kDa (Probe 3). Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung.

Figur 6 einen Vergleich der Stimulation der Elastinsynthese primärer humaner Fibroblasten in Abwesenheit eines Kollagenpeptids (Kontrolle 1), in Anwesenheit von 0,5 mg/ml eines 100 kDa Kollagenpeptids (Kontrolle 2), eines erfindungsgemäßen nicht-hydroxylierten

Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren Molekulargewicht von 1,8 kDa (Probe 1), eines erfindungsgemäßen nicht-hydroxylierten Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren

Molekulargewicht von 2,4 kDa (Probe 2) oder eines erfindungsgemäßen nicht-hydroxylierten Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren Molekulargewicht von 3,4 kDa (Probe 3). Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Figur 7 einen Vergleich der Stimulation der Proteoglykansynthese primärer humaner Fibroblasten in Abwesenheit eines Kollagenpeptids (Kontrolle 1), in Anwesenheit von 0,5 mg/ml eines 100 kDa Kollagenpeptids (Kontrolle 2), eines erfindungsgemäßen nicht-hydroxylierten Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren Molekulargewicht von 1,8 kDa (Probe 1), eines erfindungsgemäßen nicht-hydroxylierten Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren Molekulargewicht von 2,4 kDa (Probe 2) oder eines erfindungsgemäßen nicht-hydroxylierten Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren Molekulargewicht von 3,4 kDa (Probe 3). Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung.

Figur 8 einen Vergleich der Stimulation der Kollagensynthese primärer humaner Fibroblasten in Abwesenheit eines Kollagenpeptids (Kontrolle 1), in Anwesenheit von 0,5 mg/ml eines erfindungsgemäßen hydroxylierten Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren

Molekulargewicht von 7 kDa (Probe 4), eines erfindungsgemäßen hydroxylierten Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren Molekulargewicht von 5,6 kDa (Probe 5) oder eines erfindungsgemäßen hydroxylierten Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren Molekulargewicht von 1,3 kDa (Probe 6). Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung.

Figur 9 einen Vergleich der Stimulation der Elastinsynthese primärer humaner Fibroblasten in Abwesenheit eines Kollagenpeptids (Kontrolle 1), in Anwesenheit von 0,5 mg/ml eines erfindungsgemäßen hydroxylierten Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren

Molekulargewicht von 7 kDa (Probe 4), eines erfindungsgemäßen hydroxylierten Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren Molekulargewicht von 5,6 kDa (Probe 5) oder eines erfindungsgemäßen hydroxylierten Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren Molekulargewicht von 1,3 kDa (Probe 6). Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung.

Figur 10 einen Vergleich der Stimulation der Proteoglykansynthese primärer humaner Fibroblasten in Abwesenheit eines Kollagenpeptids (Kontrolle 1), in Anwesenheit von 0,5 mg/ml eines erfindungsgemäßen hydroxylierten Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren Molekulargewicht von 7 kDa (Probe 4), eines erfindungs gemäßen hydroxylierten Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren Molekulargewicht von 5,6 kDa (Probe 5) oder eines erfindungsgemäßen hydroxylierten Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren Molekulargewicht von 1,3 kDa (Probe 6). Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung.

Beispiele: Beispiel 1 - Herstellung von Kollagenpeptiden:

1.1 Hydrolyse eines in Pichia pastoris rekombinant hergestellten nicht-hydroxylierten Kollagenpeptids bovinen Ursprungs mit einer Größe von 45 kDa mit neutraler Protease

Eine 0,789 %-ige Kollagenlösung wurde in einer 50 ml Flasche im Kryostaten zunächst auf 50 °C temperiert. Anschließend wurden der temperierten Kollagenlösung 200 ppm CaCl ₂ x2H ₂ 0 (bezogen auf Trockensubstanz (TS) des Kollagens) zugegeben und der pH-Wert der Lösung mit einer 10 %-igen NaOH-Lösung auf 6,2 eingestellt. In einem nächsten Schritt wurden der Kollagenlösung 0,8 % Sumizyme BNP-L (bezogen auf TS des Kollagens) zugegeben.

Das mittlere Molekulargewicht der Kollagenpeptide nach einer Hydrolysedauer von 180 min wurde auf 5,04 kDa bestimmt.

1.2 Hydrolyse eines in Pichia pastoris rekombinant hergestellten nicht-hydroxylierten Kollagenpeptids bovinen Ursprungs mit einer Größe von 45 kDa mit alkalischer Protease

Eine 0,792 %-ige Kollagenlösung wurde in einer 50 ml Flasche im Kryostaten zunächst auf 63 °C temperiert. Daraufhin wurden der temperierten Kollagenlösung 200 ppm CaCl ₂ x2H ₂ 0 (bezogen auf TS des Kollagens) zugegeben und der pH-Wert der Lösung mit 10 %-iger NaOH- Lösung auf 7,75 eingestellt. In einem nächsten Schritt wurden der Kollagenlösung 0,3% Alcalase 2.4L (bezogen auf TS des Kollagens) zugegeben.

Das mittlere Molekulargewicht der Kollagenpeptide nach einer Hydrolysedauer von 180 min wurde auf 3,01 kDa bestimmt.

1.3 Hydrolyse eines in Pichia pastoris rekombinant hergestellten nicht-hydroxylierten Kollagenpeptids humanen Ursprungs mit einer Größe von 25 kDa mit alkalischer Protease

Eine 2,85 %-ige Kollagenlösung wurde in einer 50 ml Flasche im Kryostaten zunächst auf 63 °C temperiert. Anschließend wurden 200 ppm CaCl ₂ x2H ₂ 0 (bezogen auf TS des Kollagens) zu der temperierten Kollagenlösung gegeben und der pH-Wert der Lösung mit 10 %-iger NaOH- Lösung auf 7,6 eingestellt. In einem nächsten Schritt wurden der Kollagenlösung 0,3% Alcalase 2.4L (bezogen auf TS des Kollagens) zugegeben. Das mittlere Molekulargewicht der Kollagenpeptide nach einer Hydrolysedauer von 45 min betrug 1,8 kDa.

1.4 Hydrolyse eines in Pichia pastoris rekombinant hergestellten nicht-hydroxylierten Kollagenpeptids humanen Ursprungs mit einer Größe von 100 kDa mit alkalischer Protease

Zunächst wurde eine 2,85 %-ige Kollagenlösung in einer 50 ml Flasche im Kryostaten auf 63 °C temperiert. Anschließend wurden der temperierten Kollagenlösung 200 ppm CaCl ₂ x2H ₂ 0 (bezogen auf TS des Kollagens) zugegeben und der pH-Wert der Lösung mit 10 %-iger NaOH- Lösung auf 7,6 eingestellt. Daraufhin wurden der Kollagenlösung 0,4% Alcalase 2.4L (bezogen auf TS des Kollagens) zugegeben.

Nach einer Hydrolysedauer von 45 min wies die Lösung Kollagenpeptide mit einem mittleren Molekulargewicht von 2,4 kDa auf. Das erhaltene erfindungs gemäße Kollagenpeptidpräparat wurde in Beispiel 6 als Probe 2 eingesetzt.

1.5 Hydrolyse eines in Pichia pastoris rekombinant hergestellten nicht-hydroxylierten Kollagenpeptids humanen Ursprungs mit einer Größe von 100 kDa mit alkalischer Protease

Eine 1,5 %-ige Kollagenlösung wurde in einer 50 ml Flasche im Kryostaten auf 63 °C temperiert. Anschließend wurden der temperierten Kollagenlösung 200 ppm CaCl ₂ x2H ₂ 0 (bezogen auf TS des Kollagens) zugegeben und der pH-Wert der Lösung mit 10 %-iger NaOH- Lösung auf 7,6 eingestellt. Schließlich wurden der Kollagenlösung 0,3% Alcalase 2.4L (bezogen auf TS des Kollagens) zugegeben.

Das mittlere Molekulargewicht der Kollagenpeptide nach einer Hydrolysedauer von 60 min betrug 1,8 kDa. Das erhaltene erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat wurde in Beispiel 6 als Probe 1 eingesetzt.

1.6 Hydrolyse eines in Pichia pastoris rekombinant hergestellten nicht-hydroxylierten Kollagenpeptids humanen Ursprungs mit einer Größe von 25 kDa mit alkalischer Protease Eine 2,85 %-ige Kollagenlösung wurde in einer 50 ml Flasche im Kryostaten zunächst auf 63 °C temperiert. Anschließend wurden 200 ppm CaCl ₂ x2H ₂ 0 (bezogen auf TS des Kollagens) zu der temperierten Kollagenlösung gegeben und der pH-Wert der Lösung mit 10 %-iger NaOH- Lösung auf 7,6 eingestellt. In einem nächsten Schritt wurden der Kollagenlösung 0,1% Alcalase 2.4L (bezogen auf TS des Kollagens) zugegeben.

Das mittlere Molekulargewicht der Kollagenpeptide nach einer Hydrolysedauer von 60 min betrug 3,4 kDa. Das erhaltene erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat wurde in Beispiel 6 als Probe 3 eingesetzt.

1.7 Hydrolyse eines in Pichia pastoris rekombinant hergestellten hydroxylierten

Kollagenpeptids bovinen Ursprungs mit einer Größe von 45 kDa mit alkalischer Protease

Eine 5,53 %-ige Kollagenlösung wurde in einer 250 ml Glasflasche im Kryostaten zunächst auf 55 °C temperiert. Daraufhin wurden der temperierten Kollagenlösung 200 ppm CaCl ₂ x2H ₂ 0 (bezogen auf TS des Kollagens) zugegeben und der pH-Wert der Lösung mit 2 %-iger NaOH- Lösung auf 7,59 eingestellt. In einem nächsten Schritt wurden der Kollagenlösung 0,2% Alcalase 2.4L (bezogen auf TS des Kollagens) zugegeben.

Das mittlere Molekulargewicht der Kollagenpeptide nach einer Hydrolysedauer von 150 min wurde auf 7 kDa bestimmt. Das erhaltene erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat wurde in Beispiel 7 als Probe 4 eingesetzt.

1.8 Hydrolyse eines in Pichia pastoris rekombinant hergestellten hydroxylierten

Kollagenpeptids bovinen Ursprungs mit einer Größe von 45 kDa mit alkalischer Protease

Eine 5,00 %-ige Kollagenlösung wurde in einer 100 ml Glasflasche im Kryostaten zunächst auf 55 °C temperiert. Daraufhin wurden der temperierten Kollagenlösung 200 ppm CaCl ₂ x2H ₂ 0 (bezogen auf TS des Kollagens) zugegeben und der pH-Wert der Lösung mit 2 %-iger NaOH- Lösung auf 7,60 eingestellt. Anschließend wurden der Kollagenlösung 0,25% NZ37071 (bezogen auf TS des Kollagens) zugegeben.

Das mittlere Molekulargewicht der Kollagenpeptide nach einer Hydrolysedauer von 240 min betrug 5,6 kDa. Das erhaltene erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat wurde in Beispiel 7 als Probe 5 eingesetzt. 1.9 Hydrolyse eines in Pichia pastoris rekombinant hergestellten hydroxylierten Kollagenpeptids bovinen Ursprungs mit einer Größe von 45 kDa mit alkalischer Protease

Ausgehend von dem gemäß Beispiel 1.7 erhaltenen Kollagenpeptidhydrolysat wurden die höhermolekularen Bestandteile des Hydrolysats mittels eines Konzentrators (z.B. Vivaspin 20) mit einer Größenausschlussmembran von 5000 Da entfernt.

Für die so erhaltenen Kollagenpeptide wurde ein mittleres Molekulargewicht von 1,3 kDa ermittelt. Das erfindungsgemäße Kollagenpeptidpräparat wurde in Beispiel 7 als Probe 6 eingesetzt.

1.10 Gelchromatographische Analyse der Kollagenpeptidhydrolysate

Die Molekulargewichtsverteilung der in den Beispielen 1.3 bis 1.5 erhaltenen Kollagenpeptidhydrolysate sowie von zwei kommerziell erhältlichen Vergleichsprodukten mit einem mittleren Molekulargewicht von 2,3 kDa und 1,7 kDa wurden mittels Gelchromatographie (Knauer, Germany) bestimmt. Die statistische Analyse erfolgte durch die Software WinGPC (Firma PSS GmbH, Mainz, Germany). Zur Gelchromatographie wurden folgende Parameter verwendet:

Stationäre Phase: TSK 2000 SW XL (TOSOH Bioscience GmbH)

Mobile Phase: 0.4 mol/l Natriumdihydrogenposphat, pH 5.3

Flussrate: 0.5 ml/min

Kalibrationsstandard: definierte Kollagen Typ 1 Fragmente (FILK)

Detektion: UV-Detektion bei 214 nm (Knauer)

Probenkonzentration : 1 %

Für die unterschiedlichen Kollagenpeptidhydrolysate ergaben sich die in Tabelle 1 und in Figur 1 dargestellten prozentualen Anteile einzelner Kollagenpeptide in definierten Molekulargewichtsbereichen.

Tabelle 1: Auswertung der prozentualen Anteile der einzelnen Kollagenpeptide in definierten Molekulargewichtsbereichen. Die Analyse wurde mittels Gelchromatographie unter Verwendung definierter Typ-l Kollagenpeptidstandards durchgeführt.

Chromatogramme einer jeweils 1 %-igen Lösung der Vergleichsprodukte und der Kollagenpeptidpräparate gemäß den Beispielen 1.3 bis 1.5 sind in den Figuren 2 bis 4 dargestellt. Durch die engere Molekulargewichtsverteilung, das Fehlen höhermolekularer Peptide und die erfindungsgemäße Durchführung der Hydrolyse kann der Anteil der Peptide < 500 Da deutlich reduziert und dennoch ein Produkt mit einem mittleren Molekulargewicht von unter 2 kDa erzielt werden. Gleichzeitig wird die Anzahl von Peptiden im bevorzugten Größenbereich zwischen 1500 und 3500 Da deutlich gesteigert. Während Peptide > 1500 Da vom Fachmann als geschmacklich neutral eingestuft werden, tragen gerade die niedermolekularen Peptide < 500 Da maßgeblich zur Bitterkeit von Kollagenpeptidprodukten bei.

Die Vermeidung der Entstehung solcher Peptide ist ein weiterer Vorteil zur Herstellung sensorisch und organoleptisch hervorragender und vom Verbraucher als„neutral“ schmeckend eingestufter Kollagenpeptide. Gleiches gilt auch für Produkte mit höherem mittleren Molekulargewicht im Bereich 3 bis 7 kDa.

Aus den genannten Ausführungsbeispielen lässt sich ableiten, dass durch das erfindungsgemäße Verfahren und damit der Verwendung einheitlicher rekombinanter Kollagenfragmente als Ausgangsmaterial für die Hydrolyse die Bildung bevorzugter Einzelpeptide innerhalb einer engen Molekulargewichtsverteilung möglich ist, die je nach Wahl der Hydrolysebedingungen charakteristische Peaks aufweist, in der Regel zwischen 4 und 6 (Fig. 3A, Fig. 3B, Fig. 4).

Die Bildung dieser Einzelpeptide kann sowohl durch Wahl des Ausgangsfragments als auch der Hydrolysebedingungen gezielt gesteuert werden, was bei der Verwendung tierischen Ausgangsmaterials infolge derer Inhomogenität nahezu unmöglich ist. Beispiel 2 - ex vivo-Hydroxylierung von Kollagenfragmenten

Zur posttranslationalen Modifizierung (Hydroxylierung von Prolinresten) von Kollagenfragmenten ex vivo wurde eine spezifische 4-OH Prolylhydroxylase (P4H) in Gegenwart der Cofaktoren a-Ketoglutarat, Eisen(II)-Ionen sowie 0 ₂ eingesetzt, wobei auch der Einsatz unspezifischer Hydroxylasen denkbar ist. Dazu wurden 8 mM des Kollagenfragmentes in Gegenwart von 14 mM a-Ketoglutarat, 0,5 mM Eisen(II) sulfat und 1,5 mM L-Ascorbinsäure in 50 mM MES Puffer (pH 6,5) und einer Enzymlösung in einem Gesamtvolumen von 1 mL unter Schütteln (300 UPM) bei 37 °C auf einem Thermomixer für 14 bis 18 Stunden inkubiert. Alternativ kann die Inkubation unter den vorgenannten Bedingungen auch in einem Brutschrank erfolgen.

Beispiel 3 - Osteoblasten-Aktivität (insbesondere Knochengesundheit):

Zur Analyse der biologischen Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Kollagenpeptidpräparats in Hinblick auf den Erhalt der Knochengesundheit und die Prophylaxe und Behandlung von Knochenerkrankungen wird dessen stimulierende Wirkung auf die Synthese von Matrixproteinen und Enzymen, die beim Aufbau und der Mineralisation der Matrix eine Rolle spielen, durch Osteoblasten in vitro untersucht. Dies erfolgt durch eine Bestimmung der Expression der entsprechenden mRNA mittels Realtime-PCR und eine semiquantitative Auswertung (bezogen auf eine Kontrolle ohne Kollagenhydrolysat).

Dazu werden zunächst humane Osteoblasten aus Kniegelenken isoliert, indem Knochenmaterial unter starker Agitation bei 37 °C für 1 h in Hanks-Lösung inkubiert wird, supplementiert mit 7 mg/ml Hyaluronidase Typ I und III-S und 5 mg/ml Pronase. Der Aufschluss wird anschließend bei 37 °C für 3-5 h in Hanks-Lösung, supplementiert mit 16 mg/ml Kollagenase Typ CLS IV, fortgesetzt. Die erhaltenen primäre Osteoblasten werden nach dem enzymatischen Aufschluss in HanTs Fl2-Medium, supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum, 20 U/ml Penicillin- Streptomycin, 50 pg/ml Partricin, 0,05 mg/ml Ascorbinsäure und 0,15 mg/ml Glutamin kultiviert. Alternativ können primäre Osteoblasten (Artikel-Nr. C- 12760; 2019) zur Untersuchung der biologischen Wirksamkeit auch von der PromoCell GmbH, Heidelberg, Deutschland, bezogen werden. Die Kultivierung der Zellen erfolgt dann in HanTs Fl2-Medium, supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum, 20 U/ml Penicillin-Streptomycin, 50 pg/ml Partricin und 0,15 mg/ml Glutamin. Für die Untersuchung der biologischen Wirksamkeit werden Monolayer-Zellkulturen der isolierten humanen Osteoblasten für einen Zeitraum von 24 h in einem Medium inkubiert, welches mit 0,5 mg/ml des jeweiligen Kollagenpeptidpräparats supplementiert ist. Eine Kontrolle wird jeweils in Medium ohne Präparat inkubiert. Anschließend erfolgt die Bestimmung der jeweiligen mRNA-Expression.

Beispiel 4 - Fibroblasten- Aktivität (insbesondere Hautgesundheit):

Beispiel 4.1 - Stimulation der mRNA-Synthese:

Die Stimulation der Synthese von Kollagen (Typ I) sowie der Proteoglykane Biglykan und Versican wird in vitro an humanen dermalen Fibroblasten (Hautzellen) untersucht. Hierfür werden die Zellen für 24 Stunden mit jeweils 0,5 mg/ml eines niedermolekularen beziehungsweise des erfindungsgemäßen Kollagenpeptidpräparats inkubiert und anschließend die Expression von Kollagen-RNA, Biglykan-RNA und Versican-RNA mittels Realtime-PCR bestimmt und semiquantitativ (bezogen auf eine Kontrolle ohne Präparat) ausgewertet.

Beispiel 4.2 - Stimulation der Synthese von Proteinen des Bindegewebes:

Zur Bestimmung der Stimulation der Synthese von Proteinen des Bindegewebes durch die erfindungsgemäßen Kollagenpeptidpräparate werden primäre humane dermale Fibroblasten nach enzymatischem Verdau zunächst in HAM’s F12 Medium, umfassend 10% FCS, 20 U/ml Penicillin-Streptomycin, 50 pg/ml Partricin, 0,05 mg/ml Ascorbinsäure und 0,15 mg/ml Glutamin, kultiviert. Nach Erreichen einer Konfluenz von 80% wird das jeweilige Kulturmedium durch ein Medium ohne Kollagenpeptid (Kontrolle) oder mit 0,5 mg/ml eines zu testenden Kollagenpeptidpräparats ersetzt und die primären humanen Fibroblasten für einen Zeitraum von mindestens 14 Tagen, bevorzugt 14 bis 21 Tagen, insbesondere 14 Tagen, in dem jeweiligen Medium inkubiert. Anschließend kann die Expression unterschiedlicher Proteine des Bindegewebes mittels geeigneter Assays (siehe beispielsweise Beispiele 6 und 7) bestimmt und ausgewertet werden.

Beispiel 5 - Chondrocvten- Aktivität (insbesondere Knorpel gesundheit):

Für die Zellkulturen werden porcine beziehungsweise humane Chondrocyten auf bekannte Weise aus Knorpelgewebe isoliert und mit einer Dichte von ca. 350.000 Zellen/cm auf Kulturplatten ausgesät. Als Kulturmedium wird Ham‘s Fl2-Medium mit 10 % fötalem Kälber serum, 10 mg/ml Gentamycin und 5 mg/ml Amphotericin B verwendet. Alternativ zu 10 mg/ml Gentamycin können auch 10 mg/ml Penicillin-Streptomycin verwendet werden. Die Kultivierung erfolgte bei 37 °C in einer sauerstoffreduzierten Atmosphäre (5 % 0 ₂ , 5 % C0 ₂ und 90 % N ₂ ).

Bestimmung der Kollagen-Biosynthese:

Die Quantifizierung des von den Chondrocyten synthetisierten Kollagens (im Wesentlichen Typ II) erfolgt durch radioaktive Markierung mit ¹⁴ C-Prolin, welches in das Kollagen eingebaut wird.

Dem Kulturmedium wird zunächst radioaktives ¹⁴ C-Prolin zugesetzt und die Chondrocyten werden unter diesen Bedingungen bis zum Zeitpunkt der Bestimmung kultiviert. Um bei der Detektion das eingebaute von nicht eingebautem ¹⁴ C-Prolin unterscheiden zu können, wird das isotopenhaltige Kulturmedium dann für einen Zeitraum von 3 Tagen durch reines Kulturmedium ersetzt. Anschließend wird das Kulturmedium verworfen und der adhärente Zellrasen wird mit destilliertem Wasser versetzt, um durch osmotischen Stress die Zellmembranen zu zerstören und cytosolisches, nicht gebundenes ¹⁴ C-Prolin freizusetzen. Durch Zentrifugation werden die Zelltrümmer mit der synthetisierten extrazellulären Matrix pelletiert. Das Pellet wird in frischem destillierten Wasser resuspendiert und mit einem Xylen-Scintillations-Cocktail versetzt. Durch Detektion des ¹⁴ C-Prolins mit einem Betacounter kann dann die Menge des synthetisierten Kollagens quantifiziert werden.

Alternativ kann die Quantifizierung mit Hilfe des Sircol Collagen Assay Kits (Artikel-Nr. 054S5000, 2019, tebu-bio, Offenbach, Deutschland, beziehungsweise Biocolor Ltd., UK) nach Herstellerangaben durchgeführt werden (siehe Beispiele 6 und 7).

Bestimmung der Proteoglykan-Biosynthese:

Die Quantifizierung der von den Chondrocyten synthetisierten Proteoglykane erfolgt durch eine Alcianblau-Färbung und photometrische Bestimmung der Glykosaminoglykane (GAG), welche Bestandteile der Proteoglykane sind.

Um den Gehalt an GAG in der Zellkultur zu bestimmen, wird zunächst das Kulturmedium verworfen und der adhärente Zellrasen wird mit PBS-Puffer (pH 7) gespült. Anschließend werden die Zellen bei 4 °C für 2 Stunden in einer 10 %-igen Formaldehydlösung in PBS fixiert. Nach Entfernen des Formaldehyds wird das Alcianblau-Färbereagenz (5 % Alcianblau in 3 %- iger Essigsäure) auf den Zellrasen gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nicht gebundenes Alcianblau wird verworfen und durch drei- bis viermaliges vorsichtiges Spülen mit PBS ausgewaschen. Durch Zugabe von saurer Guanidinlösung (8 mol/l) werden die GAG-Komplexe aus dem Zellrasen herausgelöst. Die Menge an Glykosaminoglykanen kann dann photometrisch bei einer Wellenlänge von 620 nm quantifiziert werden.

Alternativ kann die Quantifizierung mit Hilfe des Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kits (Artikel-Nr. 054B3000, 2019, tebu-bio, Offenbach, Deutschland, beziehungsweise Biocolor Ltd., UK) nach Herstellerangaben durchgeführt werden (siehe Beispiele 6 und 7).

Beispiel 6 - Stimulation der Synthese von Kollagen, Elastin und Proteoglykan in primären humanen Fibroblasten durch erfindungs gemäße nicht-hydroxylierte Kollagenpeptidpräparate:

Zur Bestimmung der Stimulation der Synthese von Kollagen, Elastin und Proteoglykan wurden primäre humane dermale Fibroblasten gemäß Beispiel 4.2 über einen Zeitraum von mindestens 14 Tagen, bevorzugt 14 bis 21 Tagen, insbesondere 14 Tagen, in Medium ohne Kollagenpeptid (Kontrolle 1) und in Anwesenheit von 0,5 mg/ml eines 100 kDa Kollagenpeptids (Kontrolle 2), eines Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren Molekulargewicht von 1,8 kDa (Probe 1), eines Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren Molekulargewicht von 2,4 kDa (Probe 2) und einem eines Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren Molekulargewicht von 3,4 kDa (Probe 3), inkubiert.

Beispiel 6.1 - Bestimmung der Stimulation der Synthese von Kollagen

Die Bestimmung der Kollagensynthese durch primäre humane dermale Fibroblasten wurde mittels des Sircol Collagen Assay Kits (Artikel-Nr. 054S5000, 2019, tebu-bio, Offenbach, Deutschland, beziehungsweise Biocolor Ltd., UK) gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Die Ergebnisse des Versuchs sind in Tabelle 2 und Figur 5 dargestellt.

Tabelle 2: Bestimmung der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 450 nm zur Ermittlung der Kollagensynthese gemäß dem Sircol Collagen Assay (tebu-bio, Offenbach, Deutschland, beziehungsweise Biocolor Ltd., UK).

Beispiel 6.2 - Bestimmung der Stimulation der Synthese von Elastin

Die Bestimmung der Elastinsynthese durch primäre humane dermale Fibroblasten wurde mittels des Fastin Elastin Assays (Artikel-Nr. 054F2000, 2019, tebu-bio, Offenbach, Deutschland, beziehungsweise Biocolor Ltd., UK) gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Die Ergebnisse des Versuchs sind in Tabelle 3 und Figur 6 dargestellt.

Tabelle 3: Bestimmung der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 450 nm zur Ermittlung der Elastinsynthese gemäß dem Fastin Elastin Assay (tebu-bio, Offenbach, Deutschland, beziehungsweise Biocolor Ltd., UK).

Beispiel 6.3 - Bestimmung der Stimulation der Synthese von Glykosaminoglykan Die Bestimmung der Synthese von Glykosaminoglykanen durch primäre humane dermale Fibroblasten wurde mittels des Blyscan Glycosaminoglycan Assays (Artikel-Nr. 054B3000, 2019, tebu-bio, Offenbach, beziehungsweise Biocolor Ltd., UK) gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Die Ergebnisse des Versuchs sind in Tabelle 4 und Figur 7 dargestellt.

Tabelle 4: Bestimmung der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 450 nm zur Ermittlung der Synthese von Glykosaminoglykanen gemäß dem Blyscan Glycosaminoglycan

Assay (tebu-bio, Offenbach, Deutschland, beziehungsweise Biocolor Ltd., UK).

Beispiel 7 - Stimulation der Synthese von Kollagen, Elastin und Proteoglykan in primären humanen Fibroblasten durch erfindungs gemäße hydroxylierte Kollagenpeptidpräparate:

Zur Bestimmung der Stimulation der Synthese von Kollagen, Elastin und Proteoglykan wurden primäre humane dermale Fibroblasten gemäß Beispiel 4.2 über einen Zeitraum von mindestens 14 Tagen, bevorzugt 14 bis 21 Tagen, insbesondere 14 Tagen, in Medium ohne Kollagenpeptid

(Kontrolle 1) und in Anwesenheit von 0,5 mg/ml eines Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren Molekulargewicht von 7,0 kDa (Probe 4), eines Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren Molekulargewicht von 5,6 kDa (Probe 5) und eines Kollagenpeptidpräparats mit einem mittleren Molekulargewicht von 1,3 kDa (Probe 6) inkubiert. Beispiel 7.1 - Bestimmung der Stimulation der Synthese von Kollagen

Die Bestimmung der Kollagensynthese durch primäre humane dermale Fibroblasten wurde mittels des Sircol Collagen Assay Kits (Artikel-Nr. Artikel-Nr. 054S5000, 2019, tebu-bio, Offenbach, Deutschland, beziehungsweise Biocolor Ftd., UK) gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Die Ergebnisse des Versuchs sind in Tabelle 5 und Figur 8 dargestellt. Der für die unbehandelte Kontrolle (Kontrolle 1) ermittelte Durchschnittswert wurde standardmäßig auf 1 normiert.

Tabelle 5: Bestimmung der optischen Dichte (OD) zur Ermittlung der Kollagensynthese gemäß dem Sircol Collagen Assay (tebu-bio, Offenbach, Deutschland, beziehungsweise Biocolor Ftd., UK).

Beispiel 7.2 - Bestimmung der Stimulation der Synthese von Elastin

Die Bestimmung der Elastinsynthese durch primäre humane dermale Fibroblasten wurde mittels des Fastin Elastin Assays (Artikel-Nr. 054F2000, 2019, tebu-bio, Offenbach, Deutschland, beziehungsweise Biocolor Ltd., UK) gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Die Ergebnisse des Versuchs sind in Tabelle 6 und Figur 9 dargestellt. Der für die unbehandelte Kontrolle (Kontrolle 1) ermittelte Durchschnittswert wurde standardmäßig auf 1 normiert.

Tabelle 6: Bestimmung der optischen Dichte (OD) zur Ermittlung der Elastinsynthese gemäß dem Fastin Elastin Assay (tebu-bio, Offenbach, Deutschland, beziehungsweise Biocolor Ltd., UK).

Beispiel 7.3 - Bestimmung der Stimulation der Synthese von Glykosaminoglykan

Die Bestimmung der Synthese von Glykosaminoglykanen durch primäre humane dermale Fibroblasten wurde mittels des Blyscan Glycosaminoglycan Assays (Artikel-Nr. 054B3000, 2019, tebu-bio, Offenbach, beziehungsweise Biocolor Ltd., UK) gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Die Ergebnisse des Versuchs sind in Tabelle 7 und Figur 10 dargestellt. Der für die unbehandelte Kontrolle (Kontrolle 1) ermittelte Durchschnittswert wurde standardmäßig auf 1 normiert.

Tabelle 7: Bestimmung der optischen Dichte (OD) zur Ermittlung der Synthese von Glykosaminoglykanen gemäß dem Blyscan Glycosaminoglycan Assays (tebu-bio, Offenbach, Deutschland, beziehungsweise Biocolor Ltd., UK).