本発明のアンドロゲン非依存性前立腺癌の� ��立腺特異抗原産生に対する阻害作用および/ または同癌の増殖抑制作用を有する化合物の スクリーニング方法は、アンドロゲン非依存 性ヒト前立腺癌細胞を用いることを特徴とす る。
 ここで、「アンドロゲン非依存性ヒト前立� ��癌細胞」とは、ステロイド(例えば、野生型 または変異型アンドロゲン受容体に結合する 分子、具体的には、例えば、アンドロゲン、 プロゲステロン、グルココルチコイド、エス トロゲン)が実質的に存在しない培養条件に� �いて増殖能を示すヒト前立腺癌細胞を意味� �る。
 アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞と� ��ては、例えば、(i)ステロイドが実質的に存� ��しない培養条件において増殖が抑制される� ��ト前立腺癌細胞(親株)を由来とし、ステロ� �ドが実質的に存在しない培養条件における� �殖能が親株よりも高いヒト前立腺癌細胞、(i i)ホルモン療法によって一旦血中PSA濃度が低� ��した後に再度PSA濃度が上昇した前立腺癌患� ��由来のヒト前立腺癌細胞等が挙げられる。� ��お、(i)記載の親株には、ステロイドが実質� ��に存在しない培養条件において増殖速度が� ��制されるヒト前立腺癌細胞、及び該条件に� ��いて増殖することができない細胞が含まれ� ��。
 好ましいアンドロゲン非依存性ヒト前立腺� ��細胞としては、例えば、(i)記載の性質に加� ��て、(iii)親株よりもPSAの基礎産生量が上昇� �ている及び/又は(iv) 親株の場合よりも低濃� ��のアンドロゲン刺激よって親株と同程度のP SA産生量を示す細胞、が挙げられる。(iii)の� �胞としては、親株よりも1.2倍以上、好まし� �は1.2倍~30倍のPSAの基礎産生量を示す細胞が� �げられる。また、(iv)の細胞としては、親株� ��場合の1/3以下、好ましくは1/3~1/30の濃度の� �ンドロゲン刺激によって、親株と同程度のPS A産生量を示す細胞が挙げられる。
 上記(i)の細胞は、例えば、ステロイドが実� ��的に存在しない培養条件において増殖が抑� ��されるヒト前立腺癌細胞(親株)をステロイ� �が実質的に存在しない培養条件において培� �し、親株よりも高い増殖能を獲得した亜株� �選択することにより得られる。親株として� �用できるヒト前立腺癌細胞とは、例えば、LN CaP-FGC(ATCC CRL-1740)である。
 本発明のアンドロゲン非依存性ヒト前立腺� ��細胞としては、例えば、LNCaP-FGCを由来とす� ��細胞、具体的には、参考例記載のヒト前立� ��癌細胞LNCaP-hr等があげられる。LNCaP-FGCを由� �とする細胞は、例えば次の方法により得ら� �る。まず、親株であるLNCaP-FGC細胞をチャコ� �ルデキストランによりステロイドを除去し� �血清をふくむ培地(例えば、MEM培地、DMEM培地 、RPMI1640培地、199培地、F12培地等、特に、RPMI 1640培地)で培養する。細胞が、一旦増殖が抑� ��された後増殖を再開した後も同じ条件で培� ��を続け、増殖速度、PSA産生量、細胞形状等� ��形質を安定させた細胞を得る。
 LNCaP-hr細胞においては、アンドロゲン反応� �の蛋白質であるPSAの基礎産生量が、親株(LNCa P-FGC細胞)よりも上昇している。また、LNCaP-hr� ��胞は、親株の場合よりも低濃度のアンドロ� ��ン刺激によって、親株と同程度のPSA産生量� ��示す。したがって、LNCaP-hr細胞は、親株よ� �もアンドロゲン刺激に高反応性の細胞と考� �られる。LNCaP-hr細胞においては、従来のアン ドロゲン受容体拮抗薬のビカルタミドは高濃 度ではPSA産生にアゴニストとして作用し、ビ カルタミドによる細胞増殖の抑制も、LNCaP-FGC の場合よりはるかに弱い。これは臨床でのホ ルモン療法抵抗性癌の性質と類似する。

 また、本発明のスクリーニング方法は、
(1)アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞に 試験化合物を接触させたときのPSA産生量また は細胞数と、試験化合物を接触させない場合 のPSA産生量または細胞数を測定し、比較する 工程を含むこと;
(2)連結されたPSAプロモーターとレポーター遺 伝子が組み込まれたアンドロゲン非依存性ヒ ト前立腺癌細胞を試験化合物と接触させる工 程を含むこと;または
(3)モデル動物にアンドロゲン非依存性ヒト前 立腺癌細胞を移植し、該モデル動物に試験化 合物を投与した場合と投与しない場合の細胞 増殖の状態を測定し、比較する工程を含むこ と
を特徴とする。
 以下、(1)~(3)について、詳細に説明する。

 (1)アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞� ��試験化合物を接触させたときのPSAの産生量� ��たは細胞数と、試験化合物を接触させない� ��合のPSA産生量または細胞数を測定し、比較� ��る工程を含むスクリーニング方法:
 (1)の方法は、アンドロゲン非依存性ヒト前� ��腺癌細胞を用いることを特徴とする前立腺� ��異抗原産生阻害作用および/またはアンドロ ゲン非依存性前立腺癌増殖抑制作用を有する 化合物(例えば抗癌薬)のスクリーニング方法� ��して使用できる。アンドロゲン非依存性ヒ� ��前立腺癌細胞としては、例えば、LNCaP-FGC由� ��の細胞、具体的には、例えばLNCaP-hrが使用� �きる。
 PSA産生量の測定は、試験化合物を含む(また は含まない)培地を用いてアンドロゲン非依� �性ヒト前立腺癌細胞を培養した後、培養上� �に分泌されたPSAをELISA法、RIA法等によって測 定することにより実施可能である。細胞数は 、試験化合物を含む(または含まない)培地を� ��いてアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細� ��を培養した後に測定すればよい。細胞数は� ��例えば、コールターカウンターを用いる細� ��数のカウント、細胞内のATP含量の定量、ミ� ��コンドリアにより還元されて発色する色素� ��用いる方法によって測定することができる� ��
 (1)記載の工程の結果に基づいて、(i)アンド� ��ゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞に接触させ� ��ときに該細胞のPSA産生量を減少させる試験� ��合物を選抜する、または(ii)アンドロゲン非 依存性ヒト前立腺癌細胞に接触させたときに 該細胞の増殖が抑制される試験物質を選択す ることにより、前立腺特異抗原産生阻害作用 および/またはアンドロゲン非依存性前立腺� �増殖抑制作用を有することが期待される化� �物を得ることができる。
 (1)のスクリーニング方法は、例えば、下記� ��ように実施することができる。
 LNCaP-FGC由来のアンドロゲン非依存性ヒト前� ��腺癌細胞をマルチウェルプレートあるいは� ��ャーレに播き、翌日、化合物を添加する。� ��合物は化合物を溶解する適当な溶媒(PBS、HBS S、生理食塩水、水、エタノール、DMSO、DMFな� ��)に溶解し、そのままあるいは培地で希釈し 、細胞を播種したマルチウェルプレートある いはシャーレに添加する。一定期間培養後培 養上清中のPSA濃度を、ELISAまたはRIAにより測� ��し、コントロール群を100%、化合物添加前の PSA量を0%としたときのPSA産生抑制率を算出す� ��。また細胞増殖をコールターカウンターに� ��る計数、細胞内のATP含量測定、BrdU取り込み 、[ ³ H]-Thymidine取り込み、色素法(MTT、alamar blue,resa zurin、WST-1、WST-8など)により評価する。

 (2)連結されたPSAプロモーターとレポーター� ��伝子が組み込まれたアンドロゲン非依存性� ��ト前立腺癌細胞を試験化合物と接触させる� ��程を含むスクリーニング法:
 (2)の方法は、連結されたPSAプロモーターと� ��ポーター遺伝子が組み込まれたアンドロゲ� ��非依存性ヒト前立腺癌細胞に試験化合物を� ��触させた場合と試験化合物を接触させない� ��合のレポーター遺伝子の発現量を測定し、� ��較する工程を含むことが好ましい。
 (2)の方法は、アンドロゲン非依存性ヒト前� ��腺癌細胞を用いることを特徴とする前立腺� ��異抗原産生阻害作用および/またはアンドロ ゲン非依存性前立腺癌増殖抑制作用を有する 化合物(例えば抗癌薬)のスクリーニング方法� ��して使用できる。アンドロゲン非依存性ヒ� ��前立腺癌細胞としては、例えば、LNCaP-FGC由� ��の細胞、具体的には、例えばLNCaP-hrが使用� �きる。
 PSAプロモーターとは、アンドロゲン受容体� ��よって転写が調節されるPSA遺伝子のプロモ� ��ターであって、6k-PSAプロモーター(文献名:Mo l. Endocrinol., 1997, 11, 148-161)、PSAR-PCPSA-P(文献 名:Cancer Res., 1997, 57, 495-499)等が使用可能で ある。レポーター遺伝子としては、例えばβ- ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺 伝子、蛍光タンパク質遺伝子、アルカリホス ファターゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダ ーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチル トランスフェラーゼ遺伝子が使用できる。
 (2)の方法は、例えば、下記のように実施す� ��ことができる。まず、PSAプロモーターを、� ��ポーター遺伝子を連結した後、これをアン� ��ロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞に組み込� ��で変異株を作製し、該変異株と試験化合物� ��接触させる。変異株と接触させた場合にレ� ��ーター遺伝子の発現を低下させる試験化合� ��、すなわちアンドロゲン受容体による転写� ��進に対する抑制作用を有する化合物を選別� ��ることで、前立腺特異抗原産生阻害作用お� ��び/またはアンドロゲン非依存性前立腺癌増 殖抑制作用を有する化合物(例えば抗癌薬)を� ��ることができる。
 (3)モデル動物にアンドロゲン非依存性ヒト� ��立腺癌細胞を移植し、該モデル動物に試験� ��合物を投与した場合と投与しない場合の細� ��増殖の状態を測定し、比較する工程を含む� ��クリーニング方法:
 (3)の方法は、抗腫瘍作用を有する化合物の� ��クリーニング方法として使用できる。アン� ��ロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞としては� ��例えば、LNCaP-FGC由来の細胞、具体的には、� ��えばLNCaP-hrが使用できる。モデル動物とし� �は、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモ� �ト、ハムスター、マウス、ラット、特に好� �しくはマウスまたはラットが使用できる。� �デル動物は、免疫不全動物であることが好� �しい。細胞増殖の状態の測定としては、例� �ば、腫瘍体積の測定が挙げられる。
 上記(3)の工程の結果に基づいて、モデル動� ��の腫瘍体積を縮小させる、または腫瘍体積� ��増加を抑制する試験化合物を選抜すること� ��より、抗腫瘍作用を有することが期待され� ��化合物を得ることができる。
 (2)の方法は、例えば、下記のように実施す� ��ことができる。
 LNCaP-FGCに由来するアンドロゲン非依存性ヒ� ��前立腺癌細胞をPBS、HBSS、生理食塩水あるい はマトリゲル中に浮遊させ、そのうち0.5-10X10 ⁶ 細胞に相当する浮遊液をヌードマウス皮下、 腹腔内、静脈内、心室内、骨内あるいは前立 腺内に移植する。雄ヌードマウスあるいは雄 ヌードラットにおいては場合により去勢した 動物を使用する。腫瘍体積がある程度以上(� �えば100mm ³⁾ になった段階で腫瘍体積をもとに群分けし、 化合物を1日1~4回1~8週間経口投与を行い、コ� �トロール群の体積を100%、投与開始時の体積� ��0%として投与群の腫瘍体積を計算する(T/C%)� �

 本発明のスクリーニング方法に供される� ��験化合物には特に制限はなく、例えば、コ� ��ビナトリアルケミストリー技術を用いて作� ��された化合物ライブラリー、固相合成やフ� ��ージディスプレイ法により作製されたラン� ��ムペプチドライブラリー、あるいは、微生� ��、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が� ��げられる。

 本発明はまた、上記のスクリーニング方法� ��実施するのに好適なキットをも提供する。� ��発明のスクリーニング用キットは、アンド� ��ゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞を含んでな� ��ことを特徴とする。アンドロゲン非依存性� ��ト前立腺癌細胞としては、本発明のスクリ� ��ニング方法の説明において上記したものが� ��用できる。
 本発明のスクリーニング用キットは、PSAを� ��定するための試薬類をさらに含んでいても� ��い。例えば、下記の試薬類を含むことがで� ��る。
タンデム-RフリーPSA、高感度PSAタンデム、ア� ��セス・ハイブリテック・フリーPSA、ST Eテ� �ト「TOSOH」II(PSA II)、ナノピアPSA、LTオート� �コーPSA、ランリームPSA II、マーキットM PA� �アーキテクト ^R (登録商標)・PSA、イノテック PSA、 DPC・イム ライズ(R)HS-PSA、 E-テスト PSA、エクルーシス 試薬PSAII、エクルーシス試薬FPSA、AxSYM ^R  PSA・ダイナパック ^R 、AxSYM ^R  フリーPSA・ダイナパック ^R 、ルミパルス PSA-N、ルミスポットAL-1000用PSA� ��定試薬、 Unicel Dx I 800用測定試薬、日立70 70分析装置用PSA測定試薬

 本発明はまた、本発明のスクリーニング法� ��得られた前立腺特異抗原産生阻害作用およ� ��/またはアンドロゲン非依存性前立腺癌増殖 抑制作用を有する化合物を含有してなる癌(� �に前立腺癌)の予防・治療薬を提供する。該� ��防・治療薬は、必要に応じて薬理学的に許� ��される担体を含有することができる。
 ここで、「薬理学的に許容される担体」と� ��ては、製剤素材として慣用の各種有機ある� ��は無機担体物質が用いられ、固形製剤にお� ��る賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤;液状製 剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等 張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合さ れる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化 剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用い ることもできる。

 賦形剤の好適な例としては、乳糖、白糖、D -マンニトール、D-ソルビトール、デンプン、 α化デンプン、デキストリン、結晶セルロー� ��、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース� ��カルボキシメチルセルロースナトリウム、� ��ラビアゴム、デキストリン、プルラン、軽� ��無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メ� ��ケイ酸アルミン酸マグネシウムなどが挙げ� ��れる。
 滑沢剤の好適な例としては、ステアリン酸� ��グネシウム、ステアリン酸カルシウム、タ� ��ク、コロイドシリカなどが挙げられる。
 結合剤の好適な例としては、α化デンプン� �ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、メチル� �ルロース、カルボキシメチルセルロース、� �ルボキシメチルセルロースナトリウム、結� �セルロース、白糖、D-マンニトール、トレハ ロース、デキストリン、プルラン、ヒドロキ シプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル メチルセルロース、ポリビニルピロリドンな どが挙げられる。
 崩壊剤の好適な例としては、乳糖、白糖、� ��ンプン、カルボキシメチルセルロース、カ� ��ボキシメチルセルロースカルシウム、クロ� ��カルメロースナトリウム、カルボキシメチ� ��スターチナトリウム、軽質無水ケイ酸、低� ��換度ヒドロキシプロピルセルロースなどが� ��げられる。
 溶剤の好適な例としては、注射用水、生理� ��食塩水、リンゲル液、アルコール、プロピ� ��ングリコール、ポリエチレングリコール、� ��マ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実� ��などが挙げられる。
 溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチ� ��ングリコール、プロピレングリコール、D-� �ンニトール、トレハロース、安息香酸ベン� �ル、エタノール、トリスアミノメタン、コ� �ステロール、トリエタノールアミン、炭酸� �トリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル� �ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが挙げら� �る。
 懸濁化剤の好適な例としては、ステアリル� ��リエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリ� ��ム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチ� ��、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニ� ��ム、モノステアリン酸グリセリンなどの界� ��活性剤;例えばポリビニルアルコール、ポリ ビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロ ースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロ キシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセ ルロース、ヒドロキシプロピルセルロースな どの親水性高分子;ポリソルベート類、ポリ� �キシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられ� �。
 等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリ� ��ム、グリセリン、D-マンニトール、D-ソルビ トール、ブドウ糖などが挙げられる。
 緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢� ��塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液など� ��挙げられる。
 無痛化剤の好適な例としては、ベンジルア� ��コールなどが挙げられる。
 防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安� ��香酸エステル類、クロロブタノール、ベン� ��ルアルコール、フェネチルアルコール、デ� ��ドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
 抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、� ��スコルビン酸塩などが挙げられる。
 着色剤の好適な例としては、水溶性食用タ� ��ル色素(例、食用赤色2号および3号、食用黄� ��4号および5号、食用青色1号および2号などの 食用色素)、水不溶性レーキ色素(例、前記水� ��性食用タール色素のアルミニウム塩など)、 天然色素(例、β-カロチン、クロロフィル、� �ンガラなど)などが挙げられる。
 甘味剤の好適な例としては、サッカリンナ� ��リウム、グリチルリチン酸二カリウム、ア� ��パルテーム、ステビアなどが挙げられる。

 前記医薬組成物の剤形としては、例えば錠� ��、カプセル剤(ソフトカプセル、マイクロカ プセルを含む)、顆粒剤、散剤、シロップ剤� �乳剤、懸濁剤などの経口剤;および注射剤(例 、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤 、腹腔内注射剤など)、外用剤(例、経鼻投与� ��剤、経皮製剤、軟膏剤など)、坐剤(例、直� �坐剤、膣坐剤など)、ペレット、点滴剤、徐� ��性製剤(例、徐放性マイクロカプセルなど)� �の非経口剤が挙げられ、これらはそれぞれ� �口的あるいは非経口的に安全に投与できる� �
 医薬組成物は、製剤技術分野において慣用� ��方法、例えば日本薬局方に記載の方法等に� ��り製造することができる。以下に、製剤の� ��体的な製造法について詳述する。医薬組成� ��中の本発明のスクリーニング方法により得� ��れる化合物の含量は、剤形、該化合物の投� ��量などにより異なるが、例えば約0.1ないし1 00重量%である。

 例えば、経口剤は、有効成分に、賦形剤( 例、乳糖、白糖、デンプン、D-マンニトール� ��ど)、崩壊剤(例、カルボキシメチルセルロ� �スカルシウムなど)、結合剤(例、α化デンプ� ��、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロ� ��ス、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリ� ��ニルピロリドンなど)または滑沢剤(例、タ� �ク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチ� �ングリコール6000など)などを添加して圧縮成 形し、次いで必要により、味のマスキング、 腸溶性あるいは持続性を目的として、コーテ ィング基剤を用いて自体公知の方法でコーテ ィングすることにより製造される。

 該コーティング基剤としては、例えば糖衣� ��剤、水溶性フィルムコーティング基剤、腸� ��性フィルムコーティング基剤、徐放性フィ� ��ムコーティング基剤などが挙げられる。
 糖衣基剤としては、白糖が用いられ、さら� ��、タルク、沈降炭酸カルシウム、ゼラチン� ��アラビアゴム、プルラン、カルナバロウな� ��から選ばれる1種または2種以上を併用して� �よい。
 水溶性フィルムコーティング基剤としては� ��例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒ� ��ロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロ� ��シエチルセルロース、メチルヒドロキシエ� ��ルセルロースなどのセルロース系高分子;ポ リビニルアセタールジエチルアミノアセテー ト、アミノアルキルメタアクリレートコポリ マーE〔オイドラギットE(商品名)、ロームフ� �ルマ社〕、ポリビニルピロリドンなどの合� �高分子;プルランなどの多糖類などが挙げら� ��る。
 腸溶性フィルムコーティング基剤としては� ��例えばヒドロキシプロピルメチルセルロー� �� フタレート、ヒドロキシプロピルメチル� �ルロース アセテートサクシネート、カルボ キシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸 セルロースなどのセルロース系高分子;メタ� �クリル酸コポリマーL〔オイドラギットL(商� �名)、ロームファルマ社〕、メタアクリル酸� ��ポリマーLD〔オイドラギットL-30D55(商品名)� �ロームファルマ社〕、メタアクリル酸コポ� �マーS〔オイドラギットS(商品名)、ロームフ� ��ルマ社〕などのアクリル酸系高分子;セラッ クなどの天然物などが挙げられる。
 徐放性フィルムコーティング基剤としては� ��例えばエチルセルロースなどのセルロース� ��高分子;アミノアルキルメタアクリレートコ ポリマーRS〔オイドラギットRS(商品名)、ロー ムファルマ社〕、アクリル酸エチル・メタア クリル酸メチル共重合体懸濁液〔オイドラギ ットNE(商品名)、ロームファルマ社〕などの� �クリル酸系高分子などが挙げられる。
 上記したコーティング基剤は、その2種以上 を適宜の割合で混合して用いてもよい。また 、コーティングの際に、例えば酸化チタン、 三二酸化鉄等のような遮光剤を用いてもよい 。

 注射剤は、有効成分を分散剤(例、ポリソ ルベート80、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ� ��60など、ポリエチレングリコール、カルボ� �シメチルセルロース、アルギン酸ナトリウ� �など)、保存剤(例、メチルパラベン、プロピ ルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブ タノール、フェノールなど)、等張化剤(例、� ��化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトー� �、D-ソルビトール、ブドウ糖など)などと共� �水性溶剤(例、蒸留水、生理的食塩水、リン� ��ル液等)あるいは油性溶剤(例、オリーブ油� �ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油などの植� �油、プロピレングリコール等)などに溶解、� ��濁あるいは乳化することにより製造される� ��この際、所望により溶解補助剤(例、サリチ ル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等)、安定� �(例、ヒト血清アルブミン等)、無痛化剤(例� �ベンジルアルコール等)等の添加物を用いて� ��よい。注射液は、通常、適当なアンプルに� ��填される。

 このようにして得られる製剤は、安全で低� ��性であるので、例えば、哺乳動物(例えば、 ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブ タ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパ ンジーなど)に対して経口的にまたは非経口� �に投与することができる。
 該予防・治療薬の投与量は、対象疾患、重� ��度、投与対象、投与ルートなどにより異な� ��が、例えば、前立腺癌に罹患している成人� ��者(体重60kg)においては、有効成分である化� ��物の量として、一日あたり約0.1~約100mg、好� ��しくは約1.0~約50mg、より好ましくは約1.0~約2 0mgであり、この量を1回または数回に分けて� �与することができる。
 以下に、参考例、実施例を挙げて本発明を� ��らに詳しく説明するが、本発明はこれらに� ��定されるものではない。
[参考例]

 ヒト前立腺癌細胞LNCaP-FGCを親株として用い� ��本発明のアンドロゲン非依存性ヒト前立腺� ��細胞「LNCaP-hr」を得た。
 まず、ステロイドが実質的に存在しない培� ��を用いて、LNCaP-FGC細胞(ATCCCRL-1740)を培養し� �。ステロイドが実質的に存在しない培地と� �、アンドロゲンが除去された牛胎児血清を10 %含有する、RPMI1640培地(GIBCO社 11835-030, phenol� �red free)である。
 牛胎児血清からのアンドロゲンの除去は、� ��胎児血清のDCC(Dextran coated charcoal)処理によ� ��行った。まず、「Charcoal, activated, USP」(SIGM A社, C7606-500G) 25g、 「デキストランT70」(EXTR ASYNTHESE社, 4445) 250mgおよびD-PBS(GIBCO社, 14190-1 44) 500mLを混合した後にオートクレーブ(121℃,  20分)し、これをDCCとした。次に、牛胎児血� ��500mLにDCC 25mLを混合し、45℃の温浴中で30分� ��振とう撹拌した。その後、4℃, 3000rpmでの� �心を2回行い、得られた上清をろ過滅菌(CORNIN G 430773, 0.2um Nylon)し、アンドロゲンが除去� �れた牛胎児血清を得た。アンドロゲンが除� �された牛胎児血清と、RPMI1640培地(GIBCO社 1183 5-030, phenol red free)を混合し、ステロイドが� ��質的に存在しない培地とした。
 ステロイドが実質的に存在しない培地を用� ��て培養すると、LNCaP-FGC細胞の増殖は、一旦� ��制された後、再開された。再増殖開始後も� ��じ条件で培養を続け、増殖速度及び細胞形� ��が安定した細胞を選択した。得られた細胞� ��「LNCaP-hr」と名づけた。
 なお、「LNCaP-hr」は、Cancer Res. 2003 Jan 1;63 (1):149-53(非特許文献13)にも記載された細胞で� ��る。
 LNCaP-hr細胞のPSAの基礎産生量を、ELISA法で測 定した。その結果、LNCaP-hr細胞においては、� ��ンドロゲン反応性の蛋白であるPSAの基礎産� ��量は、LNCaP-FGC細胞の約1.2倍~30倍であった。
 また、アンドロゲン刺激による細胞のPSAの� ��生量を、ELISA法で測定した。その結果、LNCaP -hr細胞は、LNCaP-FGC細胞の場合の1/3~1/30の濃度� ��アンドロゲン刺激によって、LNCaP-FGC細胞と� ��程度のPSA産生量を示した。したがって、LNCa P-hr細胞は、親株よりもアンドロゲン刺激に� �反応性の細胞と考えられる。
 この細胞では従来のAR拮抗薬のビカルタミ� �は高濃度ではPSA産生にアゴニストとして作� �し、ビカルタミドによる細胞増殖の抑制もLN CaP-FGCの場合よりはるかに弱かった。これは� �床でのホルモン療法抵抗性癌の性質と類似� �ていた。
 この細胞を用いてin vitroでのPSA産生の産生� ��害および増殖阻害ならびにこの細胞をヌー� ��マウスに移植して作成した癌に対する抗腫� ��作用で化合物を評価した。